Biología molecular y citogenética

TEMA 2. CULTIVOS CELULARES

1. Conceptos previos
Célula
• Unidad morfológica y funcional de todo ser vivo.
• Es el elemento de menor tamaño que puede considerarse vivo.
• Células procariotas, eucariotas, vegetales y animales
Matriz extracelular
• Conjunto de materiales extracelulares que forman parte de un tejido.
• Medio de integración fisiológico, de naturaleza bioquímica compleja, en el que están
"inmersas" las células.
Tejido
• Material biológico constituido por un conjunto complejo y organizado de células, de uno o
varios tipos.
• Comportamiento fisiológico coordinado y un origen embrionario común.
Órgano
• Agrupación de diversos tejidos que forman una unidad estructural encargada del
cumplimiento de una función determinada en el seno de un organismo pluricelular.
Cultivo celular
❖ Conjunto de procedimientos que hacen posible el mantenimiento de células de organismos
pluricelulares in vitro, preservando al máximo sus características fisiológicas, bioquímicas y
genéticas.
Línea celular
❖ Conjunto de células que parten de un cultivo u órgano y que se mantienen por un tiempo
ilimitado
Citogenética tipos de cultivos celulares:
• Líquido amniótico
- Líquido rodea al bebe dentro del útero
- Cultivos a largo plazo (10-14 días)
- Diagnóstico prenatal de ciertas cromosomopatías
• Vellosidad corial
- Se obtiene de una biopsia del corión, placenta
- Cultivos cortos (24-48h)
- Estudio prenatal anomalías cromosómicas en edad temprana del feto (9 a 11 semanas)
• Sangre periférica
- Cultivo de linfocitos
- Cultivos indirectos, se emplean agentes que estimulan la división celular (mitosis)
- Cultivos cortos
- Detectar alteraciones cromosómicas en las células somáticas
• Médula ósea
2. Tipos de cultivos
Cultivo de órganos
➢ Consiste mantener un órgano entero o parte de él en la interfase entre un medio de cultivo y
una atmósfera controlada.
➢ Se mantienen vivos durante un tiempo limitado los tipos celulares diferenciados, las
interacciones histológicas y la arquitectura característica del tejido “in vivo”.
➢ Buena réplica del tejido de origen.
 ➢ Se utilizan para estudiar interacciones y relaciones intercelulares, respuestas globales a
estímulos y sustancias, estudios regenerativos, etc.
Inconvenientes
➢ No se pueden propagar, proliferación celular limitada a las células de la periferia donde no
conservan la estructura tisular típica.
➢ Nuevo explante para cada experimento, supone mucha más trabajo y limitada reproducibilidad
de la muestra.
➢ Cantidad de material que se puede cultivar es reducida.
Cultivo de explantes
➢ Fragmento tisular que se adhiere a una superficie (placa o frasco de cultivo) sobre la cual las
células proliferan.
➢ Las células periféricas del explante se multiplican y proliferan, migrando por la superficie del
soporte.
Cultivo de células
➢ Se realizan a partir de suspensiones celulares o explantes.
➢ Se introducen en placas o frascos de cultivo junto con medio de cultivo y se incuban en las
condiciones óptimas para que las células proliferen.
➢ Las células se separan de la matriz tisular por medios físicos (mecánicos) o medios químicos
(enzimáticos).
➢ Se realiza a partir de cualquier tipo de tejido: líquido amniótico, sangre, restos ovulares, etc.
➢ Permiten aumentar la masa celular del tejido que queremos estudiar.
➢ INCONVENIENTE: si partimos de masas celulares heterogéneas, esta heterogeneidad se
puede perder debido a la uniformidad de la población de células y que trae como consecuencia
que las poblaciones predominantes den mayor tasa de crecimiento.
➢ Según la procedencia de la suspensión celular de partida, los cultivos de células pueden ser
primarios o secundarios
❖ Cultivo celular primario
• La suspensión celular se obtiene por disgregación de un tejido mediante procedimientos
mecánicos o enzimáticos.
• Se obtiene una mezcla celular compleja, formada por diferentes tipos celulares presentes
en el tejido.
