II CURSO INTERNACIONAL CULTIVO DE LA FRESA

METODOS ALTERNATIVOS DE PRODUCCION DE PLANTA DE FRESA.

MULTIPLICACION INDUSTRIALIN VITRO.

J.M. López-Aranda
CIFA Málaga-Churriana

Consejería de Agricultura y Pesca.

Dirección General de Investigación y Formación Agraria y Pesquera.
Métodos alternativos de producción de planta de fresa.
Multiplicación industrial in vitro.

Autor: J.M. López Aranda (CIFA Málaga-Churriana)

Indice de la versión word para el II Curso Internacional Cultivo de la Fresa.

Boxus (+) (1974, 1975) diseñó un procedimiento industrial de
multiplicación in vitro de plantas de fresa, a partir de ápices caulinares
que se creía revolución en el sistema tradicional de producción de
plantas de esta especie.

La fresa fue la primera especie de interés agronómico en la que se uso

masivamente el cultivo in vitro como procedimiento a escala industrial de
producción de plantas.

Dicho procedimiento fijaba con claridad las tres fases clásicas del cultivo
in vitro;

.- inicio (cultivo de meristemos)

.- multiplicación

.- enraizamiento in vitro
Medio de cultivo para fase de INICIO propuesto por Boxus (1974,1975)

*Medio solidificado con Agar.

*Enriquecido con los elementos nutritivos clásicos adecuados:
macroelementos, microelementos, vitaminas, hidratos de carbono, etc;
*Añadiéndose una combinación de reguladores de crecimiento
(fitohormonas) a base de:

Auxinas (generalmente 1 mg/l de de AIB, ácido indolbutírico),

Citoquininas (0,1 mg/l de BA, BAP, benziladenina),
Giberelinas (0,1 mg/l de GA3).

En concreto, sugería el medio de cultivo de Knop para la fresa.

Esta fase de inicio, varias semanas de duración (3-6), permite producir

una única planta a partir de cada ápice caulinar (meristemo) que es
transferida a la fase de multiplicación.
Medio de cultivo para fase de MULTIPLICACION propuesto por Boxus
(1974,1975)

Mismo medio para la fase de inicio pero:

Auxinas (generalmente 1 mg/l de de AIB, ácido indolbutírico),

Con concentración aumentada 10 X de benciladenina (1,0 mg/l de BA).
Giberelinas (0,1 mg/l de GA3).

En este caso, debido a la acción de esta citoquinina benciladenina, que

induce la formación de tallos axilares contrarrestando la dominancia
apical, la plántula in vitro crece de modo distinto y se transforma en
una masa (colonia) de yemas y tallos sin raíces.

Esta fase de multiplicación se realiza en ciclos denominados

subcultivos, de una duración entre 3 y 7 semanas,
que produce una teórica progresión geométrica,
cuya razón podemos denominar tasa de multiplicación (número de
tallos producidos/tallo iniciado/subcultivo),
oscilando dicha tasa entre 6 y 20 según autores.
Medio de cultivo para fase de ENRAIZAMIENTO propuesto por Boxus
(1974,1975)

Mismo medio para la fase de inicio pero:

Auxinas (generalmente 1 mg/l de de AIB, ácido indolbutírico),

Retirando la citoquinina benciladenia,

Giberelinas (0,1 mg/l de GA3).

Fase única de duración entre 4 y 6 semanas.

Este procedimiento industrial fue asumido con interés por los
viveristas europeos, holandeses, franceses, británicos e italianos,
principalmente, a finales de los años 70.

También por parte de la Investigación pública Norteamericana y de

países del Este (URSS, Polonia, Rumanía, etc.):

Ya que suponía lo que se pensaba eran ventajas evidentes frente a la

producción convencional de plantas in vivo de fresa:

*Permitía el saneamiento del material (liberación de virus y otras

enfermedades) en la fase de INICIO mediante el cultivo de cúpulas
meristemáticas de tamaño inferior a 1 mm.

*Asumía la posibilidad de realizar un número de ciclos de cultivo in vitro

(subcultivos) ILIMITADO (ad infinitum) en la fase de multiplicación, lo
que permitía la obtención de varios millones de plántulas/año a partir de
un ápice caulinar (meristemo) iniciado.

*Posibilitaba el USO DIRECTO de estas plantas, tras su aclimatación ex

vitro, como productoras de fruto.
Sin embargo, es bien conocido, que desde los primeros años de uso de
esta técnica de producción alternativa de plantas de fresa
(micropropagación), comenzaron a observarse anomalías fisiológicas,
fenotípicas y morfológicas.

Con sus correspondientes consecuencias negativas de tipo

agronómico, principalmente en los campos de fructificación.

(por ejemplo, en la zona de cultivo italiana de Cesena en Emilia-

Romagna), que contenían este tipo de material vegetal, directo ex vitro e
incluso en la primera generación de multiplicación in vivo.

