Unidad N°5 - Análisis Clínicos III

Tecnicatura en Análisis Clínicos

Facultad de Ciencias Médicas

Recogida y procesamiento de muestras

El laboratorio de microbiología busca hallar el agente etiológico que
produce un determinado cuadro clínico y establecer una adecuada
terapia antimicrobiana.
Los datos generados por el laboratorio están influidos por la calidad de la muestra y su
estado al momento de la recepción de la muestra. Una muestra de mala calidad
puede hacer que no se detecte el agente infeccioso responsable del estado del
paciente. También puede dar lugar a la administración de una terapia inadecuada si
se administra un tratamiento para un organismo contaminante.
El laboratorio debe establecer procedimientos para la gestión de las muestras. El
personal técnico y bioquímico debe conocer en profundidad los procedimientos de
recepción y procesamiento de muestras.

Principios básicos para la recogida de muestras

El laboratorio de microbiología sólo puede procesar muestras
correctamente recolectadas. Es probable que las muestras a analizar
contengan organismos vivos. El objetivo del envase recolector debe ser
mantener la viabilidad de los organismos con la mínima contaminación.
Algunos de los principios básicos para la recolección de muestras destinadas al
laboratorio de microbiología son:
● En lo posible, la muestra debe ser recogida en la fase aguda de la infección y
antes de la administración de antibióticos.
● Seleccionar el lugar anatómico correcto de recolección de la muestra.
● Recoger la muestra utilizando la técnica y los suministros adecuados con una
contaminación mínima de la flora normal.
● Recoger la cantidad adecuada de muestra.
● Envasar la muestra en un recipiente o medio de transporte diseñado para
mantener la viabilidad de los microorganismos y evitar los riesgos derivados de
posibles fugas.
● Etiquetar la muestra de forma precisa con detalle del lugar anatómico preciso y
la información del paciente, mínimamente el nombre y apellido del paciente,
número de DNI, número de protocolo, y fecha y hora de recogida.
● Transportar la muestra al laboratorio con prontitud o tomar las medidas
necesarias para almacenarla en un entorno que no degrade los
microorganismos sospechosos.
● Notificar con antelación al laboratorio ante la sospecha sobre la presencia de
agentes patógenos inusuales.

Procedimientos de recogida
Las muestras para cultivos microbiológicos deben recogerse en
recipientes estériles. Para muestras como orina, heces y líquidos
biológicos no se recomiendan los hisopos para la recogida ya que no
proporcionan una cantidad suficiente, se contaminan fácilmente y
pueden reservarse, con la consiguiente pérdida de microorganismos.

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Los hisopos son apropiados para muestras del tracto respiratorio superior, oído
externo, ojo y tracto genital. Las puntas de los hisopos pueden ser de algodón, dacrón,
poliéster o alginato de calcio. Los hisopos con punta de algodón tienden a tener un
exceso de ácidos grasos que pueden ser tóxicos para ciertas bacterias.
Los hisopos de dacrón y de poliéster tienen una amplia gama de usos. Existen
sistemas de recogida de torundas que proporcionan medios de transporte y protegen
la muestra de la desecación.
Las lesiones, heridas y abscesos plantean muchos problemas en el laboratorio de
microbiología para la recolección de muestras. Una herida no es una fuente de
muestra apropiada para la recogida.
Antes de recoger la muestra, debe limpiarse la zona para eliminar la mayor cantidad
de flora microbiana comensal. Siempre que sea posible, la muestra debe recogerse
mediante aspiración con aguja, en lugar de hacerlo mediante frotis del margen de la
herida. El material aspirado debe ser colocado en un tubo estéril o un vial de
transporte, sin usar hisopos en la recolección.

Muestras recogidas por el paciente

En determinadas situaciones, son los pacientes quienes deben recoger la
muestra. El personal del laboratorio debe proporcionar a los pacientes las
instrucciones detalladas sobre cómo recoger la muestra y no se debe dar
por sentado que el paciente sabe el procedimiento de recolección.
Las instrucciones deben estar escritas en un lenguaje sencillo y con imágenes que
ayuden al paciente a comprender el procedimiento a medida que se le explica
verbalmente. Las muestras que suele obtener el paciente son orina, material fecal y
esputo, entre otras.

