DR Amartinez

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas en

Aspregillus flavipes FP-500
TESIS
Dirigida por:
Dr. Juan Silvestre Aranda Barradas, UPIBI-IPN.

Dr. Guillermo Aguilar Osorio, FQ-UNAM.
Presentada para obtener el grado de:
DOCTOR EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS
Por:
María Aurora Martínez Trujillo

Ingeniera Bioquímica
Maestra en Ciencias con Especialidad en Biotecnología
México, D. F., 2009

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO
CARTA CESION DE DERECHOS
En la Ciudad de ___México, D.F.__________el día _19__del mes__enero___________del

año __2009____, el (la) que suscribe___María Aurora Martínez Trujillo____________
alumno (a) del Programa de___Doctorado en Ciencias en Bioprocesos___ con número de
registro _B040716__, adscrito al ___Instituto Politécnico Nacional_____, manifiesta que es
autor (a) intelectual del presente trabajo de Tesis bajo la dirección de _Dr. Juan Silvestre
Aranda Barradas (UPIBI-IPN) y Dr. Guillermo Aguilar Osorio (FQ-UNAM)__ y cede los
derechos del trabajo intitulado _”Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas
en Aspergillus flavipes FP-500”___, al Instituto Politécnico Nacional para su difusión, con
fines académicos y de investigación.
Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas o datos del
trabajo sin el permiso expreso del autor y/o director del trabajo. Este puede ser obtenido
escribiendo a la siguiente dirección __jaranda@acei.ip.mx o gao@servidor.unam.mx___. Si
el permiso se otorga, el usuario deberá dar el agradecimiento correspondiente y citar la fuente
del mismo.
María Aurora Martínez Trujillo

DEDICATORIA
El final de este camino ha marcado lo que soy. Dedico este trabajo a las siete personas
más importantes de mi vida:
A mis padres, Juan José y María Aurora, por ser el pilar de mi vida. Su ejemplo, apoyo
y cariño incondicional me han dado las armas para sobrevivir en esta vida. Por no
dejarme caer ni permitirme rendirme en los peores momentos. ¡¡¡Misión cumplida!!!.
Los amo con todo mi corazón.
A mis hermanos, por completar la red que me sostiene.

Verito, por tu abrazo y cariño constantes. Porque en mí tienes una alumna en vez de la
maestra que crees que soy para ti. Admiro y respeto tu sensibilidad y estoy orgullosa de
tenerte como hermana. Estaré a tu lado siempre.
Teresina, por sostenerme fuerte cuando iba en caída libre. Por poner la fortaleza por
encima de la tristeza. Por compartir conmigo tu espacio y el alojamiento cálido durante
las estancias. Tu apoyo incondicional refuerza mi seguridad.
Juan, por tu respeto y cariño. Me has enseñado la importancia de las pequeñas cosas.
Gracias por las carcajadas que limpian el alma. Tengo tanto que aprender de ti….te
quiero chaparro!!
A Quique, porque me regalaste los nueve mejores años de mi vida. Tu paso por ella
dejó una gran enseñanza y tu partida me mostró la importancia de vivir. Flaco esto se
quedó incompleto, pero aún me sostiene la esperanza de encontrarte en la eternidad.
A Petrita, porque su cariño se ha impuesto aún por encima de ella misma. Por ser el
pilar de una gran familia y por olvidarte de todos pero tener presentes a tus niños. ¡¡Te
quiero abu!!
A todos ustedes les debo aquellas pequeñas cosas que me hacen lo que hoy soy. Los
amo!!!
AGRADECIMIENTOS
A Rosario, por el cariño sincero y constante. Me has mostrado el verdadero sentido de
la amistad. ¡¡Gracias por formar parte de mi vida!!
A Ale, porque no me dejaste rendirme. Porque me has mostrado la importancia de

disfrutar cada pequeño momento. Porque cambiaste por completo mi concepto de vida y
muerte. Siempre serás mi Sensei. El círculo está cerrado, ya no tengo escapatoria, ahí te
voy….
Gaby y Jaz, mis compañeras en el camino. Compartiendo alegrías y tristezas

fortalecemos los lazos que nos unen como familia. Las quiero!!
A Mayo, por las porras, el cariño y la admiración. Aprecio tu sinceridad y admiro la

forma en que defiendes tus ideales, porque con ello me has enseñado mucho.
A Ricardo y Amapola Sánchez Quiros, porque primero fueron mis maestros y ahora
tengo el honor de contarlos como amigos. Agradezco su cariño sincero y las palmadas
de apoyo y aliento.
A Isabel, por ser una guerrera y ganarle la carrera a la vida. Gracias por el ejemplo.
A Pao, por seguir a mi lado enriqueciendo nuestra amistad. Eres el mejor ejemplo de
cómo la alumna superó a la maestra.
A Claudia y Rubén, unos excelentes compañeros de laboratorio. Me gustó encontrarlos
en el camino y compartir tardes enteras de trabajo arduo.
A Ada Luz, por el apoyo y disposición sincera y constante. Me ayudaste a alivianar el
camino.
A Carlos, por poner ante mis ojos la ruta a seguir. ¡Gracias por la sugerencia!.
A Ubaldo, Gloria, Marlene, Paty, Fátima, Selene, Elizabeth y Ada Luz, sin cuyo apoyo
en el laboratorio las carreras de cada día hubieran sido prácticamente imposibles. Su
ayuda fue invaluable. Gracias por su cariño y preocupación para hacer las cosas lo
mejor posibles.
A Mayra, Damaris, Bety, Maribel, Fernando, Rafa, Lety, Laura, Janeth, Félix, Erick y
David, por permitirme poner un granito de arena en su formación y seguirme el paso
con confianza y admiración.
A Lety, por tu cariño y fe ciegas. Tu alegría fue un gran motor.
A Angie, Jesús, Elizabeth, Ana y Estela, por su cariño sincero. A Pamela, además por
mostrarme la luz en el camino. Por ustedes vale la pena el trabajo.
A Lupita, Gaby, Yola, Alex, Odi y la Dra. Ponce, por su amistad constante. Son el
mejor premio de mi paso por CINVESTAV.
A Oli e Inti por las porras y el abrazo sincero. Agradezco a Tere el compartirlos
conmigo.
A Nadia, por la disposición y apoyo. Gracias por ayudar en mis carreras, y todas las
horas dedicadas a los trámites.
A Blanca Aguilar Trejo, por la enseñanza de la técnica, pero sobre todo por la
enseñanza de vida. Siempre agradeceré la disposición para aligerar mi camino. Gracias
por la confianza, aprendí mucho de ti.
A los revisores de este trabajo, Dr. Enrique Durán, Dr. Edgar Salgado y Dra. Carmen
Oliver, por los acertados comentarios para mejorar este documento y el tiempo dedicado
a la revisión del mismo.
A mis directores de tesis, Dr. Guillermo Aguilar Osorio y Dr. Juan

Aranda Barradas, por la confianza que depositaron en mí. Por compartir sus
conocimientos conmigo y aportar lo mejor para mi formación. Por el
empeño que pusieron para hacer de mí una mejor profesionista, pero sobre
todo una mejor persona. No me alcanzan las palabras para agradecerles
todo lo que me dieron durante estos años y lo que forjaron en mí. Siempre
tendrán mi admiración, respeto y cariño.
Este trabajo se realizó en el Grupo de
Fisiología de Hongos Filamentosos del
Departamento de Alimentos y Biotecnología
de la Facultad de Química de la Universidad
Nacional Autónoma de México y en el
Laboratorio de Investigación en Bioingeniería
de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de
Biotecnología (UPIBI-IPN), bajo la dirección
de
Dr. Guillermo Aguilar Osorio
Dr. Juan S. Aranda Barradas

El presente trabajo fue apoyado por la
Dirección General de Asuntos del
Personal Académico de la UNAM,
proyectos IN207603 e IN209007.
Así mismo, se agradece el apoyo recibido
de la Secretaria Técnica de Intercambio
Académico para Facultades y Escuelas de
UNAM a través de su programa de
Colaboración Académica Nacional.
INDICE
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1. INTRODUCCIÓN GENERAL 3
2. OBJETIVOS 5
2.1 Objetivo general 5
2.2 Objetivos específicos 5
3. MARCO TEÓRICO 6
3.1 Los polisacáridos de la pared celular de las plantas. 6
3.1.1 Estructura y función de la pectina. 6
3.2 El sistema pectinolítico 7
3.2.1 Regulación de la actividad pectinolítica 11
3.2.1.1 Regulación por la fuente de carbono. 12
3.2.1.2 Regulación por pH. 12
3.3 Los sistemas de producción de polisacarasas 13
3.3.1 Los microorganismos productores de pectinasas 14
3.3.1.1 Las características de género Aspergillus 14
3.3.1.2 Aspergillus flavipes FP-500 15
3.3.2 Sistemas de producción en cultivo en medio líquido 16
3.3.2.1 El cultivo en lote 16
3.3.2.2 El cultivo alimentado 16
3.4 Los balances de materia para los cultivos 17
3.5 Modelos cinéticos utilizados para describir el comportamiento de un cultivo
microbiano 19
3.5.1 Estimación de los parámetros cinéticos a partir de datos
experimentales. 20
4. MATERIALES Y MÉTODOS. 23
4.1 Microorganismo. 23
4.2 Composición del medio. 23
4.3 Inóculo 23
4.4 Condiciones de cultivo 23
4.4.1 Cultivos en matraz. 23
4.4.2 Experimentos de transferencia 24
4.4.3 Cultivo por lote en fermentador. 25
4.4.4 Cultivo alimentado en fermentador 26
4.5 Técnicas de analíticas 28
4.5.1 Cuantificación de la concentración de biomasa. 28
4.5.2 Cuantificación de la actividad de exopectinasas. 28
4.5.3 Cuantificación de la actividad de endopectinasas. 29
4.5.4 Cuantificación de la actividad de pectinliasas. 29
4.5.5 Cuantificación de la concentración de azúcares reductores. 29
4.5.6 Cuantificación de la concentración de ácido poligalacturónico y pectina en
los cultivos. 30
Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 i

4.6 Modelo matemático 30
4.6.1 Estimación de parámetros del modelo 32
4.6.2 Estimación de las varianzas del modelo 33
4.6.3 Análisis estadístico 34
5.1 CONSTITUTIVIDAD E INDUCIBILIDAD EN PECTINASAS DE ASPERGILLUS

FLAVIPES FP-500: ANÁLISIS DE PRODUCCIÓN VOLUMÉTRICA Y ESTUDIO
CINÉTICO 35
5.1.1. La producción de exopectinasas 36
5.1.2 La producción de endopectinasas 39
5.1.3 La producción de pectinliasas 40
5.1.4 Estudio cinético sobre la naturaleza inducible y constitutiva de las pectinasas de A.
flavipes FP-500 43
5.1.4.1 Parámetros cinéticos de crecimiento generados con el modelo. 45
5.1.4.2 Correlación de los parámetros cinéticos sobre la constitutividad e inducibilidad de
las exopectinasas. 47
5.1.5 Conclusión 51
5.2 REGULACIÓN POR LA FUENTE DE CARBONO DE LA PRODUCCIÓN DE
PECTINASAS EN ASPERGILLUS FLAVIPES FP-500 52
5.2.1 Producción concertada y secuencial de las pectinasas. 52
5.2.2 Experimento de transferencia. 58
5.2.3 Represión catabólica de las pectinasas de A flavipes FP-500 - efecto de la glucosa.
61
5.2.4 Conclusiones 69
5.3 MODULACIÓN POR PH DE LAS PECTINASAS PRODUCIDAS POR ASPERGILLUS

FLAVIPES FP-500 71
5.3.1 Relación de la evolución del pH con la producción de pectinasas. 72
5.3.2 Efecto del pH sobre la producción de las pectinasas de A. flavipes FP-500 81
5.3.3 Verificación de la estabilidad de las pectin liasas a diferentes valores de pH 86
5.3.4 Uso del cultivo en lote alimentado para conocer la relación del pH con la producción de
pectinasas por A. flavipes FP-500 87
5.3.5 Conclusión. 90
6. CONCLUSIONES GENERALES 92
7. AMPLIACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN 93
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 94
Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 ii

INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Clasificación de las enzimas que conforman al sistema pectinolítico 10
Figura 2. Morfología microscópica de Aspergillus y micrografía 15
Figura 3. Ajuste de los datos experimentales a un modelo cinético en cultivos en lote
desarrollados a nivel matraz 44
Figura 4. Correlación µmax - α , a diferentes valores de pH inicial en glucosa, ácido
galacturónico, ácido poligalacturónico y pectina en cinéticas desarrolladas a nivel
matraz 50
Figura 5. Evolución del cultivo en lote desarrollado a nivel biorreactor, utilizando
pectina como fuente de carbono 55
Figura 6. Experimento de transferencia de micelio, desarrollado a nivel matraz con
pectina al 1% (p/v) como fuente de carbono 60
Figura 7. Evolución del crecimiento, concentración de pectina y de azúcares reductores
en el cultivo alimentado desarrollado sobre pectina 62
Figura 8. Velocidad específica de crecimiento µ y factor de dilución D, calculadas a
partir de los datos experimentales de biomasa obtenidos durante el régimen de
alimentación en el cultivo alimentado 63
Figura 9. Producción específica de exopectinasas, endopectinasas y pectin liasas
producidas por A. flavipes FP-500 en un cultivo en lote alimentado 65
Figura 10. Producción específica de exopectinasas, endopectinasas y pectin liasas
producidas por A. flavipes FP-500 en un cultivo en lote alimentado 68
Figura 11. Evolución del pH, la producción de exopectinasas, endopectinasas y pectin
liasas en cultivos en lote de A. flavipes FP-550 desarrollados a nivel biorreactor con
pectina al 1% (p/v) como única fuente de carbono 75
Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 iii
Figura 12. Evolución del pH, la producción de exopectinasas, endopectinasas y pectin
liasas en cultivos en lote de A. flavipes FP-500 desarrollados a nivel biorreactor con
ácido galacturónico al 1% (p/v) como única fuente de carbono 79
Figura 13. Evolución de la producción de exopectinasas producidas en cultivos en lote
desarrollados sobre pectina o ácido galacturónico 82
Figura 14. Evolución de la producción de endopectinasas producidas en cultivos en lote
Figura 15. Evolución de la producción de endopectinasas producidas en cultivos en lote
Figura 16. Estabilidad de las pectin liasas en los valores de pH de 2, 4, 6 y 8 87
Figura 17. Biomasa, producción específica de exopectinasas, endopectinasas y pectin
liasas producidas por A. flavipes FP-500 en un cultivo en lote alimentado desarrollado
sobre pectina 88
Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 iv

INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Balances de materia para el cultivo en lote y el cultivo en lote alimentado a
partir de los balances generales. 18
Tabla 2. Producción máxima de exopectinasas de A. flavipes FP-500 en cultivos en lote
desarrollados a nivel matraz 36
Tabla 3. Producción máxima de endopectinasas de A. flavipes FP-500 en cultivo en lote
desarrollado a nivel matraz 40
Tabla 4. Producción máxima de pectin liasas de A. flavipes FP-500 en cultivo en lote
desarrollado a nivel matraz 42
Tabla 5. Parámetros cinéticos de crecimiento obtenidos con la modelación de los datos
experimentales, mediante el empleo de la función de residuales 46
Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 v

Resumen
Resumen
Se estudió la regulación por el pH y la fuente de carbono de la producción de las pectinasas
producidas por Aspergillus flavipes FP-500. Para lo anterior, se utilizaron diferentes tipos
de cultivos. A nivel matraz, se desarrollaron cultivos en lote con diferentes fuentes de
carbono, cada una en tres valores de pH inicial; a nivel biorreactor se desarrollaron cultivos
de dos tipos, lotes desarrollados sobre pectina y ácido galacturónico y cultivos alimentados,
en los que se emplearon glucosa y pectina. Para todos los experimentos desarrollados, se
cuantificó el crecimiento del microorganismo, la concentración de sustrato y la producción
de exopectinasas, endopectinasas y pectin liasas.
Mediante el análisis de las actividades enzimáticas volumétricas y cinético de los cultivos
en lote se propuso la constitutividad de algunas isoformas con actividad de exopectinasas y
pectin liasas, así como la naturaleza inducible de las exo y endopectinasas y pectin liasas
producidas por esta cepa. Con el uso de los cultivos alimentados, además de confirmar la
constitutividad e inducibilidad de las pectinasas, se observó que la producción de exo y
endopectinasas se regula por el fenómeno de represión catabólica, aunque esta es
transitoria. La secuencia de producción de las pectinasas permitió proponer un modelo,
mediante el cual se explica el orden de aparición de cada actividad pectinolítica a lo largo
del cultivo en lote. Finalmente, se estableció la relación de la producción de pectinasas con
la evolución del pH, y se sugirió la existencia de isoformas de las pectinasas producidas
ante los diferentes valores de pH observados. Se observó que las exo y endopectinasas se
producen en mayor proporción en valores de pH ácidos, mientras que la producción de
pectin liasas es mejor en los valores de pH cercanos a la neutralidad.
Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500

1
Resumen
Abstract
Regulation by pH and a variety or carbon sources, on pectinases production from
Aspergillus flavipes FP-500 was studied. For this, the microorganism was cultivated in
batch or fed-batch systems with different carbon sources and at different initial pH in the
culture media. For all the experiments, biomass, substrate concentration and exopectinases,
endopectinases and pectin lyases production were quantified.
Through the analysis of experimental enzymatic activities and from a kinetic interpretation
of the pectinases production, we propose constitutive isoforms for the exopectinase and
pectin lyase activities, so as inducible isoenzymes of the exopectinases, endopectinases and
pectin lyases produced by this strain. Inducible pectinases were found to be subject to
catabolic repression, although this phenomena is only transient. Besides, it was observed
that the exo and endopectinases are produced mainly on acidic pH values, meanwhile
pectin lyases production was better on pH values near to neutrality.

2
Objetivos
2. Objetivos
2.1 Objetivo general
Analizar la cinética de producción de las pectinasas de Aspergillus flavipes FP-500 ante
diferentes fuentes de carbono y valores de pH en el medio.
2.2 Objetivos específicos
¾ Determinar la naturaleza constitutiva o inducible de las pectinasas de A. flavipes FP-
500.
¾ Determinar si la producción de las pectinasas es concertada, secuencial o
independiente entre sí.
¾ Proponer un modelo cinético simple para describir la secreción de pectinasas.
¾ Analizar el efecto represor o inductor de la fuente de carbono sobre la producción de
pectinasas por A. flavipes FP-500.
¾ Analizar el efecto del pH del medio sobre la producción de las pectinasas de A. flavipes
FP-500

5
Introducción general
1. Introducción general
La pectina es uno de los polisacáridos más complejos encontrados en la naturaleza. Su
degradación es el producto de la acción concertada de enzimas de diversos tipos, que en
conjunto se conocen como pectinasas.
Considerando la complejidad estructural de la pectina y el tamaño de la misma, resulta
poco probable su acceso al interior de la célula microbiana. Debido a lo anterior, los
microorganismos deben secretar al medio las enzimas necesarias para degradar a esos
materiales y poder sobrevivir en ellos.
No se conoce con claridad la secuencia de expresión de las pectinasas en un cultivo, o si
existe alguna relación o dependencia entre la producción de estas enzimas. Sin embargo, es
bien sabido que este es un proceso complejo, regulado por diversos factores, de los que
destacan la naturaleza y cantidad de la fuente de carbono y el valor del pH del medio de
cultivo.
En lo que se refiere a la regulación de la producción de las pectinasas por la fuente de
carbono, estas enzimas pueden ser de dos tipos. Aquellas que se expresan ante cualquier
fuente de carbono se conocen como constitutivas, mientras que las que lo hacen solamente
ante la presencia de fuentes de carbono específicas, conocidas como inductores, se
consideran de naturaleza inducible. Estas últimas, además, pueden verse afectadas por la
presencia de azúcares de fácil asimilación, mediante el fenómeno de represión catabólica.
Por otra parte, el pH del medio determina la cantidad y tipo de pectinasas obtenidas en cada
cultivo. La producción de exo y endopectinasas sucede en mayor proporción en los medios
con valores de pH ácidos, de entre 2 y 4, mientras que las pectin liasas se producen
preferentemente en valores de pH menos ácidos o cercanos a la neutralidad.
Estudio cinético de la producción concertada de pectinasas por A. flavipes FP-500

3
Introducción general
En el presente trabajo se presentan resultados de la producción de exopectinasas,
endopectinasas y pectin liasas por Aspergillus flavipes FP-500 en diferentes fuentes de
carbono, valores de pH y condiciones de cultivo.
Estudio cinético de la producción concertada de pectinasas por A. flavipes FP-500

4
Marco teórico
3. Marco Teórico
3.1 Los polisacáridos de la pared celular de las plantas.
Los polisacáridos de la pared celular de las plantas son los compuestos orgánicos más
abundantes de la naturaleza. La pared celular de los materiales cítricos está conformada en su
mayoría por tres polisacáridos: celulosa, hemicelulosa y pectina (de Vries y Visser, 2001).
La celulosa es el polisacárido más abundante y confiere la estructura y rigidez que caracterizan
a la pared celular. Las hemicelulosas, son polisacáridos heterogéneos que forman poros en
dicha estructura. La pectina forma parte de la pared celular primaria, y su función es la de
estabilizar a las microfibrillas de celulosa, así como a otros polímeros y proteínas (Annis y
Goodwin, 1997). Es el componente principal de la lamela media, y se encarga de mantener
unidos a los componentes de la misma (Naidu y Panda, 1998). Las sustancias pécticas
comprenden del 0.5 al 4.0 % del peso seco de la planta (Singh Jayani et al, 2005).
3.1.1 Estructura y función de la pectina.
La pectina es uno de los heteropolisacáridos más complejos de los que conforman a la pared
celular de las plantas. La estructura de la pectina está constituida por dos grandes regiones:
homogalacturonano y ramnogalacturonano. La región del homogalacturonano es la de
estructura más sencilla. Su cadena lineal está constituida por unidades de ácido D-
galacturónico, unidas entre sí por enlaces α,1-4. A lo largo de dicha cadena se encuentran
grupos acetilo (en los grupos hidroxilo de los carbonos 2 y 3) o metilo (en el carbono 6), así
como algunos iones de sodio, potasio o amonio (Jayani et al, 2005).
En la región del ramnogalacturonano, las unidades de ácido galacturónico se intercalan con las
de L-ramnosa, mediante enlaces β,1-2 y β,1-4. Además de las interrupciones de la cadena
Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 6

Marco teórico
principal, esta región se caracteriza por ramificaciones de azúcares de diversos tipos, que van
desde largas cadenas de arabinanos y galactanos (en el ramnogalacturonano I) hasta
ramificaciones más pequeñas, conformadas por xilosa, ácido ferúlico, apiosa y fucosa, entre
otros (en el ramnogalacturonano II) (de Vries y Visser, 2001).
La complejidad estructural de la pectina puede limitar el rendimiento de diversos procesos
industriales que emplean como materia prima elementos ricos en este polisacárido (Kashyap,
et al, 2001; Hoondal et al, 2002; Jayani et al, 2005; Hadj-Taieb et al, 2006). Por otro lado, en
la naturaleza este tipo de materiales son los sustratos de los microorganismos saprófitos,
debido a la capacidad de estos para producir pectinasas. Así, las enzimas pectinolíticas
producidas de manera natural por los microorganismos saprófitos se han utilizado para
incrementar los rendimientos de algunos procesos industriales, como sucede en la elaboración
de jugos y alimentos de diversos tipos (Ortega et al, 2004; Rodríguez-Nogales et al, 2008); la
producción de azúcares fermentables a partir de los subproductos de las industrias productoras
de azúcar y almidón (Kashyap et al, 2001; Mathew y Abraham, 2005) y los procesos de
fabricación del papel (Kashyap et al, 2001, Hoondal et al, 2002; Chand y Mishra, 2003).
3.2 El sistema pectinolítico
El grupo de enzimas encargadas de degradar a la complicada estructura de la pectina hasta sus
azúcares constitutivos, se conoce en su conjunto como pectinasas. La complejidad estructural
de la pectina tiene ciertas implicaciones sobre las enzimas involucradas en su degradación. De
esta manera, la primera gran clasificación de las pectinasas se da con base en la parte de la
estructura sobre la que actúan, teniéndose dos grupos: el de las enzimas que actúan sobre la
estructura principal de la pectina y el conformado por las enzimas accesorias.