Algunas Referencias de episodios de alteración fenotípica:

Aparición de rasgos de juvenilidad en plantas micropropagadas:
incrementode yemas axilares y ramilletes florales: descenso del calibre
de los frutos (Sansavini y Gherardi, 1980; Schaeffer et al., 1980; Swartz y
Lindstrom, 1986).

Aparición de Cambios morfológicos como enanismo o portes erectos y/o

arbustivos, que se separaban de las características normales de las
plantas multiplicadas convencionalmente.

Aumento de susceptibilidad a ciertas enfermedades criptogámicas

(D’Ercole y Nipoti, 1979; Rancillac y Nourrisseau, 1980).

En general, se describieron numerosos episodios de clorosis tipo

"June yellows", "White streaks", y otros, así como aparición de
individuos variegados.
Variantes somaclonales de Chandler
El conjunto de problemas descritos creó una polémica internacional
sobre el tema desde principios de los años 80.

Se cuestionó la técnica de cultivo in vitro de la fresa en Europa y Estados

Unidos (California).

Abandonando la mayor parte de los viveristas su utilización a escala

industrial.

Cayendo incluso en una pobre reputación (Dijkstra y Van Oosten, 1979,

1980) en Holanda, Jones (1987) en Inglaterra, Sansavini et al. (1982) en
Italia, y Nelson (1987) en California, etc.

Así, a modo de ejemplo, la producción italiana de plantas in vitro de fresa,

que era de varios millones a finales de los 70 descendía a no más de
15.000 plantas en 1989.
Las dudas sobre la estabilidad fenotípica del material vegetal de fresa
multiplicado in vitro (micropropagado) y cultivado en campo a
continuación, aún siguen vigentes en los tiempos actuales.

De hecho, en el Informe Final del Meeting de Expertos en Frutas del

ámbito de la Oficina Comunitaria de Variedades Vegetales (CPVO),
celebrado en Angers (Francia) entre el 8 y el 9 de Octubre de 2002, se
aprobó un nuevo test guía para los ensayos DHE para la protección
comunitaria de variedades de fresa que introducía en el apartado de
“condiciones sobre el material vegetal a testar” que éste no debería
haber sido obtenido directamente por cultivo in vitro. Así, figuran las
siguientes correcciones en el nuevo documento CPVO-TP/22/1 Draft-4 de
17 de Enero de 2003 (los países indicados son aquellos en los que la
CPVO realiza estos tests en Europa, respecto a los que se realizan en
España, nuestro equipo de trabajo en coordinación con la OEVV-MAPA,
es el responsable de los mismos.
Las dudas sobre la estabilidad fenotípica del material vegetal de fresa
multiplicado in vitro (micropropagado) y cultivado en campo a
continuación, aún siguen vigentes en los tiempos actuales.

A modo de ejemplo reciente:

Informe Final del Meeting de Expertos en Frutas del ámbito de la Oficina

Comunitaria de Variedades Vegetales (CPVO), celebrado en Angers
(Francia) entre el 8 y el 9 de Octubre de 2002, se aprobó un nuevo test
guía para los ensayos DHE para la protección comunitaria de variedades
de fresa que:

introducía en el apartado de “condiciones sobre el material vegetal a

testar” que éste no debería haber sido obtenido directamente por cultivo
in vitro.

Así, figuran las siguientes correcciones en el nuevo documento CPVO-

TP/22/1 Draft-4 de 17 de Enero de 2003:
“3. Plant material requirements

Survey of final dates for request for technical examination and sending of
Technical Questionnaire by the CPVO as well as submission date of plant
material by the applicant.
Request of Plant material Plant material requirements
examination

15/07 31/08 40 well-rooted, vigorous, virus-tested potted

FRANCE fresh plants. Plants should not have been
obtained directly by in vitro culture.

(v) 15/07 (v) 31/08 (v) 30 well-rooted, vigorous, virus-tested potted

GERMANY fresh plants. Plants should not have been
(s) 15/11 (s) 15/12 obtained directly by in vitro propagation.
(s) 1.5 g seed; minimum germination capacity
60%

PORTUGAL 31/10 30/11 40 virus-tested plants packed in such a way

as to prevent dehydration. Plants should not
have been obtained directly by in vitro
culture.

SPAIN 31/07 15/10 30 well-rooted, vigorous, virus-tested, potted

fresh plants. Plants should not have been
obtained directly by in vitro culture.
Con objeto de paliar los problemas descritos, ya desde hace años se
ha seguido un proceso alternativo de cultivo in vitro denominado por
Arias (1988) y otros autores “macro-propagación”:

Basado en la utilización de la técnica para producir una única planta a

partir de un ápice caulinar, siguiendo la posterior multiplicación
mediante los métodos convencionales in vivo.

Este procedimiento ofrece la ventaja del saneamiento pero abandona

las tradicionales ventajas de multiplicación acelerada del material.