Requisitos de etiquetado
Es importante que el recipiente de muestra esté correctamente
etiquetado y en la solicitud figure la identificación correcta de la muestra.
La etiqueta de la muestra debe contener información suficiente para que
la muestra y la solicitud coincidan cuando se reciban en el laboratorio. La
correcta identificación de cada muestra incluye una etiqueta firmemente adherida al
contenedor con la siguiente información:
● Nombre y apellido del paciente.
● Número de DNI.
● Número de protocolo.
● Médico solicitante.
● Lugar de cultivo.
● Fecha y hora de recogida.
Para realizar el análisis de laboratorio, el servicio necesita información específica sobre
el paciente y la muestra. Todo lo que el laboratorio sabe sobre el paciente se aprende
del formulario de solicitud.
El formulario de solicitud de análisis debe consignar la siguiente información: nombre
y apellido del paciente, edad y sexo del paciente, ubicación del paciente, médico

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solicitante, localización anatómica específica, fecha y hora de recogida de la muestra,

diagnóstico clínico, antecedentes relevantes del paciente, agentes microbianos, etc.
Los formularios de solicitud pueden permitir el uso de medios específicos por parte
del personal del laboratorio o realizar ciertos ajustes en la incubación con el fin de
maximizar la recuperación del patógeno.

Seguridad
Las muestras recogidas para microbiología no deben suponer un riesgo
para la seguridad del personal que las manipula. Los recipientes con
fugas y las muestras con agujas son los más peligrosos. Todas las
muestras deben transportarse en recipientes secundarios a prueba de
fugas. El personal de laboratorio debe cumplir unas estrictas directrices de seguridad
cuando empiece a trabajar con las muestras del paciente.
Todo el personal que manipula muestras de pacientes debe llevar ropa protectora, y
las muestras sólo deben abrirse en una cabina de seguridad biológica.

Conservación, almacenamiento y transporte de muestras

El transporte de muestras es otro componente esencial del proceso
preanalítico de las pruebas microbiológicas. El objetivo principal en el
transporte de muestras al laboratorio es mantener la muestra lo más
cerca posible de su estado original, con un deterioro mínimo, y evitar riesgos para la
persona que la manipula.
Si el deterioro de la muestra provoca la muerte del agente causal presente o el
crecimiento excesivo de contaminantes, la muestra ya no es representativa del
proceso de la enfermedad.
Las muestras deben transportarse al laboratorio idealmente en los 30 minutos
siguientes a su recogida, y preferiblemente en las 2 horas siguientes. Los cambios
ambientales adversos de oxígeno, pH y temperatura pueden impedir la recuperación
de ciertos microorganismos y permitir el crecimiento excesivo de otros.
Si el transporte al laboratorio se retrasa, o si la muestra no se va a procesar tal como se
recibe en el laboratorio, la muestra se puede mantener almacenada en determinadas
condiciones o con el uso de conservantes, anticoagulantes, medios de transporte o
medios de cultivo.

Almacenamiento de especímenes
Las muestras que no se van a transportar o procesar inmediatamente se
deben conservar almacenándolas en determinadas condiciones. Algunas
muestras como orina, heces, esputo, secreciones bronquiales, hisopos,
catéteres y muestras víricas, pueden mantenerse a una temperatura
refrigerada de 4 °C durante 24 horas. Las muestras con patógenos sensibles al frío
deben ser mantenidas a temperatura ambiente. Si el líquido cefalorraquídeo no se
procesa de inmediato, puede conservarse refrigerada a 35 °C durante un máximo de 6
horas.

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Conservantes
Dos tipos de muestras en las que se pueden utilizar conservantes son la
orina y las heces. Los conservantes están diseñados para mantener la
población bacteriana de la orina a temperatura ambiente durante 24 hs.
Las muestras de heces para cultivo bacteriano que no se transportan inmediatamente
al laboratorio pueden refrigerarse pero, si el retraso es superior a las 2 horas, la
muestra puede añadirse al medio de transporte Cary-Blair.

