Informe de laboratorio análisis

instrumental.
(Laboratorio número 9 Cromatografía Líquida de Alta Resolución
(HPLC)).

Integrantes:
Joshua Silva
Fernanda Valenzuela
Docentes:
Daniel Navas
Constanza Venegas
sección: 801
Fecha: 14/07/22
Introducción:
En este informe presentaremos lo realizado en el laboratorio número 9, el objetivo de este
era determinar el contenido de cafeína que contiene la muestra problema a través de el
metodo de cromatografia HPLC, (Líquida de Alta Eficiencia) este método se utiliza para
separar los componentes de una mezcla en estado líquido. Este tipo de cromatografía en
columna en el que por activación de una bomba, se hace pasar la mezcla en un disolvente
comúnmente llamado como fase móvil. La fase móvil pasa a través de la columna
cromatográfica que contiene la fase estacionaria, al interactuar estas dos fases la mezcla se
separa y se empieza a analizar.

Antes de empezar se tuvo que realizar una curva de calibración la cual constó de cinco
aforos de 0,10,20,40 y 50 ppm y con esto ya hecho se procedió a “inyectar” en el equipo las
muestras de cafeína con cuidado y precisión.

Este sistema consta de una bomba, inyector, columna de separación por donde pasa el
analito/muestra y un reservorio de fase móvil, este analito pasa por la columna de la fase
estacionaria bombeando la fase móvil (la cual es líquida) con alta presión. La muestra
preparada se introduce en un pequeño volumen (en específico 20 μL debido al tipo de
equipo), a la corriente de la fase móvil en donde se retarda por las interacciones químicas
con la fase estacionaria, todo esto mientras atraviesa la columna.

Una vez que el líquido se pudo separar este paso a una máquina que detecta la cantidad de
cafeína que pasaba a través de esta durante un periodo de tiempo así generando una curva
con una área y esta pertenece a la cantidad de cafeína detectada por la máquina.

Esto se realizó con toda la curva y con la muestra problema a analizar.

Objetivos:
-Conocer y manejar un equipo HPLC.

- Determinar el contenido de cafeína en una muestra problema (bebidas

energizantes)

Marco teórico:
Materiales
HPLC LC-4000
Matraces de aforo 25 mL
Pipeta volumétrica (aforada) 3 mL
Jeringuilla 20 μL
Agitador magnético
Barra magnética
Vaso de precipitado 50 mL
Filtro de membrana 0,22 μm

Reactivos
Solución estándar de cafeína 500 ppm
Agua para HPLC
Metanol para HPLC
Bebida energética o gaseosa

Métodos utilizados:
El método que utilizamos en este último laboratorio fue el de cromatografía (en específico
HPLC), este método consiste en separar y analizar los componentes de una mezcla
basándose en diferentes tipos de interacciones químicas entre las moléculas de la
mezcla y la columna cromatográfica. Luego de realizar las muestras requeridas,
utilizamos curvas de calibración, con el objetivo de identificar y cuantificar los
componentes de la mezcla, dando así por determinando su tiempo de retención
(identificación) y su cuantificación. Con todo esto, se prepara el equipo de HPLC, el
cual medirá el contenido de cafeína que contiene cada muestra realizada.
Condiciones experimentales:

Este práctico se realizó sin ninguna dificultad, hicimos y preparamos todas las muestras
correspondientes de forma correcta, cabe mencionar que si tuvimos un pequeño problema,
se nos derramó un poco de muestra de uno de los matraces sobre nuestro meson, el cual
rápidamente y paso a paso volvimos a hacer para luego proceder a conocer como se
maneja un equipo de HPLC en el laboratorio, medimos las muestras con ayuda del profesor
que se encontraba dándonos a conocer el equipo y anotamos cada resultado de este
proceso sin problemas.

