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AL
de 60 Å) de gel de sílice con un tamaño entre 2 y 10 µm y un tamaño promedio de partícula de 5 µm, además de un aglutinante
polimérico y un indicador fuorescente (F254) recubriendo un soporte que por lo general es una placa de vidrio o lámina de aluminio.
Otras fases estacionarias tales como fases unidas químicamente (C8, C18, CN, NH2; DIOL) o celulosa microcristalina, también están
disponibles con y sin indicador fuorescente. Debido a la mayor e<ciencia de separación de las partículas <nas en la HPTLC, el
sistema cromatográ<co se miniaturiza, usando cámaras de desarrollo más pequeñas y distancias de desarrollo más cortas de 6–8
CI
cm, en comparación con la TLC clásica, en el que se requieren 12–15 cm para una mejor separación. En consecuencia, se requiere
menos fase móvil y menos tiempo para el desarrollo del cromatograma. Otro efecto de la miniaturización es el uso de volúmenes de
muestra más pequeños, lo que resulta en la posibilidad de analizar más muestras por placa que con la TLC clásica.
Asimismo, la mejor calidad de la capa debida a un tamaño de partícula más pequeño mejora la relación señal-ruido y, por ende,
tiene efectos sobre la capacidad de detección de los componentes de la muestra separados. Se usa una prueba de aptitud del
FI
sistema para cali<car los resultados. Esta característica es de gran importancia para la identi<cación de ingredientes botánicos, los
cuales tienen una variabilidad natural intrínseca en su composición química. Las imágenes electrónicas de cromatogramas de
HPTLC permiten una comparación visual conveniente de los resultados obtenidos para múltiples muestras contra imágenes de
cromatogramas generados con materiales de referencia. Para propósitos de identi<cación, la complejidad de los ingredientes
O
botánicos se representa mejor mediante huellas dactilares obtenidas con múltiples modos de detección a partir del mismo
cromatograma, p. ej., luz UV 254 nm y UV 366 nm sin derivatización, y luz blanca y UV 366 nm después de la derivatización. Debido a
que los métodos farmacopeicos se usan para determinar el cumplimiento, se debe evitar la variabilidad de los resultados ocasionada
por el método analítico seleccionado. Dado que la HPTLC puede controlar las variables dentro de intervalos estrechos usando una
metodología rigurosamente estandarizada y equipo apropiado, la HPTLC es capaz de incrementar de manera signi<cativa la
reproducibilidad de los resultados cromatográ<cos entre placas, en comparación con la TLC tradicional. A continuación se presenta
un análisis de las variables que se deben controlar para obtener resultados reproducibles en la identi<cación de artículos de origen
botánico usando HPTLC.
VARIABLES DE LA HPTLC
La placa es un sistema abierto afectado por factores ambientales, los cuales deben controlarse cuidadosamente. A diferencia de
la cromatografía en columna que es un sistema cerrado en el que las muestras se analizan de manera secuencial, en la HPTLC se
pueden analizar múltiples muestras en paralelo en la misma placa. Todas las etapas del proceso cromatográ<co planar son
independientes en cuanto a tiempo y espacio (proceso fuera de línea). Para cada una de las etapas—aplicación de la muestra,
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desarrollo del cromatograma, visualización, detección, documentación y evaluación—se pueden seleccionar libremente numerosos
parámetros. Esta característica única agrega una inmensa fexibilidad al método y hace del enfoque cromatográ<co planar un
complemento de las técnicas basadas en columna.
Durante el desarrollo del método, la gran cantidad de opciones disponibles para los diversos parámetros puede resultar
abrumadora, y, dependiendo de la combinación seleccionada, pueden resultar múltiples opciones que cumplan con el objetivo
analítico respectivo, aunque sean bastante distintas. Por este motivo, a menudo se dice que un determinado ajuste de parámetros es
“mejor” o “peor” que otro de acuerdo con las preferencias personales. En un ambiente de cumplimiento con las Buenas Prácticas de
Fabricación vigentes, la reproducibilidad y la integridad de los resultados son de gran importancia. Esta es la razón por la que los
parámetros individuales de la técnica de HPTLC deben ser seleccionados y combinados concienzudamente en una metodología
estandarizada de modo que se optimice el resultado <nal y se pueda comparar con los resultados obtenidos por distintos analistas.