Recepción y procesamiento de muestras

Prioridad de las muestras
Las muestras deben ser procesadas rápidamente tras su llegada al
laboratorio. A menudo es imposible procesar todas las muestras en
cuanto se reciben. Una gestión adecuada de las muestras debe incluir
directrices para priorizar su procesamiento.
Se puede utilizar un esquema de priorización de 4 niveles basado en la naturaleza
crítica del espécimen o el potencial de degradación del espécimen.
Las muestras del nivel 1 se clasifican como críticas porque representan una
enfermedad potencialmente mortal y provienen de una fuente invasiva. Requieren
procesamiento inmediato. Son: líquido amniótico, sangre, cerebro, líquido
cefalorraquídeo, válvulas cardíacas, líquido pericárdico.
Las muestras del nivel 2 no están protegidas y pueden degradarse rápidamente o
presentar un crecimiento excesivo de flora contaminante. Son: líquidos corporales,
hueso, drenaje de heridas, heces, esputo, tejido.
Las muestras del nivel 3 requieren cuantificación. El retraso de este tipo de muestras
puede afectar negativamente a la exactitud de la cuantificación. Son: punta de
catéter, orina, tejidos.
Si se pospone, el procesamiento de muestras nivel 2 y 3, debe iniciarse el proceso de
almacenamiento o conservación adecuados.
Las muestras del nivel 4 son especímenes que llegan al laboratorio en medios de
retención o transporte. Son: heces y orinas en medios de transporte, hisopos en
medios de transporte o solución fisiológica.

Muestras inaceptables y rechazo de muestras

La fase analítica del proceso de pruebas de laboratorio comienza con la
recepción de muestras. Una vez recibida, la muestra debe ser examinada
para garantizar que se ha seleccionado, recogido y transportado
correctamente.
La realización de pruebas en muestras de mala calidad proporciona información
engañosa que puede dar lugar a un diagnóstico erróneo y a un tratamiento
inadecuado. Las siguientes situaciones son ejemplos de muestras no óptimas, es
decir, son criterios de rechazo:
● La información de la solicitud no coincide con la de la etiqueta de la muestra.
● La muestra no tiene identificación.
● La muestra no se presenta en el recipiente adecuado o el recipiente tiene fugas.

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● La cantidad de la muestra es inadecuada para realizar las pruebas solicitadas.

● El tiempo de transporte de la muestra es superior a 2 horas y la muestra no está
debidamente conservada.
● La muestra está desecada.
● Se envía más de una muestra de la misma fuente del mismo paciente el mismo
día; los hemocultivos son una excepción.
Todas las muestras rechazadas requieren comunicarse con el recolector del
espécimen. Nunca se debe descartar una muestra antes de ponerse en contacto con
un miembro del equipo sanitario. El laboratorio debe documentar la situación,
indicando el motivo del rechazo de la muestra.
En determinadas situaciones puede ser necesario procesar una muestra que no sea
óptima. Las muestras que son imposibles de recoger o que requieren que el paciente
se someta a procedimientos invasivos pueden tener que procesarse
independientemente de la situación. El informe final debe incluir una anotación que
indique las condiciones de procesamiento de la muestra.

Observación macroscópica
El procesamiento de las muestras comienza con una observación
macroscópica. El aspecto de la muestra puede proporcionar información
útil. Las características físicas de la muestra deben documentarse.
Las anotaciones de la observación macroscópica deben incluir lo
siguiente, entre otros:
● Hisopo o aspirado.
● Consistencia de las heces.
● Presencia de sangre o moco.
● Volumen de la muestra.
● Turbidez de la muestra.
El examen macroscópico también permite al procesador determinar la idoneidad de
la muestra y la necesidad de un procesamiento especial. Se seleccionan áreas de
sangre y moco para cultivo y examen microscópico directo. Los cultivos anaerobios
pueden estar indicados si hay presencia de gas, mal olor o gránulos de azufre.

Clasificación de los medios de cultivo

Los medios de cultivo pueden agruparse según su estado físico, su
composición o su objetivo de uso.

