UNIVERSIDAD MAYOR REAL Y PONTIFICIA DE SAN FRANCISCO XAVIER DE

CHUQUISACA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

CARRERA DE AGRONOMIA TECNICO SUPERIOR

MULTIPLICACION DE MEMBRILLO (Cydonia oblonga) MEDIANTE EL

METODO DE PROPAGACION POR ESQUEJES DE 500 EXPLANTES EN EL
LABORATORIO DE CULTIVO IN VITRO DEL CIIAB

INFORME DE PASANTIA PARA

OPTAR EL TITULO DE TECNICO
SUPERIOR EN AGRONOMIA

Maria Luisa Marcani Sandi

Sucre-Bolivia

2023
1. INTRODUCCION

Como toda técnica científica, el cultivo in vitro de explantes vegetales es el

resultado de innovaciones, observaciones y experimentaciones que han permitido
acumular conocimientos cada vez más profundos, constituyéndose en una valiosa
fuente de progreso.

La expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un

frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene
dos características fundamentales que es la asepsia y el control de los factores
que afectan el crecimiento.

El avance alcanzado por las ciencias biológicas ha permitido en los últimos años el
estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular, y en
condiciones de laboratorio es posible actualmente reproducir todos los factores
que puedan incidir en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Este principio
general se aplica también al cultivo in vitro de plantas.

Es así que los orígenes del cultivo in vitro, se remontan a principios del siglo XX
cuando Haberlandt, un científico alemán percibe el concepto de sustancias de
crecimiento al intentar cultivar células aisladas de plantas, originando la hipótesis
de la totipotencia celular en plantas, que se refiere a la capacidad de una célula
vegetal de formar una planta completa bajo ciertas condiciones químicas y físicas
a partir de cualquier parte aislada de la planta, misma que es la base teórica sobre
la que se sustentan todas las técnicas de cultivo in vitro actuales.

Sin embargo, este investigador no pudo demostrar en forma práctica su hipótesis,

debido a que la mayoría de sus componentes complejos que integran los medios
de cultivo actuales todavía no habían sido descubiertos.

1
Después de Haberlandt, los científicos White logra el crecimiento continuo de
raíces de tomate en Estados Unidos y Gautheret establece en cortes de zanahoria
el primer cultivo a crecimiento en Francia, demostraron de forma definitiva la
posibilidad de cultivar células vegetales in vitro. En ese tiempo hubo dos grandes
descubrimientos que repercutieron de manera fundamental sobre el desarrollo de
la técnica del cultivo de células y tejidos vegetales.

 La identificación de las auxinas como reguladores naturales del

crecimiento vegetal.
 El reconocimiento de la importancia de las vitaminas del complejo B en el
crecimiento de las plantas.

Estos investigadores junto con Nobecourt, quien reporto en ese mismo año el
establecimiento de un cultivo similar a partir de zanahoria, son los tres
investigadores considerados los pioneros de la técnica del cultivo in vitro.

En Bolivia existe cerca de 18 laboratorios que están relacionados con la

conservación in vitro como componente de la estrategia de conservación de los
bancos de germoplasma de especies multiplicadas vegetativamente o de semilla
recalcitrante. Y la micropropagación a gran escala de plantas, que genera semilla
certificada de alta categoría en el caso de la papa y de material vegetal con alta
calidad genética y fitosanitaria.

La aplicación del cultivo de tejidos en Bolivia inicia en 1986 con la unidad de

producción de semilla de papa (SEPA), a partir de plántulas libres de
enfermedades mediante el cultivo de tejidos in vitro.

El Instituto Boliviano de Ciencia y Tecnología Nuclear (IBTEN) en La Paz, instala

con el apoyo de la Agencia Internacional de Energía Atómica un laboratorio de
Cultivo de Tejidos in vitro destinado a realizar mutaciones inducidas en material
vegetal de diferentes especies.

2
Actualmente el IBTEN está produciendo plántulas in vitro para la obtención de
semilla de alta calidad de papa, oca, isaño, haba y ajo, así como plántulas in vitro
de piña y plátano destinados a los productores.

El Instituto Nacional de Innovación Agropecuaria y Forestal (INIAF) de Bolivia y las

Alcaldías de Vallegrande y Comarapa hizo posible esta investigación, a través del
subproyecto ‘Fortalecimiento del sistema de producción frutícola en los municipios
de Comarapa y Vallegrande con aplicación de tecnología in vitro’.

La propagación masiva de material vegetal leñoso a través de técnicas

convencionales presenta importantes limitaciones, como la lentitud del crecimiento
y la dificultad para obtener poblaciones de plantas homogéneas en cuanto a edad
y tamaño.

Una solución a esta problemática es la implementación de las técnicas de

cultivo in vitro, con el fin de obtener material uniforme, genéticamente idéntico y
sano asociado a altas tasas de propagación en tiempos reducidos y en cualquier
época del año.

El cultivo de tejidos vegetales o plantas in vitro ofrece una amplia gama de

oportunidades para mejorar la eficiencia en los procesos de selección dentro de
los procesos de mejora genética, especialmente en el caso de especies frutales.

Se utiliza como técnica de micropropagación, saneamiento y conservación de

nuevas variedades, así como saneamiento de variedades susceptibles a
determinadas patologías. La utilización de las técnicas de cultivo in vitro en los
programas de mejora ha sido descrita para la evaluación patrón-variedad de las
nuevas selecciones de frutales obtenidas.

Entre las principales ventajas que presenta es que permite establecer un amplio
número de micro injertos en condiciones controladas en un corto periodo de

3
tiempo y espacio reducido, así como acelerar el crecimiento y desarrollo de las
plantas.
La aplicación de cultivos de callos y micro injertos, en el estudio de la
compatibilidad es un sistema rápido y fidedigno en el estudio de los procesos
celulares que tienen lugar en la superficie de unión. Estudios de este tipo se han
realizado en combinaciones peral sobre membrillero, revelando que existe
correlación entre los repuestos celulares que se producen in vivo e in vitro.

En Sucre, INIAF cuenta con laboratorio de semillas de papa prebásicas que está
ubicado en la zona de Q`ara Punku, como también hay laboratorio de cultivos in
vitro del Centro de Investigación e Innovación Agrotecnológica La Barranca
dependiente de la Carrera de Agronomía T.S. de la Facultad de Ciencias Agrarias
viene realizando trabajos de propagación con frutales entre los cuales está el
membrillo.

Al igual que la mayoría de especies leñosas, la etapa de enraizamiento in vitro del

membrillo es una fase crítica en donde la respuesta y el desarrollo de las raíces se
encuentra directamente influenciado por la calidad del explante, el medio de
cultivo, la concentración de azúcares reductores, los reguladores del crecimiento y
las condiciones físicas de incubación.

Las localidades que destacan en su cultivo de Membrillo son las provincias

Saavedra, Nor Chichas, Chayanta y Charcas en Potosí, aunque también se
produce en otros departamentos junto a las “lucmas” fruto que es muy parecido al
membrillo.

En el departamento de Chuquisaca la producción de membrillo se encuentra

principalmente en provincia de Icla y el Chaco Chuquisaqueño.

4
 2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Efectuar la multiplicación de 500 explantes in vitro de membrillo (Cydonia oblonga)

mediante el método de propagación por esquejes en el laboratorio de cultivo in
vitro del Centro de Investigación e Innovación Agrotecnológica la Barranca
(CIIAB).

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Establecer protocolos de multiplicación por esquejes in vitro para membrillo.

 Realizar el seguimiento al desarrollo vegetativo en laboratorio.
 Evaluar el porcentaje de desarrollo y mortandad en la multiplicación de
membrillo in vitro.

5
 3. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

3.1. Origen

La expresión cultivo in vitro de plantas, significa cultivar plantas dentro de un

frasco de vidrio en un ambiente artificial. Esta forma de cultivar las plantas tiene
dos características fundamentales: la asepsia (ausencia de gérmenes, etc), y el
control de los factores que afectan el crecimiento.

El avance alcanzado por las ciencias biológicas ha permitido en los últimos años el
estudio detallado de las plantas tanto a nivel celular como molecular, y en
condiciones de laboratorio es posible actualmente reproducir todos los factores
que puedan incidir en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Este principio
general se aplica también al cultivo in vitro de plantas.