• El cultivo primario se realiza a partir de la mezcla celular o seleccionar un tipo celular
concreto.
❖ Cultivo celular secundario
• Suspensión celular de partida se obtiene a partir de un cultivo primario o de otro
secundario mediante subcultivo o “pase”.
• A partir de una línea celular mantenida en congelación.
Aplicaciones de los cultivos celulares
➢ Aplicaciones en investigación básica
• Metabolismo celular: ciclo celular, rutas metabólicas, flujos intracelulares, diferenciación,
transformación, etc.
• Interacciones celulares: entre células, con la matriz extracelular, con el medio ambiente.
➢ Aplicaciones en investigación aplicada
• Inmunología, producción anticuerpos monoclonales.
• Virología, producción de vacunas.
• Farmacología, producción de fármacos
• Toxicología, estudios citotoxicidad, carcinogénesis y mutagénesis.
➢ Otras
• Estudio con células madre (stem cells), terapia celular
• Ingeniería de tejidos, conseguir in vitro producción in vitro de tejidos y órganos funcionales
para uso en injertos y trasplantes
3. Procedimientos de obtención, mantenimiento, manipulación y propagación de cultivos
Disgregación celular
• Proceso de separación de las células de la matriz extracelular en la que se encuentran
inmersas
• A partir de un órgano o tejido
• Se realiza por métodos de disgregación celular: mecánicos o enzimáticos
• Se puede realizar selección celular
Métodos mecánicos
▪ Se basan en cortar, picar e incluso triturar fragmentos de órganos o tejido
▪ Colocan en placa de Petri con tampón o medio de cultivo recogen las células
▪ Método útil: cribado de células
Cribado de células
1. Colocar trozos de órganos o tejido sobre una criba de nailon (diámetro de poro
permita paso de células)
2. Aplastar suavemente la masa de tejido
3. Acoplar la criba a un tubo falcon o sobre una placa de Petri
4. Lavar con tampón o medio de cultivo
Métodos enzimáticos
▪ Se basan en el tratamiento con enzimas proteolíticas
▪ Digieren las proteínas de la matriz extracelular liberando a las células englobadas en
ella
▪ Proteasas más empleadas:
- Tripsina
- Colagenasa
- Dispasa
- Elastasa
▪ Soluciones enzimáticas se suelen combinar con EDTA
▪ Método habitual: disgregación enzimática con tripsina
Disgregación enzimática con tripsina
1. Colocar tejido en una placa de Petri y triturar o trocear con bisturí o tijeras
2. Colocar el tejido triturado en un tubo de 15 o 50 ml añadir una solución de tripsina
con EDTA
3. Incubar a 37 ºC durante 30-60 min en función del tamaño de los fragmentos
4. Añadir medio de cultivo DMEM con 10% de suero bovino fetal (FBS) y antibióticos
5. Centrifugar 10 min a 1400 r.p.m. (revoluciones por minuto)
6. Eliminar el sobrenadante
7. Añadir medio de cultivo y resuspender las células con una pipeta pasteurç
• Tras la disgregación se obtiene una mezcla de tipos celulares → Inicio cultivo primario
• Seleccionar tipo celular concreto para cultivarlo → Selección de células
✓ Propiedades específicas de las células.
✓ Métodos inmunológicos selección celular.
 ✓ Métodos inmunológicos selección celular.
- Recubrir los pocillos de placa multipocillos con anticuerpo específico
- Recubrir esferas de material inerte con el anticuerpo específico
- Recubrir esferas magnéticas con el anticuerpo.
Recuento y viabilidad celular
• Obtenida la suspensión celular es necesario conocer la densidad celular
• El cultivo se inicia con un número determinado de células (superficie del recipiente a utilizar)
• Comprobar la viabilidad de esas células
• Se emplea un colorante vital (viabilidad) y cámara de recuento (número de células)
Colorante vital
- Azul tripán más utilizado
- Penetra en el interior células que tienen la membrana rota y no en células con
membranas intactas
- Se ven dos tipos de células: células de color azul (células no viables) y células
blancas (células vivas)
Cámara de recuento
- Contaje: recuento de células azules (no viables) y células blancas (viables)
- Cámara de Nuebauer (cámara de contaje celular o hemocitómetro)
¿Cómo se realiza el contaje celular?