Cálculos y resultados:
Gráfico 1: curva de calibrado para la determinacion de cafeina mediante HPLC

V alícuota C patrón (ppm) Área (u.a)

0 0 34027

1 10 537744

2 20 1059272

4 40 2065121

MP 1865585
Curva de calibración

Acuerdo del gráfico la ecuación sería A= 50840 * C - 34344

A equivale al área de los picos cromatográficos y C es la concentración de cafeína. Como el

área del pico cromatográfico corresponde a A (MP) = 1865585, Por lo tanto la ecuación
sería:

C = (1865585 + 34344) / 50840 = 37,37 ppm

En este caso ya que se midieron 3 ml de la muestra problema y se diluyó hasta un volumen

de 25 ml, entonces:
C = 37,37 ppm X ( 25ml / 3 ml) = 311,422 ppm

Por lo tanto la concentracion de cafeina en la muestra problema seria de 311,422 ppm

Discusión de los resultados:
Lo primero que realizamos fue preparar 25 ml de patrones con diferentes concentraciones,
estas eran de 0, 10, 20, 40 y 50 ppm de cafeína, las cuales se prepararon a partir de una
solución patrón de 500 ppm, luego procedimos a inyectar las preparaciones en el equipo de
HPLC, todo esto para obtener la curva de calibración. Preparamos el equipo e inyectamos
lo antes mencionado (20 μL) de cada solución patrón realizada, así determinamos el área
bajo la curva del pico de cafeína. Para preparar la muestra problema tomamos 25 ml de
esta y la agitamos con un agitador de vidrio hasta ya no ver burbujas dentro (las producidas
por el gas que contiene la bebida) después se tomaron 3 ml de la muestra y se aforó hasta
los 25 ml.

Hay que recalcar que debido a un error en hacer la dilución de la curva correspondiente al
aforo de 50 ppm los datos no dieron la figura del área que se esperaba y por lo tanto se
descartó este dato a la hora de hacer la curva de calibración.

El tiempo de retención (tR) está presente en cromatografía líquida y cromatografía de

gases, este se define como el tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la
aparición de la respuesta máxima. La optimización de la fase móvil puede realizarse con
dos métodos diferentes, estos vendrian siendo cromatografia de elucion isocratica y por
gradiente, en la primera las condiciones cromatográficas permanecen constantes durante la
separación y en gradiente las características de la elución se van modificando durante la
separación. Con esto puede conseguirse una mejor resolución de mezclas que son
complejas.

En la operación de HPLC como cuidado, se recomienda un uso de una precolumna, esta

sería para proteger su columna y así aumentar su vida útil, también cabe destacar que se
debe evitar el uso de esta columna por fuera de los intervalos de ph recomendados para la
fase de columna, se reducirá la vida útil de esta si se utiliza fuera de estos intervalos de ph
recomendados y temperatura.

En HPLC la fase móvil cumple el rol de portador de la muestra, ya que esta es inyectada
sobre la fase móvil, los componentes de la mezcla “emigran” por las interacciones
no-covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas determinan
la separación de los contenidos en la solución. En cuanto la CG, se emplea como fase móvil
un gas, la muestra se volatiliza (se requiere ya que en la mezcla que se va a separar
también debe ser un gas) y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica.

La diferencia clave entre la fase inversa y la fase normal de HPLC es que la la HPLC de
fase inversa utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil menos polar, mientras que
la HPLC de fase normal utiliza una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar.
Conclusión:
Se lograron los objetivos ya que se aprendió a utilizar y manejar un cromatógrafo HPLC y se
pudo determinar la concentración de la muestra problema.

El método de cromatografía (HPLC) en específico, es la técnica de separación de

componentes en mezclas más utilizada, utilizamos este método de cromatografía líquida de
alta resolución ya que buscábamos determinar la cafeína que contiene nuestra muestra
problema.

A pesar de que la el último punto de la curva no se realizó correctamente de igual forma la

muestra problema entró en los parámetros de la curva y la precisión de la técnica utilizada
ayudó bastante en la determinación de la concentración.

Cabe recalcar que este método al ser tan preciso toma un tiempo en que la máquina pueda
determinar la totalidad de la concentración de cada muestra haciendo que la duración total
de la experiencia se alargue sin mencionar que cada parte de la curva se hizo por duplicado
para evitar errores.

Bibliografía:

¿Cómo funciona la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)? | Waters. Waters

Corporation, from
https://www.waters.com/nextgen/xg/es/education/primers/beginner-s-guide-to-liquid-chromat
ography/how-does-high-performance-liquid-chromatography-work.html

Cromatografía de líquidos HPLC. Laboratorio de Técnicas Instrumentales, from

https://laboratoriotecnicasinstrumentales.es/analisis-qumicos/cromatografa-de-lquidos-hplc