LABORATORIO DE ANALISIS INSTRUMENTAL.

Informe de Laboratorio Nº3 Profesor: Jaiver Osorio

Determinación de contenido de cafeína en productos alimenticios y farmacéuticos, usando

HPLC, e identificación y cuantificación de sustancia de interés farmacéutico por
cromatografía de gases

Diana Miley Saavedra Vásquez

Alexis Chiran Chuquizan
Bryan Felipe Saavedra Chavárro
Sebastian Ramírez Areiza

diana.saavedra04@usc.edu.co
sebastian.ramirez05@usc.edu.co
alexis.chiran00@usc.edu.co
bryan.saavedra00@usc.edu.co

Universidad Santiago De Cali, Facultad de Ciencias Básicas Laboratorio de Análisis

Instrumental, Santiago de Cali, Colombia

Resumen:
En esta práctica, se realizó la determinación de contenido de cafeína en 2 productos alimenticios
(café soluble y bebida energizante) y un medicamento que, presuntamente tienen cafeína. Como
método analítico se usó cromatografía líquida de alta eficacia de fase inversa (HPLC-RP por sus
siglas en inglés). Para ello se prepararon 6 soluciones estándar de rango 0-50 ppm con el objetivo de
crear una curva de calibración y con esta, calcular una concentración de cafeína en las muestras.
El resultado fue mixto: por una parte, se pudo validar la presencia de cafeína en cada muestra
evaluada y la curva de calibración arrojo límites de detección y de cuantificación adecuados para
analizar las muestras. Pero, por otro lado, se obtuvieron parámetros estadísticos y porcentajes de
recuperación insuficientes para catalogar el método usado en esta práctica como confiable.
También se realizó la identificación de sustancias de interés farmacéutico por cromatografía de
gases, par a esto se preparó una solución madre de 1000 ppm de las sustancias farmacéuticas de
interés, a partir de la solución madre se prepararon estándares de 5 ppm – 200 ppm en un mismo
matraz, se construyó las curvas de calibración para cada sustancia.
Palabras clave: cafeína, cuantificación, cromatografía, curva de calibración; HPLC-RP; LOD;
LOQ; UV-Vis
Abstract:
In this practice; a validation and determination of caffeine content in 2 food products (soluble
coffee and energy drink) and a drug that, allegedly, have caffeine was carried out. As the analytical
method, a high-performance liquid chromatography on reverse phase (HPLC-RP) was used. On this
set of ideas, six standard solution of caffeine were prepared compressing a range from 0-50 ppm in
order to measure the area under the curve of each sample and compute each caffeine concentration.
The end result was midterm: On one hand, caffeine content in each sample was validated and the
calibration curve had LOD and LOQ values that were satisfiable enough to proceed on the

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determination of caffeine content. But, on the other hand, certain statistic values and the yield
percentage were inconvenient to what was expected and shows that the results were untrustworthy.
Keywords: Caffeine; Calibration curve; HPLC-RP;LOD;LOQ; Quantification; UV-Vis

1.Introducción: moléculas que fluyen a su lado. Esto permite

La cromatografía agrupa un conjunto una separación mucho mejor de los
importante y diverso de métodos que facilitan componentes de la mezcla.
la separación, identificación y determinación
de componentes estrechamente relacionados
en mezclas complejas; muchas de dichas
separaciones son imposibles por otros
medios. En todas las separaciones
cromatográficas la muestra se disuelve con
una fase móvil que puede ser un gas, un
líquido o un fluido supercrítico la cual se
hace pasar a través de una fase estacionaria
inmiscible fija en una columna o en una
superficie sólida. Las dos fases se eligen de
tal forma que los componentes de la muestra
se distribuyen en grados distintos entre la fase
móvil y la fase estacionaria. Aquellos Figura 1. Diagrama simplificado del
componentes que son fuertemente retenidos funcionamiento de un HPLC.
por la fase estacionaria se mueven con mucha
lentitud con el flujo de la fase móvil. En 1.2 Cromatografía de gases
cambio, los componentes unidos débilmente a
En cromatografía de gases los componentes
la fase estacionaria se mueven con rapidez.
de una muestra vaporizada se separan como
Como consecuencia de las distintas
consecuencia de que se reparten entre una
velocidades de migración, los componentes
fase gaseosa y una fase estacionaria contenida
de la muestra se separan en bandas o zonas
en una columna. Al efectuar una separación
distintas que se pueden analizar en forma
cromatográfica de gases, la muestra se
cualitativa y cuantitativa.
vaporiza y se inyecta en la cabeza de una
columna cromatográfica. La elución se lleva a
1.1 HPLC cabo mediante el flujo de una fase móvil de
El HPLC es básicamente una forma de gas inerte. A diferencia de la mayoría de los
otros tipos de cromatografía, la fase móvil no
cromatografía de columna muy mejorada. En
interactúa con las moléculas del analito; su
lugar de permitir que un disolvente gotee a
única función es transportar este último a
través de una columna por gravedad, se
través de la columna.
fuerza a través de altas presiones de hasta 400
atmósferas que hace todo el proceso más
rápido. También le permite utilizar un tamaño
de partículas mucho más pequeño para el
material de relleno de la columna. lo que da
una superficie mucho mayor para las
interacciones entre la fase estacionaria y la

