Ingreso al codigo de referencia rs5110 y posteriormente abro el visor de variaciones de la

secuencia de interes, en la parte superior en la barra azul, observamos un codigo de

transcripcion NM_000482.4, el cual vamos a copiar.

Una vez obtenida la información anterior, ingresamos a la cuenta de BENCHLIGN, con el correo
institucional, sobre el costado izquierdo observamos una barra azul donde aparece un (+), se
da clic en el (+)
Posteriormente se da clic donde dice DNA /RNA sequence y luego clic donde dice import
DNA /RNA sequence

En el recuadro que aparece, seleccionamos en la parte superior el que IMPORT FROM

DATABASE y en el recuadro en blanco que dice SEQUENCE, pegamos la Secuencia de referencia
NCBI: NM_000482.4 y le damos clic en SEARCH, una vez se le da clic en SEARCH, genera la
siguiente ventana emergente, donde se puede modificar el nombre, por el común, para saber
de que estoy hablando
Posterior a esto, se da clic en IMPORT, abriendo siguiente interfaz

Una vez tengamos esta información, me dirijo al visor de variaciones de NCBI y me posiciono
sobre el gen de interés en color verde y verifico el titulo de la proteína, para posteriormente
ser ubicada en BENCHLING.
Identifico que el título de la proteína es precursor de la apoliproteina A-IV, por lo cual me dirijo
a BENCHLING, y selecciono el precursor CDS APOA4, lo cual queda señalado de color naranja

Una vez seleccionada la secuencia de interés, sobre el costado derecho aparecen dos flechitas
en doble sentido, se da clic allí, se selecciona en la venta emergente la opción de PRIMERS,
luego se da clic donde diche CREATE PRIMERS y se selecciona WIZARD.
Luego se abre la siguiente ventana emergente donde se diligencian las siguientes condiciones:
Tm params: se da clic allí y posteriormente se selecciona Set to Primer3 defaults y se le da clic
en SAVE
%GC: 40% G y 60% C
Tm: de 55ºC a 65ºC
Size: 27
Amplicon: Size 100 Max 23000

Posterior a esto, se da clic en GENERATE PRIMERS, generando la siguiente interfaz, donde es

importante tener en cuenta que la puntuación PENALTY (Puntuación de penalización de
Primer3). más bajos son mejores.
Con base en lo anterior, seleccionamos los PRIMERS, con la penalidad mas baja y sobre el
costado derecho damos clic donde dice EDIT

Posterior a dar clic en EDIT, se habilita la siguiente interfaz, donde podemos verificar el tanto el
FWD, como el REV, y se le puede indicar un nombre para diferenciar y podemos verificar si se
cumple con los parámetros en cuanto a Tm, %GC, Longitud y tamaño del producto.

Además, puede asignársele colores diferentes a los PRIMERS, para reconocerlos

IMPORTANTE: CHECK SECONDARY STRUCTURE DEBE MODIFICARSE Y COLOCAR 50 Y DAR

CLIC EN CHECK SECONDARY STRUCTURE

Una vez realizado el paso anterior del CHECK SECONDARY STRUCTURE, observamos que se
habilitan unos numeritos de variaciones delta de G, que nos indican las estructuras
secundarias que pueden formar
Para evaluar los dímeros, tener en cuenta la siguiente tabla, lo que no se enmarque allí debe
ser descartado.

Si la estructura secundaria formada se encuentra en los últimos seis nucleótidos, se considera

estructura 3`

Posterior a haber verificado los parámetros anteriores, doy clic donde dice SAVE PRIME PAIR,
con el fin de guarda los PRIMERS, generándose la siguiente interfaz.
Luego nos dirigimos a las flechitas en doble sentido ubicadas al costado derecho, damos clic en
ellas, se me habilita una ventana emergente de la cual en la parte superior voy a seleccionar
PRIMERS y posterior marco los cuadritos.

Posteriormente damos clic nuevamente en la flechita doble sentido al costado derecho,

seleccionamos en la parte superior de la ventana emergente el botón que dice PAIRS
Luego damos clic donde dice CREATE PCR PRODUCT, generando la siguiente interfaz

Posteriormente le doy clic donde diche COPY y SELECT y observamos la siguiente interfaz,
como resultado de la PCR, donde podemos observar los PRIMERS FWD y REV, anillados.
Por último, ingreso a verificar los PRIMERS en PCR ELETRONICA https://genome.ucsc.edu/cgi-
bin/hgPcr

Pegando los PRIMERS en Forward Primer y Reverse Primer y dando clic en Submit

Evidenciando el amplicon de los PRIMERS