Haberlandt, un científico alemán, postuló a principios del siglo pasado (XX) que las
plantas eran capaces de reproducir su crecimiento a partir de células aisladas,
originando la hipótesis de la totipotencia celular en plantas. Sin embargo, este
investigador no pudo demostrar en forma práctica su hipótesis, debido a que la
mayoría de los componentes complejos que integran los medios de cultivo
actuales todavía no habían sido descubiertos.

Sería recién en la década del ´50 cuando se determina la importancia del balance
hormonal en las plantas, con el descubrimiento de las hormonas vegetales más
usadas en la actualidad.
111219220807102417.pdf(Review) - Adobe cloud storage

Como toda técnica científica, el cultivo in vitro de explantes vegetales es el

resultado de innovaciones, observaciones y experimentaciones que han permitido
acumular conocimientos cada vez más profundos, constituyéndose en una valiosa
fuente de progreso (Seilleur, 1989).

6
Ovando (2004) define al cultivo de tejidos vegetales como una herramienta de la
biotecnología vegetal que aísla partes de una planta y las hace crecer en un medio
de cultivo artificial in vitro en condiciones de asepsia para obtener metabolitos,
tejidos, órganos o plantas completas. El mismo autor menciona que el concepto in
vitro, presente en casi todos los reportes de biotecnología de plantas, es una
forma de indicar que las plantas o partes de plantas estudiadas fueron cultivadas
dentro de un contenedor de vidrio (del latín in: adentro, vitro: vidrio), es decir, en
un frasco de vidrio, en una placa Petri, en un matraz Erlenmeyer, etc.

Es así que los orígenes del cultivo de tejidos in vitro, se remontan a principios del
siglo XX, cuando Haberlandt percibe el concepto de sustancias de crecimiento al
intentar cultivar células aisladas de plantas, postulando así el principio de la
totipotencia vegetal, que se refiere a la capacidad de una célula vegetal de formar
una planta completa bajo ciertas condiciones químicas y físicas a partir de
cualquier parte aislada de la planta, misma que es la base teórica sobre la que se
sustentan todas las técnicas de cultivo in vitro actuales.

White en 1934 logra el crecimiento continuo de raíces de tomate en un medio rico

en sales minerales y vitaminas del grupo B. Por otro lado, Gautheret en 1939
establece en cortes de zanahoria el primer cultivo a crecimiento continuo. En la
década del 50 estuvieron disponibles los conocimientos sobre los reguladores de
crecimiento y los medios de cultivo que hicieron posible el rápido desarrollo de
estas herramientas.
Murashige y Skoog en los años 60 contribuyen a popularizar las técnicas del
cultivo in vitro desarrollando métodos que han permitido la propagación de
diversas especies vegetales.
A partir de los avances alcanzados en la regeneración de plantas in vitro se ha
desarrollado toda una industria de micro propagación que se inició en Europa y
Estados Unidos, y que se encuentra ampliamente extendida en el resto del
mundo, incluyendo países en desarrollo de América Latina, Asia y África.
(Pérez, Jiménez & Agramonte, 1998)Aguirre, Baudoin, Leigue UMSS 2016.pdf

7
3.2. Concepto de cultivo in vitro

El cultivo in vitro consiste en tomar una

porción de una planta (ej. el ápice, una
hoja o segmento de ella, segmento de
tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla,
antera, etc.) y colocarla en un medio
nutritivo estéril (usualmente gelificado,
semisólido) donde se regenerará una o
muchas plantas. Durante las últimas
décadas, la técnica del cultivo “in vitro” ha
ganado especial interés para el establecimiento
de diversas plantas para la producción de compuestos o la obtención de cultivos
más sanos y con características genéticas específicas. El cultivo in vitro de
vegetales se basa en el aislamiento de órganos, tejidos o células vegetales y en el
ajuste de las condiciones necesarias para la obtención de respuestas fisiológicas o
morfogénicas a partir de estos explantes (Höxtermann, 1997). El cultivo de células
y tejidos in vitro, involucra diferentes técnicas a partir de diferente material vegetal
tales como cloroplastos, células, tejidos, órganos e incluso plantas completas.
https://www.intagri.com/articulos/nutricion-vegetal/cultivo-in-vitro-de-celulas-y-
tejidos-vegetal

El cultivo in vitro es una técnica que se utiliza en diversos campos de la biología

para mantener organismos vivos, o partes de estos, bajo condiciones controladas
dentro de un laboratorio. Si bien las áreas más desarrolladas de esta técnica son
la microbiología y la biología celular de líneas celulares animales, el cultivo de
tejidos vegetales también ha mantenido un desarrollo constante en las últimas
décadas, y es aplicado en la conservación de plantas ornamentales como las
orquídeas endémicas de la selva, la restauración de bosques, la generación de
plantas modificadas para producir nutrientes esenciales, o la producción de
fármacos, entre otros. (Bioingenieria, 2023)

8
Desde hace 50 años se ha demostrado el avance en el desarrollo de la
biotecnología vegetal, principalmente en la propagación de especies vegetales.
Para este propósito existe toda una tecnología biológica en grandes laboratorios e
invernaderos de diferentes países, que reditúa ganancias en miles de millones de
pesos.

A este sistema de propagación se le conoce como micropropagación, que tiene

como base principal el cultivo in vitro de tejidos vegetales, una de las más
importantes aplicaciones para la producción masiva de plantas de interés
económico o biológico. (Bioingenieria, 2023)

3.3. Principios botánicos para el cultivo in vitro

La multiplicación asexual o vegetativa ocurriéndose fue dando naturalmente a

través de la intervención humana, y se ha ido especializando en invernaderos y
viveros. El procedimiento de propagación vegetativa en la mayoría de los casos es
a partir de cortes de tallos, raíces y hojas.

Los tallos, porción de las plantas vasculares con hojas y yemas, tienen el potencial
para la regeneración de plantas. Hay tallos subterráneos, como el rizoma del lirio o
los estolones de fresa; el tubérculo de la papa y de otros tubérculos andinos como
la oca, papalisa e isaño que sirven como estructuras en la reproducción
vegetativa.
Las raíces son órganos de las plantas superiores, casi siempre subterráneas, que
tienen funciones de absorber, conducir agua, minerales disueltos, acumular
nutrientes y fijar la planta firmemente en la tierra. También ellas sirven como
estructuras reproductoras vegetativas, por ejemplo, en manzano y rosa.

Las hojas son los principales órganos fotosintéticos de la gran mayoría de plantas.
Bajo determinadas condiciones, pueden producir nuevas plantas a partir de cortes

9
 de las hojas por ejemplo en begonia, tuna o violeta africana. En algunos casos,
crecen de las hojas nuevas plantas sin estar separadas de la planta materna.
La multiplicación in vitro de plantas no crea nuevos procesos de crecimiento,
simplemente dirige y ayuda al potencial natural de la planta para regenerar y
multiplicar de una manera muy eficaz y predecible, en contraste con la
propagación vegetativa convencional que requiere más espacio y más tiempo en
la producción de plantas.
Aguirre, Baudoin, Leigue UMSS 2016.pdf

3.4. Micropropagación

La micropropagación es un sistema de propagación asexual, a partir de un

segmento de una planta madre, que da como resultado la propagación masiva de
plantas genéticamente idénticas, denominadas clones. Con esta biotécnica se
incrementa de forma exponencial el número de plantas en microexplantes
menores a 1 cm de longitud o de diámetro, en los que se forman minúsculos
brotes que se desarrollan hasta la formación de plantas, mediante el fenómeno de
la regeneración vegetal. Lo anterior se explica debido a que las células vegetales
son capaces de generar una planta a partir de una simple célula, proceso
conocido como “totipotencialidad”.

El explante más usado para los procesos de propagación in vitro son las yemas
vegetativas de las plantas. Los frascos que contienen las plantas se ubican en
estanterías con luz artificial dentro de la cámara de crecimiento, donde se fija la
temperatura en valores que oscilan entre los 21 y 23°C, además de controlar la
cantidad de horas de luz. Por su parte, el medio de cultivo se compone de una
mezcla de sales minerales, vitaminas reguladoras de crecimiento, azúcar, agua y
agar.

La composición del medio depende de la especie vegetal y de la etapa del

proceso de micropropagación.

10
El número de plantas que se regenere en un explante y el tiempo de cultivo,
dependen de la especie vegetal, en plantas herbáceas pueden producirse un gran
número de plántulas por explante en no más de 60 días de cultivo, pero en plantas
leñosas o arbóreas solamente unas cuantas y puede lograrse hasta los 180 días.

