UT 2 Tecnicas Microbiologicas Ba Sicas 09-10

UT 2.
TCNICAS MICROBIOLGICAS BSICAS

A) NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
Un laboratorio de Microbiologa es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden
manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo con una buena
tcnica asptica, y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado y trabajar siempre en
condiciones de esterilidad (en la proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas).
Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patgenos, todos los
cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con precaucin por su potencial
patogenicidad. Por lo que es necesario cumplir dos REQUISITOS BSICOS:
1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de
cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un compaero.
2. Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa, etc.)
contaminen nuestras muestras.
Para mantener estas condiciones, es necesario respetar una serie de NORMAS DE
SEGURIDAD:
1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.
2. Al iniciar y finalizar las prcticas, el estudiante se lavar las manos con agua y jabn.
3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada prctica , y al
terminar, es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes ms habituales
para esto son la leja y el alcohol (etanol 96).
4. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama.
5. Durante las prcticas est prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan
microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.
6. Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin de la prctica
deben estar apartados del lugar de trabajo.
7. Todos los utensilios usados deben estar estriles antes de su utilizacin. Para reutilizar material en
el que existiera algn cultivo microbiano (tubos de ensayo) debern introducirse en una bolsa de
esterilizacin y llevarse al autoclave antes de lavarlos, para evitar la contaminacin del personal.
8. Para deshacerse del material contaminado se utilizarn los recipientes adecuados, que sern
esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera o a la
basura comn.
9. Bajo ningn concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.
10. Antes de comenzar la prctica se debe comprobar que no falta ningn material, dado que ello
puede paralizar e invalidar el trabajo realizado.
11. Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden crear
corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.
12. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.
13. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) se
comunicar inmediatamente al profesor.
14. Todo el material sucio que quede despus de realizar la prctica se llevar al fregadero para su
limpieza. No dejar nada en las mesas de trabajo.
15. Terminada la prctica cada alumno deber anotar lo realizado, desde la preparacin del material
hasta los resultados obtenidos.
B) LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO
En Microbiologa es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada limpieza del
material. Asimismo, es muy importante la recuperacin del material reciclable y la eliminacin del
material desechable. Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes
adecuados, provistos de tapa.
Como los objetos contaminados contienen, con frecuencia, cantidades importantes de materia
orgnica (procedente de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos de los agentes
fsicos o qumicos utilizados en la descontaminacin de los mismos, no puede asegurarse la total
destruccin de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por ello, se recomienda utilizar
mayores concentraciones de desinfectante y tiempos ms largos de tratamiento que para la
desinfeccin o la esterilizacin de material limpio.
En Microbiologa se define esterilizacin como la destruccin o eliminacin total de todos los
microorganismos vivos en un objeto o material, incluido las endosporas bacterianas. El material que
se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado:
-
El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc, se cierran con algodn graso o
tapones metlicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Adems, cuando se
usa algodn, ha de cubrirse ste con un papel impermeabilizado. Una vez preparadas, se
introducen en estuches o cajas metlicas, o bien se envuelven individualmente en papel
satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se esteriliza con
calor seco, generalmente en un horno Pasteur.
El material de plstico desechable ya se suministra estril y listo para su uso. Por ejemplo,
las placas de Petri se introducen en bolsas de plstico selladas y se esterilizan con xido de
etileno o radiaciones.
Las soluciones y medios de cultivo lquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan,

generalmente,
en autoclave. Existen varios mtodos para llevar a cabo el proceso de
esterilizacin y la eleccin de uno determinado viene condicionado por el tipo de material que
se quiere esterilizar.
Material
Mechero Bunsen, horno Pasteur o estufa de aire caliente, autoclaves, equipos de filtracin y
materiales a tratar.
Tcnicas
SECO
Flameado
Estufa
CALOR
FSICOS
MTODOS DE ESTERILIZACIN
HMEDO
Ebullicin
Vapor fluente
Vapor saturado
FILTRACIN
IRRADIACIN
QUMICOS
El mtodo ms comnmente empleado para destruir los microorganismos es el calor, entre otras
razones porque es el ms econmico y el ms fcil de controlar. El calor utilizado con este fin puede
aplicarse en forma de calor seco o de calor hmedo.
El calor seco destruye los microorganismos por efectos de oxidacin y se requieren
temperaturas muy elevadas. El calor hmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores,
ya que la presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrgeno responsables de la estructura
terciaria de las protenas, haciendo que stas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.
La esterilizacin por calor seco puede hacerse por flameado o mediante estufas de aire caliente.
I)
Flameado: Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas, esptulas, etc.
Consiste en someter directamente a la accin de la llama de un mechero Bunsen o un
mechero de alcohol los utensilios que se vayan a esterilizar. Este mtodo es rpido y su
eficacia es altsima, sin embargo no se puede aplicar a objetos termolbiles (plsticos).
II)
Esterilizacin por aire caliente: Se lleva a cabo en estufas de aire caliente y consiste en
colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente protegidos para que no se
contaminen una vez esterilizados, en el interior de una estufa. Este procedimiento se
utiliza para esterilizar material de vidrio (Pipetas, matraces, tubos) u otros materiales
termorresistentes. Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy
elevadas (160-180C durante cerca de 2 horas).
Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar lquidos (como medios de
cultivo), ya que al llegar a los 100C comenzaran a hervir y continuaran hirviendo sin
elevar su temperatura por encima del punto de ebullicin del agua a presin atmosfrica.
A 100C las esporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas, y adems la
evaporacin producira cambios en la concentracin de los componentes del medio.
El calor hmedo tambin se utiliza para la destruccin de los microorganismos siendo, como ya
se ha comentado, a igual temperatura, mucho ms eficaz que el calor seco; con este tratamiento
las enzimas se desnaturalizan rpidamente, al igual que las membranas celulares. Adems, el
vapor de agua, especialmente si se genera a sobrepresin, es un eficaz transmisor de calor al
interior de la clula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios mtodos: Ebullicin, vapor
fluente y vapor saturado a presin.
I)
Ebullicin: El agua hirviendo (100C) tiene accin limitada, ya que aplicada durante 10
minutos va a destruir las formas vegetativas de los microorganismos, pero las esporas
bacterianas pueden sobrevivir incluso a tratamientos prolongados. Se podra utilizar el
bao Mara o bao de agua hirviente (slo con fines de desinfeccin en el laboratorio),
cuando no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros mtodos
mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos) como para medios de cultivo que
no puedan esterilizarse en autoclave.
II)
Vapor fluente: Esta tcnica se emplea con frecuencia para esterilizar medios de cultivo
que no se puedan someter a una temperatura superior a 100C sin que pierdan alguna de
sus propiedades, como leche, azcares, suero, etc. Se utiliza un autoclave a presin
atmosfrica, con la espita abierta, donde nunca se superan los 100C, y se realiza el
proceso durante tres das consecutivos, dejndose a temperatura ambiente en los
intervalos entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100C) durante
30-45 minutos destruyndose en este proceso las formas vegetativas pero no las
endosporas termorresistentes. Si stas se encuentran presentes en la muestra germinan
despus del calentamiento y estas formas vegetativas sern destruidas en los siguientes
ciclos. Este mtodo de esterilizacin se denomina tambin esterilizacin fraccionada o
tindalizacin.
III)
Vapor saturado a presin: La esterilizacin por esta tcnica utiliza vapor de agua
saturado que se somete a una atmsfera extra de presin sobre la presin atmosfrica
normal, elevndose con ello el punto de ebullicin del agua de 100C a 121C y
consiguindose la destruccin de todos los microorganismos (salvo los termfilos
extremos) en un tiempo de 15 a 20 minutos. Esta temperatura es tambin necesaria para la
destruccin de las endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia trmica. El
vapor de agua difunde por smosis a travs de las membranas de las esporas, coagulando
su protoplasma, fenmeno que se acenta si el vapor es saturado y a sobrepresin. Esta
tcnica de esterilizacin requiere el uso del autoclave.
El autoclave permite elevar la presin una o dos atmsferas sobre la presin atmosfrica,
elevndose con ello la temperatura de ebullicin del agua que se encuentra en su interior. Consta de
un recipiente metlico, generalmente de acero inoxidable, similar a una gran olla, en cuyo interior se
introduce el material a esterilizar que se coloca sobre una rejilla o placa agujereada. Despus de cerrar
cuidadosamente la tapa, se conecta la fuente de calor y comienza a elevarse la temperatura en su
interior. La salida continua del chorro de vapor a travs de la vlvula nos indica que el aire contenido
en el interior del autoclave ha sido eliminado. La eliminacin de este aire es importante ya que la
difusin del calor entre el vapor de agua y el aire es pobre, por lo que no se alcanzar la temperatura
esperada a la presin elegida y no se conseguir la esterilizacin. La vlvula se cierra cuando slo sale
vapor de agua y, a partir de ese momento, comienza a elevarse la presin hasta una atmsfera sobre la
presin normal, elevndose como consecuencia la temperatura hasta 121C. Transcurridos 15-20
minutos, en estas condiciones, el material se ha esterilizado.
Es el incremento de temperatura por encima de los 100C y no la presin la que destruye los
microorganismos. Si se esterilizan volmenes grandes de lquidos, es necesario mantener el material
en el autoclave durante perodos de tiempo ms prolongados, pues se tarda ms en alcanzar los 121C
en el centro de un gran volumen. Una vez transcurrido el tiempo necesario, se apaga el autoclave y
se deja descender la temperatura hasta que el indicador marque menos de 80C, que ser cuando la
presin haya descendido hasta presin atmosfrica. Se abre ligeramente la espita para comprobar que
no queda vapor a presin en el interior y ya se puede proceder a retirar todo el material esterilizado,
dejndolo enfriar a temperatura ambiente. El autoclave se utiliza para esterilizar medios de cultivo,
instrumentos, ropas, soluciones, jeringas, etc que puedan soportar altas temperaturas y una atmsfera
de sobrepresin.
Para la esterilizacin de materiales lquidos sensibles al calor, como algunos medios de cultivo,
soluciones de antibiticos, enzimas, vacunas, etc. o tambin para gases, se utiliza la filtracin. En
la esterilizacin por calor se destruyen los microorganismos del medio, mientras que la filtracin
los retira de una forma mecnica, en lugar de destruirlos.
La filtracin es el paso de un lquido o gas a travs de un material filtrante, con poros lo

suficientemente pequeos como para retener clulas microbianas. Tanto los filtros de membrana
como los equipos de filtracin con los que stos se usan deben ser esterilizados por otros
mtodos, generalmente vapor saturado a presin en el autoclave.
Los virus y algunas bacterias de tamao muy pequeo como, por ejemplo, los micoplasmas, no
son retenidos por los filtros habituales.
C) MEDIOS DE CULTIVO
NECESIDADES NUTRITIVAS DE LAS BACTERIAS.
Los microorganismos para desarrollarse necesitan cierta cantidad de sustancias alimenticias
que artificialmente se les suministran en lo que se llaman medios de cultivo.
La mayora de las bacterias son cultivables en medios artificiales, siempre que el medio de
cultivo les proporcione todos los elementos necesarios para su crecimiento y su multiplicacin. En
este sentido, las necesidades de las bacterias son extremadamente variables. En general, todas las
bacterias patgenas para el hombre necesitan compuestos orgnicos para desarrollarse.
Adems de unas determinadas condiciones fsico-qumicas, las necesidades nutritivas de las
bacterias podemos clasificarlas en:
a) NECESIDADES ELEMENTALES.
Constituyen las materias primas de los medios de cultivo:
-
C, N, H, O, son necesarios en cantidades relativamente importantes.
S, P, en cantidades un poco inferiores.
K, Ca, Mg, Fe, Mn, Zn, Co, Cu, Mo, son tambin necesarios en pequea cantidad
como componentes de enzimas, protenas, etc.
b) NECESIDADES ENERGTICAS.
Son indispensables para cubrir los gastos del metabolismo. Segn la fuente de energa que
utilicen las bacterias, se dividen en:
1) FOTOTROFAS O FOTOSINTTICAS: Energa luminosa.
1.1 fotoauttrofas o fotolittrofas: c. inorgnicos.
1.2 fotohetertrofas o fotoorganotrofas: c. orgnicos.
2) QUIMIOTROFAS O QUIMIOSINTTICAS: Oxidacin de compuestos.
2.1 quimioauttrofas o quimiolitotrofas: c. inorgnicos.
2.2 quimiohetertrofas o quimioorganotrofas: c. orgnicos.
En el ltimo grupo se incluyen la mayora de las bacterias, tanto saprfitas como patgenas.
c) NECESIDADES ESPECFICAS DE CRECIMIENTO.
Teniendo en cuenta las necesidades elementales y energticas se pueden preparar medios en
los cuales todas las bacterias no son capaces de crecer. Hace falta suministrarle un cierto nmero de
compuestos bien definidos, que no son sintetizados por las bacterias, y que son necesarios para su
desarrollo. Estos son los llamados FACTORES DE CRECIMIENTO, y que pueden ser: determinados
aminocidos, bases pricas, pirimidnicas, vitaminas, determinados azcares, los cuales dependen de
las necesidades de cada bacteria.
NECESIDADES FSICO-QUMICAS DE LAS BACTERIAS.
Hidratacin: Es esencial.
Temperatura: Cada especie microbiana posee una temperatura ptima de crecimiento