1. Homogenizar la suspensión celular y preparar alícuota con solución azul tripán (1/2)
2. Montar la cámara de Nuebauer, colocar el cubreobjetos encima
3. Cargar 10 µl de la alícuota teñida en la cámara
4. Dejar reposar unos minutos en la cámara y visualizar al microscopio
5. Recuento de células blancas (viables) y azules (no viables) en los cuatro cuadrados
6. Cálculos
Siembra del cultivo
• Inicio del cultivo se realiza sembrando número determinado de células:
• Procedimiento:
1. Hacer recuento de células viables en la suspensión
2. Elegir tipo de soporte a utilizar para realizar el cultivo (densidad celular)
3. Colocar la suspensión celular en un tubo para su lavado con medio de cultivo (centrifugación)
4. Eliminar sobrenadante y resuspender las células en la cantidad de volumen de medio de
cultivo acorde al recipiente de cultivo
5. Colocar el frasco de cultivo en el incubador de CO2 a una temperatura de 37 ºC, 5% de CO2
y 95% humedad
Mantenimiento del cultivo
• Diferentes operaciones para el control de su viabilidad y crecimiento
✓ Control periódico al microscopio
✓ Cambio de medio
✓ Subcultivo o pase celular
✓ Control periódico al microscopio
- Control cada 24-48 h
- Retirar del incubador
- Observar al microscopio apariencia y crecimiento de las células
✓ Cambio de medio
- Operación de mantenimiento más frecuente
- Renovar los nutrientes consumidos por las células
- Retirar productos de deshecho del metabolismo celular
- Se realiza cada 2-3 días y siempre que haya cambio de color en el medio de cultivo (viraje del
indicador de pH)
✓ Subcultivo o pase celular
- Tras 7-10 días en cultivo las células llegan a confluencia en cultivos en monocapa
- Cultivos en suspensión alcanzan una densidad crítica
- El crecimiento se detiene y hay que hacer un pase
❖ Cultivos en suspensión
Recuento de viables y se calcula factor de dilución necesario para densidad celular adecuada
para reiniciar cultivo
❖ Cultivos en monocapa
Despegar las células para hacer el pase Métodos mecánicos (rascador) o métodos enzimáticos
(tripsinización)
Tripsinización cultivos en monocapa
1. Retirar el medio del frasco de cultivo
2. Lavar el frasco con un poco de PBS o tripsina
3. Retirar la solución de lavado y añadir solución de tripsina-EDTA al 0,05% e incubar a 37 ºC
durante 10 min
4. Pasado este tiempo o cuando las células estén despegadas, añadir medio de cultivo con FBS
(inactiva la tripsina)
5. Pipetear el medio por toda la superficie del frasco de cultivo y recoger toda la suspensión
celular en un tubo falcon.
6. Centrifugar la suspensión celular
7. Retira el sobrenadante y resuspender el pellet en medio de cultivo
8. Hacer recuento de viables
9. Calcular el factor de dilución necesario para subcultivo
10.Preparar frascos de cultivo necesarios para la densidad celular a sembrar
11.Repartir las células en los frascos de cultivo
12.Colocar los frascos de cultivo en el incubador
Conservación de las células
• Células o líneas celulares se mantienen mediante pases celulares
• Método habitual de conservación Congelación → congelación
Proceso
➢ Se obtiene una suspensión de células
➢ Se centrigufa y se realiza recuento celular
➢ Las células se congelan en criotubos
➢ La densidad celular por microtubo suele ser de 106 células/ml
➢ Volvemos a centrifugar y se resuspende en medio de cultivo completo con 10% DMSO
➢ La suspensión se alícuota en criotubos (aproximadamente 1 ml/criotubo) colocados en hielo
➢ Rampa de congelación (congelación progresiva )
Rampa de congelación
✓ Recipiente con propanol que permite el descenso gradual de la temperatura
✓ Se introduce primero en -80 ºC durante al menos 24h
✓ Congelación progresiva evita la formación de cristales intracelulares
Descongelación de las células
• Importante descongelación correcta para conseguir una alta viabilidad celular
• Tiene que ser un proceso rápido
• Mantener los viales en hielo al sacarlos del N2 líquido
4. ¿Cómo se comportan las células en cultivo? Biología de las células en cultivo
CURVA DE CRECIMIENTO
• Representa la dinámica de crecimiento de un cultivo, concentración de
células por los días de evolución del cultivo.