Al cultivarse segmentos de 1 cm2 de hoja de violeta (Saintpaulia), pueden

producirse hasta 50 plántulas en 60 días de cultivo; en yemas de aguacate solo se
regeneran de 3 a 5 brotes, formando plántulas hasta los 120 días del cultivo.

Con finalidad puramente descriptiva se puede clasificar los principales factores no

biológicos que afectaran al desarrollo del cultivo in vitro, incluyendo:

Ambiente químico

 Composición del medio de cultivo

 pH

Ambiente físico

 temperatura
 luz y fotoperíodo
 humedad

3.5. ETAPAS DE LA MICROPROPAGACIÓN

En la actualidad se sugieren cinco etapas que se numeran desde la etapa 0 hasta

la 5, en cada una de ellas los objetivos están perfectamente definidos.

11
FASE 0: PREPARACIÓN DE LA PLANTA MADRE

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener

explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener
estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta
donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas
semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas.
En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un
control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y
libre de enfermedades.

FASE 1: DESINFECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL

Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales
se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas,
porciones de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una
desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes
externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que
habitan en forma natural en el ambiente.

Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de

asepsia. A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas
de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal.

Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de

iniciación para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la
desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o
diluida durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en
agua esterilizada.

12
FASE 2: INTRODUCCIÓN DEL MATERIAL IN VITRO

Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del

material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una
semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de
nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

FASE 3: MULTIPLICACIÓN DE LOS BROTES

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2
originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base
de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto
con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar
en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros
recipientes adecuados.

Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado

que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el
número de plantas en cada repique o división de las plantas.

El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las

condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía
de la micropropagación permite alcanzar incrementos exponenciales,
considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido
optimizados.

13
 Fuente: Wikipedia

FASE 4: ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS

EXPLANTOS

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un

tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de
multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que
solo contenga hormonas del tipo auxinas.

Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus
raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto,
el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.

FASE 5: ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTOS ENRAIZADOS

Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de
manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación.
En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la
adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales.

14
En el momento en que se extraen los explantes o plantines enraizados de los
frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes
han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y
generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración
y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a
descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la
desecación del explante.
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La siguiente lista presenta una comparación de las características de una planta

en condiciones de laboratorio (in vitro) respecto a una planta en condiciones
naturales (in vivo):

IN VITRO IN VIVO
No realiza fotosíntesis Realiza fotosíntesis
Crecimiento en condiciones controladas Crecimiento en condiciones no
controladas
Crecimiento en condiciones de asepsia Exposición a los patógenos y gérmenes
del ambiente
Alta humedad relativa Humedad relativa variable
Estomas no funcionales Estomas funcionales
Ausencia de pelos radiculares Presencia de pelos radiculares
Ausencia de cera en la cutícula Presencia de cera en la cutícula

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FACTORES QUE INFLUYEN EN LA MICROPROPAGACIÓN

Existen diferentes factores que determinan el éxito en la micropropagación, los

más importantes son los siguientes:

15
Planta que dona el explante

El estado fisiológico de la planta madre influye significativamente en la capacidad

morfogenética del explante. Asimismo, se ha observado que la edad fisiológica del
explante tiene gran influencia en la morfogénesis, cuanto más joven y menos
diferenciado esté el tejido que se va a sembrar, mejor será la respuesta in vitro. La
posición relativa de las yemas es otro factor importante.

Se ha observado en algunas especies que las yemas axilares obtenidas de la

parte media del tallo se desarrollan más rápidamente que aquellas obtenidas de la
base o de la porción apical. Sin embargo, en otras especies las yemas apicales
son las únicas que producen plantas in vitro.

El explante

Generalmente, la selección del explante se hace teniendo en cuenta el sistema de

propagación de la planta. Así, si las plantas que se van a micropropagar se
reproducen por semilla, las partes embrionarias son las fuentes más comunes de
explantes; las semillas pueden ser desinfectadas superficialmente y germinar en
condiciones de asepsia.

Los brotes jóvenes y los ápices meristemáticos son, generalmente, la fuente de los
explantes.

Factores físicos

La temperatura a la que está expuesto el explante cultivado in vitro afecta a la

mayoría de procesos fisiológicos y por consiguiente es un factor fundamental a
controlar. En general, cada especie tiene un intervalo de temperaturas en el que

16
se produce el crecimiento óptimo. Este intervalo puede variar en función del
genotipo, del órgano del que procede el explante, del fotoperiodo, etc.

La temperatura de incubación para la propagación de la mayoría de las familias

fluctúa entre los 24 y 28ºC. El control de la temperatura no es solamente
importante porque pueda afectar al crecimiento del cultivo sino también porque
puede ser un factor que induzca determinados procesos fisiológicos.

La luz es uno de los factores principales que determinan el desarrollo de los

organismos autótrofos, en ello radica la importancia de controlar el factor luz en los
cultivos in vitro.
Se asume que las necesidades de luz en cultivo in vitro son inferiores de las
plantas in vivo, dado que las plantas in vitro sólo son parcialmente autótrofas
(utilizan como fuente de carbono los azúcares añadidos al medio, realizando por
tanto una fotosíntesis muy reducida).

Medio de cultivo

El medio de cultivo es la combinación sólida o líquida de nutrientes y agua. A

menudo se denomina medio basal y puede ser suplementado con algún regulador
de crecimiento y con otras sustancias.

Los requerimientos nutritivos para un crecimiento in vitro óptimo varían con la

especie e incluso son específicos de acuerdo a la parte de la planta que se esté
cultivando y de la respuesta que se desea obtener. Debido a estas necesidades
específicas se han desarrollado muchas formulaciones diferentes para los medios
de cultivo.

El control del pH inicial del medio y de su dinámica durante el cultivo tiene una
gran importancia, ya que su valor puede afectar a la absorción de determinados

17
nutrientes por parte del explante y puede afectar al pH del citoplasma, y como
consecuencia a la actividad de muchos enzimas.

Ventajas

En comparación con los sistemas convencionales, la mayoría de los autores

coinciden en que el cultivo in vitro presenta las siguientes ventajas:

 Posibilidad de producción masiva de plantas homogéneas en una superficie

reducida a bajos costos y tiempos reducidos.
 Ahorro de espacio con respecto a los sistemas tradicionales.
 Mejor control sobre la sanidad del material vegetal que propaga.
 Facilidad para transportar el material in vitro de un país a otro.
 Posibilidad de multiplicar rápidamente una variedad de la cual sólo existen
pocos individuos.
 Propagación de plantas recalcitrantes a las técnicas convencionales.
 Posibilidad de conservar germoplasma a mediano y largo plazo

Debido a lo sofisticado de la técnica, la micropropagación es restringida y aplicada

solo en laboratorios de investigación o en grandes empresas que cuentan con
recursos para el mantenimiento del proceso y hacerlo costeable económicamente.
Es justificable el método solo en plantas con reproducción natural difícil, plantas en
peligro de extinción, plantas con características importantes únicas como las
transgénicas y plantas de uso ornamental con valor unitario elevado.
(Garciglia, 2023) Rebigo_2008_07.pdf

Desventajas

 Estabilidad genética débil en algunos sistemas de propagación in vitro.

 Aclimatación de las plántulas, como un proceso difícil con mayores
probabilidades de pérdidas en esta etapa.

18
  Poca respuesta inicial de algunas especies y genotipos.
 Alto costo de establecimiento de un laboratorio, lo que incide indirectamente
en el precio final de la planta producida.
 Alto costo de los reactivos, aspecto que influye incluso en el desarrollo de la
investigación en esta área.
 Necesidad de mano de obra especializada.
 Alta dependencia de energía eléctrica.
(Intagri, 2023)

3.6. Técnicas de cultivo in vitro

El cultivo in vitro consiste en tomar una porción de una planta (ej. el ápice, una
hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión, nudo, semilla,
antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril (usualmente gelificado,
semisólido) donde se regenerará una o muchas plantas.

El cultivo in vitro de vegetales se basa en el aislamiento de órganos, tejidos o

células vegetales y en el ajuste de las condiciones necesarias para la obtención de
respuestas fisiológicas o morfogénicas a partir de estos explantes. (Intagri, 2023)

El término “cultivo in vitro de tejidos” significa cultivar algunas partes de las plantas
también llamados “explantes”, como segmentos de hoja, tallo y raíces, además de
otros tejidos u órganos vegetales, dentro de un frasco de vidrio en un ambiente
artificial, en los que deben de controlarse la asepsia, el crecimiento y el desarrollo
de estos diferentes tejidos.