Según el estado físico:

● Medios líquidos → facilitan el crecimiento del germen en todos los planos del
espacio. El crecimiento es más rápido que en el resto.
● Medios sólidos → limitan el crecimiento al punto donde se encuentra el
microorganismo, donde además se agotan más fácilmente los nutrientes, de
forma que permiten un crecimiento limitado y la observación de las
características del crecimiento.
● Medios semisólidos → permiten realizar con facilidad pruebas bioquímicas.

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Según el objetivo de aplicación:

● Medios generales → formulados para detectar la mayoría de los gérmenes
aerobios y facultativos. El más conocido es el agar sangre.
● Medios enriquecidos → contienen nutrientes específicos para microorganismos
exigentes, como el agar chocolate.
● Medios selectivos → están concebidos para promover el crecimiento de ciertos
microorganismos y simultáneamente la inhibición de flora no deseada.
● Medios diferenciales → se consigue una apariencia específica de un germen al
utilizar determinados sustratos y, por lo tanto, estos medios ayudan en la
identificación.
● Medios especiales → están formulados para permitir el crecimiento específico de
un microorganismo.
● Medios de transporte → se usan para preservar la supervivencia del
microorganismo desde que se toma la muestra hasta que se recibe en el
laboratorio y se siembra en el medio de cultivo.

Inoculación primaria
Tipos de medios de cultivo
Los medios de cultivo pueden dividirse en grupos definidos por la
capacidad de favorecer el crecimiento bacteriano. Los medios no
selectivos favorecen el crecimiento de la mayoría de los microorganismos no
exigentes. Un ejemplo es el agar sangre.
Los medios selectivos favorecen el crecimiento de un tipo o grupo de microbios pero
no de otro. Estos medios pueden contener sustancias inhibitorias como
antimicrobianos, colorantes o alcohol. Un ejemplo es el agar MacConkey.
Los medios diferenciales permiten agrupar los microbios en función de las diferentes
características demostradas en el medio.
Los medios enriquecidos contienen potenciadores para el crecimiento que se añaden
a agar para permitir el crecimiento de microorganismos exigentes. Un ejemplo es el
agar chocolate. Los caldos de enriquecimiento son medios líquidos diseñados para
favorecer el crecimiento de un número reducido de un organismo concreto,
suprimiendo al mismo tiempo el resto de la flora presente. Los caldos de
enriquecimiento se incuban durante un periodo determinado y luego se deben
subcultivar para aislar el organismo concreto. tal es el caso del caldo tioglicolato.

Selección de los medios de cultivo

La selección del medio de cultivo adecuado se basa en el tipo de
espécimen sometido a cultivo y en los organismos que probablemente
estén implicados en el proceso infeccioso. Las muestras que se recogen
de un lugar que contiene microbiota normal requieren tipos de medios que
disminuyan la flora bacteriana y que enriquezcan el crecimiento de los patógenos.
La selección de los medios primarios está estandarizada para el cultivo bacteriano de
rutina. Sin embargo, los laboratorios prefieren algún otro medio por su población de
pacientes o por circunstancias especiales.

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Algunas muestras requieren una sóla placa, mientras que otras requieren una batería
de placas. Los medios de cultivo primarios de rutina incluyen: agar no selectivo,
medios enriquecidos, medios selectivos y diferenciales, y caldos de enriquecimiento.

Preparación de las muestras

La mayoría de las muestras llegan al laboratorio en alguna de tres formas:
hisopo, tejido o fluido. Las muestras como fluidos corporales, pus, orina y
esputo se inoculan directamente en los medios seleccionados.
Los grandes volúmenes de fluidos corporales estériles se concentran para
aumentar la recuperación de las bacterias. La centrifugación y la filtración son
métodos de concentración de la muestra. A continuación, el sedimento se utiliza para
inocular los medios y preparar los frotis. Si la consistencia de la muestra es fina, debe
filtrarse y colocar la muestra sobre la superficie de la placa de agar.
Las muestras recibidas en hisopos pueden inocularse directamente en medios de
cultivo. La muestra debe ser recogida con dos hisopos: uno para inocular el medio de
cultivo y otro para hacer el frotis directo.
En algunos casos, el hisopo se coloca en 1 mL de caldo o solución salina y luego agitan
la muestra con un vórtex para desprender el material del hisopo y producir una
suspensión uniforme de los microorganismos.
Los tejidos pueden prepararse para el cultivo mediante homogeneización, en la que el
tejido se tritura con mortero y pilón, o con la ayuda de pinzas estériles.