• Adopta forma de una curva sigmoidea en la que se diferencian 3 fases:
➢ Fase de latencia: Se corresponde con las primeras 24 h de evolución del cultivo en las
que no se produce crecimiento y el número de células permanece constante. Tramo
recto, sin pendiente.
➢ Fase de crecimiento exponencial: Dura aprox. 6-7 días, número de células aumenta
de forma exponencial hasta alcanzar su máximo. Tramo recto con pendiente elevada.
➢ Fase estacionaria: A partir del día 7 de cultivo, número de células permanece
constante. Tramo recto de pendiente nula.
FORMAS DE CRECIMIENTO
• No todos los tipos celulares tienen la misma facilidad para crecer en cultivo
• Cuanto más indiferenciado más fácil de cultivar, ya que poseen mayor capacidad de
proliferación y división
• Muchos tipos celulares pierden características de diferenciación a lo largo del cultivo
• El crecimiento de las células puede ser de dos tipos : en monocapa o en suspensión
En monocapa
• Células crecen adheridas sobre una superficie sólida (plástico o vidrio)
• Dependientes de anclaje
• La mayoría de cultivos celulares. Etapas:
1. Adhesión a superficie. Periodo durante el cual las células se adhieren al soporte.
Coincide con el periodo de latencia de la curva de crecimiento.
2. Proliferación y formación de colonias. Una vez las células están pegadas al frasco de
cultivo, empiezan a crecer y se expanden por toda la superficie formando colonias.
Coincide con la fase exponencial.
3. Inhibición por contacto. Con el paso del tiempo, las células ocupan toda la superficie
del frasco de cultivo y llegan a confluencia, establecen contacto entre ellas y tiene lugar
la inhibición por contacto. Las células dejan de crecer pero se mantienen vivas.
Comienza así la fase estacionaria
En suspensión
• Células se mantienen dispersas en el medio de cultivo donde proliferan
• No necesitan anclarse a superficie
• Células sanguíneas. Etapas
1. Adaptación al medio de cultivo. Las células se adaptan al medio y las condiciones de
cultivo antes de iniciar la proliferación. Coincide con la fase de latencia.
2. Proliferación en suspensión. Una vez adaptadas, las células comienzan a multiplicarse
aumentando exponencialmente su número. Coindice con la fase exponencial.
 3. Inhibición por densidad. Momento en el que el cultivo alcanza número crítico de
células en relación al volumen de medio de cultivo y nutrientes presentes. Las células
dejan de crecer aunque continúan vivas. Coincide con la fase de latencia.
COMPORTAMIENTO TRAS SUCESIVOS PASES
A partir del cultivo primario, los sucesivos pases dan lugar a una línea celular primaria o a una línea
celular continua.