Marco teórico
Las actividades enzimáticas que actúan sobre la cadena principal de la pectina, tienen la
función de degradarla hasta sus unidades monoméricas básicas. Así, de acuerdo al mecanismo
de acción que desarrollan, este grupo se divide en dos subgrupos: las enzimas desesterificantes
y las despolimerizantes. Las enzimas desesterificantes se encargan de liberar los grupos acetilo
(pectin acetil esterasas) o metilo (pectinmetilesterasas) colocados a lo largo de la cadena
principal. A la vez, el grupo de las enzimas despolimerizantes se subdivide, con base en la
reacción que catalizan, en tres grupos: las polimetilgalacturonasas, las poligalacturonasas y las
poligalacturonato y polimetilgalacturonato liasas (Kashyap et al, 2001).
Las polimetilgalacturonasas incorporan una molécula de agua durante la ruptura de los enlaces
α-1,4-glicosídicos existentes entre dos unidades de monosacáridos, mediante una catálisis
ácida. Dependiendo del mecanismo mediante el cual lleven a cabo esa ruptura, estas enzimas
se subclasifican en dos grupos: las del tipo endo y las del tipo exo. En el primer grupo se
encuentran las enzimas encargadas de hidrolizar de manera aleatoria los enlaces α-1,4-
glicosídicos de la pectina, preferentemente aquellos que están altamente esterificados.
Mediante su acción, liberan oligogalacturónidos saturados y en ocasiones ácido galacturónico.
A la vez, las enzimas del tipo exo causan una ruptura secuencial de los enlaces α-1,4-
glicosídicos de la pectina, a partir de los finales no-reductores de la cadena principal. Con esto,
provocan la liberación de residuos saturados de ácido galacturónico (Niture, 2008).
Las poligalacturonasas catalizan la hidrólisis de los enlaces α-1,4-glicosídicos en el ácido
poligalacturónico. Estas enzimas también pueden ser del tipo endo (que catalizan la hidrólisis
aleatoria de los enlaces α-1,4-glicosídicos del ácido péctico) o con mecanismo exo (catalizan
la hidrólisis secuencial de los enlaces glicosídicos α-1,4- del ácido péctico).

Marco teórico
La acción de las poligalacturonato y polimetilgalacturonato liasas rompe los enlaces
glicosídicos α-1,4- mediante reacciones de trans-eliminación, que remueven un protón, lo que
da como resultado un enlace insaturado entre los carbonos C-4 y C-5 de la unidad de sacáridos
y los extremos no reductores. Si actúan sobre la región esterificada del homogalacturonano, se
conocen como pectin liasas, mientras que si lo hacen sobre la región parcialmente esterificada
de éste, se conocen como pectato liasas. De igual manera, dentro de las liasas se encuentran
enzimas con los mecanismos endo y exo mencionados previamente.
Por último, las enzimas accesorias se encargan de liberar de las ramificaciones laterales a la
cadena principal de la pectina, mediante la hidrólisis de los enlaces glicosídicos
correspondientes. Las enzimas que conforman a este grupo se listan en la Figura 1.

Marco teórico
Pectin Acetil esterasas

Deesterificantes
Pectinmetilesterasas
Enzimas que actúan sobre

la cadena principal de la Polimetilgalacturonasas
pectina Exo
Poligalacturonasas
Depolimerizantes
Poligalacturonato y Endo
Pectinasas polimetilgalacturonato liasas
α-L-arabinofuranosidasas
Endo- y exoarabinasas
α-D-xilosidasas
Enzimas accesorias
α- y β-D-galactosidasas
Endo- y exogalactanasas
Feruloil y p-cumaroil esterasas
Figura 1. Clasificación de las enzimas que conforman al sistema pectinolítico

10 10
Marco teórico
3.2.1 Regulación de la actividad pectinolítica
Las poligalacturonasas pueden tener distintas funciones, en dependencia del organismo que las
produce. Así, mientras que en los hongos saprófitos, como A. niger, estas enzimas son
importantes para proveer al microorganismo los nutrientes a partir de los materiales de su
medio ambiente, en el caso de los microorganismos fitopatógenos, estas enzimas participan en
la degradación de la pared celular, para ayudar al microorganismo a penetrar a las células y
expandirse hacia el tejido de la planta (Parenicová, 2000).
Considerando la complejidad y tamaño molecular de los polisacáridos, es obvia la dificultad
de estos para ingresar a las células. Así, se ha sugerido que los oligosacáridos liberados de
estos polímeros y/o sus respectivos derivados, son los encargados de desencadenar la
inducción de la expresión de las enzimas degradadoras de estos polisacáridos. Lo anterior se
establece con base en la frecuente observación de que el compuesto que induce la producción
de una cierta enzima, resulta ser precisamente el producto de esa reacción enzimática, o el
derivado metabólico de este producto (de Vries, 2003).
Se ha demostrado que los hongos saprófitos producen de manera constitutiva una serie de
isoformas de poligalacturonasas. La acción de éstas sobre la pectina provoca la liberación de
diversos grupos reductores, de los que destaca el ácido galacturónico, con lo que a su vez se
activan los miembros de la familia de genes inducibles que codifican para pectinasas.
Adicionalmente, la expresión de estos genes puede verse afectada por los fenómenos de
represión catabólica por carbono (Wubben, 2000).
Los mecanismos exactos mediante los cuales sucede la regulación de la expresión de
pectinasas aún no son claros, debido a la complejidad y diversidad del sustrato. Sin embargo,
se ha observado que la síntesis del complejo pecinolítico pareciera estar controlada, al nivel de

11
Marco teórico
transcripción, por al menos tres mecanismos diferentes: la inducción específica por pectina o
ácido galactrónico, la represión catabólica mediada por el factor transcripcional CreA y la
regulación por el pH ambiental, controlada por el factor transcripcional PacC (Bruno-Bárcena
et al, 2002).
3.2.1.1 Regulación por la fuente de carbono.
Respecto a la inducción del sistema pectinolítico, se ha reportado en A. niger al ácido D-
galacturónico como el principal inductor de la expresión de la mayoría de los genes que
codifican para enzimas pectinolíticas (de Vries, 2003), mientras que fuentes como la L-
arabinosa, L-ramnosa o ácido ferúlico provocan la expresión de subseries de genes
pectinolíticos. De hecho, los genes individuales se expresan a diferentes tiempos y en
respuesta a distintas fuentes de carbono (de Vries et al, 2002).
En lo que se refiere a la represión catabólica de las pectinasas, se ha observado que muchas de
estas enzimas, dependiendo del sistema biológico que las produzca, pueden sufrir represión
catabólica por carbono. Los principales represores de los sistemas pectinolíticos son las
fuentes de carbono fácilmente metabolizables, como glucosa, fructosa y sacarosa. El principal
elemento involucrado en el proceso de represión catabólica de las pectinasas es la proteína
CreA (Parenicová, 2000; de Vries, 2003; Akimitsu et al, 2004).
3.2.1.2 Regulación por pH.
El pH del medio de cultivo evoluciona a medida que sucede la producción de metabolitos por
parte de los microorganismos que se están desarrollando en el medio. De hecho, el pH del
medio tiene un efecto importante sobre el crecimiento y la formación del producto, al

12
Marco teórico
influenciar la ruptura de los sustratos como el transporte a través de la pared celular de los
sustratos y los productos, por lo que es un factor de importancia en cualquier fermentación.
La supervivencia de los microorganismos en un amplia variedad de valores de pH requiere de
la capacidad de estos para secretar una serie de enzimas, en dependencia del pH del medio
(Prusky y Yakobi, 2003). A pesar de que se ha documentado la secreción de enzimas y
metabolitos de diversos tipos, en dependencia del pH del cultivo, por los organismos
patógenos de animales, humanos y plantas, a la fecha no se ha profundizado en el estudio de
tales procesos regulatorios en los microorganismos saprófitos. Existen reportes en los que se
mencionan algunos genes de A. nidulans sujetos a regulación por el pH ambiental, dentro de
los cuales se encuentran aquellos que codifican para las enzimas secretadas por el hongo. De
esta manera, las poligalacturonasas se secretan a bajos pH, mientras que las pectato liasas lo
hacen cuando el pH del medio se incrementa, lo que sugiere que los patógenos son capaces de
modular el pH del huésped como un mecanismo para incrementar su virulencia (Eshel et al,
2002). En general, la regulación de la expresión de poligalacturonasas por el pH está mediada
por la acción de la proteína PacC (de Vries y Visser, 2001).
3.3 Los sistemas de producción de polisacarasas
Los sistemas de producción de las polisacarasas comprenden, en primera instancia, los
fenómenos naturales, que consideran la generación de estas enzimas por parte de los
microorganismos saprófitos; y de un modo más elaborado, los procesos dirigidos a la
producción, explotación y estudio de las características de estas enzimas a nivel laboratorio,
donde destacan los cultivos líquidos y la fermentación sólida. Dentro de los cultivos líquidos,
los cultivos en lote, así como los lotes alimentados son los más utilizados.

13
Marco teórico
3.3.1 Los microorganismos productores de pectinasas
Las enzimas pectinolíticas son producidas por una extensa variedad de organismos, tales como
nemátodos, insectos, protozoarios, levaduras, bacterias y hongos (Hoondal et al, 2002). De
entre todos ellos destacan los hongos filamentosos, debido a su fácil cultivo, y su alta
producción de enzimas extracelulares con potencial industrial (Guimares et al, 2006). La
diversidad de las enzimas producidas por estos microorganismos, así como su elevada
actividad, provienen de su diversidad metabólica inherente, que se refleja en su habilidad para
crecer sobre diversos sustratos bajo una gran variedad de condiciones en el ambiente
(MacCabe et al, 2002). Los géneros más utilizads para la producción de las diversas
poliscarasas de interés industrial son Trichoderma, Penicillium y Aspergillus, al ser
clasificados generalmente como seguros para la salud humana (GRAS, por sus siglas en
inglés) (Ward et al, 2006).
3.3.1.1 Las características de género Aspergillus
Los microorganismos del género Aspergillus son hongos filamentosos que crecen en materia
orgánica bajo condiciones aerobias. Se encuentran en suelo, compostas y en materiales de
plantas en descomposición. Se caracterizan por tener una estructura morfológica conformada
por un conidiósporo, el cual tiene un tallo y una cabeza conidial de más de 700 µm de
diámetro, que surge desde la delgada pared micelial, llamada célula pie, como se muestra en la
Figura 2.
Los hongos del género Aspergillus crecen en un rango de temperaturas de 6- 47ºC, con una
temperatura óptima entre 35-37ºC y un intervalo de valores de pH de entre 1.4 y 9.8 (Schuster
et al, 2002). Tienen la capacidad para crecer en fuentes de carbono de diversos tipos. Se

14
Marco teórico
caracterizan por su propiedad para producir una variedad de enzimas de importancia a nivel
industrial (Ward et al, 2006).
Figura 2. Morfología microscópica de Aspergillus y micrografía 400X (Casas López 2004).
3.3.1.2 Aspergillus flavipes FP-500
El grupo de los Aspergillus flavipes está conformado por una sola especie, sin variedades.
Aunque no representa una de las especies de Aspergillus más estudiadas, se ha demostrado su
capacidad para producir flavipina (Raistrick y Rudman, 1956) y lovastatina (Valera et al,
2005). Dentro de las enzimas degradadoras de polisacáridos que producen las cepas de esta
especie, se han reportado las α-galactosidasas (Ozsoy y Berkkan, 2003) y pectinasas,
destacando las poligalaturonasas del tipo endo y exo, y las pectin liasas (Solís et al, 1997).
La cepa Aspergillus flavipes FP-500 fue aislada por el Grupo de Fisiología de Hongos
Filamentosos, a partir de tomates en descomposición. Diversos proyectos de investigación han

15
Marco teórico
demostrado que esta cepa produce xilanasas y α- y β- galactosidasas (Álvarez Arriaga, 2005),
así como diversos tipos de pectinasas (Arreguín-Rangel, 2008), con productividades y
características que la hacen competitiva con las obtenidas de otras especies del género
Aspergillus.
3.3.2 Sistemas de producción en cultivo en medio líquido
Cuando se desea estudiar tanto la fisiología, como los aspectos cinéticos y metabólicos que
conlleva la producción de pectinasas, se opta por el empleo las distintas metodologías
utilizadas durante el desarrollo de cultivos líquidos, en donde los parámetros involucrados
sean de fácil medición y por ende, se puedan generar correlaciones a partir de estos (Teixeira
et al, 2000; Jacob y Prema, 2006; Oncu et al, 2006; Favela-Torres et al, 2006; Cavalitto y
Mignone, 2007; Gummadi y Kumar, 2008). Dos de las técnicas más utilizadas para tal fin son
el cultivo en lote y el cultivo en lote alimentado.
3.3.2.1 El cultivo en lote
El cultivo en lote es uno de los métodos más sencillos empleados para el desarrollo de cultivos
líquidos. Se caracteriza por el hecho de que la concentración de sustratos, productos y células,
así como el estado fisiológico y metabólico celular, cambian conforme avanza el cultivo. De
igual manera, parámetros como el pH y el oxígeno disuelto cambian, a menos de que se
establezcan estrategias adecuadas para su control (Ramírez Reivich, 2004).
3.3.2.2 El cultivo alimentado
Cuando la generación de productos y subproductos provoca efectos negativos sobre la
formación de los metabolitos de interés, o bien el sistema de producción es susceptible a
represión por la concentración del sustrato, una alternativa es el empleo del cultivo

16
Marco teórico
alimentado. En este, uno o varios de los nutrientes limitantes se suministran a lo largo del
cultivo y la alimentación de los sustratos puede hacerse por pulsos, o de manera continua; en
este último caso, el volumen se incrementa lineal o exponencialmente. A pesar del cambio en
el volumen de operación, el valor de ciertas variables clave, como las concentraciones del
sustrato y biomasa pueden controlarse en valores relativamente constantes. Mediante el
desarrollo del cultivo alimentado se puede además controlar la velocidad de crecimiento
dentro de los intervalos que favorezcan una función objetivo particular (Ramírez Reivich,
2004; Najafpour, 2007).
3.4 Los balances de materia para los cultivos
Para su diseño y análisis cinético, tanto el cultivo por lote como el cultivo alimentado parten
de los mismos balances de materia. Así, las ecuaciones que definen los balances para la masa
total del sistema de reacción (Vρ), generación de biomasa (X), consumo de sustrato (S) y la
formación de producto (P) se expresan mediante las ecuaciones diferenciales:
d (Vρ )
= ρF Balance total de masa
dt
dXV
= qXV Para generación de biomasa
dt
dSV
= −q S V Para consumo de sustrato
dt
dPV
= q P XV Para generación de producto
dt
Donde V es el volumen de reacción, ρ es la densidad del medio de cultivo y F representa al
flujo de alimentación; mientras que las expresiones de velocidad (qX, qS y qP) se definen como:

17
Marco teórico
q X = µX
qX
qS = −
Y XS
dP dS
qP = = −Y PS
dt dt
Donde µ es la velocidad específica de crecimiento. Estas ecuaciones asumen que el sustrato
sólo se usa para la formación de biomasa (x) y producto (p). YXS y YPS representan el
rendimiento de conversión del sustrato en biomasa y producto, respectivamente, y se definen
como:
∆X Biomasa producida
Y XS = =
∆S Sustrato consumido
∆X Pr oducto generado
Y PS = =
∆S Sustrato consumido
Tabla 1. Balances de materia para el cultivo en lote y el cultivo en lote alimentado a partir de los
balances generales. Para el desarrollo de las ecuaciones específicas para cada cultivo, se expandieron
los términos diferenciales, calculando los productos de las dos derivadas.
Parámetro para balance Cultivo en lote Cultivo alimentado
Volumen constante, no hay Volumen variable, existe
flujo de entrada flujo de entrada
Volumen dV
=0
dV
dt
=F
dt
Flujo F =0 F ≠0
dX dX F
Generación de Biomasa = q X = µX = µX −   X
dt dt V 
dS 1 dS  F  1
= −q S X = − µX =  S 0 − µX
Consumo de sustrato dt YXS dt  V  Y XS
dP dP F
Generación del producto = qP X = qP X −  P
dt dt V 
La relación entre el flujo y el volumen (F/V), se conoce como Factor de dilución (D).

18
Marco teórico
Estas ecuaciones de balance describen el comportamiento macroscópico promedio del sistema
de producción, y dependiendo del tipo de cultivo que se esté desarrollando, las ecuaciones
toman formas específicas para describir el comportamiento del mismo, tal como se muestra en
la Tabla 1.
3.5 Modelos cinéticos utilizados para describir el comportamiento
de un cultivo microbiano
Los resultados obtenidos de un experimento presentan tendencias que pueden dar una idea
general del comportamiento del cultivo ante ciertas condiciones de operación. A menudo es
necesario predecir eventos futuros con un alto grado de precisión, a partir de las tendencias
observadas en un cultivo. Lo anterior precisa la generación de modelos matemáticos, que
permitan además un adecuado análisis cuantitativo de la cinética biológica y otros fenómenos
dentro del proceso.
La modelación basada en modelos cinéticos no estructurados representa una aplicación de
suma utilidad para desarrollar un análisis matemático del comportamiento de un cultivo, a
partir del cual son posibles inferencias sobre la constitutividad o inducibilidad de la
producción de metabolitos y de actividades enzimáticas, desde una base cinética (Gombert y
Nielsen, 2000).
El modelo propuesto por Monod es, por su sencillez y generalidad, uno de los más utilizados
para describir la velocidad de crecimiento de un gran número de cultivos. Mediante este
modelo, se define a la velocidad específica de crecimiento como:
S
µ = µ max
KS + S

19
Marco teórico
donde µmax es la velocidad específica de crecimiento máxima, y Ks se conoce como la
constante de saturación (Ramírez-Reivich, 2004).
En lo que respecta a la generación del producto durante el cultivo, esta puede darse
exclusivamente cuando las células crecen (producción asociada al crecimiento) o
alternativamente cuando las células están vivas, independientemente si crecen o no
(producción no asociada al crecimiento). También puede ocurrir un comportamiento mixto
(parcialmente asociado al crecimiento). Cualquiera de estos tres casos se puede describir
mediante el modelo propuesto por Luedeking y Piret, con el cual:
q P = αµX + β X
donde P es la concentración de producto, α es el coeficiente de producción asociado al
crecimiento (o rendimiento de producto sobre biomasa) y β es el coeficiente de producción no
asociado a crecimiento (o velocidad específica de producción de producto) (Ramírez Reivich,
2004).
Además de los modelos aquí mencionados, existen otros más específicos o complejos
(Gombert y Nielsen, 2000; Thilakavathi et al, 2007), sin embargo, cualquiera que sea el
modelo empleado, este deberá acoplarse a las ecuaciones de balance listadas en la Tabla 1.
3.5.1 Estimación de los parámetros cinéticos a partir de datos
experimentales.
Un buen modelo matemático es un compromiso entre la precisión en la descripción del
sistema que representa, la aplicabilidad en el propósito para el que se desarrolla y la claridad
de representación de variables importantes. Sin embargo, mientras más complejo sea el
modelo, mayor será la dificultad para calcular los valores apropiados de los múltiples

20
Marco teórico
parámetros que lo definen, aunque proporcionará explicaciones a mayor detalle (Dunn e
Ingham, 1995).
Los diversos parámetros y constantes que se incorporan en los modelos cinéticos pueden ser
simplemente coeficientes de ajuste a datos experimentales y constantes de proporcionalidad
sin ningún significado físico, o bien representar magnitudes sobre algún proceso físico,
químico o biológico (Garcia-Ochoa y Casas, 1999). Así, por ejemplo, en un proceso por lotes,
las constantes µmax y KS no se puede determinar simultáneamente, por lo que solamente podrá
calcularse adecuadamente el valor de una de ellas con la metodología que se haya elegido para
la estimación de los parámetros del modelo (Nihtila y Virkkunen 1977, Chouakri et al, 1994).
Con frecuencia el valor de los parámetros del modelo se estima a partir de la idea de obtener el
mejor ajuste de los datos experimentales a la tendencia descrita por éste. Para lograr lo
anterior, los resultados experimentales se deberán comparar con los obtenidos a partir de la
aplicación del modelo, utilizando múltiples corridas para obtener el mejor ajuste de los
parámetros. El procedimiento para estimar los parámetros cinéticos que describen un sistema
de producción involucra el uso de simulaciones sucesivas, partiendo de valores iniciales de los
parámetros del proceso, y modificando estos hasta encontrar el mejor ajuste con los datos
experimentales (Dunn e Ingham, 1995), o la menor diferencia posible entre el dato
experimental y el calculado por el modelo (Aranda-Barradas et al, 2000).
Para asegurar que el modelo obtenido a partir de la estimación de parámetros se ajusta
adecuadamente a la tendencia que presentan los datos experimentales, se deben especificar los
intervalos de confianza de los valores que tomaron los parámetros que definen a dicho
modelo. Uno de los métodos más sencillos para desarrollar calcular los intervalos de confianza
es la aplicación del estadístico t de Student, aunque existe una gran cantidad de metodologías,

21
Marco teórico
cuya robustez determinará la confiabilidad de los valores que definen a los parámetros
mediante los cuales se modela el comportamiento del cultivo (Isermann, 1980; Almasy y Mah,
1984).
La producción de pectinasas por hongos filamentosos se ha estudiado bajo diversas
perspectivas. Destacan los avances que de ello se ha tenido con el empleo de la biología
molecular y la proteómica. Sin embargo, hay una escasa explotación del enfoque cinético y los
cultivos en lote y lote alimentado para el estudio del modo en que estas enzimas se producen
durante el crecimiento de estos hongos en fuentes ricas en pectina.

22
Materiales y Métodos
4. Materiales y Métodos.
4.1 Microorganismo.
Para este trabajo se utilizó la cepa Aspergillus flavipes FP-500, una cepa silvestre aislada a partir
de muestras de tomates en descomposición por el Grupo de Fisiología de Hongos Filamentosos
de la UNAM. Esta cepa se mantuvo en refrigeración en cajas con agar papa-dextrosa mediante
resiembras periódicas.
4.2 Composición del medio.
Para todos los experimentos, A. flavipes FP-500 se hizo crecer en medio basal, que contenía en
g/l: K2HPO4, 2; KH2PO4, 2; y (NH4)2SO4, 5. El pH inicial del medio se ajustó con la ayuda de
soluciones de NaOH o H2SO4 2M, hasta lograr el valor deseado en cada caso. El medio se
esterilizó a 121°C y 1.5 psi durante 20 min. A esta solución basal se adicionó la fuente de
carbono en la concentración final adecuada para cada experimento.
4.3 Inóculo
La suspensión de esporas que sirvió como inóculo se obtuvo a partir de cultivos desarrollados en
cajas petri con tres a cinco días de crecimiento, utilizando solución salina (NaCl al 0.9%). Cada
experimento se inoculó con el volumen adecuado de esta suspensión para tener 1X106
esporas/ml.
4.4 Condiciones de cultivo
4.4.1 Cultivos en matraz.
Para evaluar el efecto de la fuente de carbono y el pH inicial del medio sobre el crecimiento del
hongo y la producción de pectinasas, A. flavipes FP-500 se hizo crecer en medio basal, utilizando

23
diversas fuentes de carbono: pectina cítrica, ácido poligalacturónico, ácido galacturónico,
arabinosa, ramnosa, xilosa, lactosa, glicerol y glucosa. Cuando se utilizaron monosacáridos como
fuente de carbono, el medio de cultivo fue adicionado con extracto de levadura al 0.1% (p/v).
Para cada una de las fuentes de carbono utilizadas se probaron tres valores iniciales de pH (3.5,
4.2 y 5.0), que se lograron mediante la adición de los volúmenes adecuados de soluciones de
NaOH o H2SO4 2M al medio de cultivo. En estos experimentos solo se registró el cambio del pH
a lo largo del cultivo. Todos los matraces se incubaron a 37ºC, en un agitador reciprocante a
200 rpm. Se tomaron muestras periódicas a cada matraz cada 24 h, las que después de registrarles
el pH, se filtraron conservando el filtrado en congelación hasta su análisis.
4.4.2 Experimentos de transferencia
Para evaluar de manera preliminar el efecto inducible o represor del ácido galacturónico o
glucosa, respectivamente, sobre la producción de pectinasas, se desarrolló el experimento de
transferencia de micelio. Para esto, se inocularon los matraces con la cantidad adecuada de
esporas de A. flavipes FP-500 y se incubaron en el medio basal adicionado con glucosa al 1%
como única fuente de carbono y extracto de levadura al 0.1%, como potenciador para la
germinación de las esporas. Al cabo de 16-18 horas, cuando el cultivo se encontraba en la fase de
crecimiento exponencial, se colectó por filtración el micelio obtenido, lavándolo en tres
ocasiones con solución salina (NaCl al 0.9%) estéril a 4°C. El último lavado se realizó con medio
basal estéril, y se obtuvo una suspensión de micelio, cuya concentración se determinó mediante la
técnica de peso seco. Con el volumen adecuado de dicha suspensión se inocularon 0.5 g L-1 de
micelio a matraces que contenían medio basal y pectina al 1% como fuente de carbono. Al cabo
de 12 h, se adicionó a los matraces la cantidad adecuada de soluciones concentradas estériles de
glucosa o ácido galacturónico para alcanzar una concentración final de 1 g L-1. Se utilizó un
control sin adición, para comparar los resultados. Después de la adición, se tomaron muestras

24
cada 4 h, hasta completar 24 h de cultivo. Las muestras se filtraron, y se cuantificó el crecimiento
por peso seco. El sobrenadante se mantuvo en refrigeración hasta su análisis. Todos los
experimentos se llevaron a cabo a un pH inicial de 4.2, el cual evolucionó libremente a lo largo
del cultivo, registrando su valor en el momento de tomar las muestras. Los matraces se incubaron
a 37ºC, en un agitador reciprocante a 200 rpm.
4.4.3 Cultivo por lote en fermentador.
Para observar la evolución de los parámetros de operación a lo largo del cultivo y conocer la
relación de este con la producción de las pectinasas, se utilizó un biorreactor BioFlo 110,
Newbrunswick Scientific, de 7 L, con 5 L de volumen de operación. Al fermentador se le
instalaron los bafles y dos impulsores, la distancia en la cual se colocaron los impulsores se
determinó con base en el diámetro del reactor. Así el primer impulsor se colocó a una distancia
igual a 1 diámetro y el segundo a 1.5 diámetros a partir de la base del reactor. Los cultivos en lote
desarrollados a nivel matraz utilizaron el medio basal descrito previamente. Y como única fuente
de carbono se empleó pectina, glucosa o ácido galacturónico, inoculando en cada caso con 1 X
106 esporas mL-1. En general, se emplearon para estos cultivos tres valores de pH inicial: 3.5, 4.2
y 5.0, empleando para ello una de dos modalidades. En la primera de ellas, el pH de los cultivos
se dejó evolucionar libremente, registrando de manera continua los cambios en este parámetro a
lo largo del experimento. Para la segunda, se mantuvo constante el valor del pH inicial, mediante
la adición de NaOH, controlada por el reactor.
Para ambas modalidades, los cultivos operaron a 400 rpm, 37°C y 0.5 vvm de aire, registrando la
evolución del oxígeno disuelto (dO2) durante todo el cultivo. Se tomaron muestras periódicas
cada 4 h, a las cuales se les determinó la concentración de biomasa, el consumo de sustrato, la
concentración de grupos reductores y las actividades pectinolíticas, mediante las técnicas
descritas más adelante.