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Figura 2. Diagrama de un cromatógrafo de
gases, tomado de Análisis instrumental, Skoog
1.3 Cafeína
La cafeína es el estimulante del sistema
nervioso central más consumido a nivel
mundial. Químicamente, este se le agrupa en
las metilxantinas y su estructura química es
tal y como se muestra en Fig. 1.
Figura 3. Estructura molecular de la cafeína
Este compuesto está presente naturalmente en
63 plantas y se agrega a productos
alimenticios y farmacéutico (Francis, 1999).
Además de su actividad estimulante, en la
industria farmacéutica, se usa por sus
propiedades químicas: La cafeína es una
base débil, no puede perder un protón ni
actuar como cid a un valor de pH inferior a
14. Además, la cafeína actúa como electrófilo
en las posiciones 1, 2 y 3. En la sangre, no
hay una gran cantidad de proteína unida a la
cafeína. Además, la cafeína se distribuye en
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el cerebro en alta concentración debido a las
propiedades lipofílicas.
La cafeína tiene una toxicidad importe en
concentraciones superiores a 400 mg por día
y 10 g es una concentración fatal. Ahora bien,
es importante determinar con exactitud los
niveles de cafeína en productos comerciales
como alimentos o fármacos para prevenir
niveles tóxicos del compuesto (Saad, 2016).
Para evaluar los niveles de cafeína de
productos comerciales, se tomaron tres
muestras de café soluble, bebida energética
“Speed”, e ibuprofeno con cafeína 50 mg.
Según la información proporcionada por el
fabricante el contenido de cafeína de las
muestras es: 1,3 por 100g en café soluble; 20
mg por 100g en bebida “Speed” y 5 mg por
cápsula de medicamento.
1.4 Moléculas de interés farmacéutico
Benzocaína.
Aprobarbital
Fenacetina
Cafeína
Lidocaína
Fenobarbital
Procaína
Cocaína
2. Materiales para HLPC y CG:
 6 balones aforados de 10 mL para
estándar
 Beaker de 500 mL
 Probeta 10 mL
 Micropipeta
 Centrifugadora
 2 balones aforados para analitos de
100mL
 1 balón aforado de 25 mL
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 Equipo para HPLC
 Cromatógrafo de gases
 Jeringa tipo HPLC

Muestras y reactivos:
-Metanol grado HPLC
-0,1 g de café soluble
-7 mL de bebida energética “Speed” con un
- 80 a 100 mg de tabletas de medicamento
con cafeína. Se usaron 5 tabletas para llegar Figura 4. Fotografía de las soluciones
al peso requerido. estándares.

-Agua grado HPLC

3.2 Preparación de las muestras
3.Método:
3.1 Soluciones estándar 3.2.1 Bebida energizante.

Primeramente, para poder realizar un análisis La bebida energizante se dejó que liberara
del contenido de cafeína en analíto, se debe todo el gas doce horas antes ya que es
de tener una curva de calibración. Para ello se importante que todo analito que entre en la
preparó una solución matriz 200 ppm de columna sea líquido ya que afectaría el
cafeína con la que se harían 6 diluciones a resultado. Luego se midieron 7 mL de
diferentes concentraciones para realizar la muestra en probeta y aforarlo con agua grado
curva. HPLC hasta completar un volumen total de
25 mL.
Tabla 1. Volúmenes tomados para realizar
las soluciones estándar. 3.2.2 Medicamento con cafeína.
Se pesaron 10 tabletas de ibuprofeno con
Volume
Volume cafeína. Se trituraron para obtener un polvo
n (μL) de Concentració
n (mL) que pesase entre 80 a 100 mg. Se traslado a
Estándar solución n (ppm) de
total de un balón aforado de 100 mL donde se le
de 200 cafeína
solución agregaron 10 mL de metanol y se completó el
ppm
aforo con agua tipo HPLC. Por último, se
1 250 10 5
introdujo en una centrifugadora por,
2 350 10 7
alrededor, de 15 minutos.
3 500 10 10
4 1250 10 25 3.2.3 Café Soluble
5 2000 10 40
6 2500 10 50 Se peso 0,1 g del producto y se llevó a un
balón aforado de 100 mL. A este, se le
adicionaron 30 mL de metanol grado HPLC y
se completó el aforo con agua grado HPLC.
Por último, se homogenizo dándole agitación
manual.