En definitiva, la fase in vitro quedaba reducida a lo que hemos llamado

fases de inicio y de enraizamiento.
El hecho de ser la fresa la primera especie de interés agronómico en la
que se aplicaron procedimientos industriales de producción in vitro,

dió lugar a recapacitar acerca de las causas de los fracasos

agronómicos obtenidos

y a estudiar posibles soluciones para recuperar esta eficiente técnica

de multiplicación;

pudiendo por otra parte servir de modelo a problemas similares que se

vislumbraban en los años 80 y 90 en otras especies de interés agrícola,
como frambuesa, zarzamora, alcachofa, espárrago, ajo, platanera
(banano), etc.
Paralelamente a la descripción de los problemas fenotípicos y
agronómicos surgidos, se fueron lanzando hipótesis y estudiando las
posibles causas de las alteraciones observadas.

Pronto se ligaron estos problemas de inestabilidad fenotípica a las

técnicas de cultivo in vitro que se habían generalizado en la última mitad
de los años 70.

1º) Se relacionó la incorporación de citoquininas (particularmente,

benziladenina: BA ó BAP) al medio de multiplicación con los problemas
fenotípicos citados,

Ya que efectos similares se habían observado por numerosos

autores tras aplicaciones exógenas a plantas in vivo.

Boxus (+) (1974, 1975), había sugerido la incorporación sistemática de

una concentración estandarizada de 1 mg/litro de BA al medio de
multiplicación.
2º) Aunque el fenotipo de la fresa es bastante estable en el campo, esto
no ocurre cuando los tallos producidos in vitro son de origen
adventicio;

Así, estudios de Marcotrigiano et al. (1984, 1987) indicaron que al añadir

concentraciones de BA superiores a 0,33 mg/l al medio de cultivo, se
producía una alta proporción de formación adventicia.

Así, ya desde principios de los años 80 comenzó a recomendarse el uso

de la menor concentración de citoquininas posible en los medios de
cultivo in vitro de fresa, siempre que se obtuviera una adecuada tasa de
multiplicación.
3º) Además de la adición de citoquininas, otros autores, como Navatel
(1983) y Rancillac et al. (1987), habían llamado la atención sobre la
responsabilidad del número de subcultivos in vitro en la presencia de
frutos de menor tamaño y en la aparición de plantas anormales;

En esta línea, se ha sugerido reducir el número de subcultivos en cada

proceso de micropropagación a no más de 10-11.

Zimmerman (1991) observó que también puede influir la amplitud

(duración) de cada subcultivo, pues la realización de subcultivos muy
frecuentes (o sea, de muy poca duración) favorece la formación de tallos
adventicios.

Boxus (+) (1974, 1975), había sugerido la realización ilimitada (ad

infinitum) de subcultivos in vitro.
4º) También se ha señalado la utilización generalizada de medios de
cultivo para cualquier variedad;

(en definitiva, la elección de formulaciones minerales inadecuadas para

el genotipo a micropropagar).

Boxus (+) (1974, 1975), había sugerido la formulación mineral de Knop

(pobre), mientras que otros autores sugerían la formulación mineral de
MS (Murashige y Skoog, 1962) (rica);

Que sospechamos son las empleadas mayoritariamente en los trabajos

de investigación y de uso comercial.

Ambas formulaciones minerales son las extremas en concentración

iónica (concentración de nutrientes) de entre las más conocidas para
cultivo in vitro.
Podemos destacar resumiendo:

lo adecuado de la utilización de técnicas que hagan mínima la

presencia de callo en la base de las colonias de tallos durante el
proceso in vitro,

para evitar la proliferación de material adventicio causante de

inestabilidad fenotípica, frente a material axilar

Una vez conocidas, con relativa seguridad, las causas de los problemas
de inestabilidad fenotípica anteriormente descritos,

se ha pasado a una lenta pero significativa reapreciación de la técnica

de micropropagación de fresa (Boxus, 1992), a través de importantes
modificaciones en los planteamientos originales:
*Uso generalizado de la técnica únicamente en la obtención de material
(F0) inicial en el proceso de certificación y control de planta de vivero
(es decir, un meristemo-una planta).

*O en su caso una moderada micropropagación industrial a base de:

.-Mantenimiento de los reguladores de crecimiento, y en particular la

citoquinina BA, a las menores concentraciones posibles en la fase de
multiplicación, que permitan una tasa de multiplicación aceptable (4-6
tallos axilares viables/mes de subcultivo).

.-Restricción del número de subcultivos (menos de 10 a partir de cada

ápice caulinar). Incluso en algunos casos (máximo de 3-4 subcultivos).

.-Uso exclusivo de las plantas micropropagadas como plantas madre, y

nunca directamente como material de producción de fruto.

.-Inicio del proceso de micropropogación con una cierta cantidad de

explantos, y no desde un único meristemo.

.-Adaptación de medios de cultivo in vitro al comportamiento de cada

variedad específica.
El abandono de la técnica de multiplicación in vitro (micropropagación)

el uso únicamente de la macropropagación (es decir obtención

únicamente de material F0 inicial)

supondría perder una valiosa herramienta de producción masiva de

material sano y de calidad,

así como de independencia tecnológica y comercial.