25
4.4.4 Cultivo alimentado en fermentador
Para establecer el cultivo alimentado, fue necesario conocer los parámetros cinéticos del
microorganismo al desarrollarse en un cultivo en lote sobre la fuente de carbono deseada (glucosa
o pectina), en un valor de pH constante. Así, los parámetros cinéticos utilizados se obtuvieron de
un cultivo en lote desarrollado previamente. De esta manera, fue posible el establecimiento de las
condiciones de estado estacionario cuando el cultivo en lote llegó a condiciones de baja
concentración de sustrato (<1 g L-1). Para conocer el tiempo aproximado en que esto sucedía, se
modelaron los datos experimentales obtenidos en cultivos desarrollados en lote (Aranda-Barradas
et al, 2000), misma que se describe detalladamente más adelante dentro de este apartado.
Mediante este modelamiento, además de conocer el tiempo en que debía iniciar la alimentación,
se obtuvieron los valores de los parámetros cinéticos del microorganismo. Con estos datos fue
posible calcular la concentración del sustrato en la corriente de alimentación, mediante la
siguiente fórmula:
X
S0 =
Y XS
Donde
S 0 es la concentración de sustrato en la corriente de alimentación.
X es la concentración de biomasa en el tiempo en que se alcanzan las condiciones
adecuadas para comenzar a alimentar.
Y XS es el rendimiento biomasa-sustrato, parámetro calculado a partir de la modelación de
los resultados obtenidos del cultivo en lote.
Para el establecimiento del cultivo alimentado, se partió de un cultivo en lote desarrollado en un
volumen de 2 L de medio en el reactor, con un pH constante de 3.5. Cuando en este cultivo se
alcanzaron las condiciones adecuadas respecto a la concentración del sustrato, comenzó el

26
proceso de alimentación. Para ello, se utilizó un flujo de 0.042 L h-1, con el objetivo de
incrementar 1 L día-1 el volumen del reactor. El régimen de alimentación se dividió en tres etapas
de 24 h, durante las cuales se investigó si las condiciones específicas empleadas en cada caso
provocaban un cambio en la producción de pectinasas. No obstante el régimen de alimentación
empleado, durante la primera etapa se utilizaron las mismas condiciones empleadas en el
desarrollo del cultivo lote que sirvió como punto de partida.
Durante el desarrollo de los cultivos en lote se utilizó un medio basal formulado con la
concentración de sales adecuada para un volumen final de 5 L. Así, en todo momento las sales
que componían al medio basal estuvieron en exceso. Por otra parte, la aireación se suplementó a
2.5 L min-1 a lo largo de todo el régimen de alimentación. Para descartar el efecto de la evolución
del pH sobre la producción de las pectinasas, el valor de este parámetro se mantuvo constante
durante todo el experimento, mediante la adición de NaOH o H2SO4 2 M. Los cultivos se
mantuvieron a 37°C y una agitación de 400 rpm, tomando muestras periódicas cada 4 h. Las
muestras se filtraron, para cuantificar la concentración de biomasa, mientras que el filtrado se
mantuvo en congelación hasta su análisis, en el cual se cuantificó la concentración de sustratos,
azúcares reductores y las actividades pectinolíticas.
Los regímenes de alimentación utilizados en esta etapa experimental fueron de dos tipos. En el
primero, se revisó el efecto de diferentes fuentes de carbono, mientras que con el segundo se
analizó el resultado de la variación del pH sobre la producción de las pectinasas por A. flavipes
FP-500.
Los valores de µ y D para los datos experimentales, se calcularon mediante el empleo de las
siguientes expresiones:
F Y XS S 0 µX
µ= y D=
V X Y XS S 0

27
Donde
µ es la velocidad específica de crecimiento de los datos del experimento
F es el flujo de alimentación. En todos los casos, F = 0.042 L h-1.
YXS es el rendimiento, calculado a partir del experimento en lote utilizado como base.
S0 es la concentración de la fuente de carbono en el flujo de alimentación
V es el volumen del reactor. Para el cálculo de este, se consideró la velocidad de
alimentación
X es la concentración de biomasa obtenida en el reactor en cada tiempo
D es el factor de dilución de los datos del experimento
4.5 Técnicas de analíticas
4.5.1 Cuantificación de la concentración de biomasa.
El crecimiento celular obtenido en cada muestra se determinó mediante la técnica de peso seco,
expresándose en g L-1.
4.5.2 Cuantificación de la actividad de exopectinasas.
La actividad exopectinolítica se cuantificó mediante la determinación de los azúcares reductores
producidos después de incubar una mezcla de pectina al 1% (p/v) pH 5 y regulador de acetatos
100mM con la muestra, a 45 ºC durante 20 min. Las lecturas obtenidas se compararon contra una
curva patrón de ácido galacturónico (1 mg mL-1). Una unidad de actividad exopectinolítica se
definió como la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 µmol de ácido galaturónico
bajo las condiciones de ensayo (Trejo-Aguilar et al, 1996).

28
4.5.3 Cuantificación de la actividad de endopectinasas.
La actividad de endopectinasas se determinó con base en el cambio relativo que provocaban 0.5
mL de muestra sobre la viscosidad de 10 mL de una solución de pectina al 1% (p/v) pH 4.2, con
la ayuda de un viscosímetro Canon Fenske # 200. Una unidad de actividad endo se definió como
la cantidad de enzima capaz de reducir la viscosidad de la pectina en un 50% después de 10 min
de reacción (Trejo-Aguilar et al, 1996).
4.5.4 Cuantificación de la actividad de pectinliasas.
La actividad de pectin liasas se cuantificó mediante el monitoreo del incremento de la
absorbancia a 235 nm, provocado por la insaturación del enlace entre los carbonos 4 y 5 del ácido
galacturónico, después de la reacción de β-eliminación. Para esta medición la mezcla de reacción
contenía una solución de pectina al 1% (p/v) pH 5.7, regulador TRIS-acetatos 0.05 M pH 8 y la
muestra, y se incubó a 40ºC durante 1 h. Al inicio y después de 1 h, se retiró de la mezcla de
reacción una alícuota de 0.2 mL, que se agregó a 1.8 mL de HCl 0.01 M, para detener la reacción.
Una unidad de actividad de pectin liasas se definió como la cantidad de enzima que provoca una
diferencia de 0.1 en la absorbancia de la solución de ácido clorhídrico a 235 nm, bajo las
condiciones de ensayo (Delgado et al, 1993).
4.5.5 Cuantificación de la concentración de azúcares reductores.
El consumo de sustrato (en los experimentos con monosacáridos como fuentes de carbono) o la
aparición de grupos reductores (en el caso de las fermentaciones con polisacáridos como fuentes
de carbono) se determinaron mediante la cuantificación de azúcares reductores en las muestras,
utilizando ácido 3,5-dinitrosalicílico (Miller, 1959). La cantidad adecuada de muestra se llevó a
un volumen final de 1 mL, considerando que la concentración máxima de muestra que detecta
esta técnica es de 1 mg mL-1. A la muestra diluida adecuadamente, se le agregaron 2 mL del

29
reactivo DNS y se sometieron a ebullición por 5 min. Posteriormente, a cada tubo se le agregaron
5 mL de H2O y se leyeron en el espectrofotómetro a 575 nm, utilizando un blanco preparado con
agua en vez de muestra. La concentración obtenida en cada caso se calculó utilizando las curvas
patrón de los azúcares correspondientes.
4.5.6 Cuantificación de la concentración de ácido poligalacturónico y
pectina en los cultivos.
El consumo de sustrato en los experimentos en los que se utilizaron polisacáridos como fuente de
carbono se estimó mediante la técnica descrita por Dubois et al (1956). Para ello, la cantidad
necesaria de muestra se llevó a un volumen final de 2 mL, considerando que la concentración
máxima de muestra que detecta esta técnica es de 0.1 mg mL-1. A la muestra diluida
adecuadamente, se le agregó 1 mL de fenol al 5% (p/v) y 5 mL de H2SO4 concentrado. Después
de dejar reposar los tubos durante 20 min, los tubos se leyeron en el espectrofotómetro a 480 nm,
utilizando un blanco preparado con agua en vez de muestra. Las lecturas se compararon contra
curvas patrón de pectina o ácido poligalacturónico, para determinar la concentración del
polisacárido correspondiente en cada tiempo de fermentación.
4.6 Modelo matemático
El comportamiento del cultivo a lo largo del tiempo para los cultivos desarrollados en matraz se
describió, de acuerdo a las siguientes ecuaciones:
dx s
= µ max x (Para crecimiento microbiano)
dt s + kS
ds µ s
= − max x (Para consumo de sustrato)
dt Yx / s s + k s
dp s
= αµ max x + βx (Para la producción de exopectinasas)
dt s + ks

30
donde
dx
Acumulación de biomasa en el medio de cultivo (gB L-1 h-1)
dt
ds
Consumo de sustrato en el medio de cultivo (gs L-1 h-1)
dt
dp
Acumulación de exopectinasas en el medio de cultivo (U L-1 h-1)
dt
µmax Velocidad específica de crecimiento máxima (h-1)
S Concentración de sustrato (gs L-1)
Ks Constante de saturación de Monod (gs L-1)
x Concentración de biomasa (gb L-1)
Yx/s Coeficiente de rendimiento biomasa-sustrato (gb gs-1)
α Coeficiente asociado al crecimiento o inducibilidad respecto a la producción de
pectinasas (U gb-1)
β Coeficiente no asociado al crecimiento para la producción de pectinasas
(U gb-1 h-1)
Las constantes descritas en el modelo de Monod (µmax y Ks) no pueden identificarse
simultáneamente en un proceso por lotes (Nihtila and Virkkunen 1977, Chouakri et al. 1994), por
lo que la máxima velocidad específica de crecimiento (µmax) será, para este trabajo, el único
parámetro de utilidad.
Los parámetros cinéticos declarados en el modelo de Leudeking-Piret, α y β, indican la relación
entre el crecimiento del microorganismo y la producción de pectinasas en este cultivo fúngico. El
parámetro α expresa la producción de la enzima que se encuentra asociada con el crecimiento
microbiano, de manera tal que la producción de la enzima se considerará asociada al crecimiento
cuando α ≠ 0. Debido a que la producción de pectinasas es necesaria para la asimilación de

31
sustratos complejos durante el crecimiento del microorganismo, el parámetro α será considerado
como el más significativo en nuestra aproximación matemática, además de que en todos los casos
los valores de β resultaron iguales a cero.
4.6.1 Estimación de parámetros del modelo
Con base en todas las condiciones anteriormente descritas, se especificó un vector de parámetros
P, definido como:
P = [µ max YX / S α ]
Las condiciones iniciales para modelar las ecuaciones (x0, s0 y p0) son las concentraciones
experimentales al inicio del cultivo, cuando t = 0.
El rendimiento (YX/S) así como los parámetros identificables de los modelos de Monod (µmax) y
Luedeking-Piret (α) se obtuvieron de acuerdo a la metodología reportada previamente (Aranda-
Barradas et al, 2000), utilizando la siguiente función de residuales F como criterio de
minimización:
F ([µmax Yx / s α β ]) = F ( P )
n n n
2 2 2
F ( P ) = ∑ xiexp − ximod ( P ) + ∑ siexp − simod ( P ) + ∑ piexp − pimod ( P )
[ ] [ ] [ ]
i =1 i =1 i =1
Donde los superíndices exp y mod indican los datos de los resultados experimentales y los
obtenidos a partir del modelo, respectivamente. Las diferencias entre los valores teóricos y los
experimentales se calcularon a partir de n puntos muestrales (n = 12). Los parámetros cinéticos
estimados (Pest) son aquellos que satisfacen la condición:
F ( Pest ) = min
lo que significa que el valor de los parámetros estimados será aquel que produzca los menores
errores residuales entre los valores teóricos y los experimentales. La búsqueda del mínimo se hizo

32
empleando el método simplex Nelder-Mead, partiendo de un vector arbitrario P0 para iniciar el
cálculo.
Además, los valores de los parámetros obtenidos con el modelo se utilizaron para crear series de
datos sintéticos, adicionando ruido blanco a los resultados numéricos de x, S y p del modelo.
Cada serie de datos sintéticos produjo un vector de parámetros estimados de manera equivalente.
Así, se generó cierto número de parámetros equivalentes para estimar la media y la desviación
estándar de todos los parámetros cinéticos.
4.6.2 Estimación de las varianzas del modelo
Los intervalos de confianza de los parámetros calculados a partir de la mejor estimación se
obtuvieron mediante la siguiente ecuación:
σi
∆Pi = ± t0.975
mN − q
donde:
σ desviación estándar de cada parámetro cinético, estimada mediante el tratamiento
de la serie de datos sintéticos (i = µmax, YXS o α)
m determinaciones experimentales desarrolladas a las N muestras
N número de muestras obtenidas de cada cultivo
q número de parámetros estimados
t0.975 factor t de Student para un nivel de confianza del 5%
La varianza de los datos experimentales de la biomasa (x), el sustrato (S) y la producción de
exopectinasas (p), se estimó mediante la siguiente expresión:
1
V (u ) =
mN − q
∑ (uexp − umod ) 2

33
donde
u → x, S o p
4.6.3 Análisis estadístico
Los efectos provocados por cada tratamiento experimental se compararon mediante la prueba
estadística de Diferencia Mínima Significativa (LSD, por sus siglas en inglés) (Montgomery,
2001). En todos los casos, la diferencia significativa entre medias se presenta como un diseño
factorial completamente aleatorizado mediante el parámetro (p), con el uso del programa
estadístico SAS®, utilizando un intervalo de confianza del 5%.

34
Constitutividad e inducibilidad en pectinasas de Aspergillus flavipes FP-500: análisis de producción volumétrica y
estudio cinético
5.1 Constitutividad e inducibilidad en pectinasas de

Aspergillus flavipes FP-500: análisis de producción
volumétrica y estudio cinético
Los polisacáridos son macromoléculas de elevado peso molecular y algunos, como la celulosa,
son insolubles, por lo que las células microbianas no los pueden transportar a su interior. Debido
a esto, para metabolizarlos es muy probable que los monosacáridos y pequeños oligosacáridos
que conforman al polisacárido en cuestión, sean los inductores reales de los sistemas enzimáticos
encargados de degradarlo. Para entender cómo funciona la producción de las enzimas de un
sistema enzimático complejo, como el de las pectinasas, una estrategia adecuada consistiría en
estudiar el comportamiento del microorganismo al cultivarlo por separado en cada uno de los
azúcares que constituyen al polisacárido sujeto a la degradación (de Vries, 2003). Con base en lo
anterior, para el desarrollo de esta etapa experimental se hizo crecer al hongo en ácido
galacturónico, ramnosa, xilosa o arabinosa, por ser estos azúcares los principales constituyentes
de la pectina. Considerando además que, si el microorganismo produce una enzima ante cualquier
condición de cultivo y no obstante la fuente de carbono disponible en el medio, es porque la
enzima es constitutiva (Mach y Zeillinger, 2003; Adriano-Anaya et al., 2005), el hongo se hizo
crecer también en glucosa y glicerol, por ser fuentes de carbono que no forman parte de la
estructura de la pectina. Finalmente, se observó la producción de las pectinasas utilizando ácido
poligalacturónico, un homopolisacárido no ramificado que representó a la cadena lineal de la
región del homogalacturonano; y pectina de frutas cítricas (SIGMA), el heteropolisacárido más
complejo.
Por otro lado, a pesar de que hay pocos estudios referentes a la regulación por pH sobre la
producción de pectinasas por las especies de Aspergillus, se ha demostrado que la secreción de

35
estudio cinético
actividades pectinolíticas específicas por hongos fitopatogénicos puede depender del pH del
medio de cultivo (Peñalva y Arst, 2000; Maccheroni et al, 2004). Debido a lo anterior, para los
cultivos desarrollados en cada una de las fuentes de carbono mencionadas anteriormente, se
utilizaron tres valores de pH inicial, 3.5, 4.2 y 5.0, cubriendo el intervalo ácido de crecimiento y
actividad óptimos para hongos microscópicos, con el objetivo de elucidar la inducibilidad o
constitutividad de las pectinasas producidas por Aspergillus flavipes FP-500.
5.1.1. La producción de exopectinasas
La actividad de exopectinasas se observó en todas las condiciones experimentales probadas, con
distintos valores dependiendo de la fuente de carbono utilizada en el cultivo. Destaca la
producción máxima obtenida en las fuentes de carbono no relacionadas estructuralmente con la
pectina, como la glucosa o el glicerol (Tabla 2). La producción de exopectinasas observada en
glicerol fue incluso mayor que la alcanzada con algunos de los monosacáridos relacionados
estructuralmente con la pectina, mientras que la generada en glucosa fue la producción más baja
de entre todas las encontradas (Tabla 2). Este comportamiento sugiere en primera instancia la
naturaleza constitutiva de dicha actividad enzimática. El razonamiento mediante el cual se
elucida que la producción de una actividad enzimática tiene la característica de constitutividad, a
partir de la verificación de su producción en sustratos de diversos tipos, se ha utilizado incluso en
otros sistemas enzimáticos, como se reportó para la producción de lacasas con Botryosphaeria sp.
(Alves da Cunha et al, 2003). Además, existen reportes de exopectinasas constitutivas para otras
especies de Aspergillus (Aguilar y Huitrón, 1990; de Vries et al, 2002; Giese et al, 2008), que
validan y refuerzan la sugerencia de constitutividad para las exopectinasas de A. flavipes FP-500.

36
estudio cinético
Tabla 2. Producción máxima de exopectinasas de A. flavipes FP-500 en cultivos en

lote desarrollados a nivel matraz.
Máxima producción de Exopectinasas
(U/mL)
pH inicial del medio
Fuente de carbono 3.5 4.2 5.0 LSD*
Ácido galacturónico 23.81 2.24 5.41 0.9074
± 0.56B,a ± 0.56B,c ± 0.77D,b
Arabinosa 9.38 13.74 6.46 0.1729
± 0.1D,b ± 0.13C,a ± 0.07C,c
Ramnosa 2.038 1.68 4.10 0.4682
± 0.1F,b ± 0.36D,b ± 0.014E,a
Xilosa 5.19 3.41 2.75 1.1066
± 0.375E,a ± 0.82D,b ± 0.2F,c
Glucosa 0.51 1.38 0.78 1.4757
± 0.001G,c ± 0.23D,a ± 0.04 G,b
Glicerol 8.89 6.01 4.55 0.0788
± 2.91D,a ± 1.1C,D,b ± 0.12E,c
Acido poligalacturónico 21.20 30.18 19.45 1.2118
± 0.77C,b ± 1.03D.a ± 0.81B,b
Pectina 63.28 39.34 43.93 0.2186
± 0.12A,a ± 0.29A,c ± 0.75A,b
LSD** 0.8161 8.0004 0.4816
Los datos se obtuvieron a partir de las cinéticas desarrolladas en cada condición experimental, utilizando la fuente de
carbono al 1% (p/v), mediante muestreos periódicos realizados cada 24 h. Los cultivos se incubaron a 37°C y
200 rpm en un agitador reciprocante.
Cada valor es un promedio de 3 mediciones ± la desviación estándar entre las réplicas.
* Indica la diferencia mínima significativa (LSD) entre las medias a cada pH inicial en un mismo sustrato, que
difieren significativamente a p ≤ 0.05. Cuando el valor absoluto de la diferencia entre una media y otra en la misma
línea es mayor que el valor de LSD de la línea correspondiente, estos promedios se distinguen con diferente letra
minúscula: “a” para el valor mayor, “b” para el siguiente mayor y “c” para el valor más bajo.
** Indica el valor de LSD existente entre las medias de cada sustrato en un mismo pH inicial, que difieren
significativamente a p ≤ 0.05. Cuando el valor absoluto de la diferencia entre una media y otra en la misma columna
es mayor que el valor de LSD de esa columna, estos promedios se distinguen con diferentes letras mayúsculas: “A”
para el valor mayor, “B” para el siguiente en orden de magnitud, y así sucesivamente.
Cuando existe más de una letra mayúscula o minúscula junto a una media, significa que el valor absoluto de la
diferencia entre esa media y otra en la misma línea o columna es mayor que el valor correspondiente de LSD, pero
también el valor absoluto entre esa media y cualquier otra se encuentra en la misma situación.
La producción de exopectinasas obtenida en los monosacáridos relacionados estructuralmente
con la pectina presentó diferencias significativas entre sí, destacando la producción obtenida en
ácido galacturónico (Tabla 2). De hecho, los títulos de actividad enzimática observados en esta
fuente de carbono, junto con las alcanzadas con ácido poligalacturónico y pectina son los más
altos de todas las fuentes de carbono probadas. Es probable que A. flavipes FP-500 produzca
isoformas con actividad exopectinolítica, por lo que las actividades de las pectinasas del tipo exo

37
estudio cinético
obtenidas en mayor proporción con estas fuentes de carbono podrían tener una naturaleza
inducible. Lo anterior es congruente con lo reportado para la actividad exopectinolítica producida
por otras especies de Aspergillus, en donde se determinó que la pectina y el ácido galacturónico
inducen algunos de los genes que codifican para la producción de poligalacturonasas (Herbert et
al, 2001; de Vries et al, 2002). Asimismo, mediante el desarrollo de cultivos de diversos tipos
(uso de células inmovilizadas, fermentación sólida, y el cultivo sumergido) se reportó a la pectina
como un excelente inductor de la actividad exopectinolítica (Pashova et al, 1999; Dartora et al,
2002; Shubakov y Elkina, 2002; Fawolea y Odunfab, 2003; Favela-Torres et al, 2006).
En general, la producción de exopectinasas por Aspergilllus flavipes FP-500 resultó
considerablemente mayor que la reportada para otras cepas de A. flavipes (Solis et al, 1997), y
comparable con la reportada para A. niger, en el mismo régimen de producción (Shubakov y
Elkina, 2002).
Por otra parte, el pH inicial del medio pareció influenciar la actividad exopectinolítica obtenida
en cada fuente de carbono, propiciando valores significativamente diferentes entre sí. En la
mayoría de los sustratos, la producción más alta de exopectinasas se obtuvo en los medios con pH
inicial de 3.5, lo que se observa con claridad en los cultivos de ácido galacturónico, xilosa,
glicerol y pectina, mientras que en arabinosa, glucosa y ácido poligalacturónico las mejores
producciones exopectinolíticas se observaron en los medios con pH inicial de 4.2; en ramnosa
esto sucedió en los medios con pH inicial de 5 (Tabla 2). En general, este comportamiento es
congruente con el de las poligalacturonasas producidas por hongos saprófitos, que se caracterizan
por tener pH óptimos ácidos, y se producen y secretan preferencialmente a condiciones ácidas de
crecimiento (Maccheroni et al, 2004).