clasificndose segn esto en los siguientes grupos:
I.- Psicrfilas: capaces de desarrollarse a 0 C o menos. Su temperatura ptima aprox 15 C.
II.- Mesfilas: crecen mejor entre 25 y 40 C.
III.- Termfilas: crecen mejor entre 45 y 60 C.
Presin osmtica: No muy alta. Aunque las bacterias toleran bien los cambios de presin
osmtica, los medios de cultivo se preparan en condiciones de isotona. La mayora de las
bacterias no toleran concentraciones salinas muy elevadas.
pH: Es de gran importancia. Ha de estar cercano a la neutralidad: 7-7,6.
tiempo de incubacin necesario para que el germen adquiera vitalidad y se desarrolle.

Generalmente es de 24 a 48 horas.
Concentracin de oxgeno: Depende del tipo de bacterias:

o
Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxgeno libre. Para desarrollar

bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitacin constante o introduciendo
aire estril en el medio.
Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxgeno libre. Los anaerobios

estrictos son muy sensibles al O2 por lo que se debe evitar la exposicin de estos
microorganismos al O2. Se puede obtener un ambiente de anaerobiosis por los siguientes
mtodos:
A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolato
sdico, para disminuir el contenido de O2.
B.- Quitando el O2 por procedimientos mecnicos y reemplazndolo por N2 o CO2.
C.- Mediante reacciones qumicas dentro del recipiente que contiene el medio de
cultivo inoculado para combinar el oxgeno libre con otro compuesto. Por ejemplo: al
encender una vela se transforma el oxgeno en dixido de carbono.
Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de

oxgeno libre.
Microaerfilas: bacterias que crecen en presencia de pequeas cantidades de oxgeno libre.
MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un compuesto constituido por elementos nutritivos y de soporte, capaz
de crear un ambiente adecuado para el crecimiento de microorganismos, con objeto de aislar las
diferentes especies bacterianas, proceder a su identificacin y llevar a cabo una serie de estudios
complementarios.
CUALIDADES EXIGIBLES A UN MEDIO DE CULTIVO
1- COMPOSICIN: los medios de cultivo deben contener cualitativa y cuantitativamente las
sustancias exigidas para la supervivencia y crecimiento de los microorganismos. Bsicamente pueden
contener:
o
alimentos esenciales o nutrientes: son imprescindibles C, O, N, e H, en menores cantidades S

y P, y otros minerales como Mg, Ca, Fe, K etc.
factores de crecimiento: son metabolitos que las bacterias no pueden sintetizar: aminocidos,
vitaminas, azucares, etc.
factores estimulantes: su presencia acelera el ritmo de la multiplicacin bacteriana, o permite

la adaptacin a un medio artificial de una bacteria aislada en un medio natural.
2- pH: en general las bacterias solo se desarrollan a un pH casi neutro (7-7,6). Existen sustancias
buffer o tampn para mantener un pH estable. Algunas bacterias exigen o soportan un pH particular
que se emplea para su aislamiento o su identificacin.
3- HUMEDAD: se requiere una cantidad suficiente necesaria para el metabolismo bacteriano.
4- ESTERILIDAD: no es imprescindible para que el microorganismo crezca, pero si es necesaria esta
condicin a la hora de llevar a cabo cualquier investigacin bacteriana. Puede hacerse en:
-
Autoclave: 110-120C, para la mayora.
Tyndalizacin o esterilizacin fraccionada: Varios calentamientos a 100C/3 das sucesivos.
Se deben de tener en cuenta, pero no son imprescindibles:

1- AUSENCIA DE SUSTANCIAS INHIBIDORAS las cuales inhiban parcial o completamente la
vitalidad y multiplicacin de los grmenes que queremos estudiar. Ej: colorantes (verde brillante),
metales pesados (bismuto).
2- PRESENCIA DE SUSTANCIAS FACILITADORAS: que favorezcan el desarrollo de los
microorganismos. Ej: sangre, vitaminas, factores de coagulacin, etc.
3- ISOTENIA: es la concentracin de ClNa, que en la mayor parte de los medios corresponde a un
8,5%.
PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO. CLASIFICACIN:

Los medios de cultivo utilizados en Bacteriologa son numerossimos y pueden clasificarse
segn distintos criterios, pero todos ellos compatibles.
a) POR SU COMPOSICIN:
- Medios simples (agua, ClNa, peptona).
- Medios complejos o enriquecidos (aa.,vitaminas, protenas).
b) POR SU CONSISTENCIA:
- Lquidos: se denominan caldos, y no poseen sustancias gelificantes.
- Slidos: la sustancia gelificante es agar. El contenido de agar > 1%.
- Semislidos: "
"
" agar. El contenido de agar < 1%.
c) POR SU UTILIZACIN:
-
Medios generales o nutritivos.- Es aquel que soporta el crecimiento de una amplia

variedad de microorganismos sin exigencias nutritivas especiales.
Medios de mantenimiento y conservacin.
Medios de enriquecimiento.- Aquel que favorece ms el crecimiento de un determinado

tipo de bacterias por encima de otros tambin presentes en el inoculo.
Medios de aislamiento
Medios Selectivos.- Aquel que slo permite el crecimiento de un biotipo entre los que se
presentan en el inculo.
Medios diferenciales o Medios de identificacin.- Aquel que permite la distincin entre

biotipos prximos y relativamente parecidos.
Medios de transporte.
MEDIOS GENERALES O NUTRITIVOS.

Tienen gran cantidad de nutrientes, favoreciendo el crecimiento de gran cantidad de
microorganismos (tanto Gram + como -).
Por ej.: CALDO NUTRITIVO (lquido)
AGAR NUTRITIVO (slido)
Dentro de los medios generales, estn los ENRIQUECIDOS con alguna sustancia (sangre =
agar sangre).
MEDIOS DE MANTENIMIENTO Y CONSERVACIN.
Son los medios utilizados cuando se quiere conservar una colonia durante un espacio mayor de
tiempo.
Los medios se envasan en tubos, que tienen menos superficie que las placas y evitan en parte la
desecacin del medio. Los grmenes son sembrados en profundidad, lejos del oxgeno ambiental, en
medio slido, que evite la difusin de metabolitos txicos, y colocados los tubos en la nevera, a
temperaturas bajas para evitar al mximo su crecimiento y desarrollo.
Por ej.:
AGAR NUTRITIVO.
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO.
Son medios lquidos empleados para favorecer el crecimiento y desarrollo de una determinada
especie bacteriana. Se utilizan cuando la bacteria que se quiere investigar se encuentra en pequeo
nmero en comparacin con la carga bacteriana de la muestra. Se utilizan como medios de
revitalizacin, y de ah se pasa ya a los medios de aislamiento. Por ej.:
AGUA DE PEPTONA (Enriquecimiento gral).
EE DE MOSSEL (Enterobacterias).
CALDO SELENITO (Salmonella).
GIOLITTI CANTONI (Estafilococos).
CALDO LACTOSADO (coliformes).
ROTHE (Estreptococos).
MLLER-KAUFFMANN (Salmonella).
MEDIOS DE AISLAMIENTO.
Se emplean para el aislamiento de bacterias. Son medios slidos. Pueden ser de aislamiento
general o selectivo de un microorganismo o grupo de microorganismos determinados.
En los medios selectivos se incorporan sustancias inhibidoras del desarrollo de un grupo de
bacterias, pero permiten en cambio, el crecimiento de otras.
Medios de aislamiento general.- Se utilizan para recuento bacteriano. Por ej.:
PLATE COUNT AGAR
AGAR NUTRITIVO
Medios de aislamiento selectivo.- Por ej.:
SS (Salmonella-Shigella).
LEVINE (Escherichia coli).
XLD (xilosa-lisina-descarboxilasa)(Shigella).
BAIRD-PARKER (Estafilococos).
HEKTOEN (Shigella).
SABOURAUD (Hongos y levaduras).
AGAR VERDE BRILLANTE (Salmonella).
SPS (Clostridium).
MAC CONKEY ( Enterobacterias).

MEDIOS DE DIFERENCIACIN E IDENTIFICACIN.
Los medios de identificacin son de varios tipos, y comprenden medios lquidos, slidos y
semislidos. Se caracterizan por poseer en su composicin alguna/s sustancia/s (indicadores de pH,
fuentes nutritivas, etc) que ponen de manifiesto los caracteres bioqumicos o enzimticos de las
bacterias, y as poderlas identificar o diferenciar. Por ej.:
CALDO LACTOSADO (Dif. de Coliformes).
CALDO EVA o LITSKY (Dif. de Enterococos).
KLIGLER (Ident. de Entrobacterias: Coliformes).
CITRATO DE SIMMONS (Ident. de Enterobacterias).
DNasa (Ident. de Estafilococos).
VRBG - VRBA (Dif. de Enterobacterias).
MEDIOS DE TRANSPORTE
Su finalidad es el transporte de las bacterias sin multiplicarse, pues no tienen nutrientes, y los
otros componentes favorecen la estabilizacin del pH. Por ej:
COREY-BLAIR AMIES
STUART
MEDIOS DE CULTIVO MS IMPORTANTES