Puede ser importante evitar etapas engorrosas y que consuman mucho tiempo, así como evitar el uso de sustancias químicas
peligrosas o tóxicas. La simplicidad y la claridad son aspectos deseables de los métodos prácticos.
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Para la identi<cación apropiada (distancia de migración/valores RF), todas las muestras deben aplicarse en una línea (virtual)
paralela al borde inferior de la placa. La distancia entre la línea de aplicación y el borde inferior (y) debe ser lo su<cientemente
grande para evitar que la muestra se sumerja en la fase móvil. Durante el desarrollo, la velocidad de la fase móvil se reduce a
medida que aumenta la distancia de desarrollo. Por consiguiente, el resultado <nal depende de la posición de aplicación con
respecto al nivel de fase móvil (Figura 2).
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Figura 2. Parte superior: Efecto de la posición de aplicación con respecto al nivel de fase móvil (5 mm). La distancia desde el
borde inferior va de 8–50 mm en incrementos de 3 mm. Parte inferior: Valores RF calculados para las diferentes distancias de
desarrollo efectivas. Muestra: partes aéreas de Houttuynia; fase móvil: una mezcla de acetato de etilo, ácido fórmico y agua (15:1:1,
v/v/v); derivatización: reactivo para productos naturales; detección: UV 366 nm.
Para obtener resultados reproducibles, se debe mantener constante la distancia desde el borde inferior (y) y también se debe <jar
la cantidad de fase móvil que se coloca en la cámara. Para minimizar el consumo de fase móvil, se usan cámaras de cubetas
gemelas. Por lo general, el nivel de fase móvil en dichas cámaras es de 5 mm. Se forma un menisco sobre la placa en la línea de
inmersión. Una muestra aplicada a y = 8 mm estará adecuadamente por encima de este menisco.
La distancia de la posición de aplicación con respecto a los bordes izquierdo y derecho de la placa (x) debe ser su<ciente para
evitar el denominado “efecto de borde” (Figura 3). Durante la producción, la mayoría de las placas pre-recubiertas desarrollan una
pequeña elevación en los bordes donde la capa es ligeramente más gruesa. Esto ocasiona que la fase móvil avance más rápido, y
las muestras que se aplican directamente en o muy cerca del borde elevado migrarán de manera irregular.
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La posición x1 a menudo se denomina “posición de aplicación”. Para evitar el efecto de borde, se debe tomar en cuenta la longitud
de la banda aplicada (l) al de<nir x2 como la distancia a partir del borde de la placa. Se requiere un mínimo de 15 mm para x2. La
distancia entre dos muestras (d1) también considera la longitud de la banda (l). Para d2, se recomienda un mínimo de 3 mm de
modo que las muestras no inter<eran entre sí cuando se apliquen volúmenes mayores. Se debe <jar la longitud de la banda (l) para
cada método, debido a que ésta afecta la concentración de muestras por banda si se aplica un volumen de<nido de solución
muestra. La cantidad aplicada (a lo largo de una longitud de banda de<nida) tiene un efecto sobre la intensidad de las zonas
separadas y puede afectar la capacidad de visualizar una zona particular de una huella dactilar. Un motivo para seleccionar bandas
más cortas sería la capacidad para aplicar más muestras sobre la placa. Sin embargo, debido a que la evaluación del cromatograma
se realiza principalmente de manera visual, se debe tener en cuenta que una banda se ve más “de<nida” (más como una banda y
menos oblonga) cuando tiene una longitud >5 mm (Figura 4). Una longitud de banda de 8 mm es un buen compromiso teniendo en
cuenta también que el capítulo 〈621〉 especi<ca bandas de 5–10 mm para placas para HPTLC.