38
estudio cinético
5.1.2 La producción de endopectinasas
En lo que respecta a la producción de endopectinasas, esta actividad no se observó en todas las
fuentes de carbono utilizadas (Tabla 3). Dentro del grupo de los azúcares simples, sólo se detectó
en ácido galacturónico en el cultivo con pH inicial de 3.5, con valores mayores que los obtenidos
con ácido poligalacturónico. En pectina la producción de endopectinasas fue considerablemente
mayor en todos los valores de pH inicial probados. La producción de las endopectinasas en las
fuentes de carbono probadas señala que, a diferencia de las exopectinasas, la actividad
endopectinolítica de A. flavipes FP-500 es inducible, y que la pectina es el principal inductor. Lo
anterior es congruente con lo reportado previamente para otras cepas del genero Aspergillus
(deVries et al, 2002; de Vries, 2003).
En lo que se refiere al efecto del pH sobre la producción de endopectinasas por A. flavipes FP-
500, hubo una influencia clara de los valores más ácidos del pH sobre dicha producción. Así, la
actividad endopectinolítica fue mayor en los cultivos que iniciaron a pH de 3.5, mientras que su
valor disminuyó o fue prácticamente nulo en los medios con el pH inicial menos ácido (Tabla 3).
Lo anterior es congruente con lo reportado para las endopectinasas de otras cepas del género
Aspergillus, como en el caso de A. oryzae, donde las máximas producciones se obtuvieron en el
cultivo con pH inicial de 4.0 (Malvessi y Moura, 2004). Este comportamiento indica que el pH
inicial tiene una importante influencia sobre la producción de la actividad endopectinolítica
producida por este microorganismo.

39
estudio cinético
Tabla 3. Producción máxima de endopectinasas de A. flavipes

FP-500 en cultivo en lote desarrollado a nivel matraz.
Máxima producción de Endopectinasas
(U/mL)
Fuente de pH inicial del medio
carbono 3.5 4.2 5.0 LSD*
Ácido 2.51 0,17 0C,c 0.019
B,a B,b
galacturónico ± 0.12 ± 0,006
Acido poli 0.613 0.298 0.241 0.0206
galacturónico ± 0.021C,a ± 0.013B,b ± 0.01B,c
Pectina 35.63 10.45 15.16 3.0177
± 2A,a ± 0.45A,c ± 0,45A,b
LSD** 1.4796 0.1228 0.1861
Para la interpretación del análisis estadístico de los datos, ver las notas de la Tabla 2.
5.1.3 La producción de pectinliasas
La actividad de pectin liasas producida por A. flavipes FP-500 se observó en todas las fuentes de
carbono probadas (Tabla 4). La producción obtenida en glicerol fue uno de los valores más bajos
(Tabla 4). Por su parte, la máxima producción de los medios con glucosa fue similar a las
generadas en sustratos estructuralmente relacionados con la pectina, como arabinosa, ramnosa y
xilosa, bajo cualquiera de las condiciones de pH probadas (Tabla 4). Esto es un hecho destacable,
ya que sugiere la posibilidad de la naturaleza constitutiva de las pectin liasas de A. flavipes
FP-500. La producción constitutiva de pectin liasas no se ha reportado explícitamente en los
trabajos que estudian la producción de pectinasas por diversos hongos. Para Penicillium
griseoroseum se reportó una buena producción de pectin liasas (∼ 60 U mL-1) al utilizar sacarosa
como fuente de carbono, aunque ante esta condición no se sugirió el carácter constitutivo de
dicha actividad enzimática, sino que sólo se destacó la capacidad del microorganismo para
producir pectin liasas en un sustrato que en general puede funcionar como un represor catabólico

40
estudio cinético
para estas enzimas (Piccoli-Valle et al., 2001). En lo que respecta a las cepas del género de
Aspergillus, la producción de pectin liasas en un nivel constitutivo puede deducirse para A. niger,
al analizar que de una familia de seis genes que codifican para diversas pectin liasas, tres de ellos
(pelB, pelC y pelF) sintetizan enzimas que se expresan en una variedad de sustratos, que incluyen
a la glucosa (de Vries et al., 2002). Este es, entonces uno de los primeros reportes que señalan,
bajo un argumento de comparación en la producción volumétrica, la constitutividad de algunas
isoformas de las pectin liasas producidas por A. flavipes FP-500.
Bajo el mismo criterio con el que se señaló la naturaleza constitutiva de las exopectinasas
producidas por A. flavipes FP-500, se consideraron los valores obtenidos para la actividad de
pectin liasas en todas las fuentes de carbono probadas (Tabla 4). De esta manera, se observó una
serie de valores, desde unos muy pequeños hasta algunos cercanos a las 30 U mL-1, dependiendo
de la fuente de carbono usada. Esta variación en las producciones máximas de pectin liasas
sugiere que esta actividad también tiene isoformas de naturaleza inducible. Los sustratos en los
que se obtuvieron los mayores títulos de actividad de pectin liasas fueron el ácido galacturónico y
la pectina (Tabla 4), por lo que estos pueden considerarse como los principales inductores de esta
actividad.
A pesar de que fue posible observar la producción de pectin liasas por A. flavipes FP-500 en
todas las fuentes de carbono utilizadas, en general la producción de esta enzima fue baja en
comparación con los valores reportados para otros microorganismos. Así, con las cepas
CH-Y-1043 y ATCC-16795 de A. flavipes se obtuvieron producciones de 300 y 150 U mL-1 de
pectin liasas, respectivamente, en cultivo sumergido al crecer sobre cáscara de limón como fuente
de carbono (Solís et al, 1997).

41
estudio cinético
Tabla 4. Producción máxima de pectin liasas de A. flavipes FP-500 en cultivo en lote

desarrollado a nivel matraz
Máxima producción de pectin liasas
(U/mL)
pH inicial del medio
Fuente de carbono 3.5 4.2 5.0 LSD*
Ácido galacturónico 5.78 3.37 2.75 0.4012
± 0.29A,a ± 0.2B,b ± 0.17C,c
Arabinosa 1.22 2.85 0.74 0.1223
± 0.024D,b ± 0.12C,a ± 0.03E,c
Ramnosa 1.42 2.47 0.53 0.2698
± 0.09D,C,b ± 0.16D,a ± 0.02E,F,c
Xilosa 1.42 0G,c 3.24 0.0742
C,b
± 0.07 ± 0.13C,a
Glucosa 2.13 1.74 2.1 0.0853
± 0.09B,a ± 0.07E,b ± 0.09D,a
Glicerol 0.82 0.82 0.63 0.1638
± 0.03E,a ± 0.06F,a ± 0.02E,F,b
Acido poligalacturónico 0F,b 0.74 20.15 1.2763
± 0.34F,b ± 1.03B,a
Pectina 5.71 6.56 27.34 0.567
± 0.37A,c ± 0.31A,b ± 0.56A,a
LSD** 0.1591 0.2266 0.6875
En lo que se refiere al efecto del pH inicial sobre la producción de pectin liasas, se observó una
diferencia entre monosacáridos y polisacáridos. Mientras que en los monosacáridos las mayores
producciones de pectin liasas se observaron en los medios más ácidos, lo que es evidente para
ácido galacturónico (Tabla 4), en los medios que utilizaron polisacáridos la máxima producción
se obtuvo cuando estos iniciaron con un pH de 5.0 (Tabla 4).
La diferencia en la producción de pectin liasas observada en las distintas fuentes de carbono, en
relación con el pH inicial de cada cultivo, sugiere que el pH tiene un efecto significativo sobre la
producción de dicha actividad enzimática. Así, de acuerdo a las actividades alcanzadas en pectina
y ácido poligalacturónico, podría pensarse que estas enzimas se expresan sólo en los medios que
tienen un pH inicial menos ácido, como de hecho se ha reportado para otros hongos saprófitos

42
estudio cinético
(Maccheroni et al, 2004). Sin embargo, los resultados de la producción obtenida en ácido
galacturónico no permiten dicha correlación, al mostrar una respuesta inversa a la observada en
pectina.
En los experimentos descritos hasta el momento, sólo se ha considerado el efecto del pH inicial
sobre la producción de las pectinasas de A. flavipes FP-500. Sin embargo, debido a que no se ha
considerado la evolución del pH a lo largo del cultivo en las fuentes de carbono, no es posible
dilucidar el efecto de cada uno de estos factores sobre la producción de pectinasas, Para poder
discernir entre los verdaderos efectos de la fuente de carbono o el pH, fue necesario desarrollar
experimentos específicos, cuyos resultados se discuten y analizan ampliamente en las secciones
5.2 y 5.3.
5.1.4 Estudio cinético sobre la naturaleza inducible y constitutiva de
las pectinasas de A. flavipes FP-500
Para reforzar las aseveraciones referentes a la naturaleza inducible o constitutiva de las pectinasas
producidas por A. flavipes FP-500, se desarrolló un análisis cinético de los datos de producción
volumétrica, basado en el modelo no estructurado descrito por Monod. Así, mediante el empleo
de la función de residuales para la aplicación del método Simplex (Aranda-Barradas et al, 2000),
se obtuvieron los valores numéricos de los parámetros cinéticos que describían cada uno de los
cultivos desarrollados en las diferentes fuentes de carbono utilizadas.
Los modelos matemáticos, generados a partir de los datos experimentales, describieron de
manera adecuada la formación de biomasa, el consumo de sustrato y la producción de
exopectinasas para cada una de las condiciones probadas. Dicha adecuación de los datos
experimentales a modelo se muestra en la Figura 3, donde se describe el comportamiento de

43
estudio cinético
A. flavipes FP-500 creciendo sobre glucosa y pectina, en los medios con pH inicial de 3.5 y 5.0.
En esta gráfica los intervalos de confianza de cada modelo se indican mediante líneas
discontinuas.
12 1,4 12 1,4
A B
Glucosa (g/L); Crecimiento (g/L)

1,2
Glucosa (g/L); Crecimiento (g/L)
10 1,2 10
Eopectinasas (U/mL)
1 1
Exopectinaas (U/mL)
8 8
0,8 0,8
6 6
0,6 0,6
4 4
0,4 0,4
2 2 0,2
0,2
0 0 0 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80
Tiempo (h) Tiempo (h)
12 90 12 45
C D
80 40
Pectina (g/L); Crecimiento (g/L)
Pectina (g/L); Crecimiento (g/L)
10 10
70 35
Exopectinasas (U/mL)
Exopectinasas (U/mL)
8 60 8 30
50 25
6 6
40 20
4 30 4 15
20 10
2 2
10 5
0 0 0 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80
Figura 3. Ajuste (línea continua) de los datos experimentales a un modelo cinético para el consumo de
sustrato (), crecimiento () y producción de exopectinasas (), a pH inicial de 3.5 (A & C) y 5.0 (B &
D), con glucosa (A & B) y pectina (C & D) como fuentes de carbono en cultivos en lote desarrollados a
nivel matraz. Las líneas punteadas representan los intervalos de confianza de las estimaciones del modelo
para S, x y p.
Debe considerarse que el modelo matemático muestra solamente las tendencias del
comportamiento observado en el experimento, y que por definición es sólo una representación del
crecimiento y producción de pectinasas como sistema físico. Así, no será extraño observar
tendencias que muestran una inflexión positiva o negativa en la curva que describen, aún donde

44
estudio cinético
no existe ningún dato experimental que compruebe que es exactamente en ese punto sucede la
inflexión de la curva, como se observa en la Figura 3B, que describe la producción de
exopectinasas a pH de 5.0 sobre glucosa.
5.1.4.1 Parámetros cinéticos de crecimiento generados con el modelo.
Al analizar los parámetros (µmax y YXS), obtenidos mediante la modelación matemática de la
tendencia descrita por los datos experimentales, fue posible observar la variación de estos con
dependencia en la fuente de carbono utilizada (Tabla 5).
En lo que respecta a la velocidad específica de crecimiento, en sustratos como xilosa, glicerol y
ácido poligalacturónico se obtuvieron los valores más bajos de este parámetro, mientras que en
acido galacturónico y en arabinosa las µmax presentaron valores más altos (Tabla 5). En todos
estos sustratos los resultados obtenidos para este parámetro fueron relativamente constantes en
cualquier condición de pH inicial utilizada, lo que parece indicar la dependencia del crecimiento
más por la fuente de carbono que por el pH inicial del cultivo. Sin embargo, en otro grupo de
sustratos (glucosa, ramnosa y pectina), los valores de µmax sí se vieron fuertemente afectados por
el pH inicial del cultivo. Así, los experimentos desarrollados sobre ramnosa mostraron un
incremento en µmax cuando el pH inicial era de 5.0, mientras que cuando el hongo se hizo crecer
en glucosa y pectina se observó una disminución significativa de µmax ante esa condición de pH
inicial (Tabla 5). Este comportamiento fue contrario al reportado para A. niger durante la
producción de glucoamilasas, ya que para esta cepa, los valores de las constantes de velocidad
específica de crecimiento obtenidos en glucosa a pH de 2.5 a 6.0, mostraron una ligera tendencia
a aumentar en los medios con los valores de pH más altos (Pedersen et al., 2000). Finalmente, los
valores más altos de µmax se obtuvieron para los cultivos desarrollados sobre pectina (Tabla 5).

45
Constitutividad e inducibilidad en pectinasas de Aspergillus flavipes FP-500: análisis de producción volumétrica y estudio cinético
Tabla 5. Parámetros cinéticos de crecimiento obtenidos con la modelación de los datos experimentales, mediante el empleo de la función de
residuales
µmax YX/S α
Parámetro cinético
(h-1) (g de biomasa g de sustrato-1) (U g de biomasa-1)
pH pH pH
Fuente de carbono
3.5 4.2 5.0 LSD* 3.5 4.2 5.0 LSD* 3.5 4.2 5.0 LSD*
Ácido 0.069 0.064 0.079 0.009 0.44 0.39 0.35 0.0596 37.89 4.14 14.53 3,9397
Galacturónico ± 0.008D,a ± 0.01C,b ± 0.005D,a ± 0.05 ± 0.04 ± ± 2.9A,a ± ± 2.5C,b
A,B,a B,C,a
0.03C,D,b 0.98 E,c
Arabinosa 0.15 0.05 0.12 0,022 0.36 0.44 0.37 0.0928 3.1 5.18 8.3 1,5704
± 0.021C,a ± 0.001 ± 0.03B,b ± 0.06C,D,a ± ± 0.03C,a ± 0.96D,c ± 0.68 ± 0.52D,a
C,D,c
0.02B,a E,b
Ramnosa 0.04 0.098 0.104 0,0153 0.44 0.31 0.39 0,0632 1.30 25.6 4.21 1,0959
± 0.01D.E,b ± 0.006 ± 0.01B,C,a ± 0.03B, ± 0.03 ± ± 0.2D,E,c ± ± 0.06E,b
B,a C,a D,E,b
0.017C,a 1.43A,a
Xilosa 0.029 0.029 0.026 0,0046 0.411 0.26 0.46 0.0238 0.013 0.73 0.84 0,1099
± 0.008E,a ± 0.003 ± 0.002E,a ± 0.05 ± 0.007 ± ± 0.003 ± ±
D,E,a A,B,b E,c
0.024B,a E,b
0.16F,a 0.087G,a
Glicerol 0.035 0.027 0.026 0,0081 0.48 0.26 0.26 0.0299 0.004 15.71 16.17 1.8473
± 0.003E,a ± 0.007 ± ± 0.02A,a ± 0.02 ± 0.06 E,b ±0.0024 ± 2.45 ±1.21B,a
E,b
0.005E,a,b E,b E,b C,a
Glucosa 0.17 0.07 0.08 0,082 0.49 0.52 0.41 0,0388 0.32 0.12 1.65 0.136
± 0.03B,a ± ± ± 0.04 ± ± ± 0.11 E ± 0.05 ±
0.01B,C,b 0.04C,D,a,b A,B,a
0.01A,a 0.036C,b F,c
0.15F,G,a
Ácido 0.034 0.032 0.027 0,0081 0.30 0.34 0.26 0.0383 11.97 19.99 27.88 2.5768
Poligalacturónico ± 0.005E,b ± 0.002 ± ± ± 0.03 ± 0.09 ± 1.53C,b ± ± 2.7A,a
D,E,b
0.0022A,a 0.014D,E,b C,D,a D,Eg,b
1.67B,b
Pectina 0.76 0.55 0.039 0,1104 0.34 0.34 0.68 0,0689 30.78 12.13 6.27 2.0281
± 0.06A,a ± 0.06A,b ± 0.007E,c ± 0.007E,b ± 0.03 ± 0.09A,a ± 0.95B,a ± ± 2.2E,c
D,b
0.33D,b
LSD** 0.0313 0.0254 0.016 0.0723 0.067 0.0763 1.9241 1.506 1.9426
Los resultados con cuyo análisis se elaboró este análisis estadístico se generaron en cultivos en lote desarrollados en matraz. Todos los cultivos se incubaron a
37°C durante 72 h, tomando muestras periódicas cada 24 h.

46
estudio cinético
Lo anterior sugiere que este hongo está más adaptado a crecer en polisacáridos que en
monosacáridos.
Los rendimientos calculados después del empleo de los métodos numéricos, fueron semejantes a
los obtenidos a partir de los datos volumétricos experimentales, con lo que se confirma la validez
y significancia de los datos generados a partir del modelo matemático. En general, los
rendimientos observados estuvieron entre 0.2 y 0.6 g de biomasa g de sustrato-1. Los valores más
altos para el rendimiento se observaron en pectina (Tabla 5), lo que refuerza la idea de mayor
adaptación de hongo a los polisacáridos.
Los rendimientos obtenidos por A. flavipes FP-500 sobre glucosa fueron semejantes al reportado
para A. nidulans (0.48 g de biomasa g de sustrato-1) en esa misma fuente de carbono (David et al,
2005). Los valores de este parámetro dependieron en mayor medida del pH inicial del cultivo.
Así, los rendimientos más altos se obtuvieron, en los medios con pH inicial de 3.5, para ácido
galacturónico, ramnosa y glicerol, mientras que con el pH inicial de 4.2 fue con arabinosa,
glucosa y ácido poligalacturónico donde se alcanzaron los mayores valores para este parámetro,
en tanto que con xilosa y pectina esto sucedió en los medios con el pH inicial de 5.0 (Tabla 5).
5.1.4.2 Correlación de los parámetros cinéticos sobre la constitutividad e
inducibilidad de las exopectinasas.
Los parámetros cinéticos en el modelo de Leudeking-Piret, α y β, permiten establecer la relación
entre la velocidad específica de crecimiento y la producción de pectinasas en un cultivo fúngico.
El parámetro α expresa la producción enzimática asociada al crecimiento del microorganismo, así
como su constitutividad o inducibilidad, de manera tal que se considera que una producción
presenta dicha asociación siempre que α ≠ 0. Como el microorganismo produce las pectinasas
para poder crecer sobre un sustrato complejo como la pectina, entonces dicha producción está
Constitutividad e inducibilidad en pectinasas de Aspergillus flavipes FP-500: análisis de 47

producción volumétrica y estudio cinético
estudio cinético
totalmente asociada al crecimiento, por lo que el parámetro α se convierte en el factor más
significativo para esta aproximación. Adicionalmente, la modelación de los datos experimentales
reportó valores de cero o negativos, carentes de toda significación física, para el parámetro β en
todos los casos.
En lo que se refiere a la producción de exopectinasas representada por el modelo de Leudeking-
Piret, los valores estimados para α mostraron una dependencia de este parámetro tanto por el
sustrato como por el pH inicial utilizados (Tabla 5). El análisis independiente del efecto del pH o
la fuente de carbono sobre los parámetros α y µmax, si bien permite establecer tendencias y
comportamientos, podría no ofrecer una certeza definitiva a las hipótesis planteadas previamente.
Sin embargo, mostrar mediante una gráfica la relación µmax–α generada a partir de los datos
obtenidos en las fuentes de carbono más representativas permitió verificar, bajo otro criterio, la
constitutividad o la inducibilidad de las exopectinasas producidas por A. flavipes FP-500. Ese
razonamiento se basó en la idea de que, si α permanece constante aún cuando se observen
cambios en los valores de µmax, es porque en estos casos la enzima producida es constitutiva,
mientras que un incremento en α, no obstante los valores de µmax, indicaría claramente un
comportamiento de inducibilidad. Con lo anterior como base, al trazar una gráfica que relaciona
ambos parámetros se observaron tres tendencias de correlación:
i. En los datos del cultivo desarrollado con glucosa, los valores de µmax dependían
fuertemente del pH del medio, pero no así los de α (Figura 4a). Pareciera que aunque la µmax se
incrementa, el valor de α permanece prácticamente constante. Este valor constante además,
sugiere la producción basal de esta actividad enzimática ante dichas condiciones. De acuerdo al
criterio mencionado anteriormente, el comportamiento observado en pectina es indicativo de la
constitutividad de la actividad pectinolitica del tipo exo.

estudio cinético
ii. En sustratos como ácido galacturónico o ácido poligalacturónico, los valores de µmax
fueron iguales en los tres valores de pH inicial probados, pero las α variaron dependiendo del pH
inicial utilizado para cada medio. La representación gráfica de la relación de estos parámetros
muestra una clara tendencia lineal, mediante una línea casi vertical (Figura 4b). Esto sugiere que
hay una inducción de las exopectinasas, pero con una fuerte dependencia en el pH inicial, como
ya se ha reportado para otras especies de Aspergillus (de Vries et al. 2002).
iii. En los cultivos que utilizaron pectina como fuente de carbono, se observó una relación
proporcional positiva entre los valores de los parámetros µmax y α (Figura 4c). Si bien este
comportamiento señala claramente la naturaleza inducible de las enzimas, en este caso no fue
sencillo diferenciar entre pH inicial o fuente de carbono como el principal inductor.
En general, los valores de α obtenidos en pectina y acido galacturónico fueron excepcionalmente
altos comparados con los calculados para los otros sustratos, destacando los valores observados
en los medios con pH inicial de 3.5. Con lo anterior, se refuerza la idea de la inducción de las
exopectinasas por estos sustratos.
Este es uno de los primeros trabajos en los que se sugiere la naturaleza constitutiva o inducible de
las exopectinasas con base en el análisis cinético de los datos de un cultivo, lo que significaría
una de las mayores aportaciones de este estudio.

estudio cinético
45
40 A
35
30
25
20
α (U/g) 15
10
5 4.2 5.0 3.5
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
-1
µmax (h )
45
40 B
3.5
35
30 5.0
25
α (U/g)
4.2
20
15 3.5 5.0
10
5 4.2
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35
-1
µ m ax (h )
45
40 C
35
30
3.5
α (U/g)
25
20
15
10 5.0
4.2
5
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
-1
µ m ax (h )
Figura 4. Correlación µmax - α , a diferentes valores de pH inicial en (a) glucosa (), (b) ácido
galacturónico, () y ácido poligalacturónico () y (c) pectina (•). Los números asociados a los
marcadores indican el pH inicial del medio de cultivo. Los parámetros cinéticos aquí reportados se
obtuvieron a partir de los datos de producción de exopectinasas en cinéticas desarrolladas a nivel matraz.
estudio cinético
5.1.5 Conclusion
Aspergillus flavipes FP-500 creció mejor en pectina que en las otras fuentes de carbono probadas,
lo que sugiere que esta cepa está mejor adaptada a polisacáridos complejos que a cualquiera de
los monosacáridos que constituyen a estos polisacáridos. Los niveles de producción de las
pectinasas son significativos en sustratos poliméricos e comparación con los obtenidos en
azúcares simples, lo indica la naturaleza inducible de estas enzimas, señalando a la pectina y al
acido galacturónico como los principales inductores de las mismas. Por su parte, la comparación
volumétrica y cinética sugirió la naturaleza constitutiva de las exopectinasas producidas por esta
cepa, así como las características que señalan a las endopectinasas como enzimas inducibles.
Además de la dependencia de la producción de las pectinasas con la fuente de carbono, los
resultados parecen indicar cierto efecto del pH inicial sobre la producción de las pectinasas
producidas por A. flavipes FP-500. Sin embargo, con estos experimentos no fue posible dilucidar
con claridad cómo es ese efecto y si sucede sobre la producción o la actividad de las pectinasas
cuantificadas.
Dentro de las principales aportaciones de esta etapa experimental se cuentan la propuesta de las
pectin liasas como una actividad enzimática constitutiva, así como la identificación de la
naturaleza constitutiva o inducible de las pectinasas con base en criterios cinéticos, empleando
una correlación de los parámetros cinéticos µmax y α.

