Cuestionario N° 03

1. Componentes del HPLC

La cromatografía líquida (HPLC), es una técnica utilizada para separar los

componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar
(columna) y una fase móvil. La fase estacionaria es sílica que se ha tratado con
RMe2SiCl. La fase móvil actúa de portador de la muestra. La muestra en solución
es inyectada en la fase móvil. Los componentes de la solución emigran de
acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos con la columna.
Estas interacciones químicas, determinan la separación de los contenidos en la
muestra. La utilización de los diferentes detectores dependerá de la naturaleza
de los compuestos a determinar.

Los componentes básicos de un cromatógrafo líquido son:

 Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado
de eluyentes)
 Dispositivo de inyección
 Conducciones y conexiones
 Detector y registrador
 Columna
Además de los dispositivos anteriormente mencionados se pueden incorporar en
el sistema otros que pueden simplificar el trabajo o bien mejorar algún aspecto
concreto de la técnica cromatográfica, como pueden ser:
 Inyectores automáticos.
 Colectores de fracciones.
 Hornos termostatizados para las columnas.
 Sistemas de tratamiento de datos.
 1. Sistema de suministro de fase móvil
La bomba: La misión de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre
de pulsos de la fase móvil a través de la columna, sin que el flujo sea influido por
la presión en cabeza de columna, ya que ésta puede variar por obstrucción de
las líneas de conducción, del filtro de la cabeza de la columna, etc.
Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes características:
- Estar construido con materiales químicamente inertes frente a la fase móvil.
- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
- Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un amortiguador de
éstas, ya que las pulsaciones, aunque no afectan a la separación en sí, pueden
contribuir al ruido de fondo del detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad.
- Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas. El rango
de caudales para las columnas que se utilizan habitualmente varía desde los
10µl/min hasta los 10 ml/min (columnas microbore, analíticas y
semipreparativas).
- El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que de
él depende la reproducibilidad de los tiempos de retención.
Tipos de bomba
Bombas neumáticas (Figura 2)
Bombas de motor eléctrico (Figura 3)
Sistemas de mezcla de fase móvil
En cromatografía de líquidos, es posible trabajar en dos modalidades; isocrático,
cuando la fase móvil mantiene la misma composición durante la elución, y en
gradiente, cuando la composición de la fase móvil cambia según una función
dependiente del tiempo.
Para trabajar en la modalidad de gradiente, es necesario que el equipo
cromatográfico tenga un dispositivo capaz de realizar mezclas de disolventes
con un control preciso y reproducible.
Los dos principales métodos de mezclado de los componentes de la fase móvil
se conocen como mezclado a alta presión y mezclado a baja presión.

Sistemas de inyección
El método de introducción de la muestra en CLAE, es de importancia capital,
pues un mal sistema de inyección puede dar lugar a ensanchamientos de la
banda cromatográfica que deterioren la eficacia del sistema cromatográfico. Un
inyector ideal debe tener las siguientes características:
- Introducir la muestra en la columna como una banda lo más estrecha posible. -
Ser de fácil manejo.
- Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra inyectada
como en el ensanchamiento que origina en la banda cromatográfica.
- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas. Fundamentalmente existen dos
tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los de válvula.

La fase estacionaria

Como en el caso de la cromatografía líquido-sólido, la naturaleza de la fase

estacionaria influye en la selectividad del sistema cromatográfico. En la
cromatografía de fases ligadas, la polaridad de la fase estacionaria puede ser
seleccionada entre una mayor variedad, atendiendo al grupo funcional que se
liga químicamente al soporte (Tabla V), cadenas cortas (C-8), cadenas largas
(C-18) u otros grupos funcionales.
Si bien es cierto que con las fases ligadas se dispone de más versatilidad en la
elección de fases estacionarias, las más habitualmente utilizadas son:
- Cadenas hidrocarbonadas de 18 carbonos para fase inversa.
- Cadenas con extremos amino para fase normal
 2. Preparación y purificación de la muestra.
La mayoría de las muestras de alimentos que se analizan por métodos
instrumentales de separación son demasiado complejas, están demasiado
diluidas o son incompatibles con el sistema cromatográfico, lo que impide su
introducción directa. Se necesita preparar la muestra antes de su introducción
en el sistema, mediante fraccionamiento, extracción o pre-separación.

Técnicas instrumentales de preparación de muestras de alimentos.

Posibilidades clásicas:
 Cristalización
 Destilación
 Precipitación
 Extracción con disolventes (LLE, Soxhlet, etc.)
Otras:
 Diálisis y microdiálisis
 Filtración
 Ultrafiltración
 Separaciones con membranas
3. Estructura de la sacarosa y fructuosa.

D-Fructosa

C6H12O6
Sacarosa
C12H22O11
Referencias bibliográficas

1. Cromatografía líquida de alta eficacia. Disponible en:

http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatogr
afia/cromatografia_liquida_de_alta_eficacia.pdf
2. Cromatograf+ia líquida. Disponible en:
http://www.ucm.es/data/cont/docs/650-2013-12-02-
gases%20l%C3%ADquidos.pdf
3. Aplicaciones de la Cromatografía Líquida con Detector de Diodos y
Fluorescencia al Análisis de Contaminantes Medioambientales.
Disponible en:
http://www.iaea.org/inis/collection/NCLCollectionStore/_Public/43/028/43
028576.pdf