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ESTERILIZACIÓN

Proceso mediante el cual se eliminan todas las formas de vida microbiana, es decir implica
la eliminación de Células Vegetativas

Esporos

Virus

Puede llevarse a cabo por:

- Pérdida de viabilidad: pérdida irreversible de la capacidad de reproducción de un
microorganismo.
- Separación física de todos los microorganismos presentes en un objeto.

En toda ESTERILIZACIÓN debe analizarse:

Material a Agente
esterilizar esterilizante

Método de
esterilización

Desinfección: uso de agentes químicos para eliminar la infectividad potencial de un material

mediante la destrucción de las formas vegetativas de los agentes patógenos. No implica la
eliminación total de los microorganismos, ya que las esporas pueden sobrevivir.

Agentes esterilizantes
Su acción se basa en:
- la alteración de la permeabilidad de las membranas,
- la desnaturalización de las proteínas,
- la desnaturalización de los ácidos nucleicos.

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Métodos de esterilización
MÉTODOS QUE SE BASAN EN LA PÉRDIDA DE VIABILIDAD

FÍSICOS
*CALOR
SECO -Flameado
-Rojo incipiente
-Alcohol encendido
-Incineración
-Circulación de aire caliente en horno eléctrico

HÚMEDO -Ebullición simple

compuesta
-Autoclave a vapor fluente
-Autoclave con vapor saturado a presión
-Tindalización
-Pasteurización

*RADIACIONES

*ULTRASONIDO

QUÍMICOS
*SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS
ÓXIDO DE ETILENO
ÓXIDO DE PROPILENO
FORMALDEHÍDO
HIPOCLORITO
SOLUCIÓN ANTIMICROBIANA (ATB)

MÉTODOS QUE SE BASAN EN LA SEPARACIÓN DE LOS MICRORGANISMOS

FILTRACIÓN ESTERILIZANTE
*MEMBRANAS
*BUJÍAS
*ESTERILIZACION POR FILTRACION DE FLUIDOS GASEOSOS

MÉTODOS QUE SE BASAN EN LA PÉRDIDA DE VIABILIDAD

I- ESTERILIZACIÓN POR CALOR

Es el método que más se aplica en el laboratorio por ser el más eficaz, seguro, económico,
rápido y además porque se emplea para esterilizar gran variedad de material.
Factores a tener en cuenta:

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1 Tiempo y temperatura: están inversamente relacionados. A mayor temperatura menor

tiempo para lograr un mismo resultado.
a Punto térmico mortal: es la menor temperatura a la cual se mueren todos los
microorganismos presentes en una suspensión en 10 minutos.
b Tiempo térmico mortal: es el menor tiempo al cual mueren todos los
microorganismos de una suspensión a una temperatura dada.
c Tiempo de reducción decimal: es el tiempo numérico necesario para destruir el
90% de una población de microorganismos a una temperatura dada.
1 Humedad:
a Del agente esterilizante: el calor húmedo es más efectivo, la esterilización por el
calor seco requiere una intensidad y duración mucho mayores. Esto se debe a que
el agua es conductora del calor.
b Del material a esterilizar: los medios de cultivos tienen 95% de agua por lo que se
necesitan condiciones menos estrictas que para un material de vidrio o metal que
son secos.
c Del estado fisiológico de la célula:
i Células vegetativas: se destruyen a 70°C, ya que tienen un 95% de
humedad.
ii Esporos de hongos y levaduras: tienen menor porcentaje de agua. Mueren a
80 – 90°C
iii Endosporos bacterianos: viven en un estado de disecación completa, al tener
un porcentaje muy bajo de agua, requieren de condiciones mucho más
enérgicas. T = 120°C.
1 Estado fisiológico de los microorganismos: pueden formar cápsula o grumos que le dan
resistencia al calor.
2 Concentración de microorganismos: los más contaminados necesitan de condiciones más
enérgicas de esterilización.
3 pH: los pH extremos ayudan a la acción del calor.
4 Composición del medio de cultivo: cuanta más proteínas posean los medios de cultivo
existirá mayor protección para los microorganismos y por lo tanto serán necesarias
condiciones más enérgicas durante la esterilización.
Mecanismos de acción del calor
- Desnaturalización de proteínas (calor húmedo)
- Fusión y desorganización de membranas (calor seco)
- Procesos oxidantes irreversibles (calor seco)
Parámetro de máxima resistencia al calor: endosporos bacterianos.