1.- AGAR NUTRITIVO: es un medio para fines generales:
- cultivar la mayora de microorganismos poco exigentes.
- efectuar recuentos de colonias.
- transporte de cepas.
- aislar microorganismos en cultivos puros.
2.- AGAR SANGRE: es un medio general enriquecido, generalmente con sangre de carnero
desfibrinada. En su preparacin la sangre se debe introducir tras la esterilizacin del medio y una vez
enfriado, pero antes de que solidifique, para evitar que la sangre se hemolice.
Es de gran utilidad para la deteccin de estreptococos, gracias a la aparicin de hemlisis
alrededor de las colonias.
3.- AGAR CHOCOLATE: es un medio general enriquecido.
Su composicin es similar a la anterior, salvo que la sangre se aade al medio antes de
esterilizarlo, producindose hemlisis. Es de gran utilidad para detectar cocos Gram - y Haemofilus.
4.- AGAR MAC-CONKEY: es un medio de cultivo diferencial:
-
fomenta el desarrollo de las enterobacterias (Gram -).
Inhibe el desarrollo de bacterias Gram + gracias a la presencia de sales biliares.
Segn las bacterias sean capaces de fermentar la lactosa, las colonias adquirirn una coloracin
rojo-rosado o colonias blancas, transparentes o negras si no son fermentadas.
Es muy importante que la superficie del medio est completamente seca cuando se inocule.
5.- CALDO DE SELENITO: es un medio lquido de enriquecimiento.
Se utiliza para el cultivo de salmonella en muestras de heces, orina y aguas cloacales.
Normalmente tras la incubacin durante unas horas en este medio se pasa a una placa SS.
6.- AGAR SALMONELLA-SHIGELA o SS: es un medio altamente selectivo, especialmente
adaptado para el aislamiento de salmonella o shigela, las cuales forman colonias opacas o traslucidas
incoloras que generalmente son lisas.
Inhiben la formacin de colonias de tipo contaminante, pero no las destruye. Se recomienda
utilizar paralelamente enriquecimiento en selenito.
7.- MEDIO DE CHAPMAN: es un medio de aislamiento especfico de Estafilococos patgenos. Se
recomienda la incubacin durante 36 horas a 37C.
-
Los estafilococos patgenos producen colonias con zonas amarillas.
Los no patgenos producen colonias pequeas con zonas rojas o prpura a su alrededor.
8.- MEDIO DE MULLER HINTON: se utiliza para determinar la susceptibilidad de los

microorganismos (antibiograma), debido a sus posibilidades de reproduccin.
Se recomienda la adicin del 5% de sangre para comprobar la sensibilidad de organismos
exigentes que necesitan enriquecimiento o para la determinacin de reacciones hemolticas.
9.- MEDIO DE KLIGER: se utiliza para la identificacin de enterobacterias: E. Coli, Salmonella,
Shigela.
Este medio de cultivo siempre se coloca en tubo en pico de flauta o agar inclinado y la siembra
se realiza en picadura en la parte profunda y en estra en la superficie.
En este medio se valoran 4 caractersticas de los microorganismos:
-
utilizacin de la glucosa.
produccin de gas
"
"
" " lactosa
de cido sulfdrico (SH2).
Segn los cambios de color y la aparicin de burbujas o gas podremos identificar las enterobacterias.
PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La preparacin de los medios bacteriolgicos ha sufrido un cambio espectacular debido a la
disponibilidad de medios comerciales deshidratados a punto para su utilizacin, con lo que se ahorra
tiempo y se disminuye la posibilidad de errores durante su preparacin.
An as, existen algunos factores que pueden alterar la calidad del medio de cultivo:
pesada incorrecta.
uso de medios alterados por la exposicin al calor y a la humedad.
incorrecta medida del agua.
uso del agua del grifo, etc.
El aspecto y la calidad del medio preparado depende con mucha frecuencia de la forma de
rehidratarlo y almacenarlo. Por ello es muy importante su correcta elaboracin.
FUNDAMENTO: crear un ambiente adecuado para el crecimiento del microorganismo.
MATERIAL:
-
matraces erlenmeyer
placas de petri
vasos de precipitado
tubos
mechero
algodn graso
autoclave
papel de aluminio o parafina
balanza
pipetas, medidores o dosificadores
pHmetro (opcional)
automticos.
REACTIVOS:
- ingredientes para medios de cultivo o medios de cultivo deshidratados
- agua destilada o desionizada
- NaOH y ClH para ajustar el pH (si el medio es deshidratado no es necesario)
PREPARACIN.
Los medios que ms se utilizan actualmente son los medios deshidratados. En la etiqueta de
todos los frascos se incluyen las instrucciones para reconstituir los medios deshidratados.
Para una buena preparacin de los medios de cultivo es fundamental el empleo de instrumental
de vidrio y equipo limpio, exentos de sustancias detergentes.
La homogeneidad de la suspencin debe ser total y la exposicin al calor, si es precisa, ser
mnima.
PESADA: Tras calcular la cantidad de medio reconstituido que se va a utilizar, segn la etiqueta
del mismo, determinaremos la cantidad necesaria de medio deshidratado. Pesar y reservar.
HIDRATACIN: aadirle la cantidad adecuada de agua destilada o desionizada.

-
Para la preparacin del medio, se debe utilizar un matraz Erlenmeyer lo suficientemente

grande (2-3 veces el volumen total a preparar) para que se pueda remover bien con el fin de
disolver el medio.
se calienta previamente el agua. (50-65C) (1/2 o 2/3 del agua necesario)
se aaden los ingredientes o el medio preparado.
se agita para homogeneizar la disolucin, manteniendo la exposicin al calor.

-
La aplicacin del calor debe ser directa y suave, con agitacin constante
Si el medio no contiene agar (lquido), se suelen disolver bien en agua precalentada,

no siendo necesario calentar despus, aunque necesitan de una agitacin vigorosa.
Todos los medios que contienen agar (slidos y semislidos), requieren calor hasta
100C aprox., para que ste pueda fundirse. Es muy conveniente que antes de iniciar
el calentamiento se deje reposar el agar en el agua precalentada durante 5-10 minutos.
Una prctica aconsejable es retirar el medio del fuego cuando ha empezado a hervir y
volverlo a calentar hasta hierva de nuevo (2 o 3 veces) con agitacin constante.
Este calentamiento no debe hacerse nunca con una llama directa, para evitar quemar
el medio, y adems se agita a intervalos frecuentes, por el mismo motivo, hasta que el
agar se haya fundido (que no se vean copos en las paredes del matraz).
Hay que vigilar con frecuencia durante el calentamiento, porque el medio puede
hervir repentinamente y salirse del recipiente.
Con el resto del agua se lavan las paredes del recipiente y se continua agitando y
calentando si es preciso
ENFRIAR o ATEMPERAR
AJUSTAR EL PH: es imprescindible cuando se parte de los ingredientes por separado. En

los medios deshidratados, excepto en circunstancias especiales, no es necesario ajustar el
pH. Si fuese necesario, se hara con Carbonato sdico 1N, cido fosfrico 0,01% NaOH o
ClH. El pH se comprobar con el phmetro o papel indicador.
Isabel Rita Gutirrez Vega
UT 2: Tcnicas microbiolgicas bsicas
DISTRIBUCIN.
Depende del tipo de medio y de su finalidad. Si es posible, la distribucin se har en los
recipientes definitivos para realizar los cultivos; en su defecto en otros que permitan un buen
proceso de esterilizacin.
Medios en tubo: Con una pipeta de boca ancha o dosificador se deposita en cada tubo la
cantidad de medio correspondiente (de 10 a 20 ml segn la capacidad del tubo). Se tapa con
una torunda de algodn graso que se cubre, a su vez, con papel de aluminio, de filtro o
parafina, y se lleva a esterilizar. Tambin se pueden usar tubos con tapones de rosca.
Para detectar la produccin de gas de las bacterias, se puede colocar en el interior del tubo
el llamado tubo o campana de Durham.
Medios en placa: el medio de cultivo estar en un matraz erlenmeyer (no ocupar mas de
2/3 de la capacidad del matraz, pues la ebullicin en el autoclave, puede hacer que rebose).
Antes de esterilizarlo se tapa de igual forma que los tubos. Tras la esterilizacin y
ligeramente fro, se pasar a las placas.
ESTERILIZACIN
Generalmente se lleva a cabo en la autoclave:
-
volmenes de hasta 250 ml durante 15' a 1,2 atm (121C).
volmenes superiores a 250 ml se debe prolongar el tiempo de esterilizacin en

unos minutos.
Tener en cuenta no cargar demasiado el autoclave, para que pueda fluir libremente el
vapor.
Algunos medios de cultivo con ingredientes termolbiles se esterilizan por vapor fluente
o tindalizacin.
VERTIDO EN PLACAS
Tras la esterilizacin del medio se homogeneiza, movindolo en sentido rotatorio.
El vertido de las placas se debe realizar cuando el medio se encuentre en una temperatura
prxima a la gelificacin (45 - 55 C) (se puede mantener la mano sobre el recipiente).
Para el llenado, se utilizarn pipetas estriles o un dosificador, o vertiendo directamente el
medio en la placa. Durante este procedimiento, extremar la tcnica para mantener la esterilidad
del medio y de la placa, para ello:
-
trabajar cerca del radio asptico de accin de la llama del mechero (10 - 15 cm).
tras quitar el algodn graso que tapa el matraz, pasar la boquilla de ste por la
llama.
no abrir totalmente la placa de petri, solo lo imprescindible.
sera ideal usar mascarilla.
15
ENFRIAMIENTO
-
Medios lquidos: tal y como se extraen del autoclave se dejan enfriar a temperatura
ambiente.
Medios slidos:
* Tubos: se dejan solidificar a temperatura ambiente en :
- posicin vertical: agar horizontal
- posicin inclinada: agar inclinado o en flauta o en bisel.
* Placas: asegurarse de que no hay burbujas mediante movimientos rotatorios
de la placa. Solidificar en una superficie horizontal.
Cuando estn a una t inferior a 45C colocar las placas invertidas, para evitar
que las gotas de humedad por condensacin caigan sobre el medio,
favoreciendo su contaminacin.
16
CONSERVACIN Y CONDICIONES DE USO DE INGREDIENTES Y MEDIO

- Ingredientes o medios de cultivo deshidratados:
* recipientes cerrados, protegidos de la luz y humedad.
* deben desecharse si apelotonan.
* algunos deben guardarse en la nevera.
* control de la fecha de caducidad.
- Medios hidratados y esterilizados:
* tiempo limitado de conservacin: en nevera a 4C, de 4 a 6 semanas
a t ambiente, de 1 a 2 semanas.
* no mantenerlos a t inferior a 0C, ya que altera la estructura del gel.
* protegerlos de la luz.
* tubos o recipientes hermticos (mejor tapn de rosca que torundas de algodn).
* si no se va a usar inmediatamente, dejar el medio destinado a distribuir en placas, en
el recipiente inicial. Se aconseja refundir al bao mara o en autoclave a vapor fluente
durante 30', nunca aplicar calor directo.
* si el medio se coloca en las placas tener en cuenta:
- refrigeracin inmediata, con precinto adhesivo en la placa.
- colocar boca a bajo (las gotas de condensacin lo contaminan).
* si los medios estn refrigerados, cuando se vayan a emplear, atemperarlos
previamente (en estufa o a t ambiente), ya que la condensacin de humedad
ambiental retrasa el crecimiento bacteriano.
CAUSAS DE ERROR EN LA PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
En la preparacin de medios de cultivo bacteriano a partir de materiales deshidratados,
participan una serie de variables. Si no se controlan rgidamente, es probable, que el producto
final no de resultados satisfactorios. Algunos de los casos son:
-
Pesada incorrecta del material seco por error humano o defectos en la balanza.
Utilizacin del material seco obtenido de botes abiertos previamente, y que pueden
estar deteriorados por exposicin a la humedad, calor, oxidacin, etc.
Medicin incorrecta del agua o utilizacin de agua no destilada o desionizada.
Empleo de recipientes no adecuados: metlicos no inoxidables, sucios, etc.
Disolucin incompleta, con lo que el medio ser de consistencia no homognea y

que por unas partes est mas rgido que por otras.
Calentamiento excesivo durante la esterilizacin y preparacin, o por haberse

mantenido demasiado tiempo en estado de fusin, con lo que puede deshidratarse el
medio, disminuir el pH, formar precipitados, etc.
17
Determinacin incorrecta del pH, con lo que se produce la adicin incorrecta de

cido o base. Este error se puede producir por hacer la determinacin del pH con el
medio de cultivo muy caliente.
Adicin de sustancias enriquecedoras (sangre) en condiciones incorrectas

(contaminada).
Fallos derivados de un deficiente control de calidad del laboratorio.
ELIMINACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Cualquier medio de cultivo, sobre todo si se ha sembrado, es un posible foco de
contaminacin por lo que se debe descontaminar tras su utilizacin.
Se puede realizar mediante:
-
Inundacin con una solucin desinfectante: dejarlo actuar como mnimo durante 6
horas (se recomienda de 12 a 24 horas).
Esterilizacin en autoclave.
Incineracin: se utiliza para microorganismos muy patgenos.
D) PREPARACIN DE LA MUESTRA
Debido a la carga microbiana que generalmente tienen los alimentos, es necesario hacer
diluciones de la muestra con objeto de poder obtener, en los medios de cultivo, colonias
perfectamente diferenciadas; de esta forma, podemos estudiarlas, contarlas y llegar al
aislamiento e identificacin de los grmenes existentes.
1. Tomar la muestra en condiciones aspticas. Para ello se pueden emplear cubiertos y botes
previamente esterilizados. Si transcurre un tiempo entre la toma de muestra y el anlisis, se
mantendr la muestra en refrigeracin.
2. Homogeneizacin del alimento. Emplearemos un homogeneizador comercial de paletas
para que la distribucin de los microorganismos en el medio sea homognea (Stomacher).
Se pesan 10g del alimento en una bolsa de plstico estril (especial para el homogeneizador)
y se aaden 90 ml de caldo de peptona estril (= 25 g muestra + 225 ml diluyente). El
triturado de la muestra se realiza al menos durante 2 minutos, aunque el tiempo depende de
la consistencia del alimento.
3. Realizar una serie de diluciones decimales seriadas:
a) Mezclar bien el total de la muestra. Tener en cuenta que al aadir 90 ml de caldo de
peptona a los 10 g de muestra, se est realizando la primera dilucin decimal (los
10g de la muestra van a implicar aproximadamente 10 ml de volumen). dilucin
1/10
b) Preparar varios tubos con 9 ml de diluyente estril (caldo de peptona)
18
c) Tomar 1 ml de muestra con una pipeta esteril y aadirlo al primer tubo dilucin
1/100
d) Con otra pipeta estril se toma 1 ml de la dilucin anterior y se aade al 2 tubo
1/1000
e) Repetir el procedimiento hasta obtener la dilucin deseada: 1/10000, 1/100000,
1/1000000.
19
E) TCN DE INOCULACIN-AISLAMIENTO
TCNICAS DE SIEMBRA
Siembra es la operacin mediante la cual un microorganismo se deposita en un medio de
cultivo para su crecimiento.
Los objetivos de la siembra pueden ser:
-
aislamiento de microorganismos.
recuento.
obtencin de masa microbiana.
identificacin.
mantener la viabilidad y vitabilidad de los microorganismos (resiembra).
Dependiendo de los objetivos se utilizarn distintas tcnicas o mtodos de siembra.