Estos y otros datos parecían justificar sobradamente que, a partir de 1986,
nuestro equipo de trabajo iniciara y culminara diversos proyectos de
investigación para el estudio de los procesos de micropropagación de
fresa,

a la luz de las hipótesis anteriormente señaladas,

y su influencia en el comportamiento agronómico y morfológico posterior

en las variedades de origen californiano Douglas y Chandler

que en aquellos años eran de cultivo mayoritario en España.

Estudiamos en concreto los siguientes aspectos de la micropropagación
de ambas variedades de fresa:

1.- Efecto en el establecimiento de los cultivos in vitro, del tamaño y

fecha de recolección de los explantos.

2.- Selección de una formulación mineral adecuada para el medio de

cultivo.

3.- Selección de las concentraciones adecuadas de la citoquinina BA

en la fase de multiplicación.

4.- Efecto del número y duración de los subcultivos en la fase de

multiplicación.

5.- Estudio de técnicas que permiten disminuir la cantidad de callo en la

base de los cultivos.
6.- Estudio del proceso de enraizamiento in vitro y aclimatación de
ambos cultivares.

7.- Enraizamiento in vivo del material micropropagado.

8.- Estudios en vivero a nivel del mar del material micropropagado

en las diferentes formulaciones minerales, niveles de BA y número
de subcultivos.

9.- Estabilidad fenotípica y aptitud como plantas madre comparando

con material importado multiplicado mediante técnicas in vivo.

10.- Estudio del material primera generación in vivo y sucesivas

generaciones como plantas productoras de fruto (productividad,
tamaño de fruto, calidad y estabilidad fenotípica).
Después de varios años de trabajo, pudimos reunir una serie de
conclusiones en el siguiente esquema, aplicadas a la multiplicación in
vitro de fresa, tomando como modelo la variedad Chandler:

1º.-Realización de selección masal de individuos que muestren las

características morfológicas y agronómicas adecuadas del cultivar, en
campos de fructificación de nuestra zona.

2º.-Tratamiento de termoterapia e indexaje en clones silvestres de

Fragaria vesca para garantizar su sanidad frente a virus. Conservación
del material en recintos insect-proof.

3º.-Iniciar los cultivos in vitro a partir de explantos extraídos de jóvenes

estolones emitidos por dichas plantas madre en los meses de Mayo y
Junio, utilizando ápices caulinares de 1-2 mm de tamaño.
4º.-La utilización formulaciones minerales de riqueza nutriente
intermedia;

concretamente la formulación N30K (Margara, 1984) nos permitió

obtener material de buena calidad con una aceptable tasa de
multiplicación.

Cuando utilizábamos formulaciones minerales de alta concentración

iónica, formulación de Murashige y Skoog (1962), se obtenían tallos
vitrificados de aspecto suculento,

mientras que las de baja concentración iónica, formulación de

Knop, daba lugar a tallos de excelente aspecto pero la tasa de
multiplicación obtenida era muy pequeña.

5º.-Utilizar, sin variación, la formulación mineral N30K en las tres fases

de la micro-propagación.
6º.-La variedad Chandler resultaba tener pequeños requerimientos de
citoquinina BA durante la fase de multiplicación, de modo que
encontrábamos tasas de multiplicación óptimas en el nivel 0,33 mg/l de
BA añadido al medio de cultivo

(en el caso de la variedad Douglas dicho nivel de BA con tasas óptimas

de multiplicación era ligeramente más elevado, entre 0,33 y 0,66 mg/l de
BA).

Niveles de 1,00 mg/l de BA, o superiores, disminuían la tasa de

multiplicación y la calidad del material in vitro obtenido en cada
subcultivo.

Ello nos permitió en nuestros trabajos, desde hace años, hacer coincidir
nuestros óptimos (0,33 mg/l de BA), con las recomendaciones de
diversos autores (por ejemplo los citados Marcotrigiano et al. (1984,
1987) ), de reducir las concentraciones de citoquinina BA que antes
comentábamos. Incluso concentraciones de 0,165 mg/l (6 veces
menores de las habitualmente utilizadas), próximas al 0,1 mg/l de BA
nos ha permitido inducir una aceptable tasa de multiplicación en la
variedad Chandler.
7º.-La frecuencia de subcultivo óptima ha resultado ser de 7 semanas;
con una tasa de multiplicación media de 4 tallos viables por mes de
subcultivo, en el sistema normal de colonias de tallos.

8º.-El número de subcultivos (ciclos de multiplicación in vitro) máximo

que recomendamos es de 6 a 8; sin embargo, a efectos prácticos,
nuestros resultados avalan un ciclo anual de micropropagación,
permitiendo un máximo de 5-6 subcultivos del material procedente de
un mismo ápice caulinar (yema axilar).