No deben de crecer microorganismos como bacterias y hongos, y los tejidos o

plantas deben de mostrar un óptimo desarrollo.

Para lograr un cultivo in vitro de plantas, los tejidos y órganos (incluyendo

semillas) deben ser esterilizados de manera superficial (asepsia) y se cultivan en

19
 soluciones nutritivas especiales, con frecuencia en medios solidificados con agar.
A estos medios de cultivo se le incorporan combinaciones adecuadas de auxinas y
citocininas, dos de las principales fitohormonas del crecimiento vegetal.

Con la aplicación de éstas y el cultivo controlado como el pH, la luz y la

temperatura, es posible reproducir todos los factores que puedan incidir en el
crecimiento y desarrollo de los tejidos o de las plantas in vitro.

La elección del explante para iniciar un cultivo in vitro adecuado, constituye el

primer paso para el establecimiento de los cultivos. Se ha demostrado que la edad
fisiológica del explante es un factor importante en la formación de órganos, entre
más joven, más fácil será su adaptación y respuesta al cultivo in vitro.

El explante más usado para los procesos de propagación in vitro son las yemas
apicales y axilares de las plantas. (Garciglia, 2023)

Estas técnicas de propagación in vitro han abierto nuevas posibilidades para el

manejo de la genética básica y obtener nuevos cultivares. Dentro de las
alternativas se presentan la facilidad de la creación y mantenimiento de nuevo
material genético para la clonación in vitro, la obtención de material haploide a
partir de anteras o cultivo de óvulos e incrementar la variabilidad genética por
métodos de hibridación, selección y obtención de mutantes

3.7. Éxito en la propagación in vitro de plantas

En los últimos años se estima que se cultivan unos 800 millones de hectáreas con
plantas micropropagadas, sin incluir a las plantas transgénicas, producidas por
más de 50 laboratorios en Latinoamérica y más de 1,000 alrededor del mundo,
donde se propagan miles de millones de plantas por año.

20
 Las plantas propagadas por esta técnica que mayormente se comercializan son
fresa y otras frutillas, papa, plátano, caña de azúcar, eucalipto, bambú, orquídeas
y algunas cactáceas.

En América Latina, los países con mayor producción son México, Argentina,
Brasil, Cuba, Costa Rica, Colombia, Perú y Chile, donde se micropropagan y
comercializan plantas como fresa, café, vid, arándano, cereza, agave y aguacate.
(Garciglia, 2023)

3.8. Nuevas técnicas de Cultivo in vitro

3.9.1. Cultivo de meristemos

El cultivo de meristemas En la yema apical se encuentran un grupo de células que

conforman el meristema apical (tiene un tamaño entre 0,01 y 0,3 mm), tejido
embrionario que tiene la capacidad de formar todos los tejidos de la planta. A partir
de ellos se pueden regenerar plantas completas.

El cultivo de meristemas tiene numerosas aplicaciones. Una de las más

importantes es la obtención de plantas libres de virus, ya que esta pequeña zona
de tejido generalmente no es afectada por estos patógenos vegetales. Otra muy
importante es la multiplicación vegetal.

La potencialidad de la técnica se demuestra con un ejemplo: a partir de una yema

apical, se pueden obtener 4.000.000 de claveles en un año. La técnica permite
también multiplicar especies de plantas con reproducción lenta o dificultosa (como
las orquídeas), o acelerar la producción de plantas bianuales.
Cultivos celulares II.pdf

3.9.2. Cultivo de yemas

21
 En botánica, la yema es un órgano complejo de las plantas que se forma
habitualmente en la axila de las hojas formado por un meristemo apical, (células
con capacidad de división), a modo de botón escamoso (catáfilos) que darán lugar
a hojas (folíferas) y flores (floríferas).
El color de las yemas sirve para identificar las especies: en Europa hay solo
algunas especies de árboles con yemas de color verde.
(WIKIPEDIA, 2023)

3.9. Descripción del cultivo de membrillo

3.10.1. Origen

Según Corominas, en su diccionario critico

etimológico de la lengua castellana, el término
membrillo procede del griego que significa,
literalmente, manzana de miel.Entre los antiguos
griegos, se ofrecía membrillo en las bodas, un rito
que llegó de oriente
https://es.m.wikipedia.org/wiki/cydonia_oblonga

Con el culto a Afrodita y permaneció sagrado. Plutarco

relata que las novias griegas mordían un membrillo para perfumar su beso antes
de entrar en la cámara nupcial a fin de que el primer beso no fuera desagradable,
era un membrillo el premio que Paris concedió a Afrodita.

El mejor tipo de membrillo venia de la región de Cidonia, en la costa noroeste de

Creta, fruta conocida por los griegos como “mela kudonia” o “manzana de Cidonia”
de donde proviene también su nombre científico. (WIKIPEDIA, 2023)

Origen de la palabra membrillo procede de las ramas del membrillero. Cuando

estas nacen son tiernas, flexibles y resistes como el mimbre. De esta manera se
denominó membrillo al fruto, por ser el diminutivo de mimbre.

22
El membrillo es el fruto del membrillero, un árbol de tamaño pequeño a mediano
de la familia de las rosáceas y único miembro del género Cydonia. Este árbol
crece en climas fríos y templados y es nativo de la región del Cáucaso, en el
sudoeste de Asia. En España llegó procedente de Grecia y después se exportó a
América.

El membrillo es una fruta carnosa, de color amarillo y dorado brillante cuando está
maduro, y de color verde cuando está inmaduro. La recolección de los membrillos
es entre finales de septiembre hasta a diciembre. (Vasiller, 2023)

3.10.2. Taxonomía

Wikipedia de membrillo (Cydonia oblonga). 8 de septiembre de 2023 indica la

siguiente taxonomía

Tabla No 1. Taxonomía del membrillo

Reino Plantae
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Subclase rosidae
Orden Rosales
Familia Rosaceae
Subfamilia Amygdaloideae
Tribu Maleae
Subtribu Malinae
Genero Cydonia
Especie Cydonia oblonga

Fuente: (WIKIPEDIA, 2023)

Tabla Nº 2. Taxonomía del membrillo

Reino Plantae
Filum Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida

23
 Familia Rosaceae
Orden Rosales
Genero Cydonea
Especie C. oblonga

FUENTE: (Garcia, 2017)

3.10. Morfología descripción de la planta:

Porte: Arbolito caducifolio de 4-6 m de altura con el tronco tortuoso y la corteza

lisa, grisácea, que se desprende en escamas con la edad. Copa irregular, con
ramas inermes, flexuosas, parduzcas, punteadas. Ramillas jóvenes tomentosas.
(InfoAgro, 2023).

Los frutos son de color verde y cambian a amarillo-dorado brillante cuando están
maduros, son muy aromáticos. Hojas alternas de superficie con pelos blancos y
flores de cinco pétalos. Las partes usadas son los frutos (membrillos) y las
semillas. Es originario del Cáucaso en el sudoeste de Asia. (Acosta, 2023)

Hojas: Alternas, de 5-10 cm de longitud, de aovadas a redondeadas, con pecíolo

corto. El haz es glabro y el envés tomentoso. (InfoAgro, 2023)

Indica lo siguiente sus hojas están dispuestas de forma alterna, son simples, de 6
a 11cm de largo, con una superficie densamente poblado de finos pelos blancos.
(WIKIPEDIA, 2023)

Flores: Solitarias de color blanco o rosado que aparecen en las axilas de las
hojas. Miden 4-5 cm de diámetro y tienen 5 pétalos y 20 estambres. Florece en
primavera, de marzo a mayo. (InfoAgro, 2023)

Las flores, que surgen en la primavera después de las hojas, son blancas o rosas,
con cinco pétalos. (WIKIPEDIA, 2023)

Las flores, que brotan en primavera, están compuestas por cinco pétalos blancos
o rosas. El fruto es un pomo amarillo-dorado brillante de 7 a 12cm de largo por 6 a
9cm de ancho, con la pulpa dura y aromática. (Sanchez, 2023)
24
 Fruto: Pomo piriforme, de color amarillo-dorado, muy aromático, de 7.5 cm de
longitud o más, dependiendo de la variedad, con el ápice umbilicado. La pulpa es
amarillenta y áspera, conteniendo numerosas semillas.