Línea celular primaria
✓ Se obtiene a partir de un tejido u órgano mediante cultivo primario
✓ Se mantiene en cultivo mediante sucesivos pases durante un tiempo limitado
✓ Tienen una vida fina: crecimiento durante un número determinado de pases
✓ Nº pases característico de cada tipo celular (entre 20 y 100)
✓ Entran en fase de senescencia: etapa vital células pierden capacidad de división
✓ Sucesivas divisiones los telómeros se acortan, acumulan anomalías genéticas
✓ Se pueden conservar mediante congelación celular
✓ Población celular aumenta en cada pase hasta que se estabiliza →
• Células se hacen uniformes y homogéneas
• Mantienen las características morfológicas y fisiológicas durante generaciones
• Tipo celular de mayor tasa de crecimiento desplaza a los demás
Línea celular continua
✓ Se obtiene a partir de un cultivo primario
✓ Se mantiene en cultivo mediante sucesivos pases por tiempo ilimitado
✓ Se mantienen en cultivo por tiempo ilimitado mediante pases seriados → células inmortales
✓ Aparecen por transformación de células normales sufren pérdida de mecanismos de control
celular
✓ Su aparación puede ser inducida por métodos:
• Físicos: irradiación del cultivo
• Químicos: tratamiento con productos carcinogénicos
• Biológicos: infección vírica, transfección de ADN
✓ Características células transformadas:
1. Crecen indefinidamente en cultivo (son inmortales)
2. Pierden la dependencia del anclaje para crecer, pueden crecer en suspensión
3. Pierden la inhibición por contacto
4. Pueden invadir tejidos y producir tumores
5. Acumulan anomalías genéticas, aneuploidías con aberraciones cromosómicas
5. Factores que influyen en el cultivo
• El cultivo implica:
- Extraerlas de su entorno fisiológico
- Introducirlas en un recipiente adecuado con el medio de cultivo
- Colocarlo en el incubador, condiciones ambientales adecuadas
• Proceso se desarrolle correctamente, hay que tener en cuenta una serie de factores:
- Soporte físico
- Medio de cultivo
- Atmósfera gaseosa
- Condiciones de incubación
SOPORTE FÍSICO
• Mayor parte de las células crecen en monocapa adheridas a superficie del recipiente
• Para planificar el cultivo, tener en cuenta:
1. Material o sustrato con el que están fabricados
▪ Permitir la adhesión celular
▪ Fácil de esterilizar
▪ Permitir visualización al microscopio
▪ Vidrio →
✓ Reutilizable
✓ Fácil de limpiar
✓ Fácil de esterilizar por calor en autoclave
✓ Buena calidad óptica observación al microscopio
▪ Plástico desechable →
✓ Material más utilizado
✓ No reutilizable
✓ Bajo coste
✓ Fácil de esterilizar por irradiación
✓ Buena calidad óptica observación al microscopio
▪ Matrices tridimensionales →
✓ Materiales que forman estructura tridimensionales
✓ Geles de colágeno, esponjas de celulosa
✓ Cultivar tipos celulares que se introducen en el interior de la red
✓ Organización parecida al tejido de procedencia
▪ Microesferas →
✓ Células crecen adheridas a las esferas
✓ Crecen en suspensión en el medio de cultivo
✓ Células dependientes de anclaje
✓ Aumentan la superficie de crecimiento disponible
▪ Metales
2. Diseño o forma. Características y tipos de recipientes de cultivo
▪ Superficie útil de cultivo
▪ Los más habituales →
- Placas multipocillo →
+ Placas número variables de pocillos
+ Fondo plano, cubiertas por una tapa no hermética
+ Experimentos puntuales distintas líneas celulares
+ No aconsejables líneas celulares (riesgo de contaminación)
- Placas Petri →
+ Placas típicas de cultivo, circulares con tapa
+ Diferentes tamaños
+ Mismas utilidades y limitaciones que las placas multipocillos
- Frascos de cultivo →
+ Frascos planos con tapón de rosca
+ Diferente superficie de cultivo: 25, 75, 150, 225 cm2
+ Todo tipo de cultivo: monocapa y suspensión
 - Botellas incubadores tipo roller
+ Botellas cilíndricas
+ Gran superficie de crecimiento
+ Específicas para incubarlas sobre rodillos
+ Células crecen en toda la superficie interior
3. Tratamientos de la superficie
✓ Finalidad: posibilitar o mejorar adhesión de las células
✓ Proteínas de matriz extracelular: colágeno, laminina, fibronectina, etc.
✓ Otras proteínas naturales o sintéticas como gelatina o polilisina
✓ Tratamiento antes del cultivo (soporte de cultivo) o añadiéndola al medio de cultivo
COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
• Medios de cultivo →
▪ Medios nutritivos que sustituyen al medio natural en el que se encuentra la células
fisiológicamente
▪ Mezclas complejas
▪ Aporta nutrientes y sustancias necesarias para el completo desarrollo metabólico
▪ Generar condiciones microambientales adecuada para el desarrollo celular
▪ Permitir acumular temporalmente productos de deshecho del metabolismo células
• Composición →
➢ Sales minerales →
• Base del medio de cultivo
• Solución salina equilibrada.
• NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, fosfatos sódicos, bicarbonato sódico
➢ Tampón →
• Células sensibles a cambios de pH
• pH óptimo crecimiento 7,2-7,6
• Tampón bicarbonato, tampón HEPES
➢ Indicador de pH →
• pH parámetro fundamental para la supervivencia del cultivo
• Registra cambios mínimos en el rango de pH
• Más utilizado: rojo fenol
➢ Glucosa →
• Hidrato de carbono
• Fuente de energía
➢ Suplementos orgánicos de bajo peso molecular →
• Ácidos grasos esenciales
• Nucleósidos, piruvatos, etc
➢ Aminoácidos →
• Medio de cultivo debe contener aminoácidos esenciales
• Aquellos que los organismos no pueden sintetizar
• Fenilalanina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, treonina,
triptófano y valina
• Necesarios para sintetizar proteínas
➢ Vitaminas →
• Influyen en la tasa de crecimiento y supervivencia celular
• Varía de un medio a otro
• Depende de la concentración de suero
 ➢ Hormonas y factores de crecimiento →
• Multitud de componentes esenciales para el crecimiento celular
• Proporción difícil de estandarizar
• Medios no definidos añaden suero animal (2-50%)
• Suero de ternera, suero de caballo, suero bovino fetal o suero humano
• Debe utilizarse descomplementado
➢ Antibióticos y antifúngicos →
• Esenciales para prevenir contaminación
• Solos o en combinación
• Necesario controlar la concentración final, evitar dañar las células
• Antibióticos más utilizados:
- Gentamicina
- Penicilina/estreptomicina
• Antifúngico:
- Anfotericina B
• Características fisicoquímicas →
➢ pH →
- Margen de pH estrecho (7,2-7,6)
- Fija con tampones
- Indicadores de pH (cambio de color)
➢ Osmolaridad → Medios de cultivo isotónicos o ligeramente hipotónicos con respecto a las
células en cultivo.
➢ Viscosidad
➢ Tensión superficial
ATMÓSFERA GASEOSA
✓ Mezcla de gases en que se mantienen los cultivos
✓ Componentes más importantes:
- Oxigeno
• Necesario para vivir
• Concentración de oxígeno atmosférico
• Algunos cultivos requieren mayor concentración
- CO2
• Necesario para vivir
• Concentración de oxígeno atmosférico
• Algunos cultivos requieren mayor concentración
CONDICIONES DE INCUBACIÓN
✓ El incubador es el responsable de mantener las condiciones ambientales óptimas
✓ Parámetros a controlar:
- Temperatura
• Influye tasa de crecimiento de las células
• Temperatura óptima organismos de procedencia
• 37 ºC
- Humedad
• Humedad ambiental
• Evitar evaporación medio de cultivo
• Evitar concentración de componentes y osmolaridad y variaciones de pH
 6. Contaminación
• Contaminación es uno de los principales problemas en los cultivos celulares
• Para evitar imprescindible mantener condiciones de asepsia
• En un laboratorio de cultivos celulares pueden darse varios tipos de contaminación:
➢ Contaminación cruzada
❖ Tipo de contaminación que se da en laboratorios que manipulan más de un tipo de
células
❖ Contaminación con otras células distintas a las del cultivo
❖ Ejemplo: contaminación de cultivos con células Hela
❖ Células con gran capacidad de proliferación que comprometen la viabilidad de
nuestro cultivo celular
❖ Para evitar contaminación cruzada:
• Trabajar con células de bancos autorizados o fuentes de procedencia fiables
• Si en el laboratorio tenemos varias líneas celulares, no tener recipientes
abiertos que puedan ser foco de transmisión de células de una línea a otra
• Manipular en solitario las líneas celulares de crecimiento rápido
• Utilizar soluciones distintas, aunque su composición sea idéntica a la utilizada
en otras líneas celulares
• Manipular en último lugar del protocolo de trabajo del laboratorio las líneas
celulares de mayor proliferación
➢ Contaminación química
❖ Presencia de sustancias que no coexisten con el cultivo celular
❖ Producen efectos adversos a las células del cultivo
❖ Naturaleza muy variable de los contaminantes químicos
❖ Se puede producir a través de:
• Medios impuros
• Suero
• Agua contiene endotoxinas
• Agua con componentes orgánicos no deseables para el cultivo
• Concentraciones de los nutrientes esenciales en cantidades no adecuadas,
pueden ser tóxicos en el medio de cultivo
• Exposición a luz fluorescente puede alterar composición química del medio
• Tampones del cultivo celular preparados de forma incorrecta para el medio de
cultivo
➢ Contaminación microbiológica
❖ Tipo de contaminación más frecuente
❖ Produce alteración del cultivo por la presencia de microorganismos no deseados y
que son omnipresentes en el ambiente
❖ Los organismos más frecuentes se pueden agrupar en:
• Bacterias, levaduras y hongos →
➢ Bacterias y levaduras son los contaminantes más habituales en cultivos a corto
plazo
➢ Hongos son el contaminante más habitual en cultivos a largo plazo
➢ Estos contaminantes en los medios de cultivo más rápido que las células
➢ Fuente de contaminación suele ser ambiental o malas prácticas de laboratorio
(pipeteo de soluciones, apertura de recipientes, etc.)