Ello es así porque el ciclo anual comienza en Mayo-Junio, cuando

comienza el estolonado de las plantas madre (en estas latitudes del
hemisferio Norte), con el establecimiento de los cultivos in vitro
(fase inicial, 6 semanas) y finaliza en Abril-Mayo con el material
aclimatado y endurecido ex vitro (al menos 8 semanas), dispuesto a ser
transferido a multiplicación en vivero.

Comenzando de nuevo otro ciclo anual con la extracción de nuevos

explantos: Mayo-Junio (fase inicial), multiplicación in vitro, Abril-Mayo
final de aclimatación ex vitro.
9º.-En la fase de enraizamiento in vitro (6 semanas), la adición de 500
mg/l de carbón activo al medio de cultivo, impide o disminuye de manera
significativa la aparición de callo en la base de las colonias de tallos
axilare y acelera la emisión de raíces.

Sin embargo, es de tal sencillez y seguridad el enraizamiento in vivo del

material de la variedad Chandler, que nos ha servido de modelo general
para la totalidad de las entradas del género Fragaria, que el ahorro
económico, en tiempo (6 semanas), y la disminución de riesgos de
contaminación, hacen recomendable abandonar el enraizamiento in
vitro, pasando directamente desde la fase de multiplicación a la de
enraizamiento-aclimatación in vivo.

No obstante en aquellos casos que se haga necesaria la obtención de

plántulas in vitro perfectas y muy enraizadas, por ejemplo para la
obtención única y exclusivamente de material F0, podría ser adecuado
realizar una fase de enraizamiento in vitro de plántulas individuales
directamente procedentes de la fase inicial o cultivo de meristemos.
10º.-La fase de enrazimiento-aclimatación in vivo (ex vitro) no es crítica
si se dispone de instalaciones adecuadas (túneles de nebulización y
bancadas de aclimatación) en invernadero climatizado.

Recuérdese que este proceso coincide en nuestro esquema y en

cualquier otro que emplee nuestro sistema de viverismo, con los meses
de invierno Febrero-Marzo (en el hemisferio Norte).

11º.-Desde hace años hemos confirmado una alta estabilidad fenotípica

en vivero del material micropropagado de la variedad Chandler (como
modelo para variedades modernas de día corto) y una capacidad de
estolonado comercial superior a la del material del mismo cultivar
obtenido por técnicas convencionales in vivo.
12º.-La capacidad de producción de fruto no se ha visto afectada por el
sistema de multiplicación utilizado.

Con una total ausencia de diferencias en campos de fructificación, en

calibre de fruto,
reparto en categorías comerciales,
precocidad, etc.,
entre plantas primera generación ex vitro
y obtenidas por técnicas convencionales,

no habiéndose detectado ninguna anomalía ligada a los procesos de

micropropagación.
No obstante, en general, la micropropagación de la fresa in vitro sigue
siendo una práctica de producción de plantas temida y desprestigiada
en el sector comercial;
Puede ser debido a diversas causas reales o imaginarias.

*desconfianza en procesos de laboratorio no conocidos.

*tendencia a achacar fallos a terceros, cuando la responsabilidad es

propia.

*posibles protocolos de trabajo in vitro no bien testados ni conocidos

por los propios laboratorios de cultivo in vitro (no puede trabajarse
con meras recetas).
Es habitual ante la presencia de fenómenos adversos en la
multiplicación en vivero de plantas micropropagadas,

como variaciones del fenotipo, síndromes ligados a filodios

(que pueden ambos tener causas puramente naturales del proceso in
vivo),

responsabilizar ese erróneo comportamiento a las técnicas in vitro

utilizadas.

Por ello, es imprescindible realizar un trabajo previo de testaje de los

procedimientos utilizados antes de lanzarse a una producción a escala
comercial mediante estas técnicas in vitro.
En definitiva, entre 1986 y 1992 habíamos puesto a punto un método de
micropropagación para las variedades de origen californiano Douglas y
Chandler que produjo material vegetal cuya primera generación ex vitro no
mostró diferencias morfológicas o agronómicas respecto al material
estándar propagado usado como testigo.

Recordemos que este método incluía la utilización de una

solución mineral cuyos niveles de macroelementos eran
inferiores a las de la formulación MS, unas concentraciones
de citoquinina en el rango 1,48-2,96 µM (0,33-0,66 mg/l),
inferiores a las propuestas por Boxus (1974), y la limitación del
número de subcultivos hasta un máximo de 8.

Sin embargo, esos trabajos de investigación se realizaron en condiciones

ligeramente distintas a las estandarizadas en el sector fresero español; por
ejemplo, multiplicación de plantas madre a nivel del mar, en parcelas
situadas en Churriana (Málaga).
Por otra parte, los ensayos de fructificación se realizaron en Chipiona
(Cádiz) (López-Aranda et al., 1994b). O sea, los resultados se obtuvieron en
una situación algo diferente al mundo del viverismo y producción de la
fresa en España.
 1990
Condiciones establecidas para micropropagación de la variedad Chandler.