MANIPULACIN DE LAS MUESTRAS Y MATERIAL DE MICROBIOLOGA
En todas las tcnicas de siembra se debe realizar una correcta manipulacin, tanto de las
muestras como del material, para evitar la contaminacin del cultivo por otros
microorganismos.
Se seguirn las siguientes normas:
-
Trabajar en el radio de la llama del mechero (10 - 15 cm).
Todo el material ser estril.
El asa se flamear perpendicularmente a la llama del mechero, hasta el rojo vivo en

toda su longitud.
Antes de usarla debe enfriarse, pues esterilizara la muestra recogida.
En las pipetas se flamear la punta y siempre estar dirigida hacia abajo.
Los recipientes siempre estarn tapados; al abrirlos se har oblicuamente dirigiendo

su apertura hacia la llama y flameando la boca al quitar y poner el tapn.
Las placas de petri se manipularn semiabiertas y la abertura siempre orientada

hacia la llama. Otra forma sera mantener la placa orientada oblicuamente hacia la
llama y la tapa sobre la mesa orientada hacia abajo.
Al sembrar tener cuidado, pues el agar se puede romper fcilmente.
20
PREPARACIN DEL INCULO (Sustancia que se inocula)

Cuando las muestras son muy viscosas o concentradas, y para tcnicas en las que se
pretende el aislamiento, es necesario preparar el inculo de siembra para obtener resultados
fiables.
Se obtiene a partir de un cultivo joven y puro o de un producto patolgico.
Se toma con un asa estril varias colonias de un cultivo o una porcin de la muestra
biolgica y se suspende en unos 5 ml de solucin diluyente, tras lo cual se homogeneiza.
Como solucin diluyente se puede usar:
- caldo de cultivo
- solucin salina estril
- agua destilada estril.
MTODOS DE SIEMBRA
Siembra en estra o zig-zag
Siembra en estra mltiple
Por agotamiento
Tcnica de los cuatro cuadrantes
Aislamiento
Tcnica de los tres giros

Mtodo A
Por dilucin
Mtodo B: inoculacin previa vertido en placa

Dilucin en masa
Inoculacin previo vertido en placa
Tcnica de Kirby-Bauer
Recuento o
siembras
Tcnica de Barry
En placa
cuantitativas
Inoculacin sobre la superficie

del medio solidificado
Tcnica de inundacin
Tcnica de estra
En tubo
Mtodos indirectos
Medida de turbidez
Siembra por estra en superficie inclinada

Otras tcnicas
de siembra
En tubo
Siembra en picadura
Siembra en medio lquido
21
TCNICAS DE AISLAMIENTO
Se realizan en placas y su finalidad es la obtencin de cepas puras.
Para poder llegar a la identificacin de una bacteria es preciso separarla de otras que
puedan coexistir con ellas, para lo cual se realizan siembras de aislamiento, es decir, depositar el
inculo o muestra en un medio apropiado para su desarrollo.
Al sembrar una bacteria en un medio slido aparecen colonias admitindose que cada
colonia proviene de una sola bacteria. De este modo, una colonia puede ser resembrada en otro
medio, obtenindose un cultivo puro, siendo muy importante que la muestra llegue sin
contaminacin al medio.
1.- AISLAMIENTO POR AGOTAMIENTO
1.a.- Siembra en estria o en zig zag
-
Se deposita el inculo en el extremo superior de la

placa.
Se siembra con el asa, a partir del inculo, con un

movimiento de zig - zag cada vez mas amplio (en la
lnea media de la placa alcanza su mxima longitud).
Para ello el asa debe contactar suavemente con la
superficie del medio, no debiendo realizarse una
presin excesiva, pues se agrietara.
La siembra se efecta (sin levantar el asa ni flamearla) hasta la zona distal del
comienzo, donde se obtendrn colonias aisladas.
1.b.- Siembra en estra mltiple

-
Se deposita el inculo en el extremo superior de la placa.
Con el asa se reparte en varios tramos, siguiendo el borde de la placa. Entre cada tramo
se debe flamear el asa.
Los segmentos seguidos describen un poliedro regular; el ltimo tramo se efecta haca
el interior en el que se obtendrn las colonias aisladas.
22
1.c.- Tcnica de los cuatro cuadrantes

-
Se divide la placa en cuatro cuadrantes.
Se deposita el inculo en el extremo superior de uno

de los cuadrantes y se siembra en estra. (Este
cuadrante se corresponder con el n 1).
Sin flamear el asa, se realiza la misma operacin

sucesivamente en los otros 3 cuadrantes. - En cada
uno de ellos se sembrar el inculo que queda
adherido al asa tras la siembra del anterior.
En el ltimo de los cuadrantes se encontrarn las colonias aisladas.
1.d.- Tcnica de los tres giros

-
Se siembra en estra la mitad de la placa.
Flamear el asa.
Se gira la placa 90 y se siembra en estra la mitad superior de la misma.
Se repite las operaciones anteriores (siembra, flameo y giro).
Las colonias aisladas aparecern en la zona sembrada en ltimo lugar.
23
2. AISLAMIENTO POR DILUCIN

Esta tcnica se puede utilizar tanto para recuentos como para aislamiento de colonias. El
material que contiene las bacterias se diluye seriadamente. Se pueden utilizar varios mtodos:
2.a.- Mtodo A:
-
En varios tubos disponemos de 9 ml de

caldo nutritivo o agua bidestilada estril.
Se toma 1 ml de la muestra, que se diluir en

el primer tubo, obtenindose la dilucin 1/10
Tras homogeneizar el tubo anterior, se

tomar 1 ml, que se deposita en el 2 tubo,
obtenindose la dilucin 1/100.
Este proceso se realizar tantas veces se

desee, obtenindose diluciones 1/1.000,
1/10.000.
De cada dilucin cogemos con pipetas estriles y distintas 0,1 ml, sembrndolo sobre
las placas con agar, por la tcnica de inundacin.
En la ltima placa obtenemos colonias aisladas.
2.b.- Mtodo B: Inoculacin previa al vertido en placa

-
Disponer tres tubos de medio de cultivo fundido a 45 - 50C, previamente marcados con
los numeros 1, 2 y 3.
Tomar con el asa o con una pipeta, previamente esterilizadas, la muestra y sembrar en el
tubo n 1.
Homogeneizar por rotacin entre las palmas de las manos y tomar un asa del mismo
resembrndolo al tubo n 2. Dejar el primer tubo en el bao a 45C.
Homogeneizar el tubo 2, tomar un asa y pasarla al 3. Dejar los dos tubos en el bao.
Verter el contenido de cada uno de los tubos, homogeneizados de nuevo, en tres placas
estriles marcadas con los nmeros 1, 2 y 3. Esperar a que solidifique el medio.
En la placa 3 se obtendrn colonias aisladas.
Si se utiliza para recuento, debemos saber el calibre del asa.
24
Tcnica de dilucin en masa

-
En una placa de Petri vaca se deposita un pequeo volumen conocido de muestra y a

continuacin se aade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado
aproximadamente a 45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de la placa. De esta forma
los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio de cultivo,
permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.
Otra variacin de esta tcnica consiste en inocular el medio de cultivo, fundido y

atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de la muestra. La
homogeneizacin de la muestra y el medio de cultivo se realiza por rotacin del tubo entre
las manos, antes de verterlo sobre la placa.
En ambos casos, tras la homogeneizacin, se dejan enfriar las placas hasta que se solidifique
el medio y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posicin
invertida).
Aunque con esta tcnica se obtienen colonias aisladas, generalmente slo se utiliza para
determinar el nmero de microorganismos viables en una muestra, cuando stos son
anaerobios facultativos o microaerfilos.
25
TCNICAS DE RECUENTO O SIEMBRAS CUANTITATIVAS

En este tipo de siembra nos interesa disponer del microorganismo uniformemente
distribuido en el medio. Este procedimiento es til para el recuento de microorganismos. Se
utiliza para muestras de orina, cepillados alveolares, telescopaje, recuento de microorganismos
en alimentos, etc.
Se utiliza tambin para estudios de sensibilizacin a antibiticos.
1- RECUENTO EN PLACA
1.a.- inoculacin previa al vertido en placa: TCNICA DE BARRY
-
Se toman 0,1 ml del inculo en un tubo y se aaden 25 ml del medio de cultivo

fundido (temperatura no superior a 45 - 55C, para no esterilizar el inculo).
Homogeneizar por rotacin entre las palmas de las manos.
Verter en la placa de petri.
1.b.- inoculacin sobre la superficie del medio Solidificado:

TCNICA DE KIRBY-BAUER:
-
Preparado el inculo en un medio estril, se introduce un hisopo o escobilln estril

hasta que quede impregnado.
Se elimina el exceso del inculo presionando el hisopo, con un movimiento de rotacin,

contra la pared del tubo.
Se siembra la placa empleando la tcnica de los 3 giros, pero pasando 2 o 3 veces el

hisopo por toda la superficie antes de efectuar cada giro, para distribuir uniformemente
el inculo.
Se deja secar la placa durante 4 o 5 minutos en posicin semiabierta e invertida,

quedando lista para ser cultivada.
se emplea para estudios de sensibilidad o inoculacin directa del producto patolgico.

dibujo
26
TCNICA DE INUNDACIN:
-
Se aade a la placa 0,5 ml del inculo, inundando el medio con un movimiento de

rotacin, para distribuirlo por toda la superficie de la placa.
Antes de incubar, dejar secar 10 - 15 minutos a temperatura ambiente (la placa debe
estar tapada).
TCNICA DE ESTRA:
-
Flamear el asa.
Se deposita una gota de inculo o muestra en el centro de la placa, extendendola

haca la derecha e izquierda.
Diseminar el inculo en ngulo recto con respecto a la estra primaria, comenzando

del centro haca arriba.
se gira la placa 180 y se termina de diseminar la muestra en la otra mitad (del centro
haca arriba).
Este ltimo mtodo es el mas utilizado, sobre todo en orinas.

dibujo
2- EN TUBO: MTODOS INDIRECTOS.