Técnicas de aislamiento
Las muestras pueden inocularse en placas de agar utilizando una raya de
aislamiento de uso general para obtener una estimación semicuantitativa
del crecimiento. La muestra se aplica haciendo rodar el hisopo o
colocando una gota de muestra líquida en una pequeña zona del borde
de la placa y realizando la inoculación con el asa en anillo.
Los caldos deben inocularse colocando unas gotas de la muestra líquida en el tubo de
caldo o colocando el hisopo en el caldo.
El asa de inoculación se esteriliza a la llama directa y se deja enfriar completamente
antes de pasarla por el agar.
Existen varios tipos de formas de inoculación; su procedimiento depende del tipo de
muestra que se siembra y dependiendo del tipo de medio de cultivo.
Cuando se utiliza más de una placa de agar, el asa se flamea entre placas para evitar el
arrastre de un posible contaminante de una placa a otra.
Algunas muestras requieren una técnica cuantitativa para determinar el número de
bacterias presentes. Las muestras de orina se inoculan utilizando asas calibradas.

Siembra en placa
La siembra en placa se plantea con dos finalidades: el recuento o el
aislamiento de colonias.
● Para la siembra por recuento se deposita la muestra en el centro
de la placa, se traza una cruz y se extiende desde el centro al borde de la placa

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desde la cruz inicial mediante sucesivas estrías y se gira la placa 90° para
realizar un recorrido completo de la misma.
● La siembra por aislamiento se hace con una estría radial en la placa y la
extensión mediante sucesivas estrías perpendiculares en la mitad superior; se
continúa la siembra con el giro de la placa 90° y se cultiva el tercer cuadrante a
partir de las estrías del segmento anterior, hasta agotar la placa. El aislamiento
por agotamiento se emplea para separar cultivos muy poblados.
● La siembra por inundación se hace depositando la muestra sobre la placa
procurando que se difunda por toda la superficie con movimientos suaves de
balanceo. Es utilizada en la realización de antibiogramas.
● La siembra por goteo se hace con muestras líquidas en las que se espera poco
contenido bacteriano.
● Los catéteres se siembran por rodamiento, para lo que se utilizan segmentos de
no más de 4 cm y se arrastran por la placa tres o cuatro veces.
Una vez inoculadas, las placas se apilan y se incuban en posición invertida, para evitar
que la condensación que se produce contamine el cultivo.

Inoculación de medios líquidos

El cultivo de muestras en medios líquidos facilita el crecimiento de los
microorganismos ya que los mismos tienen mayor acceso a los
nutrientes y pueden proliferar en las tres dimensiones del espacio.
Cuando se inoculan tubos, la tapa del mismo no puede tocar la mesada de trabajo
sino que debe ser sostenida con el dedo meñique del operador.
Mientras se manipulan, los tubos deben mantenerse en posición oblicua para
protegerlos del polvo y la contaminación ambiental.
La inoculación en un tubo con caldo se hace con el tubo inclinado, y se deposita la
muestra frotando con el asa o el hisopo la pared interior en un punto que, al poner el
tubo en posición vertical, quede cubierto por el medio.
También se puede introducir el hisopo y frotarlo rotando el tubo o sencillamente se
puede dejar caer gotas de la muestra con una pipeta o jeringa.
Los medios en pico de flauta se siembran en zig zag a lo largo de la superficie interior
del tubo, partiendo desde la base hacia la zona más alta.
Cuando se inoculan medios semisólidos la siembra se efectúa pinchando el medio
con un asa en anillo o en punta.