Tamaño explantos 0,5-1,0 mm

Fecha inicio Mayo-Junio

Fase inicio 6 semanas

Formulación mineral N30K (todas las fases)

Período de subcultivo 7 semanas

Número máximo de subcultivos 4-5

Concentración BA 1,48µM (0,33 mg/l)

Nivel irradiancia 40 µm.m.s

Enraizamiento in vitro No

Inicio aclimatación ex vitro Febrero

Envío a vivero Abril

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO
 Estadillo para
la fabricación del
medio de cultivo
N30K (Margara),
fase de inicio en
fresa
(1ª hoja)
 Estadillo para
la fabricación del
medio de cultivo
N30K (Margara),
fase de inicio en
fresa
(2ª hoja)
 Estadillo para
la fabricación del
medio de cultivo
N30K (Margara),
fase de multiplicación
en
fresa
(1ª hoja)
 Estadillo para
la fabricación del
medio de cultivo
N30K (Margara),
fase de multiplicación
en
fresa
(2ª hoja)
 PREPARACION Y SIEMBRA DE
EXPLANTOS (CUPULAS MERISTEMÁTICAS)
PARA LA FASE DE INICIO
 Meristemo de la yema apical del
estolón

Meristemo de las yemas axilares de las

hojas en los filamentos estoloníferos

Meristemos de la yemas axilares

de las hojas principales del estolón
INICIO DE CULTIVOS (FASE I MERISTEMOS)
FASE II MULTIPLICACION
 FASE III ENRAIZAMIENTO IN VITRO
(CREEMOS QUE NO ES NECESARIA EN FRESA)
CAMARAS DE CULTIVO (FITOTRONES) Y DE
CONSERVACION IN VITRO
ENRAIZAMIENTO Y ACLIMATACION
EX-VITRO
 ALGUNOS RESULTADOS PARA LA PUESTA A PUNTO
DE NUESTRA METODOLOGIA DE MICROPROPAGACION
EN LAS VARIEDADES CHANDLER Y DOUGLAS.
En 1991, repetimos el proceso para asegurarnos de la estabilidad
fenotípica del material producido con nuestro método, mediante el
estudio en invernadero de 33 caracteres, combinación de los propuestos
por UPOV e IBPGR, cuyos resultados positivos fueron presentados en el
2º Congreso Ibérico de Ciencias Hortícolas celebrado en Zaragoza
(España) (López-Aranda et al., 1993).

El material vegetal ensayado estuvo integrado por plantas de la variedad

Chandler de tres orígenes:

1º.-Material estandar propagado: Procedente de vivero de altura situado

en la provincia de Segovia: Chandler-Segovia.

2º.-Material micropropagado: Procedente de vivero de altura situado en

la provincia de Soria, segunda generación: Chandler-Soria.

3º.-Material micropropagado: Planta base procedente de vivero sin horas

frío situado en Yunquera (Málaga), primera generación ex vitro: Chandler-
Yunquera.
Dicho material se plantó el 30 de Octubre de 1990 en dos localidades de
Huelva: bajo invernadero de P.E. (0,1 mm de espesor) en Finca
Experimental El Cebollar-Moguer y bajo tunelillos de P.E. (0,075 mm de
espesor) en Granja-Escuela de Diputación Provincial de Huelva en
Trigueros.

Se dispuso un diseño de bloques al azar con tres repeticiones; cada

parcela elemental contenía 115 y 136 plantas respectivamente.

Las técnicas de cultivo fueron las utilizadas habitualmente en la zona,

en aquellos años; el proceso de recolección y toma de datos finalizó en
la última semana de Mayo de 1991.

La evaluación morfológica y organoléptica se realizó de modo subjetivo,

siguiendo una combinación de los criterios de IBPGR (Clamot et al., 1986)
y las normas UPOV.

Los caracteres generales de la planta, de la hoja, de la flor, y

morfológicos del fruto fueron realizados mediante una observación
mensual iniciada a mediados de Enero y finalizada a mediados de
Mayo.
Los resultados se detallan en la versión word de esta comunicación.

No se observaron diferencias directamente atribuibles a la procedencia

in vitro o ex-vitro del material ensayado.
Para reproducir nuestros anteriores resultados en condiciones similares a
la multiplicación y producción comerciales (fase de transferencia de
tecnología al sector), repetíamos entre 1991 y 1994 nuestros ensayos con
la variedad Chandler.

El objetivo principal de estos trabajos era el estudio agronómico del

material obtenido a partir de plantas micropropagadas, sin tener en
cuenta otros condicionantes.

Se presenta a continuación un extracto de los resultados presentados a

las XXVI Jornadas de estudio (AIDA) (López-Aranda et al., 1994a) y en el
Curso “El Cultivo de la frutilla” celebrado en la Universidad de Chile
durante Enero de 1996 (López-Aranda, 1996).
Material y método:

Primer año. Micropropagación

Plantas “purple-tag” de fresa, de la variedad Chandler, utilizadas

habitualmente como material madre para los viveros de altura, fueron
tomadas al azar en Abril 1991.

En Junio-Julio de 1991 se iniciaron cultivos de meristemos a partir de

de jóvenes estolones aéreos.