Los frutos se forman en la extremidad de los pequeños brotes, sobre brindillas o

en ramos del año anterior. (InfoAgro, 2023)

El fruto se clasifica como climatérico, con una elevada sensibilidad al etileno, y su

vida en pos cosecha alcanza de 2 a 3 meses las condiciones óptimas de
conservación son 0 °C y una humedad relativa próxima a 90 %. (WIKIPEDIA,
2023)

3.11. Variedades

Las variedades mejor definidas son las siguientes:

3.12.1. Común

Árbol de mediano vigor y producción. Fruto de tamaño medio, piel amarillo oro y
carne aromática. Madura en octubre. (InfoAgro, 2023)

Indica los siguientes frutos de tamaño medio, piel de color amarillo oro y carne
aromática. (Eroski Consumir, 2023)

Esta variedad es de mediano tamaño, muy cultivado en Murcia, donde se realiza

la recolección a finales de septiembre y principios de octubre. (Sembrar100, 2023)

3.12.2. De Angers

Árbol de vigor regular y gran producción. Fruto de tamaño grueso, esferoidal,

pedúnculo inscrito en la extremidad, piel amarilla y pulpa fragante. Madura en
octubre. (InfoAgro, 2023)

Produce un fruto grueso que tiene forma de esfera, piel amarilla y pulpa fragante,
que también madura en el mes de octubre. Es un árbol muy versátil en cuanto al
clima, pues se desarrolla bien en el clima templado. Le van bien temperaturas de

25
 veranos cálidos e inviernos largos, porque soporta las heladas. (Sembrar100,
2023)

3.12.3. De Fontenay

De gran desarrollo y fertilidad. Fruto de tamaño más bien grande, piel amarillo-
verdosa y pulpa perfumada. Madura entre septiembre y octubre. (InfoAgro, 2023)
Frutos grandes, con piel amarilla y pulpa perfumada. (Sanchez, 2023)

3.12.4. De Portugal

De gran vigor y producción. Fruto de tamaño grueso, piel amarillenta y pulpa

amarilla y fragante. Madura en octubre. (InfoAgro, 2023)

Fruto de tamaño grueso, piel amarilla y pulpa perfumada. (Vasiller, 2023)

3.12. Clima

Requiere climas templados o relativamente fríos, de inviernos largos y veranos

calurosos. Puede cultivarse en toda la región de la vid, resistiendo las más bajas
temperaturas. La exigencia de frío va de 100-500 horas-frío, según la variedad.

En zonas elevadas las flores y frutos recién formados pueden verse afectados por
las heladas tardías. Requiere además situaciones aireadas, y si se cultiva en
valles cerrados u hondonadas, por ser muy sensible a la invasión del hongo
causante de la lepra o moteado puede perderse parte del fruto.

Se trata de uno de los frutales que reclama más cantidad de luz. (InfoAgro, 2023)

Requiere climas templados o relativamente fríos, de inviernos largos y veranos

calurosos, resistiendo las más bajas temperaturas. Se puede cultivar en zonas con
altitudes de 700 a 2000 m.s.n.m., donde las temperaturas promedio son entre
18°C–25°C, humedad relativa de 70% y precipitaciones de 1500 a 2500 mm.
anuales.

26
 Las exigencias de frio van desde 100 a 500 horas frío, según la variedad, resiste
las más bajas temperaturas, pero, es uno de los frutales que reclama más
cantidad de luz.

(DICTA, 2023)

3.13. Suelo

El membrillero se adapta desde los suelos más fértiles a las tierras más ingratas,
mientras sean de naturaleza fresca y con pH ligeramente ácido; los valores
extremos de pH para el membrillero oscilan entre 5.6 y 7.2.

Puede vegetar a la orilla de los cauces sin que el exceso de humedad lo

perjudique, en las tierras de regadío y de secano. Aunque es poco exigente en
cuanto a suelos, prefiere los francos arcillosos bien drenados, bastante fértiles y
que retienen una cantidad moderada de humedad. Presenta problemas de clorosis
férrica en suelos de más de 8% de caliza activa. (InfoAgro, 2023)

Se adapta desde los suelos más fértiles hasta las tierras más ingratas, mientras
sean de naturaleza fresca y con pH ligeramente ácido entre 5.6 y 7.2. Aunque es
poco exigente en cuanto a suelos, prefiere los suelos francos arcillosos bien
drenados con pendientes desde 25% en adelante. (DICTA, 2023)

3.14. PARTICULARIDADES DEL CULTIVO

3.15.1. Plantación

Una vez preparado el terreno para la plantación, se deben abrir unos hoyos a una
profundidad mínima de 60 x 60 cm. Rellenados los hoyos con las tierras más
fértiles y previa eliminación de las raíces heridas o magulladas, se despuntan las
más largas y se sitúa el árbol a una profundidad inferior a los 5-7 cm de lo que
estaba en vivero.

27
Plantado el árbol se escogen tres o cuatro ramitas de las más vigorosas y se
despuntan a 4-5 yemas, eliminado las restantes, o se desmocha a una altura
conveniente.

Las plantas de vivero de dos o tres años de edad se plantan a una distancia de 4,5
m, en marcos regulares, totalizando hasta 450 árboles por hectárea.

El momento oportuno para la plantación es tan pronto se ha despojado de las

hojas hasta finales de febrero o primeros de marzo. (InfoAgro, 2023)

3.15.2. Riego

El membrillero es muy resistente a la sequía, y si se cultiva en tierras de regadío

no se debe abusar de los riegos ni de los fertilizantes, los cuales fomentarían su
frondosidad en detrimento de la producción de fruto. (InfoAgro, 2023)

3.15.3. Fertilización

Como fertilizantes pueden emplearse abonos orgánicos, fosfatados y potásicos a

mitad de otoño para que estén dispuestos y poder ser asimilados por el árbol en el
momento preciso. Respecto a los nitrogenados, no deben aplicarse hasta
momentos antes de entrar en vegetación. (InfoAgro, 2023)

3.15.4. Malas hierbas

Es un árbol rústico que precisa de poco laboreo en el terreno. Por medio de

labores frecuentes debe mantenerse en toda época el suelo limpio de toda hierba
adventicia, y más tratándose de tierras de secano.

Probablemente la mejor forma de conducir la plantación de membrilleros es

mantener las plantas con tapiz herbáceo permanente luego de haber sido
cultivadas en fajas a lo largo de las hileras durante los primeros dos o tres años.
28
El control químico con herbicidas en hileras, dejando un tapiz permanente entre
ellas es una práctica muy común. (InfoAgro, 2023)

3.15.5. Poda

Debido al lento desarrollo del membrillero, su poda es muy sencilla. Durante la

época de formación se darán despuntes según la vigorosidad del árbol,
procurando fomentar su expansión y manteniendo un equilibrio perfecto copal,
obteniendo plantas en forma de vaso. Durante la producción las podas se limitarán
a eliminar aquellas ramas que puedan alterar este equilibrio o ramas que se
superpongan unas con otras.

Cada año se eliminarán las ramas chuponas y las dañadas, no siendo conveniente
más que esta limpia para su buena producción, por producir espontáneamente el
árbol suficiente número de ramificaciones fructíferas, que dan sus botones en el
extremo. La poda consistirá, por tanto, en un raleo, con algunas podas de rebaje
ocasionales de las ramas principales con el objeto de estimular las nuevas
brotaciones anuales que llevarán las frutas.

3.15.6. Recolección

La recolección de los frutos es manual. La maduración se conoce por el olor

penetrante que desprenden los frutos y porque se caen los pelos que forman el
tomento del fruto. La recolección ha de ser cuidadosa, procurando no golpear los
frutos y a horas en que la rociada esté ya seca.

Es difícil la obtención de buenos rendimientos de fruta de alta calidad, debido a

que se trata de una planta poco productiva y tardía. También destaca la presencia
de enfermedades y plagas, siendo el control difícil de realizar. (InfoAgro, 2023)

29
 4. LOCALIZACIÓN

El trabajo de Pasantía fue ejecutado en el Centro de Investigación e Innovación

Agrotecnológica La Barranca (CIIAB), dependiente de la Carrera Agronomía
Técnico Superior de la Facultad de Ciencias Agrarias. El Centro se encuentra a 14
km. de la ciudad de Sucre en la comunidad de La Barranca.