Regulación por la fuente de carbono de la producción de pectinasas en Aspergillus flavipes FP-500
5.2 Regulación por la fuente de carbono de la producción de

pectinasas en Aspergillus flavipes FP-500
Para que la degradación de los polisacáridos por los microorganismos saprófitos sea eficiente,
requiere de la acción sinérgica de las enzimas responsables de dicha acción. Aunque no se ha
demostrado la sinergia entre las pectinasas producidas por cepas de Aspergillus, se ha reportado
la producción de las enzimas encargadas de degradar a la cadena principal de la pectina
(poligalacturonasas, pectin liasas, ramnogalacturonan hidrolasas y pectin y pectato liasas) en
sustratos de diversos tipos (Shuvakov y Elkina, 2002; Malvessi y Moura, 2004; Favela- Torres et
al, 2006), lo que sugiere alguna forma de acción concertada de estas enzimas.
Con base en lo anterior, el objetivo principal de los experimentos descritos en este apartado fue
determinar si la producción de las enzimas pectinolíticas de A. flavipes FP-500 es concertada o
secuencial, y si está sujeta a represión catabólica por carbono.
5.2.1 Producción concertada y secuencial de las pectinasas.
Para determinar, de manera general, cómo sucede la producción de las pectinasas de A. flavipes
FP-500 a lo largo del cultivo desarrollado en pectina, se llevaron a cabo cultivos en lote a nivel
biorreactor, empleando un reactor automatizado (BioFlo 110, Newbrunswick Scientific).
Mediante estos experimentos fue posible monitorear los parámetros de operación a lo largo del
desarrollo del cultivo, así como un muestreo frecuente del mismo. La metodología empleada para
el desarrollo de estos cultivos se describe ampliamente en la sección de Materiales y Métodos.
Ante la presencia de un polisacárido, el hongo tiene que producir las enzimas que necesita para
obtener de éste sus azúcares constitutivos y poder metabolizarlo. Considerando que los hongos
filamentosos del género Aspergillus producen diferente cantidad y tipo de enzimas, en
dependencia con la fuente de carbono sobre la que se les haga crecer (Teixeira et al, 2000;

52
Carlsen y Nielsen, 2001; Lenartovicz et al, 2003), en el estudio del cultivo de un hongo con un
polisacárido como única fuente de carbono, la concentración de azúcares reductores liberados es
un factor que podría apoyar en el entendimiento de la acción de las actividades enzimáticas
producidas.
Al analizar los resultados obtenidos mediante el desarrollo del cultivo, se observó que al inicio
del mismo la concentración de azúcares reductores fue baja, pero se incrementó hasta 2 g L-1 al
cabo de las primeras 24 h (indicado por la línea punteada en la Figura 5). Posteriormente, se
observó una disminución en la concentración de grupos reductores, hasta obtener valores
menores de los 0.5 g L-1, comportamiento que se mantuvo aproximadamente estable desde las 40
h hasta el final del cultivo (Figura 5A). En lo que respecta a la pectina existente en el medio, su
concentración comenzó a disminuir conforme se observó la aparición de azúcares reductores, lo
que indicó que este sustrato polimérico se estaba degradando a sus azúcares constitutivos
(Leathers, 2004; Talebnia et al, 2008). La disminución en la concentración de pectina fue
evidente entre las 16 y las 40 h, donde de hecho se desarrolló la fase de crecimiento exponencial
(Figura 5A). Al cabo de ese tiempo, la concentración de pectina remanente en el medio se
mantuvo aproximadamente constante hasta el final del cultivo, al mismo tiempo que sucedió la
fase de mantenimiento de la biomasa (Figura 5A).
El análisis de la evolución en la concentración de grupos reductores a lo largo del cultivo podría
explicarse tomando como base el progreso en la producción de las diversas actividades
pectinolíticas. Para facilitar la comparación de los resultados y verificar las posibles correlaciones
existentes entre la producción de las pectinasas y la evolución de los azúcares reductores, se
calculó la producción específica de las enzimas, es decir, la relación resultante entre la actividad
enzimática producida y la concentración de biomasa observada en ese tiempo.

53
En lo que respecta a la producción de exopectinasas, es posible observar un pico de producción
específica máxima durante las primeras 24 h de cultivo (Figura 5B). Lo anterior sugiere la
producción de las isoformas constitutivas de las exopectinasas producidas por A. flavipes FP-500
durante las primeras horas de cultivo. La congruencia en el incremento de la actividad
exopecinolítica con el de la concentración de grupos reductores sugiere que estos últimos se
liberan al medio por la acción de las exopectinasas constitutivas, producidas en los tiempos
iniciales dentro del cultivo. Cuando la concentración de azúcares reductores disminuyó, también
se observó una ligera reducción en la actividad exopectinolítica, aunque esta volvió a
incrementarse al cabo de las 40 h, hasta alcanzar su máximo hacia el final del cultivo. El segundo
incremento en la actividad de exopectinasas puede corresponder a las isoformas inducibles de las
mismas, producida debido a la liberación de los grupos reductores en las primeras 24 h de
cultivo. Aunque no fue posible caracterizar la cantidad y tipo de grupos reductores liberados en
cada tiempo de muestreo, es probable que el pico de concentración máxima de azúcares
reductores estuviera conformado en su mayoría por ácido galacturónico, clasificado
anteriormente como un inductor de esta actividad enzimática. Esto, desde luego, deberá
verificarse experimentalmente.
Por otra parte, la actividad de endopectinasas comenzó a observarse hasta después de las
primeras 24 h de cultivo, cuando la concentración de azúcares reductores comenzaba a disminuir.
Luego de ese tiempo, la producción de la actividad endopectinolítica se incrementó, alcanzando
su máximo hacia el final del cultivo. Los resultados obtenidos para las actividades exo y
endopectinolíticas sugieren que existe cierta relación entre el producto de la acción de la
actividad exopectinolítica y la producción de las endopectinasas en este cultivo. Al parecer, los
azúcares reductores producidos por la acción de las isoformas constitutivas de las exopectinasas,
fueron también los inductores de la actividad endopectinolítica observada.

54
9 3.5
8 A 3
Azúcares reductores (g L-1)

7
2.5
6
Pectina (g L )
-1 5 2
4 1.5
3
1
2
1 0.5
0 0
20 2
Endopectinasas (U g de biomasa-1)
B
Exopectinasas (U g de biomasa-1)
18 1.8
16 1.6
14 1.4
12 1.2
10 1
8 0.8
6 0.6
4 0.4
2 0.2
0 0
7
C
Pectin liasas (U g de biomasa-1)
0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Figura 5. Evolución del cultivo en lote desarrollado a nivel biorreactor, utilizando pectina como fuente de
carbono. Se partió de un pH inicial de 3.5, mismo que se dejó evolucionar libremente a lo largo del
cultivo. A. Consumo de pectina (), liberación de azúcares reductores () y Biomasa total (∗); B.
Producción específica de exopectinasas () y endopectinasas (); y C. Producción específica de pectin
liasas () y pH (X).

55
La relación de la producción de exo y endopectinasas permite sugerir un modelo de acción de
estas enzimas. En principio, las exopectinasas producidas de manera constitutiva actúan sobre los
pocos extremos no reductores de la estructura de la pectina, liberándolos al medio. Con esto, se
incrementa ligeramente la concentración de azúcares reductores, mismos que ingresan a la célula
y se encargan de inducir al sistema pectinolítico, lo que provoca la secreción masiva de las
pectinasas por parte del microorganismo. Una vez en el medio, las pectinasas inducidas
recientemente actúan sobre la estructura de la pectina. Las endopectinasas provocan rupturas a lo
largo de la cadena principal, y generan con ello más extremos no reductores, que quedan
disponibles para el ataque masivo por parte de las exopectinasas recientemente inducidas. Un
modelo semejante permitió explicar la acción concertada de las celulasas (Prade, 1995), lo que
fortalece el modelo sugerido de acción sinérgica de las pectinasas en A. flavipes FP-500.
La producción específica de pectin liasas observada durante las primeras 24 h del cultivo parece
confirmar la propuesta referente a la producción de isoformas constitutivas de esta actividad
enzimática en A. flavipes FP-500. Dentro del modelo anteriormente propuesto, la producción de
las pectin liasas pareciera ser independiente de la acción de las endopectinasas, y estar
relacionada con la liberación de los inductores debido a la acción de las exopectinasas sobre la
pectina. Sin embargo, hay reportes que indican que esta actividad enzimática se regula
principalmente por el pH del medio (Yakobi et al, 2000). Como se puede observar, la
disminución en la actividad específica de pectin liasas fue concordante con la disminución del
pH, mientras que el aumento de esta actividad coincidió con el incremento en el pH (Figura 5C).
En la sección 5.3 se discutirán con detalle experimentos planteados para revisar el efecto del pH
sobre la producción de pectin liasas.
La disminución en la producción de las exopectinasas observada a las 40 h de cultivo, así como la
ligera disminución en la tendencia de la producción de endopectinasas en ese mismo tiempo

56
(Figura 5B), podrían deberse al efecto de la concentración de azúcares reductores presentes en el
medio a las 24 h (Figura 5A). Lo anterior sugeriría la posibilidad de que algunas de las isoformas
inducibles de las exopectinasas y las endopectinasas estén sujetas a represión catabólica, como en
general sucede para muchas pectinasas (de Vries, 2003; Flipphi et al, 2003). Además, a partir del
análisis de estos resultados podría decirse que esa represión sucede cuando la concentración de
azúcares reductores en el medio es mayor a 2 g L-1. Un comportamiento parecido se reportó para
las poligalacturonasas de A. niger, cuya producción disminuyó considerablemente cuando en el
medio había concentraciones de glucosa de 7 g L-1 (Panda et al, 2004), mientras que la expresión
de las endopectinasas de A. citri se vio fuertemente reprimida con concentraciones de glucosa del
1% (p/v) en el medio de cultivo, o ante la presencia de elevadas concentraciones de fructosa y
sacarosa, como sucede en el jugo de frutos cítricos (Akimitsu et al, 2004).
A pesar de que para la producción de pectin liasas sucedió también una disminución al cabo de
las 24 h de cultivo, no es posible sugerir que en este caso el efecto de una represión catabólica, si
se consideran los resultados obtenidos en el cultivo en lote desarrollado sobre pectina con un pH
inicial de 5.0 (no mostrados). En ese caso se observó, durante las primeras horas, una producción
de pectin liasas mayor que la reportada para este experimento, aún cuando la concentración
máxima de azúcares reductores fue mayor de 2 g L-1 (datos no mostrados). En la naturaleza, se ha
encontrado que las pectin liasas actúan sobre todo en la cáscara de los frutos cítricos para macerar
los tejidos, durante la invasión de estos por microorganismos patógenos (Deising et al, 1995;
Maccheroni et al, 2004). Debido a que en dichos materiales difícilmente se encuentran azúcares
reductores libres, no sería extraño que estos grupos no ejercieran un efecto importante en la
regulación de la producción de pectin liasas por A. flavipes FP-500.

57
5.2.2 Experimento de transferencia.
Para verificar las suposiciones establecidas respecto a la inducción de las exo y endopectinasas
por el ácido galacturónico liberado de la estructura principal de la pectina, así como lo referente a
la posible represión catabólica causada por la presencia de azúcares reductores en el medio, se
desarrollaron los experimentos de transferencia. En estos experimentos, se transfirió micelio
precrecido en glucosa a diversos matraces con medio mineral fresco en el que la pectina era la
única fuente de carbono. Cuando comenzó la producción de las pectinasas (12 h después de la
transferencia), se agregó ácido galacturónico o glucosa en algunos de los matraces, y se verificó
el comportamiento del cultivo con cada azúcar adicionado, comparando contra un experimento
control (sin adición). La metodología empleada para esta serie experimental se describe
detalladamente en la sección 4.4.2 (de Materiales y Métodos).
El crecimiento obtenido en las tres condiciones experimentales fue semejante durante las
primeras 8 h de cultivo después de la adición, sin embargo pareció verse favorecido por la
adición de azúcares reductores al medio (Figura 6A). Así, la concentración de biomasa fue mayor
en los experimentos a los que se les adicionó ácido galacturónico o glucosa (Figura 6A). El
incremento en la biomasa provocado por la adición de azúcares reductores es un hecho que se ha
reportado previamente para otras cepas, como A. oryzae durante la producción de α-amilasas
(Carlsen y Nielsen, 2001) y A. niger en la producción de pectinasas (Panda et al, 2004).
Durante las primeras horas después de la adición de los sustratos, el ácido galacturónico provocó
una mayor producción de exopectinasas, en comparación con la cantidad producida en el
experimento control. Esta diferencia fue más notable hacia el final del cultivo, donde hubo una
variación de aproximadamente 15 U mL-1 con respecto a la actividad exopetinolítica observada
en el control. El obvio incremento en la producción de las exopectinasas debido a la adición de

58
ácido galacturónico, apoya el papel de inductor de esta fuente de carbono sobre la actividad
exopectinolítica.
En lo que respecta a la glucosa, ésta ocasionó una disminución evidente en la producción de
exopectinasas en las primeras 4 h después de la adición, que reafirma la idea del efecto represor
de este azúcar sobre dicha actividad. Sin embargo, después de ese decremento se observó un
nuevo aumento en la producción, y hacia el final de cultivo la actividad de exopectinasas fue
igual a la observada en el experimento control. Lo anterior sugiere que, si bien la actividad
exopectinolítica sufre represión catabólica, este efecto es transitorio en la medida en que la
glucosa desaparece del medio. Un comportamiento semejante se reportó para las
poligalacturonasas de A. terreus, mediante experimentos de transferencia similares a estos
(Runco et al, 2001).
En lo que se refiere a la producción de endopectinasas, esta se vio afectada drásticamente con la
adición tanto de glucosa como del ácido galacturónico (Figura 6 C). Así, mientras que la
producción de estas enzimas durante las primeras 10 h después de la adición fue semejante a la
del experimento control, durante las siguientes 12 h esta se mantuvo prácticamente constante en
los cultivos a los que se adicionaron los azúcares reductores. A pesar de que la producción de esta
actividad enzimática se recuperó alrededor de las 40 h del cultivo, en ningún caso se alcanzaron
los niveles del control (Figura 6C). Este comportamiento pudo deberse a que, con la adición de la
glucosa o el ácido galacturónico, la concentración de azúcares reductores presentes en el medio
se incrementó, y fue sólo hasta que esta disminuyó, alrededor de las 40 h (datos no mostrados),
que se pudo observar un incremento en la producción de las endopectinasas.
Finalmente, en lo que se refiere a la producción de pectin liasas, al parecer las condiciones
iniciales de operación utilizadas en estos cultivos provocaron un retraso en dicha actividad
enzimática, ya que esta comenzó a detectarse hasta las 20 h después de la transferencia de

59
micelio. En los cultivos en los que sucedió la adición de glucosa o ácido galacturónico, la
producción de pectin liasas se retrasó 20 h más, comenzando a observarse hasta las 38 h de
cultivo, en una proporción pequeña con respecto a la del experimento control (Figura 6D).
Para probar algunas de las hipótesis generadas, referidas al posible efecto represor que ejerce la
glucosa sobre las pectinasas, así como la probable reversibilidad de dicho efecto represor, se
propuso el diseño de un cultivo alimentado. El objetivo principal de este era mantener una
condición fisiológica aproximadamente estable en el cultivo, y cambiar las fuentes de carbono
disponibles en el medio, para verificar las respuestas del hongo ante tales condiciones de
operación.
6 40
A B
35
5
30
Crecimiento (mg mL-1 )
Exopectinasas (U mL )
-1
4
25
3 20
15
2
10
1
5
0 0
3.5 2.5
C D
3
2
Endopectinasas (U mL-1)
Pectin liasas (U mL-1)
2.5
1.5
2
1.5
1
1
0.5
0.5
0 0
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
Figura 6. Experimento de transferencia de micelio, desarrollado a nivel matraz con pectina al 1% (p/v) como fuente
de carbono. Crecimiento (A), producción de exopectinasas (B), endopectinasas (C) y pectin liasas (D), del
experimento control (sin adición ), con adición (indicada por la flecha) de ácido galacturónico () o glucosa ()
al cabo de las 12 h después de la transferencia.

60
5.2.3 Represión catabólica de las pectinasas de A flavipes FP-500 -
efecto de la glucosa.
Mediante el desarrollo de un cultivo alimentado, suplementando la alimentación en un flujo
constante es posible generar una condición fisiológica estable, mediante la cual se logre la
condición de que µ→ D. La metodología utilizada para generar dicha condición, así como para el
desarrollo de este bioproceso, se indica en la sección 4.4.3 (de Materiales y Métodos).
Para el desarrollo de este cultivo alimentado, se partió del establecimiento de un cultivo en lote,
con pectina como única fuente de carbono, en una concentración de 10 g L-1. Cuando existió una
concentración menor de 1 g L-1 de pectina en el reactor, este comenzó a alimentarse con una
solución de pectina, en una concentración inicial de 6.92 g L-1 (ver fórmula para cálculo de la
concentración inicial en la sección 4.4.4). La alimentación con pectina duró 24 h, retirando
muestras periódicas del reactor cada 4 h. Al cabo de las primeras 24 h de alimentación, se cambió
la fuente de carbono en el flujo de alimentación, suplementando glucosa también en una
concentración de 6.92 g L-1, misma que se alimentó durante las siguientes 24 h. De igual manera,
se realizaron muestreos periódicos durante esta fase de alimentación. Por último, el sustrato
alimentado se sustituyó nuevamente por pectina, en una concentración de 6.92 g L-1. Después de
que se concluyó la alimentación (lo que se indica con la flecha en la Figura 7), se permitió que el
cultivo continuara desarrollándose durante 6 h más, y se tomaron dos muestras ante esas
condiciones, antes de dar por concluido el experimento.
Los cultivos se desarrollaron en condiciones fisiológicas aproximadamente constantes a lo largo
del régimen de alimentación bajo el cual se desarrollaron (Figura 7).

61
3,5
Biomasa, Pectina, Grupos reductores (g L )

-1
3 I II III
2,5
1,5
0,5
0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Figura 7. Evolución del crecimiento (), concentración de pectina () y concentración de azúcares reductores ()
en el cultivo alimentado desarrollado sobre pectina, sometido a alimentación con pectina (Etapa I), glucosa (Etapa II)
y pectina (Etapa III) en un pH constante de 3.5. La flecha indica el momento en que cesó la alimentación.
Como es posible observar, la concentración de biomasa se mantuvo prácticamente constante en
las etapas I y II, en un valor entre 1.5 y 2 g L-1, y se incrementó en la Etapa III, donde se
alcanzaron valores de casi 3 g L-1. Sin embargo al final de esta etapa la concentración de biomasa
volvió a decrecer, llegando a los valores encontrados en un inicio (Figura 7). En lo que respecta a
la concentración de pectina, esta se mantuvo constante a lo largo del régimen de alimentación, en
un valor cercano a los 0.5 g L-1, mientras que la concentración de azúcares reductores fue
también aproximadamente constante alrededor de los 0.3 g L-1 (Figura 7).
Otra manera de demostrar que mediante esta metodología se establece una condición en la que
µ → D durante el régimen de alimentación, es aplicando las ecuaciones de la sección 4.4.4, y
mostrando los resultados en una gráfica donde se pueda observar la variación del valor de ambos
parámetros en el tiempo (Figura 8). En este caso, hacia el final del régimen de alimentación, se
cumplió la condición buscada, en la cual el cultivo tendió a condiciones de fisiología estable.

62
0.06
0.05
I II III
µ (h ), D (h )
-1 0.04
0.03
-1
0.02
0.01
0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Figura 8. Velocidad específica de crecimiento µ () y factor de dilución D (), calculadas a partir de los datos
experimentales de biomasa obtenidos durante el régimen de alimentación en el cultivo alimentado. Las líneas
constantes muestran los valores de µ y D, calculados a partir de los datos de biomasa predichos por el modelo
descrito con los parámetros cinéticos del cultivo en lote que sirvió como base para el establecimiento del cultivo
alimentado. La flecha indica el momento en que cesó la alimentación.
En lo que respecta a la producción de exopectinasas, durante la Etapa I del régimen de
alimentación esta actividad pectinolítica se mantuvo prácticamente constante, alrededor del valor
obtenido con el cultivo en lote, con una actividad específica de ∼ 15 U g de biomasa-1 (Figura 9
A). Así, esta primera etapa de alimentación sirvió para establecer las condiciones fisiológicas
requeridas para estudiar el efecto de las fuentes de carbono sobre la producción de las pectinasas
de A. flavipes FP-500. En lo que se refiere a la etapa II, en la que se alimentó glucosa, durante las
primeras 12 h de alimentación la actividad exopectinolítica se mantuvo prácticamente constante,
aunque después de ese tiempo y hasta finalizar esa etapa de alimentación, dicha actividad
decreció hasta llegar a ∼ 12 U g de biomasa-1. Esta tendencia de disminución de la actividad
continuó observándose durante las primeras 8 horas de la Etapa III, cuando se volvió a alimentar
pectina. Sin embargo, pasando ese tiempo, la actividad se recuperó, y al finalizar el cultivo, esta
fue aproximadamente igual a 18 U g de biomasa-1 (Figura 9A).

63
La producción de endopectinasas se mantuvo prácticamente constante alrededor de 2.5 U g de
biomasa-1 durante la etapa I y la mitad de la etapa II (Figura 9B). En ese punto se observó un
breve incremento en la actividad hasta llegar a ∼ 3 ± 0.3 U g de biomasa-1 hacia el final de la
Etapa II. Posteriormente la actividad endopectinolítica disminuyó hasta prácticamente 1 U g de
biomasa-1, comportamiento que se observó durante las primeras 8 h de la etapa III. Al cabo de ese
tiempo, la actividad se volvió a incrementar hasta el valor de 2.5 U g de biomasa-1, observado al
principio del régimen de alimentación.
Si se considera que existe un momento en el que hay una mezcla de las dos fuentes de carbono
que han sido alimentadas al reactor, es muy probable que ambas sean utilizables por el
microorganismo. No es posible conocer la velocidad de consumo de cada una de ellas, aunque la
que se alimentó primero seguirá consumiéndose o bien comenzará a diluirse por efecto de la
alimentación de la segunda, por lo que en algún momento, la concentración de la fuente de
carbono será considerablemente mayor, y ejercerá el mayor efecto sobre el microorganismo. Los
resultados obtenidos en estos experimentos sugieren que este fenómeno sucede alrededor de las
14 h después del cambio en el sustrato de alimentación. Entonces, la clara disminución en la
producción de exo y endopectinasas, que se observa hacia el final de la etapa II y continúa
durante las primeras 12 h de la etapa III, correspondería al efecto de la glucosa sobre estas
actividades pectinolíticas. Con lo anterior, se refuerza la idea del efecto represor de la glucosa
sobre ambas pectinasas, mismo que ya se sugirió a partir de los datos obtenidos en el experimento
de transferencia. Adicionalmente, el considerable incremento de la producción de exo y
endopectinasas, observado hacia finales de la etapa III, demostró la inducción de estas por la
pectina y reforzó la sugerencia de que la represión catabólica causada por la glucosa sobre la
producción de exopectinasas es transitoria.

64
25
A
Exopectinasas (U ge de biomasa-1)
I II III
20
15
10
3.5 I III
B
II
Endopectinasas ( g de biomasa-1)
2.5
1.5
0.5
14
I III
C
12 II
10
0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Figura 9. Producción específica de exopectinasas (A), endopectinasas (B) y pectin liasas (C) producidas por A.
flavipes FP-500 en un cultivo en lote alimentado. Se muestran las producciones obtenidas a partir del comienzo del
régimen de alimentación, para el cual se utilizó pectina (Etapa I), glucosa (Etapa II) y pectina (Etapa III) en una
concentración de 6.92 g L-1, las cuales se alimentaron en un flujo de 0.042 L h-1 durante 24 h cada una. La flecha
indica el momento en que cesó la alimentación.