3.3 HPLC-RP

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Estos son los parámetros del HPLC con los
que se realizaron la toma de muestra: Inyector
20 μL, fase móvil Metanol/agua 1:1, caudal 1
mL/min, columna C18 de 15 cm x4,6mm x 5 4.Discusión y resultados:
μm y un detector UV-vis a 274 nm. 4.1 Resultaos del cromatogram

Figura 6. Cromatograma para soluciones

estándar y muestras evaluada

Tabla 2. Resultados de las soluciones

Figura 5. Equipo de HPLC usado para el
  Muestra Inj. Channel Vial Cafeina
análisis de muestras.
1 Estándar 1 1 W2489 ChA 1 1,396
Se introdujeron cada una de las muestras, 2 Estándar 2 1 W2489 ChA 2 1,396
empezando por los estándares y las muestras 3 Estándar 3 1 W2489 ChA 3 1,395
de bebida energizante medicamento y café 4 Estándar 4 1 W2489 ChA 4 1,39
soluble respectivamente, a la columna 5 Estándar 5 1 W2489 ChA 5 1,39
cromatográfica. 6 Estándar 6 1 W2489 ChA 6 1,388
Promedio         1,392
Dev.
Estándar         0,004
% RSD         0,3

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Muest In Chan Vi
  ra j. nel al Cafeina
Muest W248 5650591
estándar para tiempo de retención. 7 ra 1 1 9 ChA 7 0
Muest W248 1830788
Tabla 3. Resultados de las muestras para
tiempo de retención (minutos). 8 ra 2 1 9 ChA 8 2
Muest W248
Muest In Chan Vi 9 ra 3 1 9 ChA 9 1509324
  ra j. nel al Cafeina Prome 2544103
Muestr W248 dio         8,7
7 a1 1 9 ChA 7 1,387
Dev.
Muestr W248
8 a2 1 9 ChA 8 1,398 Estánd 2818364
Muestr W248 ar         0
9 a3 1 9 ChA 9 1,392 110,8
Prome 1,39233 % RSD
dio         333        
Dev.
Estánd 0,00550 4.1 Curva de calibración HPLC
ar         757
% RSD         0,3 Se prepararon soluciones estándar que
contenían cafeína (5-50) ppm. Para estudiar la
reproducibilidad de la respuesta del detector a
Tabla 4. Resultados de las muestras por área
diferentes niveles de concentración, se
Muest In Chann
Vi inyectaron 20 µL de solución estándar; La
  ra j. el al Cafeina curva de calibración se obtuvo trazando el
Estánd área del pico frente a la concentración para
1 W248
ar 1 1 9 ChA 1 765322 calcular la ecuación de calibración y el
Estánd coeficiente de correlación.
2 W248
ar 2 1 9 ChA 2 955213
Estánd
3 W248
Figura 7. Curva de Calibración para la
ar 3 1 9 ChA 3 1278062
Estánd cafeína usando las soluciones estándar.
4 W248
ar 4 1 9 ChA 4 2626322
Estánd
5 W248
5000000
ar 5 1 9 ChA 5 3441562
4500000
Estánd 4000000
f(x) = 77705.8973176471 x + 460770.511247059
6 W248
ar 6 1 9 ChA 6 4343850 R² = 0.992845278047926
3500000
Prome 2235055,1 3000000
2500000
Área

dio         67 2000000
Dev. 1500000
Estánd 1467631,5 1000000
ar         339 500000
0
65,7 0 10 20 30 40 50 60
% RSD Concentración (ppm)
       

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se buscaba. Se puede atribuir este resultado
dada la curva de calibración que tiene un
Nótese que el coeficiente de correlación para rango de 0 50 ppm es adecuada para cada una
la curva de calibración es significativamente de las muestras, sin embargo, no se tomó en
menor al esperado (R2>0,999). Esto puede ser cuenta que la realización de soluciones
el resultado de no realizar las soluciones por estándar por triplicado es necesaria para
triplicado. Esto da un grado de incertidumbre obtener coeficiente de correlación que
para el calculo de concentración de muestras. aseguren un alto grado de precisión.
De igual forma, podemos observar en la tabla Tabla 6. Parámetros estadísticos para el
4 y 5 el porcentaje de deviación estándar análisis de curva de calibración
relativa. Ambos parámetros son superiores a
los esperados (%RSD<1%). Esto puede ser Error estándar 3298,21967
un aspecto a considerar para evaluar la √N 2,44948974
precisión de los resultados. LOD 0,1400682
4.3 Cuantificación de las muestras LOQ 0,42444908
Pendiente 77705,8973
Para calcular la concentración de cada
Intercepto 460770,511
muestra se igual el área obtenida por cada
muestra a la ecuación de la recta y se despeja
la concentración problema. El LOD y LOQ son términos usados en
y=77705,897318 x +460770,511247 análisis para las concentraciones más bajas
que un método analítico puede llegar a medir
Teniendo conocimiento del volumen con el con un alto grado de confianza
que se aforaron las muestras, se pudo obtener (Armbruster,2008).
la cantidad de cafeína por muestra, así como
Si los comparamos con los resultados en la
su porcentaje de recuperación con respecto a
tabla 7 estos están por encima de los valores
lo reportado por el empaque:
limite de detección y de cuantificación
Tabla 5. Resultados para contenido de mostrados anteriormente.
cafeína en muestra. Rendimiento conforme a
la información establecida por los fabricantes
de los respectivos productos.
Conteni
do de
cafeína Conte
en nido %
Mue Product muestr teóric rendim
stra o a (mg) o (mg) iento
1 Bebida 1,67 1,12 49,11
Medica
2 mento 22,97 25 8,12
Café
3 soluble 1,349 3,9 65,41