Procedimientos
1 Calor seco: no se utiliza para medios de cultivos.
Acción directa de la llama:
a Rojo incipiente: se mantiene el material al rojo de 5 a 10 segundo. El caso más
común es la esterilización de ansas.
b Alcohol encendido: se coloca el material en un recipiente adecuado, se vierte cierta
cantidad de alcohol. Se enciende y se mueve el recipiente para abarcar toda la
superficie durante 2 a 5 minutos. Se utiliza como método de emergencia cuando se
vuelca material en la mesada. Para esterilizar morteros, cápsulas, etc.
c Flameado: se pasa rápida y repetidamente el material en la llama (2 – 3 segundo)
Sirve para pipetas, portaobjetos, pinzas, espátulas, bocas de recipientes.
d Incineración: se utiliza en los hospitales. Para materiales muy contaminados.
Elimina muchas sustancias tóxicas (dioxinas)
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Acción del aire caliente: (fuego indirecto)

Se calienta el aire en el interior de una estufa u horno. Generalmente se emplea para
esterilizar material de vidrio e instrumentos metálicos. Nunca se esterilizan en hornos de
medio de cultivo porque se secan.
Para realizar este método de esterilización es necesario acondicionar adecuadamente el
material a esterilizar: los objetos se envuelven con material permeable al calor (papel) Para
cargar la estufa se evitan las paquetes grandes y se los coloca lo suficientemente separados
para permitir la circulación del aire.

1 Calor húmedo:
a Ebullición: no es un método muy seguro ya que como llega sólo a 100°C no mueren
los endosporos. Se lo utiliza como método de emergencia por los menos durante 45
minutos. En algunos casos pueden agregarse sales para aumentar la temperatura
peso solo se llega hasta 106 o 107°C.
b Tindalización: se lo utiliza para la esterilización de alimentos. Como no es muy
seguro en el laboratorio se lo usa para materiales sensibles al calor. Es un método
de esterilización discontinuo en el cual se aplican sucesivamente temperaturas
menores a 100°C durante 30 minutos repartidas durante 3 días. Este proceso tiene
en cuenta la eliminación de las células vegetativas e induce a las endosporas
bacterianas a transformarse en células vegetativas para eliminarlas posteriormente.
1°) calentar a 100°C durante 30 minutos (mueren las células vegetativas) 2°)
esperar 24 horas (los endosporos se transforman en células vegetativas) 3°)
calentar a 100°C durante 30 minutos 4°) esperar 24 horas 5°) calentar a 100°C
durante 30 minutos.
c Pasteurización: es un método discontinuo que se usa para la destrucción de
microorganismos patógenos no esporulados. Se emplea para leche, vino, cerveza y
en el laboratorio se utiliza para materiales sensibles al calor. Consiste en exponer al
material a un shock térmico.
d Autoclave a vapor fluente: consiste en someter el material a la acción de una
corriente de vapor de agua usando el autoclave con la espita abierta. Como se llega
a una temperatura de 100°C se usa para esterilizar sustancias termo sensibles
(leche, azúcar, etc.)
e Autoclave a vapor saturado a presión: se somete el material a la acción de una
corriente de vapor de agua saturado a presión y por lo tanto a una presión superior
a la atmosférica, lo que permite llegar a temperaturas mayores a la del punto de
ebullición del agua. Es lo óptimo porque se llegan a eliminar endosporos. Se utiliza
para medios de cultivos, agua.
No es conveniente esterilizar en autoclave materiales que se deseen mantener
secos como telas o sustancias que puedan emulsionarse por la acción del vapor de
agua (aceites, grasas)