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Figura 4. Efecto de la longitud de banda sobre la impresión visual de separación. De izquierda a derecha, 3 µL/3 mm, 5 µL/5 mm, 8
µL/8 mm, 11 µL/11 mm y 15 µL/15 mm. Muestra: Flores de Tilo; fase móvil: mezcla de acetato de etilo, ácido fórmico, agua y metil
etil cetona (50:10:10:30, v/v/v/v); derivatización: reactivo para productos naturales /polietilenglicol; detección: UV 366 nm.
Con los parámetros descritos, la organización estándar de la placa presentará 15 bandas de 8 mm de longitud. Si se va a analizar
un número menor de muestras, se recomienda aplicar determinaciones repetidas o dejar algunos carriles en blanco sobre la placa.
Durante la aplicación, las muestras se depositan con precisión sobre las placas para HPTLC en las posiciones y cantidades
de<nidas. Las soluciones muestra se pueden aplicar mediante contacto usando un capilar o una jeringa, o rociando la solución
muestra sin tocar la placa (técnica de rociado super<cial). Durante la aplicación por contacto, el disolvente de la muestra puede
producir una cromatografía circular (Figura 5). Por lo tanto, solo se deben aplicar volúmenes pequeños en un solo desplazamiento y,
de ser posible, solo se deben usar disolventes no polares. Durante la aplicación por rociado super<cial, el disolvente de la muestra
se nebuliza y evapora, creando zonas bien de<nidas independientemente de la polaridad del disolvente.
Si se realiza una aplicación manual, se puede usar una guía de aplicación para posicionar adecuadamente las muestras. No se
recomienda marcar la posición de aplicación con un lápiz debido a que la capa puede dañarse fácilmente.
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Figura 5. Parte inferior: Aplicación de la muestra como punto (carriles 1–4) y en banda (carriles 5–8) mediante aplicación por
contacto (carriles 1; 2; 5; 6) o técnica de rociado super<cial (carriles 3; 4; 7; 8); volúmenes de aplicación: 2 µL (carriles 1; 3; 5;7) ó 5
µL (carriles 2; 4; 6; 8); mezcla de prueba de colorantes en metanol. Parte superior: Cromatografía con tolueno como fase móvil.
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En una cámara cromatográ<ca ocurren cuatro procesos distintos, los cuales siempre suceden simultáneamente e interaccionan
entre sí (Figura 6).
Figura 6. Procesos que ocurren en la cámara cromatográ<ca (cámara de cubetas gemelas): (1) saturación de la cámara; (2)
preacondicionamiento de la placa; (3) evaporación; (4) formación de frentes secundarios.
La saturación de la cámara (Figura 6, proceso 1) por lo regular se realiza antes de colocar la placa en el interior de la cámara. La
fase móvil, que tiene una composición conocida, se coloca en el interior de ambas cubetas de la cámara y la hoja de papel de <ltro
en la cubeta posterior se humedece por completo. La saturación de la cámara ocurre una vez que el líquido en la cámara está en
equilibrio con su propio vapor, lo cual es una función de tiempo. Después de 20 minutos, la cámara por lo general logrará un grado
reproducible de saturación.
La placa debe colocarse dentro de la cámara de tal manera que el soporte descanse en posición vertical apoyado sobre la pared
delantera mientras que la capa debe estar orientada hacia la pared trasera. La parte seca de la capa absorbe el vapor de la fase
móvil desde la fase gaseosa (proceso 2) para lograr la saturación adsortiva, la cual ocurre cuando la super<cie queda recubierta por
una capa de moléculas de la fase móvil. Por lo general, este proceso puede disminuir los valores RF y afectar también la selectividad
de la separación. En la porción inferior de la placa, el líquido que asciende desde la cubeta forma la fase móvil. Dependiendo del
grado de saturación, podría evaporarse parte de la fase móvil de la placa (proceso 3). La fase estacionaria podría ocasionar la
separación de los múltiples componentes de las fases móviles debido a las diferentes interacciones de dichos componentes con la
fase estacionaria. Este proceso se ve afectado por el grado de preacondicionamiento.