Empleamos nuestro método de micropropagación. El material fue

subcultivado 4 veces.

El material fue aclimatado, a partir de mediados de Febrero de 1992,

en invernadero climatizado del CIFA-Málaga, directamente desde la
fase de multiplicación.
Primer año. Multiplicación en vivero.

En la primera semana de Mayo de 1992, el material perfectamente

aclimatado se plantó en dos viveros:

a) Vivero de la Cooperativa CORA, Finca "El Barcial", situado en

Quintana del Puente (Palencia) (vivero de altura);

b) Vivero ubicado en el CIFA-Chipiona (Cádiz), situado a nivel del mar

(vivero de bajura).

Primer año. Campos de Fructificación.

A finales de Octubre de 1992 fueron recolectadas las plantas hijas del

material micropropagado en ambos viveros, y parte de ellas fueron
transportadas a dos campos de fructificación en Huelva:

-Finca El Cebollar-Moguer (agroambiente favorable),

-Finca San Juan del Puerto (agroambiente desfavorable).
Se realizaron tres tratamientos:

MA.- Material micropropagado (1ª generación ex vitro) procedente del

vivero de altura de la Cooperativa CORA.

MB.- Material micropropagado (1ª generación ex vitro) procedente del

vivero de bajura del CIFA-Chipiona.

SA.- Material estándar propagado en el vivero de altura de la Cooperativa

CORA, a partir de plantas madre "purple-tag" procedentes de Lassen
Canyon (California). Testigo no multiplicado in vitro e idéntico al material
empleado por los socios de dicha Cooperativa para la campaña 1992-93.

El diseño experimental era de bloques al azar con 3 repeticiones, con

una dotación de 750 plantas por parcela elemental.

La plantación se efectuó entre el 28 y el 29 de Octubre de 1992.

Segundo año. Micropropagación.

A mediados de 1992, se eligieron al azar plantas "purple-tag" de la

variedad Chandler, de la Cooperativa CORA, y se repitió el proceso del
primer año.

Segundo año. Multiplicación en vivero.

En la 2ª semana de Mayo de 1993, el material ex vitro, perfectamente

aclimatado, era plantado en Tordesillas (Valladolid).

La otra parte de material vegetal producido en los viveros del año anterior
y no enviado a los campos de fructificación era utilizada asÍ:

Las plantas 1ª generación ex vitro recolectadas a finales de Octubre de

1992 en el vivero de altura fueron almacenadas en cámara frigorífica a 0
+- 2ºC hasta finales de Abril de 1993 y posteriormente utilizadas como
plantas madre en el mismo vivero de Quintana del Puente (Palencia).

Las plantas 1ª generación ex vitro del vivero de bajura se mantuvieron sin

parada vegetativa en la misma parcela hasta finales de Abril de 1993,
siendo a continuación replantadas en el mismo vivero a nivel del mar en
Chipiona (Cádiz).
Segundo año. Campo de Fructificación.

A finales de Octubre de 1993 fueron recolectadas las plantas hijas del

material micropropagado en los 3 viveros y parte de él fue transportado
al campo de fructificación en Huelva (Finca Experimental El Cebollar).

Se realizaron 5 tratamientos:

MCO.- Material micropropagado (2ª generación ex vitro) procedente del

vivero de altura de la Cooperativa CORA.

MCHI.-Material micropropagado (2ª generación ex vitro) procedente del

vivero de bajura del CIFA-Chipiona (Cádiz).

MVC.- Material micropropagado (1ª generación ex vitro) procedente del

vivero de altura de Viveros California S.L.

CORA.- Material estándar propagado en el vivero de altura de la

Cooperativa CORA, a partir de plantas madre "purple tag" procedentes de
Lassen Canyon (California). Utilizado como control e idéntico al material
empleado por los socios de dicha Cooperativa para la campaña 1993-94.
CALI.-Material estándar propagado en el vivero de altura de Viveros
California.

Este material era planta certificada procedente del programa de

colaboración INSPV-IVIA-Viveristas, y que incluía: 1) Selección masal, 2)
Macropropagación y saneamiento de plantas seleccionadas (F0), 3)
Multiplicación en malla anti insectos (F1) planta pre-base, 4) Primera
multiplicación en vivero de altura (F2) planta base, 5) Segunda
multiplicación en vivero de altura, planta certificada y entrega a clientes.

El diseño experimental fue de bloques al azar con 3 repeticiones, con una

dotación de 630 plantas por parcela elemental.

La plantación se realizaba entre el 28 y el 29 de Octubre de 1993.

Resultados y conclusiones. Viveros.

En todas las plantaciones realizadas en vivero, tanto en el primero como

en el segundo año, en altura, o a nivel del mar, no se han detectado
plantas hijas procedentes de material micropropagado (1ª y 2ª
generación ex-vitro), aberrantes, fuera de tipo, cloróticas y/o variegadas.