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Acondicionamiento del material: los recipientes deben tener cierres porosos

(tapones de algodón, gasa) o en el caso de recipientes con tapas, estas deben
permanecer flojas para permitir la salida del aire. Los recipientes con líquidos deben
llenarse hasta sus 2 terceras partes evitando de esta manera que el líquido al entrar
en ebullición moje el tapón o rebalse. Los tapones de algodón se resguardan con
capuchones de papel para evitar que se mojen.
Equipo utilizado: autoclave Chamberland.

Técnica operatoria para el uso del autoclave

1) Controlar que el nivel de agua alcance justo por debajo del falso fondo.
2) Colocar el material adecuadamente acondicionado.
3) Cerrar el autoclave ajustando los tornillos en cruz para asegurar un cierre hermético y
evitar fugas de vapor.
4) Encender las hornalla o mechero.
5) Purgar el autoclave, para eliminar todo el aire encerrado en el interior. Esto evita una
falsa lectura manométrica. Se considera que el autoclave está purgado cuando al hacer
burbujear en un recipiente con agua el chorro de vapor de agua que sale para la espita,
produce un ruido seco y metálico y además deja de burbujear.

Vapor fluente Vapor saturado a presión

6) Comenzar a computar el tiempo.
7) Cumplido el tiempo de esterilización
apagar la hornalla o mecheros.
8) Abrir el autoclave.
9) Dejar enfriar.
10) Retirar el material estéril.
6) Cerrar la espita.
7) Cuando el manómetro indi
que la presión deseada, com-
putar el tiempo manteniendo
la presión constante.
8) Cumplido el tiempo de es-
terilización apagar los meche
ros.
9) Esperar que el manóme-
tro indique 0 (cero)
10) Abrir la espita. Tener cui-
dado con la salida de vapor.
11) Abrir el autoclave.
12) Dejar enfriar.
13) Retirar el material estéril.

Generalmente se llega hasta 1 atmósfera y se lo deja durante 15 minutos, esto equivale

a tener 121 °C.
Otras opciones son:
½ atmósfera 30 minutos 112°C
¼ atmósfera 45 minutos 107°C

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II - ESTERILIZACIÓN POR RADIACIONES

1) UV: longitud de onda 260 nm. Actúan destruyendo las ácidos nucleicos formando dímeros
de timina, lo cual causa un error en la duplicación del ADN. Producen peróxidos orgánicos
y H2O2 que destruyen las funciones celulares.
2) X y GAMMA: longitud de onda 1 nm. Son rayos ionizantes, sumamente penetrantes.
Posee un acción directa produciendo radicales libres de los compuestos orgánicos
celulares destruyendo sus funciones y un acción indirecta ionizando el agua la cual libera
-
oxidrilos (OH ) que al interactuar con los compuestos orgánicos los inactiva. Se denomina
esterilización en frío. Su ventaja es que puede esterilizarse cualquier tipo de material
debido a su penetrabilidad salvo medios de cultivos ya que altera sus componentes. La
desventaja es el gran costo.

III - ESTERILIZACIÓN POR VIBRACIONES

Se destruye a los microorganismos por ondas sónicos y ultrasónicas.

IV - ESTERILIZACIÓN POR AGENTES QUÍMICOS

El requerimiento esencial para que un agente químico pueda utilizarse como agente
esterilizante es: volatilidad y toxicidad. De esta manera puede realizar su acción y ser fácilmente
eliminado del objeto esterilizado.