Existen mtodos indirectos para el recuento de colonias, que si bien no miden
directamente el tamao de una poblacin, permiten obtenerlo por otra medida.
Entre ellos el ms utilizado es:
MEDIDA DE TURBIDEZ: las partculas en suspensin, al ser atravesadas por un rayo
de luz de una determinada longitud de onda, hacen que ese rayo sufra una difraccin. Cuantos
ms microorganismos se desarrollen, mayor turbidez tendr la suspensin y ser la difraccin.
27
C.- OTRAS TCNICAS DE SIEMBRA

SIEMBRA EN TUBO
1.a.- Siembra por estra en superficie inclinada
Se toma la muestra con el asa y se introduce en

el tubo que contiene el medio.
Deslizar el asa con movimientos de zig - zag

desde el fondo de la superficie y en progresin
ascendente.
Se
suele
usar
para
obtener
masa
de
microorganismos, renovar cepas (resiembra) y

pruebas bioqumicas.
1.b.- Siembra en picadura
Se siembra la muestra con la punta del hilo y se

punciona en el centro del medio (contenido en el
tubo) introduciendo la punta del hilo hasta 2 - 3
mm del fondo del tubo.
Se extrae el hilo por la misma por la misma lnea

que se introdujo.
Si se trata de medio inclinado, se puede realizar

tambin una siembra en estra por la superficie
del medio.
Cuando el agar es fluido, en lugar del hilo se puede utilizar el asa.
Se suele emplear para tcnicas de identificacin (hidrlisis de principios inmediatos, Kliger,

motilidad, etc).
1.c.- Siembra en tubo en medio lquido

Una manera sencilla de obtener bacterias es hacerlas crecer en un medio lquido, en un
tubo de ensayo.
Formas de manifestarse el crecimiento bacteriano en un medio lquido:
-
enturbiamiento: opacidad ms o menos densa.
formacin de velo: pequea masa de clulas que flotan en la parte superior del cultivo.
sedimento: deposito de clulas que permanece en la parte inferior del cultivo, pero que
se pone nuevamente en suspensin si el tubo se sacude sucesivamente.
Formas de realizar la siembra en medio lquido
28
- con asa: se sumerge el asa cargada en el medio y se agita.

- con pipeta: se vierte el contenido de la pipeta sobre el medio de cultivo y se
homogeneiza.
- con escobilln o hisopo: de igual modo que con el asa.
Tcnica:
-
Tomar dos tubos de caldo comn.
Rotular un tubo "control" y dejar sin

inocular.
Realizar la siembra en el otro tubo.
Incubar el tubo sembrado en la

estufa a la t y tiempo determinado.
Examinar el cultivo para determinar

el crecimiento. No agitar el tubo
antes
de
hacer
las
primeras
observaciones, para determinar si ha

habido enturbiamiento, formacin
de velo o sedimento.
NORMAS GENERALES TRAS LA SIEMBRA DE MUESTRAS BIOLGICAS
Inmediatamente hecha la siembra, tanto en tubo como en placa, deben taparse o cerrarse los
recipientes:
.- Los tubos se taparn con torundas de algodn graso, parafina o tapn hermtico.
.- Frascos y botellas con tapn de cierre hermtico.
.- Matraces: igual que los tubos.
.- Placas de petri, por su diseo quedan perfectamente cerradas.
Los distintos recipientes, para su cultivo se colocarn de la siguiente manera:

.- Tubos: en posicin vertical colocados en gradillas.
.- Frascos, botellas y matraces: apoyados en su propia base.
.- Placas de petri: salvo raras excepciones (cultivo de hongos) se colocaran de forma
invertida.
29
CULTIVO O INCUBACIN DEL MEDIO

Tras la siembra de un medio de cultivo, este debe ser colocado en un ambiente
adecuado para el desarrollo de los microorganismos.
Los FACTORES que afectan al cultivo de microorganismos son:
1. Temperatura: generalmente se incuban a la t fisiolgica (35 - 37C), aunque determinados
microorganismos pueden requerir otra temperatura (psicotrofos: 22 C; coliformes fecales:
44C). Dichas temperaturas se consiguen en las estufas de cultivo que pueden ser:
2. Atmsfera: segn sea aerobio, anaerobio o anaerobio facultativo. La anaerobiosis se
consigue a travs de:
-
Jarras de anaerobios: en las que se produce en su interior una reaccin qumica

que genera CO2. Constan de un sobre generador de H y CO2, un indicador de
anaerobiosis y un catalizador.
Cabinas de anaerobios: es una cmara que lleva incorporados unos guantes de

plstico para manipular el material que se encuentra en el interior. El ambiente
se mantiene anaerbico mediante un catalizador (paladio e hidrgeno).
3. Proteccin ambiental: el microorganismo durante su incubacin debe estar protegido de

agresiones externas y posibles contaminaciones, para garantizar los resultados.
El control de estos factores se puede llevar a cabo mediante estufas de cultivo.
-
Estufas convencionales: en las que se incuban medios de cultivo con

microorganismos aerobios y anaerobios facultativos. Controlan la t y la proteccin
ambiental.
Estufas o incubadoras de CO2: son aquellas que adems controlan el contenido de

CO2 y se utilizan en el cultivo de anaerobios.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

Para cultivar estas bacterias es necesario recurrir a distintos procedimientos para eliminar
el oxgeno o bien destruir el perxido de hidrgeno formado. Para ello existen distintos
mtodos:
1) Mtodos fsicos:
a- Ebullicin: Se persigue eliminar el oxgeno haciendo hervir el tubo de ensayo con medio de
cultivo a bao Mara durante 20 minutos y enfrindolo bruscamente. Para evitar que el oxgeno
vuelva a incorporarse, se sellan los tubos con una sustancia inerte, como la mezcla vaspar,
(vaselina y parafina en partes iguales).
30
b- Eliminacin del aire con bomba de vaco: Para esto se utilizan tubos especiales:
Tubo Roux: Se realiza la siembra en estos dispositivos,

cargado con medio de cultivo. Se cierra a la llama el tubo a
la altura del estrangulamiento y por la rama lateral se hace
el vaco con una bomba, y se cierra tambin a la llama la
rama lateral (Fig.a).
Tubo Fraenkel: Una vez sembrada la muestra dentro del

tubo, se hace pasar un gas inerte (nitrgeno, hidrgeno)
por la rama A, que burbujear en el medio y efectuar un lavado; la mezcla de hidrgeno y
oxgeno saldr por B, quedando al final una atmsfera de hidrgeno solamente. Ambas
ramas se cierran a la llama, luego se coloca en estufa de incubacin (Fig.b).
2) Mtodos qumicos:
Hay ciertas sustancias qumicas que tienen propiedades
reductoras, pero no pueden ser incorporadas al medio de cultivo
debido a que son txicas para las bacterias.
El pirogalato de sodio o potasio es lo ms usado para este
fin, empleando tubos especiales o desecadores.
Se coloca el tubo de ensayo sembrado dentro de otro tubo
ms grande que contiene cido piroglico e hidrxido de sodio o potasio. Se cierra con tapn de
goma y se sella con vaspar.
Hay sustancias reductoras que por ser no txicas se las puede agregar directamente al
medio de cultivo, por ejemplo: glucosa 2%, sulfito de sodio 0,1% y formiato de sodio 0,5%.
3) Mtodos biolgicos:
a- Medio de Tarozzi: Es un medio de cultivo comn al que se le agrega trozos frescos de
rganos de animales (conejo, cobayo), ricos en catalasa (hgado, pulmn, cerebro).
b- Tejidos vegetales: Similar al caso anterior, se agregan tejidos vegetales ricos en catalasa, por
ejemplo: papa, zanahoria, granos de legumbres, etc.
c- Semillas: Colocando semillas de cereales en la base
de un desecador, estas actan como reductoras durante el
proceso germinativo, tomando el oxgeno del medio y
desprendiendo dixido de carbono, con lo cual se logra
el ambiente necesario para el desarrollo de los
microorganismos. En la parte superior del desecador se
colocan las cajas y tubos sembrados, se tapa y se coloca todo el dispositivo en estufa de cultivo.
31
4) Adems de los mtodos anteriormente descriptos (fsicos, qumicos y biolgicos), una forma
directa de realizar el aislamiento de anaerobios es mediante el uso de la Pipeta de Vignal, cuyo
procedimiento es el siguiente:
Al medio de cultivo agarificado se lo
mantiene licuado a 45C, se siembra la muestra y se
succiona con la pipeta, que tiene sinuosidades; una
vez rellenada toda la pipeta con la mezcla de medio
de cultivo y muestra microbiana, se cierran los
extremos a la llama y se coloca en estufa de cultivo.
Donde se observen colonias aisladas se procede a cortar la pipeta con una lima y con una aguja
se toma la colonia elegida para obtener el cultivo puro.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS MICROAEROBIOS:
a- Desecadores: Son dispositivos dentro de
los cuales van los tubos sembrados; se
realiza el vaco con una bomba y se inyecta
dixido de carbono hasta lograr una presin
parcial de oxgeno inferior a la normal.
Una variante prctica de este mtodo
es colocar una vela encendida dentro del
desecador o bajo una campana de vidrio,
cerrando hermticamente el dispositivo. La llama de la vela consume el oxgeno y libera
dixido de carbono, logrando de esta forma un ambiente de microaerobiosis.
b- Estufas especiales: Una vez colocadas las cajas y tubos sembrados, estas estufas permiten
modificar la composicin gaseosa interna, mediante el reemplazo de un gas por otro, brindando
de esta manera las condiciones microaerobias requeridas por los microorganismos en estudio.
c. Medios de cultivo semislidos: Son medios cuya concentracin de agar es de 0,5-0.8%, con
lo cual se logra una condicin de microaerobiosis para el desarrollo subsuperficial de los
microorganismos, tales los casos de algunos fijadores de nitrgeno como Azospirillum y
Acetobacter.
32
F) TCN DE RECUENTO
RECUENTO EN PLACA DE LAS COLONIAS
Para realizar dicho contaje se toman las placas que contengan de 30 a 300 colonias
aproximadamente y en un contador de colonias se procede al contaje; tambin se puede hacer
manualmente.
El recuento de las bacterias nos da idea del grado de contaminacin que hay en una
muestra.
Suponiendo que cada colonia procede de un solo microorganismo y que se han sembrado
con un asa calibrada (con un volumen determinado), el n total de grmenes ser el resultado de
multiplicar el n de colonias por el volumen del asa calibrada.
Ejem:
Contamos 50 colonias y han sido sembradas con un asa de 1/100 (volumen=0,01 ml)
en un volumen de 0,01 ml-------------crecen 50 colonias
" "
"
1 ml -----------
"
"
X = 5.000 colonias/ ml muestra

Si la siembra se ha hecho por dilucin, el recuento ser:
Ejem: si la dilucin es de 10-2 y el n de colonias es de 50 en 0,1 ml del medio, el n de
microorganismos ser:
10-2 = 1/100
si en una dilucin 10-2 ---------------50 colonias
"
"
"
-------------
X = 5.000 colonias en 0,1 ml

si en 0,1 ml --------------- 5.000 colonias
"
1 ml ---------------
X = 50.000 colonias/ ml muestra
CALCULO DEL NMERO MS PROBABLE