En una cámara no saturada, la situación es bastante diferente. La cubeta posterior no contiene líquido ni papel de <ltro. La placa
se introduce inmediatamente después de la fase móvil, lo cual no permite su<ciente tiempo para lograr el equilibrio de saturación
gas–líquido. El preacondicionamiento tiene menos preponderancia, mientras que la evaporación y la posible formación de frentes
secundarios (proceso 4) dominan el proceso cromatográ<co. Ambos procesos por lo regular ocasionan alteraciones en los
cromatogramas, por lo que la separación se ve afectada.
En conclusión, cada cámara provee un resultado algo distinto, dependiendo de la geometría de la cámara, la presencia o ausencia
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de líquido y papel de <ltro en una de las cubetas, y el tiempo de espera antes de la introducción de la placa. Los cromatogramas
presentados en la Figura 7 se obtuvieron con una cámara de desarrollo automático con control de humedad. En este ejemplo, una
cámara saturada (A) provee una mejor separación que una cámara no saturada (C). Los cromatogramas son reproducibles siempre
que todas las condiciones sean iguales (A) y (B). Si el papel de <ltro para saturación no se cambia, sino que se reúsa sin secarlo, se
obtiene un resultado completamente distinto (D).
Figura 7. Efectos de las distintas con<guraciones de cámara a una humedad relativa de 33%: (A) y (B) saturadas, (C) no saturada,
y (D) saturada con papel de <ltro reutilizado. Muestra: Lapsana communis, estándares de referencia: ácido clorogénico (RF 0,38,
carril 1, Panel A), quercitrina (RF 0,58, carril 2, Panel A), fase móvil: agua, metanol, ácido acético glacial y cloruro de metileno
(2:3:8:15, v/v/v/v); derivatización: Reactivo de productos naturales/polietilenglicol; detección: UV 366 nm.
Para obtener resultados reproducibles, es necesario estandarizar cuidadosamente el desarrollo. La saturación de la cámara es
fácil de conseguir, al igual que la apropiada reproducibilidad de los tiempos. Las cámaras no saturadas son extremadamente
sensibles a los pequeños cambios y, por ende, desde un punto de vista práctico, deben evitarse, aunque fuesen capaces de lograr
una “mejor” separación. Una buena práctica es seguir mantener las distancias de desarrollo constantes (en las condiciones
óptimas) para todos los métodos, puesto que otros parámetros tales como la selectividad y el acondicionamiento de la fase
gaseosa afectan la separación en un grado mucho mayor.
SECADO
Después de que la fase móvil haya recorrido la distancia deseada, la placa debe retirarse de la cámara y secarse de manera
reproducible. La mejor manera de conseguir esto es exponiendo la placa en posición vertical a una corriente de aire frío. Las
temperaturas elevadas durante el secado pueden ocasionar difusión de los componentes volátiles de la muestra o que se evaporen
de la placa. Durante la evaporación de la fase móvil, los componentes de la muestra migran desde áreas más profundas de la capa
hacia la super<cie. El secado no uniforme a lo largo de la placa puede generar intensidades diferentes para zonas con las mismas
cantidades de sustancias.
EFECTOS DE LA HUMEDAD
El gel de sílice tiene una a<nidad extremadamente alta para el agua y es un agente desecante efectivo. Una placa para HPTLC
siempre está en equilibrio con el vapor de agua en la atmósfera del laboratorio (humedad relativa o HR). Los resultados
cromatográ<cos se ven afectados por la variación en la cantidad de agua adsorbida en la super<cie del gel de sílice. A mayor
humedad relativa, se absorberá mayor cantidad de agua. En primera instancia, esto reduce la “actividad” de la fase estacionaria y
ocasiona valores RF más altos. Además, debido a que el agua adsorbida puede convertirse en parte de la fase estacionaria, la
selectividad del sistema cromatográ<co a menudo cambia como respuesta a una variación en la humedad relativa.