65
En este caso fue más sencillo observar esa reversibilidad en la represión de las endopectinasas, lo
que no se había observado en el experimento de transferencia.
El comportamiento de la producción de pectin liasas en el cultivo alimentado fue errático y no
permitió obtener conclusiones con certeza. Sin embargo, pareciera no haber influencia de los
azúcares reductores presentes en el medio sobre la producción de esta actividad enzimática. Se
han reportado producciones de pectin liasas que no están sujetas a represión catabólica para
hongos patógenos de plantas y frutos cítricos, como Uromyces viciae (Deising et al, 1995), que
concuerdan con los resultados observados para A. flavipes FP-500.
Para redondear los resultados obtenidos referentes a la represión provocada por la glucosa, la
reversibilidad de la misma y el efecto inductor de la pectina sobre las pectinasas producidas por
A. flavipes FP-500, se desarrolló un último cultivo en lote alimentado. En este se utilizaron los
mismos criterios que para el experimento descrito anteriormente, pero modificando la alternancia
en los sustratos de alimentación. Así, las condiciones óptimas para comenzar la alimentación se
establecieron a partir de un cultivo en lote desarrollado en glucosa en un pH constante de 3.5. En
la Etapa I se utilizó glucosa, luego se cambió a pectina para la Etapa II, y por último se volvió a
alimentar glucosa, en la Etapa III. Los parámetros cinéticos calculados a partir del cultivo en lote
tomado como base, permitieron conocer el tiempo en el que se alcanzarían las condiciones
deseadas para iniciar el régimen de alimentación y calcular la concentración de sustrato en la
alimentación (S0 = 4.193 g L-1).
Las concentraciones de biomasa y sustrato se mantuvieron relativamente constantes a lo largo de
todo el régimen de alimentación, por lo que la producción de las pectinasas se reporta con base en
la concentración de biomasa observada en cada tiempo. Las actividades específicas de
exopectinasas, endopectinasas y pectin liasas obtenidas en este cultivo en lote alimentado se
muestran en la Figura 10.

66
Como se puede observar, la producción de exopectinasas fue baja en el cultivo en lote, ya que al
comenzar la alimentación esta actividad era como máximo de 1.5 U g de biomasa-1. Este valor se
incrementó sólo 2 U g de biomasa-1 durante la Etapa I con la alimentación de glucosa. Sin
embargo, podría considerarse que el valor de esta actividad pectinolítica se mantuvo
prácticamente constante entre 2 y 4 U g de biomasa-1 durante toda la Etapa I y la mitad de la
Etapa II (Figura 10A). La respuesta observada durante la fase de alimentación con glucosa podría
corresponder a las isoformas constitutivas de las exopectinasas de A. flavipes FP-500. Cuando el
sustrato de alimentación fue pectina, durante la Etapa II, la actividad exopectinolítica se
incrementó considerablemente hasta alcanzar las 14 U g de biomasa-1, en donde se mantuvo hasta
el final del cultivo, aún cuando el último sustrato alimentado fue la glucosa (Figura 10A). Lo
anterior podría indicar la inducción de las isoformas inducibles de las exopectinasas por acción
de la pectina adicionada. Por otra parte, el que no se observe una disminución en la actividad
exopectinolítica debido a la adición de glucosa en la Etapa III, podría deberse a que en este caso,
la concentración de glucosa es baja, y no provoca el efecto represor. Esto es congruente con lo
observado para las poligalacturonasas de A. terreus, que no parecieron estar sujetas a represión
cuando había concentraciones bajas de glucosa en el medio (Runco et al, 2000).

67
20
18 I II III A
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0.9
I II III B
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
7
I II III C
0
0 20 40 60 80 100
Tiempo (h)
Figura 10. Producción específica de exopectinasas (A), endopectinasas (B) y pectin liasas (C) producidas por A.
flavipes FP-500 en un cultivo en lote alimentado. Se muestran las producciones obtenidas a partir del inicio del
régimen de alimentación, para el cual se utilizó pectina (Etapa I), glucosa (Etapa II) y pectina (Etapa III) en una
concentración de 6.92 g L-1, las cuales se alimentaron en un flujo de 0.042 L h-1 durante 24 h cada una. La flecha
indica el momento en que cesó la alimentación.

68
A la vez, la actividad de endopectinasas no se observó desde el inicio de la fermentación, lo que
indica que esta actividad no se produjo en el cultivo en lote desarrollado en glucosa. Tampoco se
observó la producción de esta actividad durante toda la Etapa I y hasta la mitad de la Etapa II,
que muestran el efecto de la alimentación de glucosa. Lo anterior, fortalece la hipótesis del efecto
represor de la glucosa sobre la producción de las endopectinasas de A. flavipes FP-500. Además,
con la alimentación de pectina la actividad endopectinolítica comenzó a detectarse hasta obtener
casi 1 U g de biomasa-1 hacia el final de la etapa II, lo que comprueba el efecto inductor de esta
fuente de carbono sobre la actividad endopectinolítica de A. flavipes FP-500. Finalmente, cuando
se volvió a alimentar glucosa, esta actividad disminuyó ligeramente hasta ∼ 0.5 U g de biomasa-1,
y posteriormente se mantuvo constante durante toda la Etapa III y hasta el final de la
alimentación (Figura 10B). Al parecer, la producción de las endopectinasas es más sensible a la
concentración de glucosa presente en el medio.
Por último, en este experimento la producción de las pectin liasas nuevamente fue muy variable,
por lo que no se pudieron obtener conclusiones adecuadas respecto al efecto de la glucosa o la
pectina sobre esta actividad pectinolítica.
5.2.4 Conclusiones
Las exopectinasas constitutivas de Aspergillus flavipes FP-500 son las primeras pectinasas
producidas en el medio de cultivo, mientras que la producción de endopectinasas, sucede horas
después, al parecer cuando las exopectinasas ejercieron su función sobre el sustrato. La
producción de ambas enzimas está influenciada negativamente por concentraciones elevadas (> 2
g L-1) de azúcares reductores, como el ácido galacturónico y la glucosa. Los resultados indican
que las pectinasas de A. flavipes FP-500 están sujetas a represión catabólica, aunque esta es
transitoria.

69
Por otra parte, la producción de pectin liasas no tiene una influencia importante de un grupo
reductor o de la concentración de este en el medio de cultivo. Los resultados obtenidos en esta
etapa experimental indicaron que es el pH del medio el factor que determina la producción de
esta actividad pectinolítica, así como su aparición en el cultivo durante la degradación de pectina.
En el siguiente capítulo se discutirá detalladamente el efecto del pH del medio sobre la
producción de las pectinasas de A. flavipes FP-500.
Dentro de las principales aportaciones de esta etapa experimental se cuentan la propuesta de un
cultivo alimentado, en el que se obtuvieron condiciones fisiológicas aproximadamente estables,
mediante las cuales fue posible obtener conclusiones específicas respecto a la regulación de las
pectinasas de A. flavipes FP-500 por la fuente de carbono; así como la propuesta de la relación
existente entre la producción de estas enzimas a lo largo del cultivo.

70
Modulación por pH de las pectinasas producidas por Aspergillus flavipes FP-500
5.3 Modulación por pH de las pectinasas producidas por
Aspergillus flavipes FP-500
Los microorganismos saprófitos colonizan las plantas y los frutos cítricos debido a su
característica producción de pectinasas. La mayoría de estos microorganismos tiene la capacidad
para crecer en medios con una amplia variedad de valores de pH, ya que al parecer poseen un
sistema regulatorio que asegura que las enzimas y otros productos sólo se generen a niveles de
pH en los cuales sus funciones serán eficientes (Prusky y Yakobi, 2003). Así, el pH del medio es
un parámetro de suma importancia dentro del estudio de la producción de pectinasas, dado que
este puede regular la expresión de dichas enzimas. Poco se sabe respecto a la regulación por el
pH de las poligalacturonasas producidas por los microorganismos del género Aspergillus (de
Vries y Visser, 2001). Sin embargo, se ha reportado que A. nidulans puede crecer en una amplia
variedad de valores de pH, que van desde 2.5 hasta 9.0, lo que a su vez requiere de la secreción
de enzimas con diferentes características, en dependencia de los valores de pH que se encuentren
en el medio, de manera tal que el pH óptimo de éstas coincida con el de su ambiente (Manteau et
al, 2003).
En los resultados discutidos hasta este momento, algunas vertientes han conducido al hecho de
que en A. flavipes FP-500 el pH es un parámetro de suma importancia durante la producción de
las poligalaturonasas, específicamente en lo que respecta a la producción de las pectin liasas.
El objetivo de este apartado es revisar el efecto que ejerce el pH del medio sobre la producción y
actividad de las pectinasas producidas por A. flavipes FP-500.

71
5.3.1 Relación de la evolución del pH con la producción de pectinasas.
Para verificar el posible efecto del pH sobre la producción de las pectinasas de A. flavipes FP-
500, se consideraron, en primera instancia, los cultivos en lote desarrollados a nivel matraz, en
los que se utilizaron diferentes valores de pH inicial. Para determinar dichos valores, se tomó en
cuenta el pH de muchos de los tejidos que pueden servir como huéspedes para este hongo, y que
se extienden desde un nivel ácido (pH 3.32) hasta alguno cercano a la neutralidad (pH 6.30)
(Manteau et al, 2003). Uno de los objetivos de esta etapa experimental era observar el
comportamiento del microorganismo, respecto a la producción de las pectinasas, ante diversos
valores de pH, y obtener una correlación de dicha producción con las condiciones de pH inicial
probadas.
Los resultados obtenidos a partir de los cultivos desarrollados sobre diferentes fuentes de
carbono, para los que se utilizaron 3 valores diferentes de pH inicial, mostraron que la mayor
producción de exopectinasas y endopectinasas se obtuvo, en su mayoría, en los medios con los
valores más ácidos (Tablas 2 y 3), mientras que la generación de pectin liasas no presentó un
patrón específico respecto al pH inicial del medio. Para esta actividad pectinolítica, las mayores
producciones se obtuvieron en diferentes valores de pH inicial, dependiendo de la fuente de
carbono utilizada (Tabla 4). El comportamiento observado respecto a la producción de pectinasas
de A. flavipes FP-500 en los distintos valores de pH inicial, sugiere que existe un efecto de este
parámetro sobre dicha producción.
Para estudiar el efecto del pH sobre la producción de pectinasas, se llevaron a cabo cultivos en
lote a nivel biorreactor, utilizando diferentes condiciones de pH. Para establecer estos cultivos, se
tomaron como base los resultados obtenidos en los cultivos en lote desarrollados a nivel matraz,
mismos que se describieron en la sección 5.1, y considerando que los mejores inductores de la
producción de pectinasas por A. flavipes FP-500 fueron la pectina y el ácido galacturónico, estos

72
cultivos se desarrollaron con estas fuentes de carbono a dos condiciones de pH inicial: 3.5 y 5.0.
En estos cultivos, se permitió la libre evolución del pH, y se registró el valor de este parámetro a
lo largo de los mismos. Cuando se utilizó como fuente de carbono pectina, para ambos valores de
pH inicial del medio (3.5 y 5.0), el microorganismo creció con diferentes velocidades específicas
(µ = 0.1367 ± 0.01 y 0.1703 ± 0.008 h-1, respectivamente). Debido a lo anterior, para eliminar
cualquier efecto que las diferencias observadas en los valores de µ pudieran provocar en la
interpretación de los resultados, los resultados presentados en esta sección se reportan como las
actividades específicas obtenidas en cada punto muestral.
Durante las primeras horas de cultivo, el pH en el medio permaneció relativamente constante,
luego disminuyó hasta alcanzar su valor más bajo y finalmente se incrementó hacia las últimas
horas del cultivo (Figura 11 A). En lo que respecta a la producción de exopectinasas, en
cualquiera de los valores de pH inicial utilizados se presentaron dos etapas donde se obtuvo un
máximo de actividad específica. La primera de ellas se observó entre las 0 y las 36 h de cultivo,
en donde el máximo de la actividad específica se alcanzó a las ∼ 20 h en los medios con pH
inicial de 3.5, y a las ∼ 10 h cuando el cultivo inició en un pH de 5.0 (Figura 11 B). Al cabo de
las 36 h, después de la disminución que marcó el fin de la primera etapa, la producción específica
de las exopectinasas se volvió a incrementar, hasta alcanzar un nuevo máximo al final del cultivo.
La delimitación de ambas etapas de producción de exopectinasas se correlaciona con la evolución
del pH en el medio, ya que la disminución en el pH coincidió con la actividad más baja de esta
etapa, mientras que el incremento del mismo hacia el final del cultivo fue coincidente con en
aumento de la actividad exopectinolítica que determinó la segunda etapa de este cultivo (Figura
11 B).
La evolución en la producción de exopectinasas sugiere, en primera instancia, la existencia de al
menos dos grupos de pectinasas del tipo exo, cuya producción pudiera estar modulada por

73
condiciones distintas de pH. Comportamientos similares se han reportado para las
poligalacturonasas de otros hongos patógenos de plantas, como Botrytis cinerea, que produjo tres
isoformas (pI de 4.9, 7.6 y 7.8) en el medio de pH 3, y cuatro (pI de 7.1, 7.4, 7.6 y 7.8) en los
medios con pH de 7.0. En ambos casos el pH del medio evolucionó libremente a lo largo del
cultivo (Manteu et al, 2003). Por su parte, para diferentes especies de Aspergillus, se ha reportado
la secreción de exopectinasas con distintos valores de punto isoeléctrico y pH óptimo, que
sugieren la expresión de isoformas con esta actividad en dependencia con el pH del medio (de
Vries y Visser, 2001).
La acidificación del medio podría deberse a la producción de ácidos orgánicos, como resultado
del metabolismo básico del hongo. El ácido oxálico se ha reportado como uno de los principales
factores involucrados en la patogenicidad de los microorganismos invasores de las plantas y los
frutos cítricos, al proveer a las poligalacturonasas un pH adecuado y potencializar su acción,
mediante la quelación de los iones de calcio presentes en la estructura de la pectina (Manteu et al,
2003; Favaron et al, 2004). En el hongo Sclerotinia sclerotirum, la secreción de ácido oxálico es
paralela a la expresión de las isoformas ácidas de las poligalacturonasas, y una de las funciones
de éste es disminuir el pH del medio hasta el valor óptimo para la actividad de las
poligalacturonasas del tipo exo (Favaron et al, 2004). En Aspergillus, la función de la producción
de ácido oxálico aún no es del todo clara, aunque se ha correlacionado con la movilización de los
sustratos a partir de los polisacáridos de la pared celular de las plantas, debido a su capacidad
quelante del calcio (Ruijter et al, 1999).
En lo que se refiere a la producción de endopectinasas, esta sólo se observó en el medio que
inició en pH de 3.5, donde el inicio de la producción coincidió con el valor más bajo de pH en el
mismo (Figura 11 C).

74
6
A
5
pH
3
25
B
20
15
10
1.4
1.2
C
1
0.8
0.6
0.4
0.2
25
D
20
15
10
0
0 20 40 60 80
Tiempo (h)
Figura 11. Evolución del pH (A, figuras sin relleno), la producción de exopectinasas (B), endopectinasas (C) y
pectin liasas (D) en cultivos en lote de A. flavipes FP-550 desarrollados a nivel biorreactor con pectina al 1% (p/v)
como única fuente de carbono, con valores de pH inicial de 3.5 () y 5.0 ().

75
En la sección 5.2.1 se sugirió que la producción de la actividad endopectinolítica podría inducirse
por los productos de la acción previa de las exopectinasas. Sin embargo, a pesar de que la
producción de exopectinasas en los dos valores de pH inicial fue muy semejante (Figura 11B), la
de endopectinasas fue considerablemente distinta (Figura 11C). La diferencia en la producción de
las pectinasas del tipo endo pudiera deberse a la concentración máxima de azúcares reductores
producidos en cada caso (1.9 y 2.7 g L-1, respectivamente). Por un lado, una concentración
elevada de estos (mayor que 2.5 g L-1) podría tener un efecto sobre la producción de la actividad
endopectinolítica, como se reportó para las pectinasas de A. niger (Panda et al, 2004). Como la
producción de exopectinasas en ambos cultivos fue semejante, es probable que existan en cada
caso diferentes isoformas con esta actividad pectinolítica, que sean las que determinan la cantidad
y tipo de azúcares reductores producidos. A su vez, esto tendría un efecto sobre la producción de
endopectinasas, como ya se había propuesto. Por otro lado, es posible también que la producción
de endopectinasas esté influenciada únicamente por el pH inicial del medio. Para discernir entre
el efecto ejercido por cada uno de estos dos factores, fue necesario el desarrollo de experimentos
adicionales, que se discuten en la sección 5.3.2.
La producción de pectin liasas mostró diferencias respecto al pH inicial del cultivo, siendo
considerablemente mayor la obtenida en los medios que iniciaron en un pH de 5.0 (Figura 11 D).
Como sucedió con las exopectinasas, durante las primeras 24 h de cultivo se observó una primera
etapa de producción de esta actividad pectinolítica, cuyo valor máximo se obtuvo alrededor de las
20 h en ambos casos (Figura 11 D), durante las que sucedió una disminución en el pH del medio
(Figura 11 A). Cuando el pH comenzó a aumentar, comenzó la segunda etapa de producción
donde se observó también un incremento en la producción de pectin liasas, que fue más evidente
en el medio de pH inicial igual a 5.0 (Figura 11 D). El comportamiento anterior refuerza la
hipótesis que sugiere la regulación en la expresión de pectin liasas por valores de pH tendientes a

76
la neutralidad, y que concuerdan con lo reportado ampliamente para la producción de pectin
liasas por hongos filamentosos (Peñalva y Arst, 2002). Los dos máximos de actividad observados
en cada caso sugieren además la posibilidad de que el hongo produzca isoformas de pectin liasas
con distintos valores de pI, que se estarían expresando en el medio en dependencia con el pH del
mismo. Esto no sería extraño, si se considera que para A. niger se han reportado al menos cuatro
pectin liasas diferentes, cuyos puntos isoeléctricos van de 3.65 hasta 7.7 (de Vries y Visser,
2001).
Con base en los resultados descritos anteriormente, referentes a la relación de la evolución de los
grupos reductores en el cultivo con la producción de las endo y exopectinasas, la siguiente
corrida experimental se llevó a cabo utilizando ácido galacturónico como única fuente de
carbono. De esta manera, se podría determinar el efecto real de uno de los principales productos
de degradación de la pectina sobre la actividad de exopectinasas, así como comprobar las
hipótesis referentes al efecto indirecto que tiene el pH sobre la producción de endopectinasas,
hecho planteado en párrafos anteriores.
Para los cultivos en lote desarrollados con ácido galacturónico se utilizaron también dos valores
de pH inicial (3.5 y 5.0). En este caso, se observó un incremento del pH a medida que el cultivo
avanzaba (Figura 12 A). En cualquiera de los dos valores de pH inicial utilizado, el valor final del
mismo fue ∼ 6.5. La alcalinización del medio en cultivos con ácido galacturónico es un hecho
pocas veces reportado durante la producción de pectinasas por hongos del género Aspergillus,
aunque sí se ha observado en otros hongos patógenos de plantas como Botrytis cinerea (Wuben et
al, 2003) y Sclerotinia sclerotiorum (Cotton et al, 2003). A pesar de que el ácido galaturónico es
un inductor de la actividad pectinolítica en estos hongos, en altas concentraciones podría
considerarse una fuente de carbono represora (Runco et al, 2001; Panda et al, 2004). Por lo
anterior, durante su metabolismo se favorecería la utilización del esqueleto de los aminoácidos

77
que conforman a las proteínas producidas en las primeras horas de cultivo, con la subsecuente
liberación de amonio al medio, lo que provocaría la alcalinización del mismo (Peñalva y Arst,
2002). Adicionalmente, el consumo del ácido galacturónico a lo largo del cultivo podría también
ser la causa de la alcalinización del medio observada en estos casos. Como el ácido galacturónico
es un inductor de las pectinasas de A. flavipes FP-500, se hace necesario verificar cómo es la
producción de las pectinasas en esta fuente de carbono, considerando que el pH tiene un
comportamiento distinto al observado para cualquiera de las otras fuentes de carbono utilizadas.
Como sucedió con la pectina, aunque el hongo creció a una velocidad semejante en estos cultivos
(µ = 0.12 y 0.14 h-1, respectivamente), se reportarán las producciones específicas de pectinasas,
para facilitar la comparación e interpretación de los resultados.
La generación de exopectinasas volvió a mostrar dos etapas de producción máxima. En los
cultivos que iniciaron en un pH de 3.5, la primera fase de producción se observó entre las 0 y las
38 h de cultivo, mientras que en los de pH inicial de 5.0 ésta sucedió en las primeras 36 h (Figura
12 B). En ambos casos, el valor máximo de esta primera etapa se obtuvo antes de que el pH del
medio comenzara a incrementarse, mientras que la segunda etapa de la producción se observó
durante el incremento del pH en el medio. En los medios que iniciaron en un pH de 3.5 pareció
suceder una tercera etapa de producción máxima entre las 36 y las 54 h (Figura 12 B). Estos
resultados refuerzan la sugerencia de que A. flavipes FP-500 produce varias isoformas con
actividad exopectinolítica y sugiere además que la expresión de cada una está regulada por
distintos valores de pH.

78
7 A
6
pH
3
0
70
B
60
50
40
30
20
10
1
0.9 C
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
25
D
20
15
10
0
0 20 40 60 80 100
Tiempo (h)
Figura 12. Evolución del pH (A), la producción de exopectinasas (B), endopectinasas (C) y pectin liasas (D) en
cultivos en lote de A. flavipes FP-500 desarrollados a nivel biorreactor con ácido galacturónico al 1% (p/v) como
única fuente de carbono, con valores de pH inicial: 3.5 () y 5.0 ().

79
Por otro lado, la elevada producción específica de exopectinasas alcanzada con esta fuente de
carbono, en comparación con la obtenida en pectina (Figura 11 B), confirmó el papel de esta
fuente de carbono como inductor de dicha actividad pectinolítica.
La producción de endopectinasas se observó hasta después de las primeras 24 h de cultivo
(Figura 12 C), cuando la concentración de ácido galacturónico había disminuido casi a la mitad
de su valor inicial (datos no mostrados). La actividad endopectinolítica obtenida en el cultivo que
inició en pH de 3.5 fue menor que la alcanzada en pectina en el mismo valor de pH inicial en un
30% aproximadamente, y disminuyó considerablemente hacia el final del cultivo, cuando el pH
se había incrementado hasta ser mayor a 5.0 (Figura 12 A). Por otra parte, en los medios que
iniciaron en un pH de 5.0, la actividad endopectinolítica se observó en dos etapas. La primera de
ellas sucedió cuando el pH aún estaba por debajo de 6.0, mientras que la segunda fase se observó
hacia el final del cultivo, cuando el pH en el medio era cercano a la neutralidad (Figura 12 C).
Los resultados obtenidos sugieren que la actividad de endopectinasas está regulada tanto por el
ácido galacturónico como por el pH ácido en el medio, y que como sucede con otros hongos
saprófitos, como Botrytis cinerea (Wubben et al, 2003), A. flavipes FP-500 codifica para
diferentes isoformas de endopectinasas, que se sintetizan en dependencia del pH del medio. De
hecho, en el grupo de trabajo, los electroforegramas y zimogramas desarrollados a muestras
obtenidas ante distintas condiciones de producción han reportado diferencias que apoyarían esta
hipótesis. Sin embargo, sería necesario hacer un análisis electroforético y zimográfico muy
específico de los cultivos aquí reportados, para comprobar dicha hipótesis.
La producción de pectin liasas no se observó en los medios que iniciaron en el pH de 3.5 durante
las primeras 60 h, y después esta fue muy baja (Figura 12 D). Sin embargo, la producción
obtenida en los medios con pH inicial de 5.0 fue semejante a la observada en pectina en las
mismas condiciones de cultivo (Figura 12 D). En este caso hubo también dos etapas de

80
producción máxima en la actividad de pectin liasas. La mayor producción se observó cuando el
pH en el medio era mayor que 5.0, es decir, durante la segunda fase del cultivo (Figura 12 D).
Este comportamiento confirma que la producción de pectin liasas sucede preferentemente en los
medios con valores de pH mayores a 5.0, y que este parámetro tiene la mayor influencia sobre la
producción de las pectin liasas de A. flavipes FP-500.
5.3.2 Efecto del pH sobre la producción de las pectinasas de A.
flavipes FP-500
Los resultados descritos en la sección anterior proporcionaron información referente a la relación
del pH con la producción de las distintas pectinasas de A. flavipes FP-500.
En primera instancia, se destacó la acidificación del medio en los cultivos desarrollados sobre
pectina. En este caso, se mencionó la posible producción de ácidos orgánicos, como el ácido
oxálico, que se encargarían de acidificar el medio y potenciar la producción de las exopectinasas.
En segundo lugar, en lo que respecta a la producción de endopectinasas, se comprobaron algunas
de las hipótesis generadas en la sección 5.2, referentes a la regulación de la producción de esta
actividad por la fuente de carbono, y se sugirió que el pH también podía ejercer cierta regulación
al respecto.
Por otro lado, a pesar de que la producción de pectin liasas pareció estar más influenciada por
valores de pH mayores a 5.0, los resultados sugirieron la producción de isoformas de estas
enzimas, expresadas a diferentes valores de pH.
Finalmente, se sugirió la posibilidad de que el hongo produzca isoenzimas de estas pectinasas
cuya expresión esté regulada por diferentes valores de pH en el medio.
Con base en lo anterior, en esta etapa experimental se llevaron a cabo cultivos en lote utilizando
pectina o ácido galacturónico, con dos condiciones de pH. En la primera de ellas el pH se

81
mantuvo constante en un valor de 3.5 para las dos fuentes de carbono. La segunda condición fue
distinta dependiendo de la fuente de carbono utilizada. En pectina, el pH inició en 3.5, y se dejó
evolucionar libremente, hasta que alcanzó su valor más bajo (∼36 h). A partir de entonces, el pH
se mantuvo constante en ese valor hasta el final del cultivo. Para el ácido galacturónico, la
evolución del pH se controló de manera tal que semejara las condiciones observadas en pectina.
En los cultivos donde el pH se mantuvo constante, la producción de la actividad de exopectinasas
se retrasó, comenzando a observarse hasta las 24 h del mismo en ambas fuentes de carbono
(Figura 13). En pectina, la máxima producción obtenida fue como máximo de 4 U g de biomasa-1
(Figura 13 A), mientras que en ácido galacturónico se obtuvo un máximo de ∼ 9.5 U g de
biomasa-1 (Figura 13 B). En este último caso, la producción de exopectinasas fue semejante a la
observada hacia el final del cultivo en lote desarrollado sobre ácido galacturónico con pH inicial
de 3.5 y libre evolución (Figura 12 B).
20 10
18 A B 9
Exopectinasas (U g de biomasa -1)

16 8
14 7
12 6
10 5
8 4
6 3
4 2
2 1
0 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100
Figura 13. Evolución de la producción de exopectinasas producidas en cultivos en lote desarrollados sobre pectina
(A) o ácido galacturónico (B). En la primera condición probada para estas fuentes de carbono, el pH se mantuvo
constante a lo largo de todo el cultivo en un valor de 3.5 (). Para la segunda condición, en pectina el pH se dejó
evolucionar libremente, y cuando este llegó a su valor más bajo (indicado por la flecha), se mantuvo constante hasta
el final del cultivo (), mientras que en ácido galacturónico el valor del pH se hizo variar de modo que su
comportamiento fuera semejante a la evolución observada en la pectina con pH inicial de 3.5 ().