Se trata de una prueba presuntiva (se presupone que es un determinado microorganismo
porque tiene una determinada reaccin positiva), por la cual se obtiene el nmero aproximado
de bacterias que haba en la muestra. Para ello:
1. Se preparan 3 series de 3 tubos con medio de cultivo
2. Se realizan 3 diluciones seriadas de la muestra: 1/10, 1/100, 1/1000.
33
3. Se realizan las siembras:

a. se siembran los 3 tubos de la primera serie con 1 ml de la muestra 1/10
b. se siembran los 3 tubos de la segunda serie con 1 ml de la muestra 1/100
c. se siembran los 3 tubos de la tercera serie con 1 ml de la muestra 1/1000
4. Se incuban las 3 series.
5. Se leen los resultados y se extrapolan a la siguiente tabla.
NMP de microorganismos por g o ml. Utilizando 3 tubos
sembrados c/u con 1 ml de diluciones 10-1, 10-2, 10-3
Nmero de tubos positivos
NMP/ g o ml
<3
11
14
15
20
21
28
23
39
64
43
75
120
93
150
210
240
460
1100
>2400
34
G) EL MICROSCOPIO
El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo.
Es el instrumento que ms se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos.
Mediante un sistema de lentes y fuentes de iluminacin se puede hacer visible un objeto
microscpico. Los microscopios pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamao
original.
Actualmente existen dos tipos de microscopios: el ptico y el electrnico. En el
microscopio ptico el aumento del objeto se consigue usando un sistema de lentes que manipula
el paso de los rayos de luz entre el objeto y los ojos. El microscopio electrnico utiliza un rayo
de electrones controlado por un campo magntico.
MICROSCOPIO OPTICO
Los microscopios pticos suelen producir un aumento de 1000 veces el tamao original.
Las lentes de un microscopio ptico son el condensador, el objetivo y el ocular:
La luz que entra en el sistema debe enfocarse sobre la preparacin y para esto se utiliza el
condensador. Elevando o bajando el condensador puede alterarse el plano del foco de luz y
as, puede elegirse una posicin que consiga el foco preciso.
El objetivo es la lente situada cerca del objeto que se observa. El aumento primario del
objeto es producido por la lente objetivo y la imagen se transmite al ocular, donde se realiza
el aumento final.
Los microscopios que se usan normalmente en microbiologa estn equipados con tres
objetivos: bajo poder, alto poder y objetivo de inmersin. Estos objetivos estn montados
sobre una pieza que se llama revolver que puede rotarse para alinear el objetivo deseado
con el condensador.
La imagen formada por el objetivo es finalmente aumentada por el ocular. El aumento total
de un microscopio compuesto es el producto del aumento de su objetivo y de su ocular.
El microscopio compuesto es capaz de conseguir aumentos considerablemente mayores
que el microscopio construido con una sola lente. Este ltimo, llamado microscopio simple, se
usa principalmente como lupas y cristales de aumento.
Adems del aumento, una propiedad importante de un microscopio es su poder
resolutivo; esto es la capacidad de mostrar distintos y separados dos puntos muy cercanos.
Cuanto mayor sea el poder resolutivo, mayor ser la definicin de un objeto. Los microscopios
de gran poder resolutivo son especialmente buenos para ver pequeas estructuras.
El poder resolutivo de un microscopio compuesto depende de la longitud de onda
utilizada y de una propiedad ptica de la lente conocida como apertura numrica.
35
Como los microscopios pticos utilizan luz visible, la longitud de onda est fijada y es
por lo que la resolucin de un objeto es funcin de la apertura numrica; cuanto mayor sea la
apertura, el objeto resuelto ser ms pequeo.
Un factor que afecta a la apertura numrica, adems de la construccin de la lente, es el
medio a travs del cual pasa la luz. Mientras que el objetivo est separado del objeto por el aire,
su apertura numrica nunca ser mayor de 1,0; para conseguir aperturas numricas mayores que
sta, el objetivo debe estar inmerso en un lquido de mayor ndice de refraccin que el aire.
A estos lquidos se les denomina aceites de inmersin que se utilizan con los objetivos de
inmersin obteniendo una apertura numrica entre 1,2 y 1,4. An as, al utilizarse la luz visible
(longitud de onda) estos microscopios llegan a tener un poder de resolucin de
aproximadamente 0,25 m, lo que significa que las partculas con un tamao ms pequeo de
0,25 m no pueden distinguirse unas de otras.
PARTES DE UN MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO
Partes de un microscopio ptico

OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo.
OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta.
CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.
DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin.
CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, ..
REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los
objetivos.
36
TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que

consigue el enfoque correcto.
MANEJO DEL MICROSCOPIO PTICO

1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina
completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar
en esas condiciones.
2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas.
3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x
4. Para realizar el enfoque:
a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo
macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se
corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos
o ambos.
b. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la
preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el
micromtrico hasta obtener un enfoque fino.
5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente
con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se
perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir
la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin
y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se
descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una
preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin.
6. Empleo del objetivo de inmersin:
a. Bajar totalmente la platina.
b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la
zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite.
c. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el
de x40.
d. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz.
e. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin.
f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la
gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
g. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de
inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo
de accidente es muy grande.
37
h. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a
usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea
enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3.
i. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el
objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la
preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin
de observacin.
j. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica.
Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de
observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la
misma y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para
evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe
guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo.
3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente
con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica.
4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio.
5. Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el
objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable).
En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el
aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de
alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se
aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico,
platina, revlver y condensador).
7. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la
preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo
agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del
ocular.
8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido,
secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol.
9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y, al
acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos.
38
Tipos de microscopios pticos:
Microscopio de campo claro: usa una fuente de luz directa, bien una bombilla, o bien la
luz solar. Ya que los microorganismos son transparentes, es difcil distinguirlos con este
tipo de microscopa, por lo que se suelen teir.
Microscopio de campo oscuro: usa un microscopio ptico equipado con un condensador y

objetivo especial que iluminan los microorganismos en la muestra frente a un fondo oscuro.
Este mtodo se utiliza para visualizar microorganismos vivos sin teir.
Microscopio de fluorescencia: la muestra se tie con una sustancia fluorescente que

absorbe la energa de las ondas cortas de la luz (azul) y emite la luz de longitudes de ondas
ms largas (verde). En esta tcnica una sustancia fluorescente se une a un anticuerpo
especfico de ciertos microorganismos. Si el anticuerpo fluorescente se une al
microorganismo, este microorganismo emite fluorescencia y se puede identificar.
Microscopio de contraste de fases: es un microscopio ptico modificado que permite

contrastar sustancias de diferente grosor o densidad. Mediante un condensador y un
objetivo especial se controla la iluminacin de tal manera que vaya en diferentes rutas a
travs de las distintas partes de una clula. El resultado es una imagen con diferentes grados
de brillo y oscuridad. Con este mtodo, el material denso aparece brillante, mientras que las
partes de la clula que tienen una densidad cercana al H2O (citoplasma) aparecen oscuras.
Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad de usar colorantes o matar
microorganismos.
MICROSCOPIO ELECTRONICO
Los microscopios electrnicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les
permite tener un poder de resolucin muy elevado. Es posible con el microscopio electrnico
resolver objetos separados por una distancia de 0,003 m, y los aumentos pueden llegar a ser de
un milln de veces.
Microscopa Electrnica de Transmisin (MET).- A causa de la naturaleza de este
instrumento slo pueden examinarse objetos muy delgados; incluso una sola bacteria es
demasiado gruesa para ser observada directamente. Por lo que, para preparar muestras para el
microscopio electrnico se necesitan tcnicas especiales de cortes ultrafinos. Una sola clula
bacteriana puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas.
Microscopa Electrnica de Barrido (MEB).- Si slo tiene que observarse el contorno de un
organismo, no son necesarias secciones finas por lo que se montan clulas enteras que se
recubren de una capa fina de un metal pesado (oro). El rayo de electrones es dirigido sobre la
preparacin y los electrones dispersados por el metal pesado activan una pantalla de
observacin produciendo una imagen.
39
H) OBSERVACION DE LOS MICROORGANISMOS: TINCIONES

Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante
microscopios pticos, para que esta visualizacin sea ptima, deben cumplirse los siguientes
requisitos en cuanto a la preparacin de la muestra:
-
debe ser homognea.
si se usa colorante, la cantidad debe ser adecuada.
tcnica adecuada, en funcin al tipo de microorganismo a observar.
ausencia de elementos contaminantes, bien en la propia muestra o en los

instrumentos de manipulacin (asas, pipetas etc).
los portas en los que se haga la extensin y los cubres estarn escrupulosamente
limpios.
Hemos sealado anteriormente la necesidad del empleo de una tcnica adecuada en

funcin de lo que pretendamos estudiar, atendiendo a esto haremos una clasificacin global,
segn observemos grmenes vivos o muertos (sometidos a determinadas tinciones). Ambas
tcnicas tienen ventajas e inconvenientes, que veremos ms detalladamente.
A continuacin, vamos a describir las tcnicas ms comnmente usadas para realizar
preparaciones para microscopios pticos:
Mtodo de la cmara hmeda
Visualizacin
de grmenes in
vivo
Examen en fresco
Mtodo de la gota pendiente
Coloracin Vital
T. Simple
T. de Gram
T. Diferencial
T. AAR o de Ziehl-Neelsen
T. Negativa
Tinciones
bacterianas
T. Especiales
T. Fluorescente
T. de cpsulas
T. de esporas
T. Estructurales
T. de flagelos
T. de corpsculos metacromticos de Loffler
40
VISUALIZACIN DE GRMENES "IN VIVO"

Consiste en observar los microorganismos vivos a travs del microscopio con ayuda de
alguna sustancia que lo facilite, pero nunca interfiriendo. Dado que el microorganismo no est
muerto podemos observar su movilidad, morfologa y agrupamiento.
Ventajas:
-
apreciacin ms fiel de la realidad, de la morfologa, agrupacin y movilidad.
Desventajas:
-
poco contraste entre la muestra y el fondo, as como entre las estructuras del
germen.
manejo engorroso, pues es material vivo que puede contaminar.
imposibilidad de almacenamiento de la preparacin.
TCNICA PARA UNA BUENA OBSERVACIN DE LOS MICROORGANISMOS

1- Adecuada utilizacin del microscopio:
-
ideal verlos sobre fondo oscuro; en su defecto cerrar parcialmente el diafragma.
para facilitar el enfoque, comenzar localizando el porta.
comenzar con objetivos de menor aumento e ir aumentando hasta el de inmersin.
2- Crear un soporte adecuado para la visualizacin del microorganismo:

-
a la muestra se le suele aadir un lquido o medio de montaje, generalmente suero

fisiolgico.
si la muestra se encuentra en estado lquido, depositar una gota de sta sobre el

porta directamente.
3- Evitar la desecacin (pues morira el microorganismo), esto se consigue:

-
sellando la cmara que hay entre el porta y el cubre, con vaselina o parafina
reduciendo la intensidad de la luz.
TCNICAS DE VISUALIZACIN AL MICROSCOPIO

a) EXAMEN EN FRESCO
Objetivo: suspendiendo el microorganismo en un medio lquido transparente, es posible
observar al microscopio sus caractersticas morfolgicas, movilidad y disposicin.
a.1. MTODO DE LA CMARA HMEDA
Ventajas: - rapidez
- evita distorsiones pticas por el efecto lupa de los portas excavados.
Desventajas:- la de toda determinacin "in vivo": poco contraste
- la motilidad se observa con dificultad.
41
Material: mechero, porta, cubreobjetos, cultivo reciente, parafina lquida o vaselina y asa de
cultivo.
Tcnica:
-
Depositar en el centro del portaobjetos, perfectamente limpio y desengrasado, una

gota de agua estril o s. fisiolgico.
Tomar con el asa estril una muestra y realizar una suspensin con la gota de agua.
Si el medio es lquido, simplemente depositar una gota en el porta.
Colocar sobre la suspensin un cubreobjetos, evitando que se formen burbujas de

aire. Se puede sellar con vaselina o parafina para evitar la desecacin.
Observar al microscopio.
a.2.- MTODO DE LA GOTA PENDIENTE