El crecimiento vegetativo fue normal, y no diferente del observado en el

material estándar propagado, utilizado como control.
Campos de fructificación. Primer año. Finca Experimental El Cebollar (Moguer).

Ensayo 1992-1993. El Cebollar.

Resultados acumulados finales (Hasta 10 de Mayo).

Producción (g/planta) Calibre (g/fruto)

Tratam. 1ª cat. Comercial 1ª cat. 2ª cat.
SA 414,3 a(*) 517,2 a 24,7 a 11,8 a
MA 374,3 a 470,5 a 23,6 a 11,8 a
MB 377,6 a 457,3 a 25,3 a 11,9 a
(*)P < 0.05

No se observaron plantas fuera de tipo a lo largo del desarrollo del

cultivo.

El porcentaje de supervivencia osciló entre el 97,64% del material MA y

el 98,95% del SA, sin diferencias significativas (P<0.05) entre
tratamientos.

Se realizaron 20 cosechas durante el período comprendido entre

22 de Enero y 10 de Mayo de 1993.
Campos de fructificación. Primer año. Finca Granja-Escuela (San Juan del Puerto)

Ensayo 1992-1993. Granja-Escuela. Resultados acumulados.

Producción comercial (g/planta)hasta fin de:

Tratam. Marzo Abril Ensayo (13-Mayo)

SA 19,9 a(*) 117,3 a 197,8 a

MA 19,5 a 130,2 a 217,5 a
MB 17,9 b 70,8 b 142,6 b

(*)P < 0.05

No se observaron plantas fuera de tipo a lo largo del desarrollo del

cultivo.

El tamaño medio del fruto no mostró diferencias significativas al final

del ensayo, con 31,6 gramos/fruto para el material SA, 31,8 gramos/fruto
para MA y 31,7 gramos/fruto para MB en frutos de 1ª categoría.
Campos de fructificación. Segundo año. Finca Experimental El Cebollar (Moguer).

Ensayo 1993-1994. Resultados acumulados hasta final de Marzo

y mediados de Mayo.

Producción precoz Producción final

Tratam. 1ª cat. Comercial 1ª cat. Comercial
CORA 148 a(*) 170 a 413 ab(*) 503 a
MCO 138 ab 164 a 492 a 487 a
MVC 137 ab 171 a 363 b 471 a
CALI 117 bc 155 a 320 c 422 b
MCHI 101 c 149 a 291 c 391 b
(*)P < 0.05

No se observaron plantas fuera de tipo.

El porcentaje de supervivencia osciló entre el 98,30% del material MCHI y el

99,70% del MCO, sin diferencias significativas (P<0.05) entre tratamientos.
Ensayo 1993-1994. Calibre medio de los frutos de 1ª cat.
(en gramos/unidad).

3-Marzo 21-Marzo 18-Abril 13-Mayo

CORA 19 a 26 a 26 a 21 a
MCO 22 a 23 a 23 a 20 a
MVC 21 a 23 a 22 a 23 a
CALI 21 a 22 a 24 a 20 a
MCHI 19 a 21 a 25 a 23 a
RESUMEN DE CONCLUSIONES.

Los resultados obtenidos parecieron confirmar nuestras observaciones

preliminares; a saber, la inexistencia de diferencias morfológicas y
agronómicas entre material de Chandler micropropagado y multiplicado
mediante tecnología estándar, en diferentes condiciones de vivero.

Las diferencias aparecen precisamente entre las procedencias de vivero

con independencia del sistema de multiplicación utilizado.

En el ensayo de 1994, los mejores resultados eran los obtenidos por los
materiales vegetales CORA y MCO procedentes del vivero que mayor
número de horas frío había acumulado (Palencia), seguidos de MVC y
CALI producidos en Tordesillas (Valladolid);

Los peores resultados se obtuvieron con el material MCHI, multiplicado

en vivero a nivel del mar (sin horas-frío). Lo mismo ocurría en el ensayo
de Granja-Escuela (1993) con el material MB.
Las diferencias habían desaparecido en la primera generación ex vitro
(planta pre-base = F1)

Y los resultados parecieron indicar que lo mismo ocurría con el material

de segunda generación ex vitro (planta base = F2)

Material que a nivel comercial no se utiliza en campos de fructificación.

Por lo tanto, nuestros resultados apuntaron a que el material tercera

generación ex vitro (planta certificada, estándar o la categoría
denominada en la Unión Europea CAC, equivalente a la planta comercial
española no certificada = F3 o F4), no se diferenciaría ni agronómica ni
morfológicamente del material estándar propagado del mismo origen.

El método de micropropagación puesto a punto por nuestro equipo

parece un sistema razonable, seguro y eficiente de producción industrial
de plantas de fresa; al menos para la variedad entonces dominante en el
mercado español Chandler.

Dicho método, es, desde hace más de 10 años, un instrumento rutinario

en la producción de plantas madre de todas nuestras actividades.
EJEMPLOS DE RECINTOS INSECT-PROOF PARA
LA MULTIPLICACION EX-VITRO DE MATERIAL F0