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Óxido de etileno: es uno de los más conocidos. Es un líquido cuyo punto de ebullición es
de 10,7°C y puede añadirse a las soluciones un forma líquida a una temperatura menor o bien
como gas esterilizante a temperaturas superiores a la de su punto de ebullición. Es
químicamente inestable y se descompone en solución dando etilenglicol que no es volátil y puede
tener efectos no deseables. Otra desventaja es la de ser explosivo y tóxico para los seres
humanos por lo que es preciso tomar las precauciones necesarias para su manipuleo.

MÉTODOS QUE SE BASA EN LA SEPARACIÓN FÍSICA DE LOS

MICRORGANISMOS

I BUJÍAS Y MEMBRANAS FILTRANTES

Se fundamenta en un fraccionamiento que involucra filtración a través de filtros capaces de

retener los microorganismos. Éstos quedan retenidos en parte por el pequeño tamaño de los
poros y también por la adsorción a las paredes de los mismos durante su paso. La importancia
de la adsorción está indicada por el hecho de que un filtro puede retener eficazmente
microorganismos cuando el tamaño del diámetro de los poros sea mayor que el de las células
retenidas.
Como los virus oscilan en dimensiones de las macromoléculas (proteínas) no quedan
necesariamente retenidos en los filtros. En consecuencia nunca es posible tener certeza de que
los métodos de filtración que dejan soluciones libres de bacterias eliminen también los virus.
1) Equipos descartables: utilizan membranas filtrantes que son pequeñas
superficies de un material como celulosa o plástico cuyo diámetro debe ser
menor que el de las bacterias. Diámetro de los poros: 0,22 – 0,45 micrones.
Estas membranas retienen bacterias pero dejan pasar virus. Bacterias que
pueden pasar: espiroquetas, Micoplasmas. Las membranas que retienen virus
poseen poros de 0,001 micrón de diámetro. La capacidad filtrante depende de la
densidad de poros de la membrana. Son rápidas y no se altera el líquido
esterilizado ya que los materiales son inertes, pero son caras y no pueden
recuperarse.
2) Equipos no descartables: utilizan bujías porosas como se Bujías Chamberland
(silicatos), Bujías Beckerfeld, Bujías París (sulfato de calcio o yeso poroso) y
Bujías de porcelana. Los microorganismos quedan retenidos ya que se pegan a
las paredes de las bujías por fuerzas electrostáticas. Las bujías se utilizan
haciendo vacío, son rápidas y se recuperan pero son frágiles y difíciles de
recuperar. La principal desventaja es que presentan cargas que alteran el
material a esterilizar y dejan pasar los virus, por esto se utilizan poco.

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II ESTERILIZACION POR FILTRACION DE FLUIDOS GASEOSOS

Se aplica en la industria farmacéutica, en cirugía, etc., para disminuir al mínimo la probabilidad

de contaminación del aire. Se usan filtros HEPA y ULPA.
Existen básicamente 2 tipos de áreas estériles:

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La segunda corresponde a los ambientes de los GBS.