Ventajas: - mejor observacin de la motilidad debido al mayor grosor de la muestra.
- menor facilidad para la desecacin.
Desventajas: - distorsin ptica.
- mtodo lento y engorroso.
Material: porta-excavado, cubreobjetos, cultivo reciente, parafina lquida o vaselina y asa de
cultivo.
Tcnica:
-
Limpiar escrupulosamente un porta excavado y un cubre.
Colocar en los bordes del cubre vaselina o un poco de agua.
Poner una gota de suspensin microbiolgica en el centro del cubre.
Tomar el porta y colocarlo en la excavacin justo encima de la gota, presionando para

que se unan.
Invertirlos, procurando que quede suspendida la gota dentro de la excavacin del porta,
sin que toque ningn borde, ya que se extendera.
Observar al microscopio con objetivo de 40x.
42
b) COLORACIN VITAL
Es un proceso intermedio entre el examen en fresco y las tcnicas de tincin.
Objetivo: contrastar algunas estructuras celulares con mayor intensidad y sin que se produzca la
muerte del microorganismo. Se puede observar tambin la movilidad.
Ventajas:
- ms contraste que los mtodos anteriores, lo que permite mejorar la visin

morfolgica, sin que se altere la motilidad y agrupacin.
Desventajas:
- es relativamente lento.
-
se
obtiene
mayor
informacin
morfolgica
con
una
tincin
de
microorganismos muertos.
Colorantes utilizados: no tien, sino que se acumulan en ciertas partes del germen. Se
caracterizan por ser muy poco
txicos, al estar muy diluidos (aunque siempre terminan
matando al germen).
Azul de metileno: en solucin acuosa, a una dilucin 1/500 o 1/1000.
Rojo neutro:
"
"
"
Verde Janus:
"
"
fisiolgica "
" "
"
1/1000.
"
1/500.
Tcnica:
-
limpiar perfectamente porta y cubre.
colocar una gota de suspensin en el centro del porta.
aadir una gota de colorante con un asa de siembra o una pipeta pasteur y mezclarla
bien ayudados del asa y la pipeta.
colocar el cubre, procurando que no se formen burbujas.
observar al microscopio con objetivo de inmersin.
Interpretacin: los microorganismos se observan coloreados de azul, rojo o verde (dependiendo

del colorante) en un medio acuoso del mismo color.
TINCIONES BACTERIANAS
En la mayora de las ocasiones, para la observacin de los microorganismos, estos son
teidos, ya que de esta forma son ms fciles de visualizar y se pueden poner de manifiesto
caractersticas diferenciales.
TEIR es contrastar ms un microorganismo y sus estructuras, mediante el empleo de un
colorante o varios que acten de forma combinada.
Objetivo:
-
hacer ms visibles las bacterias
distinguir las estructuras de los microorganismos por su comportamiento frente al

colorante.
43
Ventajas:
-
mayor claridad en la observacin de los microorganismos despus de ser

coloreados.
mayor contraste: se pueden demostrar mejor las diferencias entre clulas de

distintas especies e incluso de la misma.
material de ms fcil manipulacin (no contaminante)
Desventajas:
-
no se aprecia la morfologa del microorganismo vivo, ya que el colorante lo mata.
no se aprecia la movilidad.
TCNICA GENERAL DE TINCIN

La mayor parte de los mtodos de tincin constan de los siguientes pasos:
1.- Rotulacin: en un extremo del portaobjetos, para evitar errores.
2.- Extensin: sobre un portaobjetos, para obtener una pelcula lo mas homognea posible. Se
emplearn portaobjetos bien limpios, desengrasados y secos, desechando los rayados. La
extensin se realizar con:
o
un asa de siembra
un hisopo
canto esmerilado de un portaobjetos.
Si la muestra est en un medio lquido, depositar, con ayuda de un asa, una o varias
gotas sobre el porta.
Si la muestra o el microorganismo estn en un medio de cultivo slido, se pone

previamente en el porta una gota de agua destilada o solucin salina y se depositar una
colonia haciendo la extensin.
3- Desecacin: tiene como finalidad eliminar el agua de la extensin para proceder a la fijacin.
Se consigue dejando secar a t ambiente, en estufa o al calor suave de la llama.
4- Fijacin: consiste en la transformacin de la composicin fsico-qumica del
microorganismo, manteniendo la morfologa de sus estructuras lo ms parecido a lo que tena
"in vivo" (Por ej: coagula las protenas, evitando que se alteren en las distintas fases de tincin).
Se produce la muerte del microorganismo, quedando la extensin adherida al portaobjetos.
La fijacin se puede realizar por:
-
calor: se consigue pasando 2 o 3 veces el porta, con la extensin hacia arriba, por la
llama del mechero, ayudados por las pinzas de madera. Cuando el porta est lo
suficientemente caliente para no aguantarlo con la mano, la fijacin es completa.
inmersin en soluciones fijadoras: metanol, alcohol etlico-acetona,etc.
5- Tincin: en la que el microorganismo capta el colorante. Este se dejar actuar durante un

tiempo determinado. Puede ser de varios tipos:
44
Negativa: Los colorantes no tien el microorganismo, sino el entorno, aumentando

de este modo su contraste. La muestra se extiende sobre una gota del colorante
(nigrosina).
Simple: Se utiliza un solo colorante que puede ser de cualquier tipo. Al igual que la
tincin negativa, slo nos permite observar la forma, el tamao y el tipo de
agrupacin de las clulas.
Diferencial: Intervienen dos o ms colorantes y cada uno diferencia una estructura.

El colorante que se usa en segundo lugar es de color diferente al del primero,
denominndose colorante de contraste.
Los colorantes son sustancias orgnicas capaces de teir estructuras cuando se ponen en
contacto con ellas.
En ocasiones, los colorantes necesitan el concurso de mordientes, que son sustancias no
colorantes que refuerzan la accin de un colorante mediante el ataque a componentes celulares
que facilitan la accin de ste (lugol, fenol, etc.). Los mordientes pueden ir incorporados o no a
la solucin del colorante.
6- Lavado: con agua destilada, para eliminar el exceso de colorante. El lavado se realizar entre
todos los pasos. El agua se vierte en el extremo del porta, nunca encima de la preparacin.
7- Secado: con lo que mejora la visualizacin al microscopio. Se har al aire o presionando
entre dos papeles de filtro.
8- Decoloracin: a veces es interesante que determinadas bacterias pierdan el color que
tomaron, lo que permite diferenciarlas de las que no lo pierden. No se debe forzar la
decoloracin, ya que pueden perder el color todas las bacterias.
9- Observacin al microscopio: empezando con objetivo de poco aumento para ver si la
muestra est bien distribuida, suficientemente concentrada y si la morfologa es buena. La
presencia de artefactos, como restos de colorante, polvo, hilos, etc, distorsionan la preparacin y
pueden estropearla.
FACTORES QUE INFLUYEN EL LA TINCIN
-
Pureza de colorantes y reactivos: deben ser lo mas puros posibles.
Concentracin del colorante: oscila entre 0,2 y 2 %, pudiendo variar.
pH de la solucin del colorante: los colorantes se dividen en:

bsicos
cidos
anfteros o neutros
azul de metileno
fucsina fenicada
safranina
cristal violeta
Rojo congo
Eosina
Nigrosina
Sudn negro
45
Temperatura: en general, temperaturas superiores a la ambiental, disminuyen el tiempo de

tincin.
Sustancias adicionales: como sustancias tampones, decolorantes, etc.
Tiempo de tincin: dependen del colorante, tcnica de tincin, especie a teir, etc. Suele
oscilar entre 1 y 10 minutos.
TIPOS DE TINCIONES Segn la tcnica aplicada, las tinciones se clasifican en:

1. Tincin simple: el teido de los microorganismos se har aplicando exclusivamente una
solucin colorante. Nos proporciona informacin sobre la forma, agrupamiento y cantidad
de grmenes.
2. Tincin diferencial: se utilizan dos colorantes de modo, que los grmenes queden teidos
con uno u otro, dependiendo del tipo que se trate. Pone de manifiesto las diferencias
existentes entre las distintas clulas bacterianas o entre las distintas partes de la misma
clula. Dentro de este tipo estn:
- Tincin de Gram
- Tincin cido alcohol resistente o de Ziehl- Neelsen.
3. Tinciones especiales:
- Tincin negativa
- Tincin fluorescente.
4- Tinciones estructurales: el colorante pone de manifiesto determinadas estructuras presentes
slo en algunos grmenes:
-
Tincin de cpsulas
"
"
" Esporas
" Flagelos
Tincin de corpsculos metacromticos de Loffler
TINCIN SIMPLE:
Objetivo: observar la morfologa, asociacin y la cantidad de microorganismos mediante el uso
de un colorante. Se basa en la afinidad de ste, por los distintos componentes celulares, que
pueden ser de mayor o menor intensidad producindose un contraste diferenciador de las
estructuras celulares.
Colorantes ms utilizados son: (1) Azul de metileno, (2) Violeta de Genciana, (3) Fucsina
Tcnica:
-
Rotular los datos oportunos
Coloracin durante 1 o 2 minutos.
Extender la muestra
Lavar
Secar
Dejar secar la preparacin
Fijar
Observar al microscopio
46
Resultados e interpretacin:
o
si el colorante utilizado es azul de metileno o violeta de genciana, los

microorganismos aparecen teidos de azul.
Si es fucsina aparecern teidos de rojo.
TINCIONES DIFERENCIALES
TINCIN DE GRAM
Es la tcnica de tincin diferencial ms importante que se utiliza en bacterias. El primero
en describirla fue el dans Christian Gram.
Objetivo: es la clasificacin de los grmenes segn la captacin o no de los colorantes que
componen esta tincin.
Fundamento: los Gram + son aquellos que resisten la accin decolorante del disolvente alcohol
- acetona tras tratamiento con un colorante bsico y lugol. Los Gram - son decolorados, siendo
posteriormente teidos con un colorante de contraste como la fucsina diluida. Este hecho es
debido a la diferente composicin de la pared celular de ambos grupos de microorganismos.
Reactivos:
1er colorante: Violeta de Genciana o Cristal Violeta al 1%
Mordiente: Lugol (aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas)
Decolorante: Alcohol-Acetona 1:1
Colorante de contraste: Fuchsina diluida o Safranina al 0,5%
Tcnica:
-
Rotular
Extender
Secar
Fijar
Cubrir con violeta de genciana (1)
Lavar con agua destilada
Cubrir con lugol (1 min)
Decolorar con alcohol-acetona, hasta que el disolvente salga exento de colorante

(aproximadamente 30 '')
Cubrir con fucsina bsica diluida (3') o safranina (1')
Lavar con agua
Secar
Observar al microscopio
47
Mecanismo de accin o fundamento: Todas las bacterias toman el primer colorante (violeta de
genciana o cristal violeta) ayudadas por el mordiente (lugol), pero las Gram (-) lo pierden al
decolorar con alcohol-acetona, y pueden tomar el 2 colorante. Se cree que las Gram (-) pierden
el colorante por la gran cantidad de lpidos que tienen estas bacterias en la pared celular, que son
disueltos por el alcohol, de forma que quedan orificios por los que sale el colorante.
Interpretacin: En base a la explicacin anterior es fcil deducir la interpretacin, as,
denominamos bacterias
Gram (+) a aquellas que vistas al microscopio presentan una
coloracin azul o violeta. Las bacterias Gram (-) presentarn una coloracin rojiza.
Existen bacterias que, en determinadas fases del crecimiento, son Gram variables y
aparecen en la misma preparacin unas clulas teidas de azul y otras de rojo; esto ocurre en
algunas especies del Gnero Bacillus.
TINCIN DE CIDO-ALCOHOL RESISTENCIA DE ZIEHL-NEELSEN (AAR)
Objetivo: diferenciar las bacterias resistentes a la decoloracin con cido-alcohol de las
restantes. Las bacterias AAR pertencen al gnero Mycobacterium cuyas especies ms
importantes son el bacilo de Koch y el de Hansen. (tuberculosis y lepra)
Reactivos:
Solucin fenicada de fucsina (1er colorante)
Alcohol-clorhdrico (decolorante)
Azul de metileno (2 colorante)
Fundamento: Las bacterias AAR, como su nombre indica, son muy resistentes, tanto a la
coloracin como a la decoloracin. Se cree que las Micobacterias tienen en su pared gran
cantidad de lpidos, siendo los colorantes ms soluble en stos que en el lquido decolorante y,
por tanto no pierden el color, esto no ocurre con las bacterias no AAR. Para teirlas hay que
forzar la coloracin mediante calor.
Tcnica:
-
Rotular
Extender
Secar
Fijar
Cubrir la extensin con fuchsina fenicada y teir en caliente de 5 a 10 min.; para

ello pasar una llama varias veces por debajo del porta hasta la emisin de vapores.
No dejar hervir. Aadir ms colorante si es preciso, para evitar desecacin. Esta
operacin se realiza 3 veces a intervalos de 5 minutos. Podemos cubrir la extensin
con papel de filtro sobre el que se echa el colorante.
Lavar con agua
48
Decolorar con el cido-alcohol, hasta que adquiera un color rosa claro,

aproximadamente 5 minutos.
Lavar con agua
Cubrir con azul de metileno durante 2 '
Lavar con agua
Secar al aire
Observar al microscopio.
INTERPRETACIN: apreciamos un fondo azul y los bacilos AAR de color rojo.