Desafortunadamente, es casi imposible predecir el efecto que tendrá un cambio en la humedad relativa sobre una separación
dada (Figura 8). Algunas separaciones se ven más afectadas que otras y, en ocasiones, únicamente cambiarán algunas partes del
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cromatograma. Además, no existe una actividad ideal de la placa que pueda resolver todos los problemas de separación, y es difícil
usar cambios de actividad de<nidos de la fase estacionaria para infuir sobre la separación de la manera deseada. La mejor opción
es mantener la humedad relativa constante a un nivel moderado (p. ej., 33%) y, posteriormente, intentar ajustar la selectividad de la
fase móvil. Una excepción práctica es el “secado exhaustivo” de la placa efectuado con tamiz molecular. Es posible activar la placa
con calor (120° durante 20 minutos), debido a que en estas condiciones, el agua adsorbida en el gel de sílice se elimina de manera
efectiva, pero la placa se reequilibra a la humedad relativa ambiental al enfriarla y almacenarla, o durante la aplicación de la
muestra.
Figura 8. Efectos de la humedad relativa sobre la separación de diferentes muestras. (A) Hoodia gordonii, fase móvil: cloroformo,
metanol y agua (70:30:3, v/v/v); derivatización: reactivo de anisaldehído, detección: luz blanca. (B) Raíz de regaliz, fase móvil:
acetato de etilo, ácido fórmico, ácido acético y agua (15:1:1:2, v/v/v/v); derivatización: reactivo de ácido sulfúrico; detección: luz
blanca. (C) Acteína/rizoma de cimicífuga racemosa, fase móvil: tolueno, formiato de etilo y ácido fórmico (5:3:2, v/v/v);
derivatización: reactivo de ácido sulfúrico; detección: luz UV 366 nm. Humedad: *ambiental; 2%: tamiz molecular; 33%: solución
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saturada de cloruro de magnesio (MgCl2); 47%: solución saturada de tiocianato de potasio (KSCN); 75%: solución saturada de
cloruro de sodio (NaCl).
Para obtener resultados reproducibles independientemente de los cambios estacionarios o regionales en la humedad relativa de
los distintos laboratorios, es importante exponer la placa, con las muestras ya aplicadas, a una humedad relativa de<nida antes del
desarrollo. Esto mantendrá constante la actividad y la selectividad de la fase estacionaria. Se puede crear una humedad relativa
de<nida en contenedores cerrados tales como un desecador sobre soluciones salinas saturadas. Entre 20° y 25°, las soluciones
saturadas de cloruro de magnesio generan una humedad relativa del 33%; las de tiocianato de potasio (KSCN), una humedad
relativa del 47%; y las de cloruro de sodio (NaCl), una humedad relativa del 75%.
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Figura 9. Similitudes y diferencias entre múltiples muestras de especies relacionadas: (1) Cimicifuga racemosa; (2) Cimicifuga
foetida; (3) Cimicifuga heracleifolia/dahurica; (4) Cimicifuga pachypoda; (5) Cimicifuga americana.
CONCLUSIONES
Debido al amplio y creciente uso a nivel global de la HPTLC en la identi<cación botánica para monitorear la calidad de los artículos
de origen botánico, parece importante estandarizar concienzudamente los procedimientos analíticos implicados. Todos los
parámetros discutidos anteriormente deben especi<carse siempre para cada uno de los análisis por HPTLC. En la actualidad, los
laboratorios en diversos países pueden generalizar esta selección dentro del marco de los capítulos generales USP; no obstante, no
se cuenta con pautas acerca de cómo obtener resultados especí<cos de HPTLC de manera reproducible. Un procedimiento
estandarizado tal como el propuesto en el capítulo 〈203〉 puede llenar dicha brecha y servir como fundamento para la
armonización de los resultados obtenidos en diferentes laboratorios.
Información auxiliar- Por favor visite la sección de preguntas más frecuentes antes de comunicarse con la USP.
< 1064 > IDENTIFICACIÓN DE ARTÍCULOS Maria Monagas BDSHM2020 Botanical Dietary Supple-
DE ORIGEN BOTÁNICO POR CROMATO- Scienti<c Liaison ments and Herbal Medicines
GRAFÍA EN CAPA DELGADA DE ALTA
RESOLUCIÓN Consultas cientí<cas en español:
uspespanol@usp.org
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