4.1. Localización geográfica

El CIIAB, se localiza en el Departamento de Chuquisaca, Provincia Oropeza,

Municipio de Sucre. Distrito-6. Comunidad La Barranca. Su ubicación geográfica
es:

Latitud Sud 19° 05’ 30”

Longitud Oeste 68° 18’ 00”
Altitud m.s.n.m 2940
Fuente: SENAMHI-CHUQUISACA (2005-2019)

Figura N° 1. Mapa de ubicación geográfica del CIIAB

30
 Figura N° 2. Vía de acceso principal al Centro de Investigación e Innovación
Agrotecnológica La Barranca (CIIAB). Punto “A” de partida - plazuela San Juanillo-
Sucre al Punto “B” comunidad La Barranca donde se ubica el Centro:

Fuente: Google Earth (2017)

Tabla N° 1. Vía principal, tramos y distancias que conduce al CIIAB:

TRAMO LONGITUD TIPO DE ESTADO

EN Km. VÍA
Plazuela San Juanillo – Av. 2,5 Pavimentada Excelente
Circunvalación

31
 Av. Circunvalación – Av. 1,2 Pavimentada Excelente
Atahuallpa
Av. Atahuallpa – Av. Evo Morales 2,3 Pavimentada Excelente
Av. Evo Morales – CIIAB 3,2 Tierra Regular
DISTANCIA TOTAL 9,2 KILÓMETROS

4.2. Laboratorio de Cultivos In Vitro CIIAB

El laboratorio este situado en el Centro de Investigación e Innovación

Agrobiotecnologica la Barranca en el edificio nuevo de agronomía en la planta baja
a lado derecho de las aulas, con una superficie de 153 m2

32
Fuente: Google Earth (2017)

33
4.3. El laboratorio cuenta con:

MESONES

PUERTAS

ESTANTES DE CRECIMIENTO

AUTOCLAVE

34
Ante sala:

Es el área donde llega el personal, estudiantes o visitantes donde dejan todas sus
pertenencias y proceden a ponerse el mandil, barbijo, guantes quirúrgicos y los
zapatones.

Área de lavado y esterilización:

Es el área donde llega el material vegetal contaminado, donde procede hacer la

desinfección y esterilización tanto de material vegetal como también de los tubos
de ensayo con el medio preparado, pinzas, bisturí, cajas Petri y las gradillas.

Área de preparado de medios:

En esta área se encuentran todos los reactivos, materiales de vidrio, hornos mufla,
balanzas microondas, pH metro, bisturís, pinzas y otros.

En esta área es donde se prepara los medios de cultivo, se dosifica y prepara para
llevar para el procedimiento de autoclave.

Área de siembra y repicaje:

Esta área es la más limpia y desinfectada de todo el laboratorio, cuanta con cuatro
lámparas UV que se prenden directamente con el interruptor.

Esta área aparte de que solo puede ingresar personal autorizado, cuenta también
con los microscopios, estetoscopios y la cámara de flujo laminar.

Este ambiente nos sirve para hacer el establecimiento de la especie a propagar,

se hace el cambio de medio de multiplicación y enraizamiento.

Área de crecimiento:

Es un ambiente en el que se controla los fotoperiodos que cada especie requiere

como la temperatura y la humedad.

35
4.4. Características biofísicas

4.4.1. Parámetros meteorológicos

Según los datos meteorológicos registrados en la Estación Agrometeorológica del

Centro de Investigación e Innovación Agrotecnológica La Barranca (CIIAB) y
procesados por el Servicio Nacional de Meteorología e Hidrología SENAMHI-
CHUQUISACA (Serie climática 2005-2019), la zona donde se encuentra el CIIAB
responde a los siguientes parámetros meteorológicos:

 Temperatura media anual: 14,3 ºC.

 Temperatura máxima media anual: 21,4 °C.
 Temperatura minina media anual: 7,2 ºC.
 Humedad relativa media anual: 72,2 %.
 Precipitación media anual: 627,8 mm.
 Dirección y velocidad media del viento: NE – 9.0

4.4.2. Clima

Según el Plan Territorial de Desarrollo Integral – PTDI (2016-2020) del Municipio

de Sucre. La ciudad de Sucre y sus alrededores donde se encuentra la
Comunidad de La Barranca sito del Centro de Investigación e Innovación
Agrotecnológica La Barranca (CIIAB), íntegramente están incluidas en la zona
climática de subhúmedo-seco-templado.

4.4.3. Vegetación

Según la Zonificación Agroecológica de Chuquisaca (2000). El municipio de Sucre

se distribuye en tres principales eco regiones dentro de la Cordillera Oriental,
presenta tres tipos de formación vegetal que son el bosque ralo, matorral y
herbácea caracterizada por una vegetación semidecidua.

36
 El área donde se localiza la comunidad de La Barranca, sito del Centro de
Investigación e Innovación Agrotecnológica La Barranca (CIIAB), predomina el tipo
de vegetación correspondiente a matorrales deciduos, asociados con gramíneas
y relictos de pequeños bosques.

4.4.4. Suelos

Según el Laboratorio privado de Suelos y Aguas (LABSA), que en el año 2008 ha

realizado análisis físico, químico y bilógico de los suelos agrícolas del área de
influencia de la comunidad de La Barranca y del Centro de Investigación e
Innovación Agrotecnológica La Barranca (CIIAB), estos presentan las siguientes
características:

 Textura de los suelos: Franco Arcillo Arenoso (FYA).

 Estructura de la capa arable: Granular migajosa.
 Profundidad promedio de la capa arable: 20 cm.
 Densidad aparente de los suelos: 1,33 g/cm3.
 pH de los suelos: 7,4 (Débilmente alcalino).
 Contenido de materia orgánica: 1,7% (Muy bajo).

4.5. Características socioeconómicas

Según el Censo de Población y Vivienda de Bolivia 2012, la población total de la

comunidad de La Barranca alcanza a 421 habitantes, de los cuales 200 son
mujeres que representa el 45% y 221 son varones que corresponde al 55% de la
población de la comunidad respectivamente.

Para el año 2012 en la comunidad de La Barranca el número de viviendas era de

127, gracias a proyectos de mejoramiento de viviendas del Estado boliviano y
algunos organismos no gubernamentales estas han sido mejorados
sustancialmente.

La actividad económica principal de la población de la comunidad de La Barranca,

sito donde se localiza el CIIAB, es la fabricación y venta de ladrillos gambote para
la construcción de viviendas en el municipio de Sucre.

37
 En importancia le sigue la actividad agrícola caracterizada por la siembra y
producción de cultivos como papa, maíz, haba, trigo, arveja y cebada. En lo
referente a la producción pecuaria, la mayoría de la población de la comunidad se
dedica a la cría de ganado vacuno, ovino y porcino en pequeña escala.

En los últimos años y con el apoyo del Gobierno Departamental de Chuquisaca, se

han construido carpas solares familiares para la producción de hortalizas
destinadas a fortalecer la alimentación de las familias beneficiarias y para
comercializarlas en caso de haber algunos excedentes en favor de la economía de
familiar.

Otra actividad que contribuye a la economía de un sector de las familias de la

comunidad, es la albañilería que la desarrollan los hombres, también las mujeres
contribuyen con actividades como la costura de prendas de vestir y labores del
hogar.

4.6. Descripción de la empresa y/o institución

El Centro de Investigación e Innovación Agrotecnológica La Barranca (CIIAB),

académica y administrativamente depende de la Carrera de Agronomía Técnico
Superior, es la Carrera primigenia de la Facultad de Ciencias Agrarias de la
Universidad Mayor, Real y Pontificia de San Francisco Xavier de Chuquisaca.

El CIIAB, fue creado el 27 de junio del año 2011 mediante Resolución Nº 20/2011
del Consejo de la Carrera de Agronomía Técnico Superior, en la gestión del
Director de Carrera Lic. Oscar Vera Fernández con el propósito de fortalecer los
Procesos de Enseñanza Aprendizaje, Investigación, Interacción y Extensión de
Docentes y Estudiantes de la Carrera, además de desarrollar modelos de
producción agropecuaria, experimentación y validación de tecnologías en el Área
de las Ciencias Agrarias con el enfoque de innovación Agrotecnológica.

Actualmente el CIIAB es parte fundamental de la Red de Centros de Investigación

e Innovación de la Facultad de Ciencias Agrarias (RCIIFCA), instituido mediante la
Resolución del Honorable Consejo Facultativo N° 027/2018 de fecha nueve de

38
julio del año dos mil dieciocho en la gestión del Decano electo M.Sc. Oscar Vera
Fernandez.

4.6.1. Misión

Ser un Centro de producción agropecuaria basada fundamentalmente en las

ciencias agroecológicas, innovar, desarrollar y promover las diferentes técnicas de
producción integral, difundir información a través de la investigación científica que
aporte al desarrollo agropecuario y el cuidado del medio ambiente, que transmita
el concepto de calidad biológica de los alimentos para respetar así la vida a través
de la protección y recuperación de los suelos de cultivos y animales con las
buenas prácticas agropecuarias.