Las bacterias teidas segn esta tcnica se clasifican en:
-
cido - alcohol resistente cuando retienen la fuchsina y quedan teidas de color

rojo. (micobacterias)
No cido - alcohol resistente: si se decoloran por el alcohol- clordrico y toman el

color de contraste de azul de metileno.
MTODO DE TAN-THIAN-HOK
Es un mtodo que utiliza los mismos componentes que el Ziehl-Neelsen, pero su
procesamiento es ms rpido y menos engorroso.
Composicin de los colorantes:
- Kinyoun: fuschina, fenol, etanol, agua destilada
- Gabett: azul de metileno, cido sulfrico, alcohol absoluto y agua destilada.
Tcnica:
-
Tras realizar la extensin de la muestra, fijar a la llama
Cubrir con la solucin de Kinyoun durante 3'.
Lavar durante 30''
Cubrir con la solucin de Gabett, durante 1'
Lavar y secar.
Interpretacin: Las bacterias AAR se observan rojas tras la decoloracin.
TINCIONES ESPECIALES
TINCIN NEGATIVA
Objetivo: colorear el fondo, resaltando los microorganismos que quedan sin colorear.
Ventajas: permite ver la morfologa externa del microorganismo: forma, cpsulas, flagelos,
asociacin, etc. Es por lo tanto un mtodo indirecto de probar la movilidad.
49
Desventajas: no permite apreciar la movilidad del microorganismo, pues lo mata.

Colorantes:
- tinta china
- solucin acuosa de nigrosina al 1/100.
Tcnica:
-
En un porta limpio y desengrasado colocar 1 gota de colorante
Con un asa de suspensin bacteriana, se extiende al microorganismo sobre la gota

del colorante, que debe formar al final una capa fina, pero no transparente (no hace
falta fijacin previa).
Mezclar hasta homogeneizar, con el asa de siembra.
Dejar secar a t ambiente.
visualizar al microscopio.
TINCIN FLUORESCENTE
Objetivo: detectar bacterias cuando se encuentran en muy poca cantidad o se enmascaran con
restos de clulas. Por ejem. en LCR, sangre, etc.
Desventajas: - se necesita microscopio de fluorescencia.
- con frecuencia se observan artefactos.
TINCIONES ESTRUCTURALES
TINCIN DE CPSULAS
La cpsula es una capa gelatinosa, de espesor variable, situada alrededor de la pared
bacteriana. Segn el MTODO ANTONY se colorea la cpsula de distinto color que el resto de
la bacteria
Objetivo: hacer visible la estructura mucopolisacrida que poseen algunos tipos de bacterias,
recubriendo la pared bacteriana.
Reactivos:
- cristal violeta al 1% o violeta de genciana

- sulfato de cobre al 20%
Tcnica:
extender, secar y no fijar la muestra.
baar con cristal violeta 2 minutos.
lavar con la solucin de sulfato de cobre.
secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin.
Interpretacin:
- las cpsulas se tien de color azul claro.

- las clulas "
" "
"
azul oscuro.
50
TINCIN DE ESPORAS de Wirtz

Las endosporas son formas de resistencia originadas por algunos grupos de bacterias
(Bacillus, Clostridium).
Objetivo: visualizar la espora.
Mecanismo de accin: consiste en introducir un colorante dentro de las esporas, haciendo que
luego lo pierda el resto de la clula y teir luego esta con un colorante de contraste.
La espora ante las tinciones normales presenta resistencia a la coloracin, por ello hay
que emplear tcnicas especficas. Esto es debido a que la cpsula de las esporas, tienen distintas
caractersticas fsico - qumicas que las formas bacterianas normales.
Reactivos:
- solucin hidroalcohlica de verde de malaquita.

- solucin acuosa de safranina.
- fucsina fenicada: solucin fenicada diluida de fuscina bsica.
Tcnica:
-
Hacer la extensin, secar y fijar a la llama.
Cubrir con verde de malaquita en caliente, con emisin de vapores 3 minutos.
Lavar con agua fra.
Cubrir con safranina o fucsina 30 segundos.
Lavar, secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin.
Interpretacin:
- las esporas se tien de verde y las clulas bacterianas se tien de rojo.
51
TINCIN DE FLAGELOS
La observacin de flagelos en preparaciones teidas es muy difcil, debido a que se
retraen con mucha facilidad y se adhieren a la pared celular.
El dimetro de los flagelos bacterianos est por debajo del lmite de resolucin del
microscopio ptico, por lo que no son visibles, siendo necesario usar tcnicas especiales de
tincin, de modo que el colorante adecuado forme una capa alrededor de cada flagelo,
aumentando as su dimetro aparente.
Las tinciones de flagelos se utilizan de manera especfica, para diferenciar los miembros
del gnero Pseudomonas que tienen flagelos polares, de los miembros de Enterobacterias que
tienen flagelos perifricos.
Objetivo: colorear los flagelos presentes en algunas bacterias o parsitos mviles.
Tipos de tinciones:
1.- utilizan una sal de plata que se deposita sobre los flagelos.
2.- "
fucsina bsica.
Tcnica general:
-
Emplear un cultivo fresco de 24 horas.
Los tiempos y composicin de colorantes y reactivos varia segn los autores,

bsicamente todos emplean:
fucsina bsica fenicada en solucin alcohlica.
cido tnico, como mordiente.
sales: ClNa, (SO4)2AlK, (SO4)2AlNH4.
a veces se aade un colorante de contraste.
Los flagelos se observan de color rojo.
MTODO DE LEFSON
-
Preparar la extensin en un portaobjetos cubrindola con solucin de dicromato.
Lavar con agua, enjuagar en alcohol y secar.
Inundar los portas con la solucin colorante que lleva fucsina bsica.
Dejar reposar 10 minutos a t ambiente (si hace calor) o en incubadora (si hace fro).
Lavar con abundante agua.
Secar y examinar.
TCNICA QUE UTILIZA UNA SAL DE PLATA

Reactivos:
-
oxido smico 1%
mordiente de Rhodes
formalina 0,5%
nitrato de plata 5%
52
Tcnica:
-
Realizar un cultivo en medio inclinado durante 18 horas.
Tomar una muestra y extenderla en un porta.
Fijar al calor con vapores de xido smico durante 2 minutos.
Suspender las bacterias en formalina hasta que aparezca turbidez.
Colocar el porta inclinado y dejar resbalar una gota de la suspensin anterior.
Desecar al aire sin calor.
Cubrir con el mordiente de Rhodes durante 3-5 minutos.
Lavar con agua mediante inmersin.
Teir con AgNO3 calentado a 95C, durante 3-5 minutos.
Lavar, secar y observar.
Los flagelos aparecen visibles debido al precipitado del nitrato de plata.
TINCIN DE CORPSCULOS METACROMTICOS DE LOFFLER

Reactivo: azul de metileno
Mtodo:
Extensin
Desecacin
Fijacin al calor y enfriar
Azul de metileno durante 5 min
Lavar con agua
Secar
Observacin con objetivo de inmersin.
Algunos microorganismos presentan en su interior corpsculos metacromticos, que se

tien ms intensamente que el resto de la clula, tal es el caso de Lactobacillus. En esta tincin
se tien de azul ms oscuro que el resto de la clula.
BIBLIOGRAFIA
Dr. Pedro F. Mateos. Departamento de Microbiologa y Gentica. Facultad de Farmacia.

Universidad de Salamanca. Cultivo de los microorganismos: medios de cultivo. En:
http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/micro2/tema02.html
Casas Pelez, A. Apuntes de laboratorio de microbiologa de aguas.
Solano Goi, C. Microbiologa General. Guin de prcticas. Instituto de Agrobiotecnologa

y Recursos Naturales. UPNA/CSIC. 2004.
Pascual Anderson, MR; Caldern y Pascual, V. Microbiologa alimentaria. Metodologa

analtica para alimentos y bebidas. 2 edicin. Daz de Santos. Madrid, 2000.
53

UT 2 Tecnicas Microbiologicas Ba Sicas 09-10

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TCNICAS MICROBIOLGICAS BSICAS

Las soluciones y medios de cultivo lquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan,

en autoclave. Existen varios mtodos para llevar a cabo el proceso de

La filtracin es el paso de un lquido o gas a travs de un material filtrante, con poros lo

C, N, H, O, son necesarios en cantidades relativamente importantes.

S, P, en cantidades un poco inferiores.

Temperatura: Cada especie microbiana posee una temperatura ptima de crecimiento

pH: Es de gran importancia. Ha de estar cercano a la neutralidad: 7-7,6.

tiempo de incubacin necesario para que el germen adquiera vitalidad y se desarrolle.

Concentracin de oxgeno: Depende del tipo de bacterias:

Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxgeno libre. Para desarrollar

Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxgeno libre. Los anaerobios

Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia de

Microaerfilas: bacterias que crecen en presencia de pequeas cantidades de oxgeno libre.

alimentos esenciales o nutrientes: son imprescindibles C, O, N, e H, en menores cantidades S

factores estimulantes: su presencia acelera el ritmo de la multiplicacin bacteriana, o permite

Autoclave: 110-120C, para la mayora.

Tyndalizacin o esterilizacin fraccionada: Varios calentamientos a 100C/3 das sucesivos.

Se deben de tener en cuenta, pero no son imprescindibles:

PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO. CLASIFICACIN:

" agar. El contenido de agar < 1%.

Medios generales o nutritivos.- Es aquel que soporta el crecimiento de una amplia

Medios de mantenimiento y conservacin.

Medios de enriquecimiento.- Aquel que favorece ms el crecimiento de un determinado

Medios diferenciales o Medios de identificacin.- Aquel que permite la distincin entre

MEDIOS GENERALES O NUTRITIVOS.

CALDO SELENITO (Salmonella).

GIOLITTI CANTONI (Estafilococos).

CALDO LACTOSADO (coliformes).

LEVINE (Escherichia coli).

SABOURAUD (Hongos y levaduras).

AGAR VERDE BRILLANTE (Salmonella).

MAC CONKEY ( Enterobacterias).

MEDIOS DE CULTIVO MS IMPORTANTES

fomenta el desarrollo de las enterobacterias (Gram -).

Inhibe el desarrollo de bacterias Gram + gracias a la presencia de sales biliares.

Los estafilococos patgenos producen colonias con zonas amarillas.

8.- MEDIO DE MULLER HINTON: se utiliza para determinar la susceptibilidad de los

" " lactosa

de cido sulfdrico (SH2).

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

uso de medios alterados por la exposicin al calor y a la humedad.

incorrecta medida del agua.

uso del agua del grifo, etc.

papel de aluminio o parafina

pipetas, medidores o dosificadores

HIDRATACIN: aadirle la cantidad adecuada de agua destilada o desionizada.

Para la preparacin del medio, se debe utilizar un matraz Erlenmeyer lo suficientemente

se calienta previamente el agua. (50-65C) (1/2 o 2/3 del agua necesario)

se aaden los ingredientes o el medio preparado.

se agita para homogeneizar la disolucin, manteniendo la exposicin al calor.

Si el medio no contiene agar (lquido), se suelen disolver bien en agua precalentada,

AJUSTAR EL PH: es imprescindible cuando se parte de los ingredientes por separado. En

Isabel Rita Gutirrez Vega

UT 2: Tcnicas microbiolgicas bsicas

volmenes de hasta 250 ml durante 15' a 1,2 atm (121C).

volmenes superiores a 250 ml se debe prolongar el tiempo de esterilizacin en

no abrir totalmente la placa de petri, solo lo imprescindible.

sera ideal usar mascarilla.

Isabel Rita Gutirrez Vega

UT 2: Tcnicas microbiolgicas bsicas

Isabel Rita Gutirrez Vega