82
El retraso observado en la producción de exopectinasas en los medios con pH constante (Figura
13 A) refuerza la idea de que la acidificación del medio es provocada por la generación de ácidos
orgánicos, que propiciarían las condiciones necesarias para la producción de estas pectinasas,
actuando ya sea sobre la estructura de la pectina para dejarla más accesible al ataque enzimático,
o bien estabilizando el sitio activo de las enzimas, para mejorar la afinidad de éstas por su
sustrato (Favaron et al, 2004). Por otra parte, a pesar de que el pH del medio se controló en
valores ácidos luego de las primeras 36 h de cultivo en pectina, la producción de exopectinasas
no fue tan alta como la observada en los cultivos en los que se permitió la libre evolución del pH
(Figura 13A), probablemente porque en este caso no se expresaron las exopectinasas inducidas
por los valores de pH menos ácidos. En ácido galacturónico, cuando la evolución del pH se
asemejó a la observada en pectina, la producción exopectinolítica obtenida fue muy baja, y sólo
se observó hacia las 70 h de cultivo (Figura 13 B). Lo anterior sugiere que con la asimilación del
ácido galacturónico se generan compuestos que provocan el incremento del pH del cultivo.
En lo que se refiere a la producción de endopectinasas, en los cultivos donde se mantuvo el pH
constante en valores de 3.5, en pectina la producción endopectinolítica obtenida fue muy baja
(Figura 14 A), mientras que en ácido galacturónico ésta fue incluso mayor a la obtenida en este
mismo sustrato en los cultivos con pH inicial de 3.5 y libre evolución del mismo (Figura 14 B).
La nula producción de endopectinasas observada en pectina, estaría ligada a la baja producción
de exopectinasas obtenida en este caso. Por otro lado, cuando el pH se mantuvo en valores
ácidos, a partir de una evolución del pH inicial, la actividad de endopectinasas se incrementó casi
al doble de la observada en el experimento control (Figura 14 A). Al parecer, si bien la presencia
de grupos reductores induce la producción de esta actividad pectinolítica, el mantener el cultivo
en valores ácidos induce una mayor proporción de estas pectinasas. En ácido galacturónico,
cuando la evolución del pH semejó la observada en pectina, sólo se obtuvo un máximo de

83
actividad endopectinolítica al cabo de las 70 h de producción (Figura 14 B), que pareciera ser una
endopectinasa inducida por valores ácidos de pH, y cuya expresión pudiera ser independiente de
la regulación por ácido galacturónico.
2.5 1.2
A B
Endopectinasas (U g de biomasa -1)
1
2
0.8
1.5
0.6
1
0.4
0.5 0.2
0 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100
Figura 14. Evolución de la producción de endopectinasas producidas en cultivos en lote desarrollados sobre pectina
La producción de pectin liasas se afectó severamente afectada por niveles ácidos de pH. Así, en
los experimentos que se mantuvieron en un pH constante de 3.5, esta actividad comenzó a
observarse hasta casi las 30 de producción en pectina (Figura 15 A), mientras que en ácido
galacturónico esta producción se observó hasta las 40 h de cultivo (Figura 15 B). En ambos casos
la producción de pectin liasas fue muy baja en comparación con la obtenida en los cultivos en
lote con libre evolución del pH. Lo mismo sucedió cuando en pectina el pH se mantuvo en su
valor mínimo hasta el final del cultivo (Figura 15 A), o cuando el pH del cultivo desarrollado
sobre ácido galacturónico se asemejó al de la pectina (Figura 15 B). Al parecer, las bajas
producciones de pectin liasas alcanzadas en las condiciones más ácidas son expresadas por genes

84
regulados por valores de pH ácidos. Aunque no se sabe si A flavipes FP-500 produce diferentes
isoformas de pectin liasas reguladas a distintos valores de pH, hay reportes de pectin liasas con
diversos puntos isoeléctricos para otras especies de Aspergillus, como A. niger (de Vries y Visser,
2001), lo que en principio podría apoyar esta hipótesis.
7 1.8
A B 1.6
6

Pectin liasas (U g de biomasa -1)
1.4
5
1.2
4 1
3 0.8
0.6
2
0.4
1 0.2
0 0
0 20 40 60 80 0 20 40 60 80 100
Figura 15. Evolución de la producción de endopectinasas producidas en cultivos en lote desarrollados sobre pectina
También, pudiera suceder que la producción de las pectin liasas observadas en la segunda etapa
del cultivo sea independiente del efecto del pH del medio, y estar más bien reguladas por otras
condiciones encontradas en estos cultivos, o bien ser expresadas a etapas tardías de los mismos.
Si cualquiera de estas suposiciones fuera cierta, entonces tal vez haya una mayor producción de
pectin liasas en el medio ante estas condiciones, pero probablemente el pH ácido generado para el
medio esté afectando la estabilidad de las pectin liasas ya producidas.

85
5.3.3 Verificación de la estabilidad de las pectin liasas a diferentes
valores de pH
Para verificar la última hipótesis desarrollada en la sección anterior, respecto a la estabilidad de
las pectin liasas en condiciones ácidas de pH, se produjo un extracto pectinolítico a partir de un
cultivo de A. flavipes FP-500, utilizando pectina al 1% como única fuente de carbono y un pH
inicial de 3.5, mismo que se dejó evolucionar libremente a lo largo del cultivo. Después de
recuperar el filtrado enzimático con actividad de pectin liasas, este se incubó a diferentes valores
de pH utilizando para ello soluciones reguladoras de acetatos (para los valores de pH de 2 a 6), y
de Tris-HCl (para el pH de 8), durante 24 h, retirando muestras cada 8 h, para verificar dicha
estabilidad. A la muestras así obtenidas se les cuantificó la actividad de pectin liasas, mediante la
técnica analítica descrita en la sección de materiales y métodos.
Después de la incubación del filtrado enzimático con soluciones reguladoras de distinto pH, se
cuantificaron diferentes valores para la actividad de pectin liasas del filtrado enzimático, respecto
al valor del pH utilizado en cada caso. En los pH de 2 y 4, el filtrado pectinolítico mostró
estabilidad en la actividad de pectin liasas durante las 24 h de incubación, aunque entre las 8 y las
16 h, esta actividad disminuyó ligeramente para volverse a incrementar a su valor inicial hacia el
final del tiempo de incubación. Sin embargo, cuando el filtrado se incubó con soluciones
reguladoras de pH igual a 6 y 8, la actividad se incrementó a partir del valor inicial (Figura 16).
Así, en los valores de pH de 6.0, la actividad se incrementó en un 50%, mientras que en los que
se incubaron en pH de 8.0 se observó un incremento de más del 100% (Figura 16).
Los resultados obtenidos mediante el desarrollo de estos experimentos permitieron demostrar que
la actividad de pectin liasas es sensible a valores ácidos de pH, y al parecer se activa en valores
mayores de 5.0.

86
250
200
Pectin liasas (%)
150
100
50
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo de incubación (h)
Figura 16. Estabilidad de las pectin liasas en los valores de pH de 2 (), 4 (), 6 () y 8 (X) durante 24 h de
incubación de una alícuota del filtrado enzimático con los reguladores preparados a los distintos valores de pH.
5.3.4 Uso del cultivo en lote alimentado para conocer la relación del
pH con la producción de pectinasas por A. flavipes FP-500
Para complementar los resultados obtenidos hasta el momento, se verificó el efecto de pH del
medio sobre la producción de las pectinasas en condiciones fisiológicas cuasiestables. Para lo
anterior, se desarrolló un cultivo en lote alimentado, cuyas condiciones de operación se describen
en la sección de materiales y métodos. El cultivo base sobre el que partió la fase de alimentación
en este experimento, se desarrolló sobre pectina, y cuando la concentración de este sustrato
disminuyó por debajo de 1 g L-1, comenzó el régimen de alimentación, mediante un flujo
continuo de pectina en una concentración de 6.92 g L-1. En este caso, las diferentes etapas del
régimen de alimentación se establecieron con base en el pH del cultivo. Así, durante la etapa I el
pH se mantuvo constante en 3.5, luego este se incrementó a 5.0 durante la etapa II, y por último
se bajó hasta 2.6 durante la última etapa de alimentación.

87
A
2.5
Biomasa (g L-1)
1.5
1
I II III
0.5
0
20
18 B
Exopectinasas (U ge de biomasa-1)
16
14
12
10
4 I II III
2
0
3
C
2.5
1.5
0.5
I II III
0
9
8 D
2
I II III
0
0 20 40 60 80 100
Tiempo (h)
Figura 17. Biomasa (A), producción específica de exopectinasas (B), endopectinasas (C) y pectin liasas (D)
producidas por A. flavipes FP-500 en un cultivo en lote alimentado desarrollado sobre pectina. Se muestran las
producciones obtenidas a partir del comienzo del régimen de alimentación, para el cual se utilizó pectina en una
concentración de 6.92 g L-1, en un flujo constante (0.042 L h-1). Durante la etapa I, se mantuvo el pH del medio
constante en un valor de 3.5, en la etapa II el pH del medio fue de 5.0, y en la etapa III se provocó una disminución
en el pH hasta 2.0.Se tomaron muestras periódicas cada 4 h durante el régimen de alimentación.

88
Como se puede observar (Figura 17 A), la concentración de biomasa permaneció relativamente
constante durante las primeras dos etapas, mientras que en la última fase dicha concentración
disminuyó notablemente. Lo anterior podría deberse al pH tan ácido en el que transcurrió esta
etapa. Un decremento en la velocidad de crecimiento en valores bajos de pH se reportó
previamente para Aspergillus oryzae (Malvessi y Moura, 2004).
Durante etapa I de alimentación, la producción de las pectinasas se incrementó a pesar de que el
pH del medio se mantuvo constante (Figura 17 B, C y D). Al parecer, durante esta etapa se
observó el efecto inductor de la pectina sobre la producción de cada una de las actividades
pectinolíticas.
En la etapa II, la actividad exopectinolítica se incrementó a medida avanzaba el cultivo (Figura
17 B). Además de la inducción por pectina, pareció observarse también el efecto inductor de los
valores de pH cercanos a la neutralidad sobre la expresión de las exopectinasas. Por otra parte, la
producción de endopectinasas permaneció aproximadamente constante durante la segunda etapa
de alimentación (Figura 17 C). Al parecer, ante la condición de pH probada durante esta etapa no
se indujo la formación de dicha especie pectinolítica. Sin embargo, tampoco se modificó la
estabilidad de las endopectinasas producidas en la etapa I. En lo que respecta a la producción de
pectin liasas, hacia el final de la segunda etapa de alimentación se observó un incremento de la
misma (Figura 17 D), que comprueba la posible inducción de la fracción de pectin liasas que se
expresa preferentemente en valores de pH menos ácidos.
Durante la etapa III, donde el pH en el medio disminuyó considerablemente, la actividad de
exopectinasas disminuyó hasta los valores obtenidos durante la etapa I, y se mantuvo
relativamente constante hacia el final de la alimentación (Figura 17 B). Por el contrario, la
actividad de endopectinasas sufrió primero una disminución severa durante las primeras horas de
la etapa III, aunque después se incrementó hasta llegar al valor máximo obtenido durante la fase

89
de alimentación (Figura 17 C). Dado que la actividad endopectinolítica es muy estable en valores
de pH ácidos, la disminución observada al inicio de la etapa III podría deberse al decremento en
la concentración de biomasa sucedido en esa etapa, mientras que el incremento observado en la
segunda parte de la Etapa III sugiere que en esta fase se indujo la formación de endopectinasas
ácidas.
Por otra parte, la producción de pectin liasas se afectó severamente durante la etapa de
alimentación en la que el pH del medio se mantuvo ácido (Figura 17 D). Dicha disminución
podría deberse a la disminución en la estabilidad de la enzima en valores tan ácidos para el medio
de cultivo, como se observó en la sección 5.3.3.
5.3.5 Conclusión.
Durante el proceso de degradación de pectina en cultivos líquidos por A. flavipes FP-500, el pH
del medio sufre cierta evolución conforme sucede el desarrollo del mismo. En las primeras horas
de cultivo, el medio se acidifica, y se observa al mismo tiempo el incremento de la actividad
exopectinolítica basal. Es muy probable que la acidificación del medio suceda por la producción
de ácidos orgánicos específicos, cuya función sea facilitar el ataque de estas enzimas al modificar
la estructura de la pectina, y/o estabilizar los sitios activos de las mismas para incrementar su
afinidad por el sustrato. El incremento en la actividad de exopectinasas provoca a su vez la
producción de la actividad endopectinolítica. Los resultados obtenidos parecieron indicar que las
pectinasas del tipo endo están reguladas tanto por la concentración y tipo de la fuente de carbono
presente en el medio, como por el pH del medio de cultivo. Finalmente, la producción de pectin
liasas pareció estar más relacionada con el pH del medio, produciéndose en mayor proporción a
condiciones de pH cercanas a la neutralidad, independientemente del momento en que se
alcanzara esta condición dentro del cultivo.

90
Por otra parte, se sugirió que A. flavipes FP-500 produce varias isoformas de estas pectinasas, que
se expresan ante diferentes valores de pH. Así, los resultados obtenidos parecieron indicar que los
genes que codifican para las exopectinasas, endopectinasas y pectin liasas producidas por este
hongo pueden generar enzimas con valores óptimos de pH ácidos o básicos, lo que fue más
evidente para la actividad exopectinolítica y la de pectin liasas.

91
Conclusiones generales
6. Conclusiones generales
Aspergillus flavipes FP-500 es una cepa adaptada al crecimiento sobre polisacáridos
complejos y por ende la producción de las pectinasas es significativamente mayor en estos
sustratos, en comparación con los obtenidos en azúcares simples. Las endopectinasas, pectin
liasas y algunas isoformas con actividad exopectinolítica son de naturaleza inducible, y la
pectina y el ácido galacturónico son los principales inductores de las mismas. Por otra parte, la
comparación de actividades enzimáticas y la relación de los parámetros cinéticos (µmax y α)
permitió indicar la constitutividad de algunas isoformas con actividad de exopectinasas y
pectin liasas producidas por esta cepa.
En lo que se refiere a la secuencia de producción de las pectinasas en cultivos en lote, las
exopectinasas constitutivas son las primeras que se observan en el medio de cultivo, mientras
que la producción de endopectinasas depende de la acción previa de las exopectinasas
constitutivas e inducibles. Además, ambas pectinasas están sujetas a represión catabólica por
carbono, aunque ésta es transitoria. Por otra parte, la producción de pectin liasas no tiene una
influencia importante de un grupo reductor o de la concentración de este en el medio de
cultivo, y parece ser independiente de la producción de las exo y endopectinasas.
El pH inicial del medio de cultivo determina la producción máxima de las pectinasas obtenidas
en las fuentes de carbono. Las exo y endopectinasas se producen en mayor proporción en la
mayoría de los medios con pH inicial de 3.5, mientras que la mayor producción de pectin
liasas se obtiene en los medios que iniciaron a pH de 5.0. La evolución del pH en el medio de
cultivo parece determinar la producción de diversas isoformas de las pectinasas, permitiendo
explicar la relación entre la producción de las mismas a lo largo del cultivo.

92
Ampliación de la investigación
7. Ampliación de la investigación
Mediante el desarrollo del presente proyecto, se conocieron las tendencias básicas de
producción de tres principales pectinasas despolimerizantes producidas por A. flavipes FP-500.
Sin embargo, la investigación respecto al estudio de las pectinasas de esta cepa aún está
incompleta, por lo que haría falta analizar la producción de las otras enzimas que componen al
sistema pectinolítico de este microorganismo.
Por otra parte, en lo que respecta a la producción de exopectinasas, endopectinasas y pectin
liasas, aún quedan algunos aspectos por resolver, que permitirán ampliar la investigación. A
continuación, se listan algunos de ellos:
¾ Determinar el perfil de azúcares y proteínas a lo largo del cultivo en lote desarrollado en
pectina.
¾ Probar el efecto de concentraciones de azúcares reductores de distintos tipos sobre la
producción de pectinasas por A. flavipes FP-500.
¾ Analizar la sucesión de las fuentes de carbono en el cultivo alimentado con diversos
sustratos.
¾ Analizar la producción de ácidos orgánicos durante las primeras horas de cultivo y
verificar si hay una correlación de la producción de estos con la de las pectinasas.
¾ Analizar la expresión de los diversos genes pectinolíticos al hacer crecer al hongo ante
fuentes de carbono inductoras y represoras
¾ Analizar la expresión de los genes pectinolíticos con relación al pH del medio.
¾ Revisar los parámetros cinéticos en un modelo de crecimiento y producción de
pectinasas en lote alimentado

93
Referencias bibliográficas
8. Referencias bibliográficas
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carbono para la producción de enzimas por cepas de Aspergillus. Tesis de licenciatura.
Universidad Nacional Autónoma de México.
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Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458 Vol.11 No.4, Issue of October 15, 2008
© 2008 by Pontificia Universidad Católica de Valparaíso -- Chile Received March 25, 2008 / Accepted June 16, 2008
DOI: 10.2225/vol11-issue4-fulltext-6 RESEARCH ARTICLE
Kinetic study on inducibility of polygalacturonases from Aspergillus

flavipes FP-500
Aurora Martínez-Trujillo
Laboratorio de Catálisis Enzimática
Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec
Av. Tecnológico s/n esq. Av. Carlos Hank González
Ecatepec, Estado de México, CP 55210, México
Tel: 01 55 00 23 00. Anexo 2227
E-mail: amartinezt@tese.edu.mx
Juan S. Aranda
Departmento de Bioingeniería
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología
Instituto Politécnico Nacional
Av. Acueducto s/n, Col. La Laguna Ticoman
D.F.CP 07340, México
Tel: 01 57 29 60 00. Anexo 56338
E-mail: jaranda@upibi.ipn.mx
Guillermo Aguilar-Osorio*
Departamento de Alimentos y Biotecnología
Facultad de Química
Universidad Nacional Autónoma de México
Ciudad Universitaria, Conj. E, Química
CP 04510, D.F., México
Tel: 01 55 56 22 53 05.
E-mail: gao@servidor.unam.mx
Financial support: This work was financially supported by the National Council for Science and Technology (Mexico), the Technologic Institute for
Higher Studies of Ecatepec (México), the Research Office of the National Polytechnique Institute (Mexico), and the National University of Mexico,
DGAPA projects IN207603 and IN219604.
Keywords: constitutive enzymes, inducible enzymes, initial pH, kinetic modeling, pectinases.
The aim of this work was to describe growth dynamics, barrier during microbial attack which involves the action of
substrate depletion and polygalacturonases production several enzymes (de Vries and Visser, 2001). Fungi of the
by Aspergillus flavipes FP-500 in batch cultures by genus Aspergillus are among the microbial species that can
means of unstructured models. The microorganism was degrade pectin, so producing a number of pectinases
cultivated on several mono- di- and polysaccharides, (Texeira et al. 2000). The importance of pectin-degrading
and then the culture development modeled with Monod enzymes lies mainly in their actual and potential uses in a
and Leudeking-Piret equations. The kinetic parameters number of industries, like in food processing, textile
related to the models (µmax, γx/s, α and β) were obtained industry, paper and pulp industry, pectic wastewater
by minimizing the quadratic residuals function with a treatment and animal feed, among others (Jayani et al.
simplex algorithm. An accurate description of 2005; Niture, 2008). In addition, the understanding of the
experimental data was attained with the proposed regulation process of the production of polygalacturonases
models. Besides, modeling provided significant kinetic will contribute to get insights in the molecular dialogue
information on microbial degradation of complex between the host and the pathogen, during microbial
substrates, such as the correlation between specific invasion of plant cell wall (Esquerré-Tugayé et al. 2000;
growth rate µmax and production yield α, suggesting that Lang and Dörnenburg, 2000).
A. flavipes FP-500 polygalacturonases are actually
constitutive, but also that there is a certain degree of Although the specific signal molecule that triggers
induciblility in these enzymatic activities. pectinases synthesis remains unknown, the general
accepted idea is that fungal cells produce a low level of
Pectin is a complex polysaccharide found in middle constitutive pectinolytic enzymes, which release a few
lamellae of plant cell wall. It represents the first plant molecules of mono or oligosaccharides from a polymer in
*Corresponding author
This paper is available on line at http://www.ejbiotechnology.info/content/vol11/issue4/full/6/