Trabajemos para garantizar una mejor calidad de vida a esta generación y a las
venideras con profesionales agrónomos inidóneos, competitivos y éticos que
lideren procesos agroproductivos sostenibles en el departamento y el país.

4.6.2. Visión

Ser un Centro con prestigio local, nacional e internacional mediante los procesos
de innovación tecnológica, investigación con buenas prácticas agropecuarias y
extensión con pertinencia, que permita la relación biológica de la producción del
suelo, planta, animal y el ser humano para influenciar positivamente en las áreas
medioambientales, sociales y económicas, a través de la producción integral a la
sociedad generando en la misma una cultura alimenticia y de protección al medio
ambiente.

39
40
 5. MATERIALES Y EQUIPOS

5.1. MATERIALES BIOLÓGICOS, INSUMOS, EQUIPOS, MATERIALES Y

HERRAMIENTAS

Se hace mención a todos los insumos que se utilizó en

el presente trabajo, para la limpieza del laboratorio.

 Alcohol al 70%
 Alcohol al 95%
 Lavandina al 3%
Insumos  Detergente liquido
 Agua
 Trapos de piso
 Trapos de mesa
 Escoba
 Aragan
 Papel toalla descartable
 Esponja
 Cepillos limpiatubos

Posteriormente se recoge las varetas con los brotes

más tiernos de la planta madre que es el material
biológico o vegetativo del Centro de Investigación e
Material biológico o
vegetativo Innovación Agrobiotecnología la Barranca (CIIAB).

 Membrillo (Cydonia oblonga)

41
 Para el desarrollo de la multiplicación de membrillo en
el laboratorio de cultivo in vitro se requieren materiales
que permitan como la preparación de los medios y
otros usos.

 Tubos de ensayo
 Probetas
Material de vidrio
 Frascos de vidrio
 Pipetas
 Cajas Petri
 Vasos precipitados
 Goteros
 Frascos de polipropileno
 Vasos precipitados

Los reactivos para preparar el medio para la multiplicación de

membrillo.

Establecimiento Multiplicación
Ø Ms completo (Murashige &  Ms completo (Murashige
skoog) & skoog)
Ø Azúcar  Azúcar
Reactivos
Ø Tiamina  ANA
Ø AG3 (Acido Giberelino)  IVA
 Carragenina
Ø PaCa (Pantotenato de Calcio)

Ø Myo-inositol  Medir el pH
Ø Carragenina

42
 Ø Medir el pH

El uso de los equipos y herramientas fue desde la

limpieza del laboratorio, secuencialmente de acuerdo
al avance del trabajo estos son:
 Cámara de flujo laminar
 Balanza analítica
 Balanza de precisión
 Agitador magnético
Equipos y  pH metro
herramientas
 Destilador de agua
 Autoclave
 Microondas
 Refrigerador
 Cocina
 Pinzas
 Jeringas
 Bisturí
 Gradillas

Los materiales de escritorio son muy fundamentales y

se utilizó desde el primer día, hasta la conclusión de
este trabajo de pasantía, estos son:
Material de escritorio  Papel bond tamaño carta
 Bolígrafo
 Libreta de campo
 Computadora

43
 6. PROCESO METODOLOGICO

6.1. Métodos y técnicas aplicadas

Para realizar el Trabajo de Grado en la Modalidad de Pasantía, se ha tomado en

cuenta el siguiente organigrama.

MULTIPLICACION DE MEMBRILLO IN VITRO

Efectuar la multiplicación de 500 plantines in vitro de membrillo (Cydonia

oblonga) mediante el método de propagación por esquejes en el laboratorio de
cultivo in vitro del Centro de Investigación e Innovación Agrotecnológica la
Barranca (CIIAB).

OBJETIVOS ACTIVIDAD TECNICA

OBJETIVO 1  Preparación de
Establecer protocolos medio
de multiplicación por  Autoclavado  Practico
esquejes in vitro para  Colecta de
membrillo material vegetal

OBJETIVO 2
Realizar el  Evaluación y
 Autoevaluación observación
seguimiento al  Toma te datos
desarrollo vegetativo  Toma de datos
en laboratorio

Objetivo 3
 Porcentaje de  Evaluación y
Evaluar el porcentaje prendimiento
44 observación
de desarrollo y  Porcentaje de  Toma de tatos
mortandad en la mortandad
multiplicación de
membrillo in vitro.
6.2. DESCRIPCION DE LAS ACTIVIDADES DESARROLLADAS

6.2.1. Reconocimiento del laboratorio productivo asignado para realizar la

pasantía

En fecha 16 de agosto de 2023 conjuntamente con la Agr. Fátima Duarte Royder

responsable del Laboratorio de Cultivos In Vitro, se realizó el reconocimiento del
laboratorio de cultivo in vitro con el objetivo de conocer y recibir información
técnica de las características del laboratorio y otros aspectos de organización del
trabajo de campo a realizar para la ejecución de la Pasantía.

6.3. OBJETIVO Nº 1 Establecer protocolos de multiplicación por esquejes in

vitro para membrillo

6.3.1. Limpieza y desinfección del ambiente

En fecha 16 de agosto se inició con la primera limpieza del laboratorio se realiza

una vez por semana de todos los ambientes del laboratorio, para la eliminación de
todas las partículas de polvo.

Se utilizo:

 30 gr Detergente en polvo (Ase Surft)

45
  4L de Agua
 0,10L de Lavandina al 3%
 2 Trapos de piso

Para hacer una correcta desinfección se ha tenido en cuenta los siguientes pasos
de limpieza:

 Se inicia con la limpieza de los mesones con trapo de mesa.

 Seguidamente barremos todos los ambientes del laboratorio.
 Trapeamos con el respectivo trapo y haragán de piso con la disolución de
lavandina al 3% y agua preparada en un recipiente no metálico.
 Y por último repasamos los mesones con el alcohol etílico al 70% y toallas
de papel desechables.

Se tiene utensilios únicos para la limpieza, de esa manera se evita la

contaminación cruzada.

6.3.2. Lavado y desinfectado de tubos de ensayo

El lavado y la desinfección de los tubos de ensayo se hizo en una bandeja, se usó

los siguientes insumos:

 2L de Agua hervida

46
  5ml de Detergente liquido
 0,10L de Lavandina al 3%
 1 cepillo para tubos de ensayo

6.3.3. Preparado de medio para el establecimiento de membrillo

Medio de cultivo

La preparación del Medio de cultivo para el establecimiento, se realizó en fecha 17

de agosto de 2023.

Reactivos de establecimiento

REACTIVOS PESO
Ms completo (Murashige skoog) 4,33 gr/l
Azúcar 25 gr/l
Tiamina 0,4 mg/l
Ag3 (Acido giberelico) 0,3 mg/l
PACA (Pantetonato de calcio) 2 ml/l
Myo-inositol 100 mg/l
pH 7,5
Carragenina 13 gr/l

47
La preparación del Medio de cultivo para la multiplicación y enraizamiento, se
realizó en fecha 5 de octubre de 2023.

Reactivos de multiplicación

REACTIVOS PESO
Ms completo (Murashige skoog) 4,33 gr/l
IBA 0,1 gr/l
ANA 0,3 mg/l
Azúcar 30 gr/l
pH 6,5
Carragenina 13 gr/l
Fuente. - Elaboración propia

Preparación de medio de establecimiento:

a) Se inicia la preparación midiendo el agua destilada de 1L en una probeta y se

lo hecha en un vaso precipitado para la agitación con el magneto.
b) Pesamos el Ms completo 4,33gr exactos en la balanza analítica y se lo
incorpora al agua destilada.
c) Pesamos azúcar de la misma manera 25gr y lo incorporamos.
d) En una jeringa medimos la Tiamina 0,4ml sin ninguna burbuja y lo echamos a
la preparación.
e) De la misma manera medimos el Ag3 0,3ml.
f) Se mide el reactivo PACA 2ml y lo incorporamos al mismo.
g) El Myo-inositol pesamos 100mg en la balanza de precisión.
h) Antes de incorporar el ultimo reactivo medimos el pH que debe de ser 5.7 (Si
el pH esta alto se baja con un ácido, y si está bajo se lo sube con Hidróxido
de sodio hasta llegar al pH indicado).
i) Por último, incorporamos Carragenina 13gr.
j) Todo está preparación lo calentamos en el microondas de 5 a 7 min hasta
que llegue a un proceso de ebullición.