Tomando en cuenta factores como el

coeficiente de correlación, el %RSD y el
porcentaje de rendimiento podemos concluir
que el método usado no dio la precisión que

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Curvas de calibración para cromatografía ------

de gases

Tabla 7. Concentraciones para curvas de calibración para los diferentes fármacos

Metil Acido
Benzocaina Aprobarbital Fenacetina Cafeina Lidocaina Phenobarbital Procaina Cocaina
salicilato Salicilico
Concentracion
Area Area Area Area Area Area Area Area Area Area
(ppm)
5 101829 101629 101468
10 220534 162122 267431 161253 124386
50 309344 1114886 812678 939433 1411391 890704 850634 653219
100 1092605 2796702 2521535 2608149 3468550 2341513 2845228 1601994
150 297046 1722792 3935837 3775144 3524828 3775144 3522555 4353995 2298198
200 495592 147508 2935804 6174152 6095539 5628181 7628976 5521382 7006853 3531886

------

f(x) = NaN
12 x + NaN 7000001
R² = 0 10 6000001
f(x) = 30146.23641 x − 196895.29187
5000001
8 R² = 0.987964336786051
4000001
Area

6
Area

3000001
4 2000001
2 1000001
0 1
4 5 6ppm 7 8 9 10 1 51 101 151 201
ppm

Figura 8. Curva de calibración para Metil Figura 10. Curva de calibración para
salicilato Aprobarbital

3500001 7000001
3000001 6000001
2500001 f(x) = 17019.134 x − 612255.5 5000001 f(x) = 34204.384 x − 974324
R² = 0.985888493511907
2000001 R² = 0.980170243524571 4000001
Area
Area

1500001 3000001
1000001 2000001

500001 1000001

1 1
30 50 70 90 110 130 150 170 190 210 1 51 101 151 201
ppm ppm

Figura 9. Curva de calibración para Figura 11. Curva de calibración para

Benzocaína Fenacetina

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6000001 8000001
7000001
5000001
f(x) = 27538.184935 x − 202970.54022 6000001 f(x) = 39954.848 x − 1230178.5
R² = 0.984830091780818
4000001
5000001 R² = 0.988059065467901
3000001 4000001
Area

Area
3000001
2000001
2000001
1000001
1000001
1 1
1 51 101 151 201 1 51 101 151 201
ppm ppm

Figura 12. Curva de calibración para Figura 15. Curva de calibración para
Cafeína Procaína

9000001 4000001
8000001 3500001
7000001 f(x) = 17669.993241 x − 160402.71057
3000001
f(x) = 35698.157539 x − 330913.66898
6000001 R² = 0.989228392517288
2500001
R² = 0.926164309373839
5000001 2000001
Area
Area

4000001
1500001
3000001
1000001
2000001
500001
1000001
1 1
1 51 101 151 201 1 51 101 151 201
ppm
ppm
Figura 16. Curva de calibración para
Figura 13. Curva de calibración para
Cocaína
Lidocaína

6000001
5.Conclusión:
Se realizó una cuantificación de cafeína en
5000001
f(x) = 27076.003207 x − 234211.10861 tres productos disponibles en el mercado
R² = 0.985474630590754
4000001 colombiano. Se pudo validar la presencia de
3000001 este compuesto en cada uno de los productos.
Area

De igual forma, se pudo cuantificar la

2000001
cantidad de cafeína en muestra usando como
1000001 método analítico HPLC-RP y detector UV-
1 Vis. Se realizo una curva de calibración del
1 51 101
ppm
151 201 cual se pudo calcular su LOD y LOQ para
evaluar la sensibilidad de la curva.
Figura 14. Curva de calibración para Sin embargo, varios resultados hacen dudar
Fenobarbital acerca de la efectividad de la metodología
usada tales como: porcentajes de
recuperación muy alto, coeficiente de
correlación alejado del esperado y %RSD
mayores a los buscados.

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Bibliografía:

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