Martínez-Trujillo, A. Et al.
Figure 1. Fitting (continuous line) of the experimental data to a kinetic model for substrate depletion ( ), growth ( ) and
polygalacturonases production ( ), at initial pH of 3.5 (a and c) and 5.0 (b and d) with glucose (a and b) and pectin (c and d)
as carbon source. Dotted lines represent confidence intervals for the model estimations of S, x and p. Solid markers ( ) are pH
evolution in the culture.
plant structure. These small molecules are transported into In this context, the present work aimed at describing the
the microorganism and start a massive expression of the dynamics of fungal growth, substrate depletion and
degrading pectinases (Mach and Zeilinger, 2003). This polygalacturonases production in batch cultures under
would mean that several pectinolytic activities are induced different conditions of carbon source and initial pH of the
by a number of substrates (Prade et al. 1999). Pectinases culture, using the Monod and Leudeking-Piret unstructured
production is regulated in different fungal species, models (Thilakavathi et al. 2007). After obtaining the
depending on the carbon source (Crotti et al. 1998; Wubben kinetic parameters, their numerical values were correlated
et al. 2000; Olsson et al. 2003) and the pH of the medium in order to point out the constitutive or inducible nature of
(de Vries and Visser, 2001; Peñalva and Arst, 2002). the produced polygalacturonases.
The mathematical modeling of microbial growth and MATERIALS AND METHODS
process performance has led to improved design and
operation of mycelial fermentations and has improved the Microorganism
ability of scientists to translate laboratory observations into
commercial practice. Unstructured modeling represents a Aspergillus flavipes FP-500, was isolated in Mexico from
particular and useful application of growth mathematical rotten tomatoes. The strain was maintained at 4ºC on PDA
analysis that could provide some important hints on agar plates.
constitutiveness and inducibility of metabolites production,
such as some enzymatic activities, on a kinetic, quantitative The strain was identified by conventional methods
basis. considering its morphological characteristics growing on
2
Polygalacturonases from Aspergillus flavipes
different media and by microscopic examination. A hydrolysis of polysaccharides containing samples with a
comparison with type strains was done resulting in the sulfuric acid and following color development of the phenol
identification of the strain as member of flavipes species. reagent (Dubois et al. 1956).
Media composition Mathematical model
A. flavipes FP-500 was grown on basal medium, containing Culture behavior in time is described with the following
(g L-1): K2HPO4, 2; KH2PO4, 2; and (NH4)2SO4, 5. The equations:
medium was sterilized by autoclaving at 121ºC for 20 min.
The initial pH of the medium was adjusted with 2 M NaOH dx S
or H2SO4. To this basal salt solution, a suitable carbon = μ max x (microbial growth)
source was added to attain a final concentration of 10 g L-1. dt S + kS
Inoculum dS μ S
= − max x (substrate depletion)
Spores were collected from 3-day-old agar slants with dt Yx / s S + k s
Saline-Tween solution (NaCl, 0.9% and Tween 80, 0.01%).
A final concentration of 1 x 106 spores/mL was obtained by dp S
adjusting with sterile water. Monosaccharide based media = αμ max x + βx (polygalacturonases
(see below) were supplemented with 0.1% (w/v) of yeast dt S + ks
extract. production)
Production of enzymes under different carbon Where

sources and initial pH
dx
In order to evaluate the effect of carbon source and initial biomass accumulation in the culture medium (gb L-1
pH on growth and enzyme production, A. flavipes FP-500
dt
h-1)
was grown on basal medium supplemented with different
carbon sources: pectin and polygalacturonic acid, as dS
complex polysaccharides; galacturonic acid, arabinose, substrate depletion in the culture medium (gs L-1 h-1)
rhamnose and xylose, as the main monosaccharide dt
constituents of pectin; glycerol as a simple substrate not
related to pectin structure; lactose and glucose, this latter dp
considered a universal catabolic repressor. Also, three exopectinases accumulation in the culture medium
dt
initial pH values of the culture media were established (3.5, -1
(U L h ) -1
4.2 and 5.0), in order to evaluate microbial growth and
polygalacturonases production under these different µmax maximal specific growth rate (h-1)
conditions. Cultures were carried out in 100 mL of
medium, and were incubated at 37ºC in a reciprocant S substrate concentration (gs L-1)
shaker at 200 rpm. Samples were withdrawn every 24 hrs
until 72 hrs of culture. ks Monod saturation constant (gs L-1)
Analytical techniques x biomass concentration (gb L-1)
Microbial biomass. Cell growth was measured by dry Yx/s biomass on substrate yield coefficient (gb gs-1)
weight and expressed as g L-1.
α growth-associated coefficient for pectinases
Polygalacturonase activity. This was measured by production (U gb-1)
determination of the reducing sugars produced from 1%
(w/v) pectin solution after incubation at 45ºC for 20 min at β growth-independent coefficient for pectinases
pH 5.0. One unit of polygalacturonase activity was defined production (U gb-1 h-1)
as the amount of enzyme that catalyzes the formation of 1
µmol of galaturonic acid under assay conditions (Trejo- Monod constants µmax and ks are not simultaneously
Aguilar et al. 1996). identifiable in batch process (Nihtila and Virkkunen, 1977;
Chouakri et al. 1994), so the maximal specific growth rate
Substrate depletion. Monosaccharide substrates is the only useful obtained parameter.
consumption was measured through quantification of
reducing sugars using 3,5-dinitrosalicilic acid, with the Kinetic parameters in the Leudeking-Piret model, α and β,
corresponding sugar as the reference standard (Miller, indicate the relation between growth and pectinases
1959). Polymers consumption was estimated after acid production in a fungus culture. The parameter α expresses
3
the enzyme production associated with microorganism Where

growth, in a way that production is considered growth-
associated whenever α ≠ 0. Since pectinases production is σ standard deviation for each kinetic parameter (i =
needed for the assimilation of complex substrates in order µmax, γx/s or α), obtained from synthetic data
the miocroorganism to grow, parameter α is the more
meaninful factor in our modeling approach. Besides, the m experimental determinations made in N samples
estimation of β resulted in a nil value for any Aspegillus
flavipes culture. The former considerantions lead to specify N samples obtained from each culture
the vector parameter P as:
q number of estimated parameters
P = [µmaxγx/s α] and the initial conditions to model equations
t0.975 Student’s factor for a confidence level αt = 0.975
(x0, S0 and p0) are the experimental concentrations at
process time t = 0. Estimated variance to x, S and p. Variance of experimental
data obtained after estimation of biomass (x), substrate (S)
Parameters estimation
and exopectinases (p) was estimated by
The growth yield (Yx/S) and the identifiable parameters for
1
Monod (µmax) and Luedeking-Piret (α) models were
obtained as reported in a previous work (Aranda-Barradas
V (u ) =
mN − q
∑ (uexp − umod ) 2
et al. 2000), with the following residuals function F as the
minimizing criterium: where
F ([μ max Yx / s α β ]) = F ( P ) u x, S or p
RESULTS
[ ] [ ] [ ]
n n n
F ( P ) = ∑ xiexp − ximod ( P ) + ∑ siexp − simod ( P ) + ∑ piexp − pimod ( P )
2 2 2
i =1 i =1 i =1
Modeling of growth and pectinases production
Where superscripts exp and mod indicate experimental data
Kinetic parameters (µmax, γx/s, α) estimated by Nelder-Mead
and model results, respectively. The differences between
simplex algorithm (Table 1) showed to be accurate enough
experimental and theoretical values were calculated for the
to build a reliable model that describes the kinetics of
n sample points (n = 12). The estimated kinetic parameters
Aspergillus flavipes FP-500 on several carbon sources, as it
Pest are those that satisfy the condition
can be seen from the model fitting in Figure 1. A good fit to
F (Pest) = min experimental data was reached with this mathematical
treatment.
Meaning that the estimated parameters are chosen in order
to produce the minimum residual errors between the model Kinetic parameters as a function of pH and
theoretical values and the experimental data. The search of substrate
the minimum was carried out with a Nelder-Mead simplex
Kinetic parameters for the mathematical model were
method, given an arbitrary initial vector P0 to start up the
determined in each experimental condition described
algorithm.
before. Monod-type growth on substrates such as xylose,
The model can be coupled to estimated parameters Pest in glycerol and polygalacturonic acid resulted in maximal
order to create synthetic data sets, by adding white noise to specific growth rates around 0.03 h-1, while on galacturonic
numerical results on x, S and p from the model. Each acid µmax ≈ 0.07 h-1 and on lactose µmax was about 0.25 h-1.
synthetic data set produces a new vector of equivalent With all the forementioned substrates the maximal specific
estimated parameters. Therefore, calculating a number of growth rate was approximately constant regardless the
equivalent parameters allows the estimation of the mean initial pH in the culture. Thus, for these substrates,
and the standard deviation for every kinetic parameter estimated µmax values seem to indicate dependence of
(Table 1). growth on the carbon source, but not on the initial pH of the
culture. However, estimated µmax for other group of
Variance estimations in the model substrates (glucose, rhamnose, pectin) was strongly affected
by the initial pH. On the one hand, experiments with
Variance associated to parameters. Confidence intervals of rhamnose as a carbon source showed increasing µmax values
the best estimated parameters are given by as the initial pH was rised from 3.5 to 5.0. Growth on
glucose and pectin presented a significative drop of the
σi specific growth rate µmax when the initial pH in the culture
ΔPi = ± t0.975 was increased.
mN − q
4
Concerning polygalacturonases production represented by estimated µmax and α (Figure 2). Three major trends were
the Leudeking-Piret model, estimated β values were equal observed:
to zero for all the substrates and initial pH tested. In
contrast, α parameter estimations showed a dependence on i) For glucose, plotting µmax vs. α it could be observed that
both the substrates and the initial pH. The lowest α value the estimated µmax values strongly depended on the pH of
was obtained for glycerol (0.004 U/g, pH = 3.5), meanwhile the medium (Figure 2a). While α value at pH 3.5 and 4.2
high values were obtained for rhamnose (25.6 U/g, pH = was similar at 5.0 a higher value was obtained. However,
4.2), galacturonic acid (37.89 U/g, pH = 3.5), this latter value was relatively low as compared with other
polygalacturonic acid (27.88 U/g, pH = 5.0) and pectin substrates.
(30.78 U/g, pH = 3.5). Values obtained for pectin and
galacturonic acid were exceptionally high when compared ii) For substrates as lactose, galacturonic acid or
to other substrates in media with initial pH of 3.5. polygalacturonic acid, estimated µmax was the same on the
Similarily, for glycerol, the product yield α is relatively three initial pH tested. However, different α values were
high (15.71 U/g for pH = 4.2 and 16.17 U/g for pH = 5.0) obtained, depending on the initial pH used for each
although this substrate is not a structural component of medium. A graphical representation of µmax – α parameters
pectin. shows a linear, nearly vertical, relationship (Figure 2b).
Polygalacturonases constitutiveness and iii) With pectin as the carbon source, there is a positive
inducibility from kinetic proportional relationship between µmax and α (Figure 2c).
Parameters These experimental results could be interpreted in terms of

constitutiveness or inducibility of pectinases as a function
After comparing kinetic parameters for different carbon either of initial pH in the culture media or of the carbon
sources and initial pH values, some interesting remarks can source.
be established concerning the relationship between
Table 1. Kinetic parameters for A. flavipes FP-500 on several carbon sources and different starting pH.
µmax YX/S α
Kinetic parameter -1
(h ) (g of biomass/g of substrate) (U/g of biomass)
pH pH pH
Carbon source
3.5 4.2 5.0 3.5 4.2 5.0 3.5 4.2 5.0
0.029 ± 0.029 ± 0.026 ± 0.411 ± 0.257 ± 0.46 ± 0.013 ± 0.73 ± 0.84 ±

Xylose
0.008 0.0026 0.002 0.05 0.0071 0.024 0.003 1.58 0.087
0.098 ± 0.104 ± 0.44 ± 0.39 ± 25.6 ± 4.21 ±

Rhamnose 0.04 ± 0.01 0.31 ± 0.03 1.30 ± 0.2
0.006 0.006 0.03 0.017 1.43 0.06
0.15 ± 0.05 ± 0.36 ± 0.37 ± 5.18 ±

Arabinose 0.12 ± 0.03 0.44 ± 0.02 3.1 ± 0.96 8.3 ± 0.52
0.021 0.0007 0.06 0.03 0.68
0.069 ± 0.079 ± 0.44 ± 0.35 ± 4.14 ± 14.53 ±

Galacturonic acid 0.064 ± 0.01 0.39 ± 0.04 37.89 ± 2.9
0.008 0.005 0.05 0.03 0.98 2.5
Polygalacturonic 0.034 ± 0.032 ± 0.027 ± 0.30 ± 0.26 ± 19.99 ± 27.88 ±

0.34 ± 0.03 11.97 ± 1.53
acid 0.005 0.0021 0.0022 0.014 0.09 1.67 2.7
0.039 ± 0.34 ± 0.68 ± 12.13 ±

Pectin 0.76 ± 0.06 0.55 ± 0.06 0.34 ± 0.03 30.78 ± 0.95 6.27 ± 2.2
0.007 0.007 0.09 0.33
0.49 ± 0.41 ± 0.12 ± 1.65 ±

Glucose 0.17 ± 0.03 0.07 ± 0.01 0.08 ± 0.04 0.52 ± 0.01 0.32 ± 0.11
0.04 0.036 0.05 0.15
0.035 ± 0.027 ± 0.026 ± 0.48 ± 0.26 ± 0.004 ± 15.71 ± 16.17 ±

Glycerol 0.26 ± 0.02
0.003 0.007 0.005 0.02 0.06 0.0024 2.45 1.21
0.24 ± 0.31 ± 0.98 ± 8.45 ± 3.67 ±

Lactose 0.25 ± 0.04 0.27 ± 0.03 0.95 ± 0.17 9.91 ± 1.97
0.008 0.04 0.13 2.12 1.57
5
glucose is not depleted in the process time, contrary to

pectin which is exhausted after 48 hrs. These findings
suggest that A. flavipes FP-500 is better adapted to complex
polysaccharides than to monosaccharides, since kinetics of
growth is faster on the former substrates.
It should be observed that µmax varied in different carbon

sources, with a clear trend to be higher for lactose and
pectin than for monosacharide susbtrates. It is interesting to
notice that this strain was able to grow on lactose as a sole
carbon source and this is not usual. Other filamentous fungi
showed a low growth rate on this substrate (Pakula et al.
2005), even when this carbon source has been reported as
the inducer of cellulases in Hypocrea jecorina (anamorph
of Trichoderma reesei), (Seiboth et al. 2004). The growth
on lactose is related to the presence of β-galactosidase
activity, a key enzyme for lactose utilization by this fungus.
Considering that lactose does not occur in the natural
environment of fungi, it has been proposed that the function
of this β-galactosidase is the hydrolysis of terminal non-
reducing β-D-galactose residues in plant cell wall
components including hemicelluloses or pectins (Seiboth et
al. 2007). Furthermore, in Aspergillus there is not a clear
picture about lactose utilization; while A. nidulans is able to
grow on lactose and galactose, A. niger does not (Seiboth et
al. 2007). As it can be seen from our results, A. flavipes
grows on lactose and is able to produce α- and β-
galactosidase. So, it is probable that A. flavipes FP-500 is
using a similar strategy to A. nidulans that allow the growth
on lactose. Nevertheless, it would be necessary to develop
additional experiments for demonstrating this hypothesis.
The highest µmax values were reached with data from a

pectin culture, so pectin allows a good microbial biomass
production in this strain. Besides, this behavior could
explain the elevated polygalacturonases production of the
fungus when it grew on pectin as carbon source. A. flavipes
FP-500 is a good pectinases producer, whose pectinases
production is better than other Aspergillus strains, such as
those reported for A. niger F-1119, which produced barely
10.8 U/ml and 2.1 g/L of biomass on citrus pectin
(Shubakov and Elkina, 2002).
The α parameter involved in Leudeking-Piret model

expresses the enzyme production associated with the
growth of the microorganism. Moreover, analysis of µmax -
α plots can give some insight about constitutiveness, if α
remains constant eventhough changes in µmax are presented;
or inducibility, if α increases regardless the behavior of
Figure 2. Relationships µmax- α, at different initial pH, for (a)
µmax.
glucose ( ), (b) galacturonic acid, ( ); polygalacturonic
acid ( ), and lactose, ( ) and (c) pectin ( ). Numbers For growth on glucose (Figure 2a), no matter what initial
asociated to markers indicate the initial pH in the culture media.
pH was adjusted in the culture, low values for α were
obtained. The numerical values were not higher than 1.65
U/g what is considered relatively low, and might be
DISCUSSION reflecting a basal enzyme activity. Taking into account that
glucose is not a constituent of pectin structure, the behavior
It can be clearly seen on Figure 1 that although final observed in this µmax – α relationship suggests that there is a
biomass for growth on glucose and pectin is similar, constitutive part of polygalacturonases produced by A.
6
flavipes FP-500, which is expressed under any pH was significantly increased at low pH (3.5) for pectin, or at
condition. a slightly higher pH (5.0) for polygalacturonic acid.
With other substrates unrelated to pectin structure (glycerol Even though kinetic parameters are not definitive evidence
and lactose) α ranged from 0.004 to ~15 U/g. However, α of enzyme induction, an indirect inference from µmax - α
raised up to 25 U/g or more for cultures developed on relationship would indicate the conditions for an increase of
carbon sources related to pectin. Among them, the highest enzymatic activity, mainly due to substrate induction.
was attained on galacturonic acid, and it was comparable in
magnitude to those observed for polygalacturonic acid and ACKNOWLEDGMENTS
pectin. This seems to indicate a certain substrate-
inducibility degree in the enzymatic production. The authors acknowledge Dr. Edgar Salgado for the critical
reading of the manuscript.
When a graphical analysis between µmax and α was
performed for pectin-related substrates, different behaviors REFERENCES
were observed. On galacturonic acid, the fungus had the
same maximal specific growth rate (~0.07 h-1) but different ARANDA-BARRADAS, Juan S.; DELIA, Marie Line and
α values for every initial pH tested (Figure 2b). This RIBA, Jean-Pierre. Kinetic study and modeling of the
suggests that on galacturonic acid there is an induction in xylitol production using Candida parapsilosis in oxygen-
this strain of polygalacturonase activity depending on initial limited culture conditions. Bioprocess and Biosystems
pH, as it has been reported for other Aspergillus species (de Engineering, March 2000, vol. 22, no. 3, p. 219-225.
Vries et al. 2002). On polygalacturonic acid (Figure 2b) it
CHOUAKRI, N.; FONTEIX, C.; MARC, I. and
was clear that initial pH of the medium also conditioned the
CORRIOU, J.P. Parameter estimation of a Monod-type
polygalacturonases activity. It seems that for almost all the
model. Part I: Theoretical identifiability and sensitivity
substrates, the initial pH of 3.5 increases
analysis. Biotechnology Techniques, October 1994, vol. 8,
polygalacturonases activity. Thus, initial pH conditions
no. 10, p. 683-688.
regulate pectinases activity.
CROTTI, Luciana B.; TERENZI, Héctor F.; JORGE Joao
Some similar conclusions have been reached in induction
A. and POLIZELI, María de Lourdes. Regulation of pectic
and repression research on cellulases by A. niger (Hanif et
al. 2004). However, although our results on kinetic enzymes from the exo-1 mutant strain of Neurospora
modeling certainly give some insight on polygalacturonases crassa: effects of glucose, galactose and galacturonic acid.
production, constitutiveness and inducibility, there is still Journal of Basic Microbiology, July 1998, vol. 38, no. 3, p.
room for other confirmatory experiments. 181-188.
CONCLUDING REMARKS DE VRIES, Ronald P. and VISSER, Jap. Aspergillus

enzymes involved in degradation of plant cell wall
Aspergillus flavipes FP-500 is a pectinases producer strain. polysaccharides. Microbiology and Molecular Biology
Our results have shown that polygalacturonases production Reviews, December 2001, vol. 65, no. 4, p. 497-522.
is strongly influenced by the available carbon source, and
that enzyme activity is regulated by the initial pH in the DE VRIES, Ronald P.; JANSEN, Jenny; AGUILAR,
culture medium. The main contribution lies in the kinetic Guillermo; PARENICOVA, Lucile; JOOSTEN, Vivi;
characterization of polygalacturonases production by the WÜLFERT, Florian; BENEN, Jacques A.E. and VISSER,
strain, that allowed to stress to some extent the Jaap. Expression profiling of pectinolytic genes from
constitutiveness and inducibility of those enzymes: Aspergillus niger. FEBS Letters, September 2002, vol. 530,
no.1-3, p. 41-47.
i) Growth on monomeric substrates unrelated to pectine
(glucose, gycerol) resulted in a low polygalacturonases DUBOIS, M.; GILLES, K.A.; HAMILTON, J.K.;
production, considered a basal constitutive enzyme activity, REBERS, P.A. and SMITH, F. Colorimetric method for
that can be modified by means of a change in the initial pH determination of sugars and related substances. Analytical
of the culture medium. Chemistry, March 1956, vol. 28, no. 3, p. 350-356.
ii) Culture media containing monomeric substrates related ESQUERRÉ-TUGAYÉ, Marie-Thérese; BOUDART,
to pectin (xylose, rhamnose, arabinose) produced in general Georges and DUMAS, Bernard. Cell wall degrading
a low polygalacturonases yield (α), eventhough some enzymes, inhibitory proteins, and oligo-saccharides
important increases in enzymatic activity are attained by participate in the molecular dialogue between plants and
establishing the appropiate initial pH (3.5 for galacturonic pathogens. Plant Physiology and Biochemistry, January
acid and 4.2 for rhamnose) in the culture medium. 2000, vol. 38, no. 1-2, p. 157-63.
iii) Complex substrates such as pectin or polygalacturonic HANIF, A.; YASMEEN, A. and RAJOKA, M.I. Induction,
acid induced important polygalacturonase production that production, repression, and de-repression of exoglucanase
7
synthesis in Aspergillus niger. Bioresource Technology, SEIBOTH, Bernhard; PAKDAMAN, Babak S.; HARTL,
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February 2004, vol. 51, no. 4, p. 1015-1025.
Note: Electronic Journal of Biotechnology is not responsible if on-line references cited on manuscripts are not available any more after the date of publication. 8
Supported by UNESCO / MIRCEN network.

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas en

Dr. Juan Silvestre Aranda Barradas, UPIBI-IPN.

Presentada para obtener el grado de:

DOCTOR EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS

María Aurora Martínez Trujillo

México, D. F., 2009

CARTA CESION DE DERECHOS

En la Ciudad de ___México, D.F.__________el día _19__del mes__enero___________del

María Aurora Martínez Trujillo

A mis hermanos, por completar la red que me sostiene.

A Ale, porque no me dejaste rendirme. Porque me has mostrado la importancia de

Gaby y Jaz, mis compañeras en el camino. Compartiendo alegrías y tristezas

A Mayo, por las porras, el cariño y la admiración. Aprecio tu sinceridad y admiro la

A Lety, por tu cariño y fe ciegas. Tu alegría fue un gran motor.

A mis directores de tesis, Dr. Guillermo Aguilar Osorio y Dr. Juan

Dr. Guillermo Aguilar Osorio

Dr. Juan S. Aranda Barradas

Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 i

5.1 CONSTITUTIVIDAD E INDUCIBILIDAD EN PECTINASAS DE ASPERGILLUS

5.3 MODULACIÓN POR PH DE LAS PECTINASAS PRODUCIDAS POR ASPERGILLUS

Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 ii

Figura 2. Morfología microscópica de Aspergillus y micrografía 15

Figura 3. Ajuste de los datos experimentales a un modelo cinético en cultivos en lote

desarrollados a nivel matraz 44

Figura 4. Correlación µmax - α , a diferentes valores de pH inicial en glucosa, ácido

galacturónico, ácido poligalacturónico y pectina en cinéticas desarrolladas a nivel

Figura 5. Evolución del cultivo en lote desarrollado a nivel biorreactor, utilizando

pectina como fuente de carbono 55

Figura 6. Experimento de transferencia de micelio, desarrollado a nivel matraz con

pectina al 1% (p/v) como fuente de carbono 60

Figura 7. Evolución del crecimiento, concentración de pectina y de azúcares reductores

en el cultivo alimentado desarrollado sobre pectina 62

Figura 8. Velocidad específica de crecimiento µ y factor de dilución D, calculadas a

partir de los datos experimentales de biomasa obtenidos durante el régimen de

alimentación en el cultivo alimentado 63

Figura 9. Producción específica de exopectinasas, endopectinasas y pectin liasas

producidas por A. flavipes FP-500 en un cultivo en lote alimentado 65

Figura 10. Producción específica de exopectinasas, endopectinasas y pectin liasas

producidas por A. flavipes FP-500 en un cultivo en lote alimentado 68

Figura 11. Evolución del pH, la producción de exopectinasas, endopectinasas y pectin

liasas en cultivos en lote de A. flavipes FP-550 desarrollados a nivel biorreactor con

pectina al 1% (p/v) como única fuente de carbono 75

liasas en cultivos en lote de A. flavipes FP-500 desarrollados a nivel biorreactor con

ácido galacturónico al 1% (p/v) como única fuente de carbono 79

Figura 13. Evolución de la producción de exopectinasas producidas en cultivos en lote

desarrollados sobre pectina o ácido galacturónico 82

Figura 14. Evolución de la producción de endopectinasas producidas en cultivos en lote

desarrollados sobre pectina o ácido galacturónico 84

Figura 15. Evolución de la producción de endopectinasas producidas en cultivos en lote

desarrollados sobre pectina o ácido galacturónico 85

Figura 16. Estabilidad de las pectin liasas en los valores de pH de 2, 4, 6 y 8 87

Figura 17. Biomasa, producción específica de exopectinasas, endopectinasas y pectin

liasas producidas por A. flavipes FP-500 en un cultivo en lote alimentado desarrollado

Estudio cinético de la producción secuenciada de pectinasas por Aspergillus flavipes FP-500 iv

Tabla 1. Balances de materia para el cultivo en lote y el cultivo en lote alimentado a

partir de los balances generales. 18

Tabla 2. Producción máxima de exopectinasas de A. flavipes FP-500 en cultivos en lote

desarrollados a nivel matraz 36

Tabla 3. Producción máxima de endopectinasas de A. flavipes FP-500 en cultivo en lote

desarrollado a nivel matraz 40

Tabla 4. Producción máxima de pectin liasas de A. flavipes FP-500 en cultivo en lote

En la Ciudad de _México, D.F.________el día _19del mesenero___________del