MÉTODOS DE CONTROL DE ESTERILIZACIÓN

1) SOBRE EL SISTEMA ESTERILIZANTE: controlan hornos eléctricos, autoclaves y
membranas filtrantes.
a. Introducción de indicadores físicos: sufren modificaciones en su estructura física,
por ablandamiento o fusión de las sustancias que lo componen. Por ej.: ampollas
conteniendo ácido benzoico que funde a 121°C al cual se le agrega un colorante
(rojo de metilo) para facilitar la observación de la fusión. También se puede usar
antipirina con azul de metileno que funde a 112°C. Estos métodos no aseguran
que se haya cumplido el tiempo de esterilización. Para esto se ha ideado un
dispositivo similar a un reloj de arena que tiene en el interior en una de sus
ampollas una determinada cantidad de ácido benzoico; cuando se llega a 121°C y
el ácido comienza a fundir y pasa de la ampolla superior a la inferior. La cantidad de
ácido se ha calibrado de modo que el pasaje total asegura un tiempo mínimo de
esterilización de 20 minutos.
b. Introducción de indicadores químicos: consisten en ciertos indicadores que viran a
determinadas temperaturas. Estas citas están embebidas en soluciones de óxidos
inorgánicos que cambian de color con la temperatura.
c. Introducción de indicadores biológicos: consiste en cintas con 104 a 106 esporas de
un microorganismo termo resistente (Bacillus stearothermophyllus). Esta cinta con
esporas está colocada dentro de un medio de cultivo con indicador de pH. Una vez
sometida a la esterilización junto con la carga del autoclave se retira, se presiona el
tubo plástico de modo de romper la ampolla que contiene el medio de cultivo y se
incuba 18 a 24 hs. a 55 – 56 °C. Un cambio del indicador revela desarrollo del
microorganismo y por lo tanto una esterilización deficiente. Otra posibilidad es la de
una ampolla conteniendo también un microorganismo termo resistente en un caldo
junto con un indicador de pH. Mientras se mantiene refrigerada la ampolla se inhibe
el desarrollo de dicha bacteria. Se coloca la ampolla de vidrio dentro del autoclave y
al finalizar la esterilización se incuba por 24hs. a 60°C junto con una ampolla
testigo. Un viraje del indicador de rosado a amarillo o presencia de turbidez es
signo de positividad y significa que el microorganismo se ha desarrollado y por lo
tanto la esterilización no ha sido eficaz. Si no se produce cambio alguno indica que
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la bacteria ha sido eliminada durante la esterilización. En todos los casos, el

desarrollo microbiano se determina visualmente por cambio de color de un
indicador de pH presente en el medio de cultivo o por observación de turbidez. Si
las condiciones del proceso se han cumplido, no debería observarse desarrollo
microbiano. Por lo tanto, un resultado positivo (crecimiento) debe interpretarse
como que no se han cumplido las condiciones del proceso y, en consecuencia, el
material no está esterilizado.
- INDICADORES BIOLÓGICOS UTILIZADOS EN ESTERILIZACIÓN POR
CALOR: Los indicadores biológicos para la esterilización por calor seco
están constituídos por soportes de papel conteniendo endosporas de
Bacillus atrophaeus, ATCC N°9372 (ex Bacillus subtilis var niger),
altamente resistente a ese proceso de esterilización. Los soportes con las
endosporas se incluyen en el ciclo de esterilización y una vez concluido
éste se ponen en contacto con el medio de cultivo adecuado y se incuban a
37°C durante no menos de 7 días. Los indicadores biológicos para el
proceso de esterilización por calor húmedo a presión superior a la
normal están constituidos por soportes de papel conteniendo endosporas
de Geobacillus stearothermophilus, ATCC N° 7953 (ex Bacillus
stearothermophilus), altamente resistente a ese proceso de esterilización.
Los soportes se incluyen en el ciclo de esterilización y una vez concluido
éste se ponen en contacto con el medio de cultivo adecuado y se incuban a
56°C durante no menos de 7 días.
- INDICADORES BIOLÓGICOS PARA OTROS MÉTODOS DE
ESTERILIZACIÓN: Para controlar la esterilización por óxido de etileno,
también se utilizan endosporas de Bacillus atrophaeus (ex Bacillus subtilis
var niger) y para la esterilización por radiaciones ionizantes, endosporas de
Bacillus pumilus ATCC N° 27142

d. Para membranas filtrantes: se prueba con un microorganismo muy pequeño para

saber si los poros son lo suficientemente efectivos.

2) SOBRE EL MATERIAL ESTERILIZADO: control directo por incubación del material

esterilizado, por ej.: se esteriliza un medio de cultivo repartido en tubos de ensayo y se
toma una muestra estadísticamente representativa y se incuba. En el caso de otro tipo de
material se toma una porción del material y se lo coloca en un medio adecuado para luego
incubarlo.

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