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Preparación de medio de multiplicación:

a) Se inicia la preparación midiendo el agua destilada de 1L en una probeta y se

lo hecha en un vaso precipitado para la agitación con el magneto.
b) Pesamos el A 0,1mg exactos en la balanza de precisión y se lo incorpora al
agua destilada.
c) Pesamos ANA de la misma manera 0,3mg y lo incorporamos.
d) Se pesa el 3% de 1000ml que es 30gr por litro y se incorpora a la
preparación.
e) Antes de incorporar el ultimo reactivo medimos el pH que debe de ser 5.7 (Si
el pH esta alto se baja con un ácido, y si está bajo se lo sube con Hidróxido
de sodio hasta llegar al pH indicado).
f) Por último, incorporamos Carragenina 13gr.
g) Todo está preparación lo calentamos en el microondas de 5 a 7 min hasta
que llegue a un proceso de ebullición.

6.3.4. Dosificación de los tubos

49
Para el medio preparado en liquido se utiliza jeringas de 20ml para la dosificación
de los tubos de ensayo con una cantidad de 3ml de medio por tubo de ensayo
para posteriormente cerrar con sus respectivas tapas.

6.3.5. Autoclave

Terminando con la dosificación se procede con el autoclavado de las gradillas con

sus respectivos tubos de ensayo, también las herramientas para manipular en la
cámara de flujo laminar, tales como agua destilada, pinzas, cajas Petri y bisturí a
una temperatura de 121ºC durante 15 minutos.

50
6.3.6. Recolección de material vegetal de membrillo para establecimiento

En fecha 24 de agosto de 2023 del Centro de Investigación e Innovación

Agrobiotenologica la Barranca (CIIAB), se recolecto a horas 7:30 am y se
seleccionó varetas porta yemas jóvenes de las plantas madres vigorosas y libres
de enfermedades de Membrillo de la variedad Común con la tijera podadora
anteriormente desinfectada con alcohol etílico al 70%, en primera instancia se
sacó los brotes más tiernos para asegurar el prendimiento y/o brotación dentro del
medio de establecimiento. Lo llevamos a laboratorio.

En el laboratorio se le saca las hojas sin dañar el tejido y las yemas,

posteriormente se lava las varetas con el cepillo de dientes y agua quitando los
pequeños pelos blancos y finos que tiene.

Se corta las varetas porta yemas en segmentos nodales(esquejes) en un tamaño

de 1 a 1.5 cm con una a dos yemas por cada nodal.

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6.3.7. Desinfección del material vegetal

 Como primer paso se desinfecta con agua corriente y un chorro (0,8ml) de

detergente líquido realizando 3 enjuagues hasta quitar toda la espuma.
 Segundo paso se pesó 2gr de fungicida de uso agrícola CURALANCHA
para un litro de agua destilada medida en la probeta, se enjuago 2 veces
con agua destilada y se lo sumerge los segmentos nodales (Esquejes) de
membrillo durante aproximadamente 15 minutos.

52
6.3.8. Desinfección de la cámara de flujo laminar

Es el área de repicaje y siembra.

Se hace la desinfección de toda la cámara de flujo laminar con alcohol al 70% y
algodón, se lo limpia la parte trasera como también paredes de los laterales, del
frente y de la parte de abajo donde se trabaja con el movimiento de arriba hacia
abajo, también desinfectamos la mesa donde se pone todas las herramientas en
uso como todo el ambiente con las cuatro lámparas UV que cuenta la cámara
durante 15 minutos.

6.3.9. Acondicionamiento y desinfección de material vegetal dentro de la

cámara de flujo laminar

Se introduce todo el material de uso tales como:

 Alcohol al 70%
 Agua destilada autoclavada
 Material vegetal desinfectada
 Pinzas y bisturí

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  Cajas Petri
 Gradillas con los tubos dosificados

Se hizo el lavado y desinfección oportuna del material vegetal en el área de lavado

y dentro de la cámara de flujo laminar se los desinfecta con agua destilada dos
veces durante 5 minutos

El material vegetal se lo enjuaga tres veces con el agua destilada y se procede

con el establecimiento.

6.3.10. Establecimiento

En fecha 24 de agosto de 2023. Teniendo todo el material autoclavado y

desinfectado se lo pone en la cámara de flujo laminar, se procedió con la siembra
de los esquejes con la ayuda del bisturí y la pinza incorporando al tubo de ensayo,
siempre flameando en el mechero con alcohol al 70% para eliminar algún
contaminante para luego sellar el tubo con film y poner el nombre y la fecha del
día establecido que fue de 160 esquejes.

Posteriormente se lo lleva al área de crecimiento, para evaluar cada dos semanas

hasta que crezca hasta un tamaño considerable para la pertinente multiplicación.

54
6.3.11. Multiplicación

En fecha 12 de octubre de 2023. Teniendo todo el material vegetal de los nuevos

explantes establecidos se lo lleva y se pone en la cámara de flujo laminar,
procediendo con el repicaje de la plántula sacando nuevos esquejes y se opera
con la siembra de los nuevos esquejes con la ayuda del bisturí y la pinza
incorporando al tubo de ensayo, siempre flameando en el mechero con alcohol al
70% para eliminar algún contaminante para prontamente sellar el tubo con film y
poner el nombre y la fecha del día de la multiplicación que fue de 30 esquejes.

55
 6.3.12. Área de crecimiento

Una vez terminado con el establecimiento de los tubos de ensayo con los
explantes se los lleva al ambiente de crecimiento donde se programó fotoperiodos
de 16 horas luz, 8 horas de oscuridad y una temperatura de 22ºC que se apaga
automáticamente a las 11:00 pm y se prende de la misma manera se prende a las
7:00 am.

6.4. OBJETIVO Nº 2 Realizar el seguimiento al desarrollo vegetativo en

laboratorio.
6.4.1. Evaluación del desarrollo vegetativo

Establecimiento

NUMERO ESTABLECIMIENTO CANTIDAD FECHA INICIO 1ª EVALUACION C N B

1 Establecimiento 160 24/08/2023 6/9/2023 11 121 28

3 Establecimiento 240 28/09/2023 17/10/2023 59 142 39

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 El presente cuadro nos permite observar que en las primeras fechas se
establecieron 400 explantes para su brotación y/o germinación vegetativa con las
evaluaciones necesarias para su respectiva multiplicación de los nuevos brotes.

Multiplicación

La primera evaluación de los primeros 30 explantes establecidos (5 de octubre de

2023) se realizó en fecha 25 de octubre de 2023, los parámetros que se tomaron
fue explantes contaminados (C) y no contaminados (N).

NUMERO MULTIPLICACION CANTIDAD FECHA INICIO 1ª EVALUACION C N

1 Multiplicación 100 5/10/2023 25/10/2023

6.4.2. Evaluación al porcentaje de brotación

En fecha 7 de septiembre se hizo la primera evaluación del número de brotes, se

revisó detenidamente cada detalle para ver los primeros brotes de los esquejes
establecidos.

NUMERO MULTIPLICACION CANTIDAD FECHA INICIO 1ª EVALUACION BROTES

1 Multiplicación 100 5/10/2023 25/10/2023

6.5. OBJETIVO Nº 3 Evaluar el porcentaje de desarrollo y mortandad en la

multiplicación de membrillo in vitro.

6.5.1. Evaluación al porcentaje de mortandad

NUMERO MULTIPLICACION CANTIDA FECHA 1ª EVALUACION MORTANDA

D INICIO D

1 Multiplicación 100 5/10/202 25/10/2023

3
2 Multiplicación

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6.6. Evaluación de los 500 explantes establecidos y multiplicados

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7. RESULTADOS

En función a los objetivos planteados se lograron los siguientes resultados

Preparado de medio para el establecimiento de membrillo

REACTIVOS PESO
Ms completo (Murashige skoog) 4,33 gr/l
Azúcar 25 gr/l
Tiamina 0,4 mg/l
Ag3 (Acido giberelico) 0,3 mg/l
PACA (Pantetonato de calcio) 2 ml/l
Myo-inositol 100 mg/l
pH 7,5
Carragenina 13 gr/l

El siguiente cuadro nos permite apreciar la cantidad de reactivos utilizados para el

establecimiento de membrillo

 Ms completo (Murashige skoog) 4,33 gr/l

 Azúcar 25 gr/l

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