➢ Solución a corto plazo adición de antibióticos o antifúngicos (estadios iniciales
de contaminación), a largo plazo es desaconsejable puede producir problemas
de viabilidad celular
➢ Para evitar este tipo de contaminación es fundamental:
1. Trabajar en condiciones de esterilidad en cabinas de flujo laminar
2. Extremar precauciones en la manipulación de los recipientes de cultivo
celular fuera de ambiente estéril
3. Limpiar con alcohol 70% la superficie externa de los frascos/recipientes
que se introducen en la cabina (especialmente recipientes incubados en
baño a 37ºC)
4. Desinfección periódica de las bandejas con agua de los incubadores y
cambio periódico de el agua de las mismas
5. En el caso de contaminación, separar frasco contaminado del resto
• Micoplasmas →
➢ Microorganismos procariotas sin pared celular, bacterias sin pared celular
➢ Pueden proceder de las propias líneas celulares continuas
➢ Pueden crear una gran variedad de problemas:
- Velocidad de crecimiento de los cultivos celulares alterados
- Cambios morfológicos de las células en cultivo
- Cambios a nivel cromosómico
- Viabilidad de recuperación disminuida en las células preservadas (en la
descongelación)
➢ Difíciles de detectar, no causan signos aparentes (cambios pH o turbidez del
medio)
➢ Indicador de este tipo de contaminación: aparición de gránulos oscuros en el
citoplasma de las células de cultivo.
➢ Micoplasmas se detectan tiñendo las células con orceína o DAPI o mediante
la realización de PCR
con cebadores específicos
➢ Una vez detectado cultivo contaminado, lo primero es aislarlo del resto de
cultivos
➢ Si el cultivo es reemplazable, lo mejor es eliminarlo
➢ Como alternativa:
- Se puede tratar el cultivo con antibióticos (kanamicina o quinolonas)
- Tratamiento con suero antimicoplasmas (medida eficaz pero muy
costosa)
➢ Para poder reducir la contaminación por micoplasmas se recomienda:
- Realizar control de microplasmas a todo cultivo celular que llegue al
laboratorio
- Controles periódicos (cada 6 meses aprox.) de los cultivos presentes en
el laboratorio
- Controles periódicos también de medios de cultivo y soluciones
empleadas
• Virus →
➢ La contaminación por virus es menos frecuente pero su eliminación es difícil
➢ Fuente principal solía ser los sueros animales, actualmente muy controlados
➢ Los virus pueden tener un marcado efecto citopático → Cambios
morfológicos, moleculares y de viabilidad celular
➢ La detección se basa en la observación de los efectos citopáticos,
característico de cada tipo de virus
➢ En ocasiones no aparecen efectos citopáticos hasta la realización de varios
pases celulares, cuando pueden detectarse la presencia de partículas víricas por
técnicas de inmunofluorescencia
➢ Mejor solución ante sospecha de infección viral, eliminar el cultivo sospechoso