Incubación
Una vez inoculado el medio, deben tenerse en cuenta las condiciones de
incubación. Las condiciones de incubación incluyen tanto la temperatura
como la atmósfera ambiental y están determinadas por el tipo de
muestra y los patógenos que puedan detectarse.
La mayoría de los cultivos bacterianos se incuban entre 35 °C y 37 °C. Los aerobios
crecen en el aire ambiente, mientras que los anaerobios no pueden crecer en
presencia de oxígeno y requieren una atmósfera anaerobia. Las bacterias
microaerófilas crecen con oxígeno reducido y en una atmósfera con CO2 aumentado.

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La mayoría de los cultivos bacterianos se mantienen durante 48 y 72 horas. Los

cultivos anaerobios y los caldos pueden mantenerse de 5 a 7 días.

Visualización microscópica
Generalmente la visualización es el primer paso del procesamiento
microbiológico de la mayoría de las muestras que llegan al laboratorio. El
examen microscópico se realiza como orientación diagnóstica,
directamente sobre la muestra clínica o bien sobre el cultivo que se
obtiene tras la siembra. Este examen permite valorar el componente celular y con ello
la calidad de la muestra, por su contenido en leucocitos como indicador de
inflamación; permite asimismo visualizar bacterias, su cantidad y sus características.
La observación permite predecir los resultados que se esperan en el cultivo, adelantar
la posible etiología del proceso infeccioso y orientar a la elección de un tratamiento
microbiano empírico.

Técnicas de observación microscópica

En general, la preparación de una muestra se hace siguiendo los procesos
de extensión, secado y fijación del material o emulsionando la muestra en
un portaobjetos, si se trata de la observación de una muestra en fresco.
Se han desarrollado varias modalidades de tinción: vitales, negativas, tinciones
simples y diferenciales. Para llevar a cabo una tinción se debe tener en cuenta:
● La extensión se hace depositando una gota o una pequeña porción de la
muestra que se obtiene con un asa sobre una gota de agua o suero salino en un
portaobjetos de cristal limpio.
● Cuando se sospecha que la presencia de gérmenes va a ser escasa, puede
concentrarse la muestra por centrifugación y preparar la extensión a partir del
sedimento.
● Para conseguir una preparación homogénea se puede hacer la extensión
depositando la muestra en el punto central del extremo del portaobjetos y, con
la ayuda de un cubreobjetos colocado entre los dedos de la otra mano en un
ángulo de 45°, se desliza la muestra a lo largo del portaobjetos.
● El proceso de secado siempre se debe hacer al aire libre. Se debe evitar las
corrientes de aire que puedan favorecer la dispersión de aerosoles peligrosos.
● Una vez seca, la preparación se fija con calor pasando el portaobjetos dos o tres
veces por la base de la llama de un mechero.
● Es importante esperar a que se enfríe antes de comenzar la tinción. La fijación
se obtiene también cubriendo la muestra con alcohol durante 2 minutos.

Examen en fresco
El examen se hace directamente en el microscopio, sin la tinción de la
preparación. Se sigue el siguiente método:
● Se extiende entre el portaobjetos y el cubreobjetos los
microorganismos que se investigan emulsionados en una gota de agua o suero
fisiológico. La solución no se fija.

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● Se procede al examen de la muestra en un microscopio óptico. Suele

examinarse con el objetivo de 40X y con el condensador bajo.
Se puede apreciar la morfología y la movilidad de células y microorganismos. La
información que aporta es limitada, porque en general todo el material celular es
transparente.

Tinciones simples
Se puede mejorar la observación mediante el uso de distintos colorantes
que tiñen uniformemente todas las estructuras y con ello aumentar el
contraste de células y microorganismos.
Las tinciones simples se pueden aplicar en fresco (tinción vital), así como en material
fijado. Son métodos sencillos, simples y baratos.
● Hidróxido potásico (KOH) al 10% → es útil para identificar elementos fúngicos
resistentes a soluciones alcalinas fuertes, una vez se ha digerido el material
orgánico de la muestra con KOH.
● Tinta china → se emplea como colorante una solución coloidal de carbón. Se
utiliza para detectar especies de hongos. Es útil para el examen de líquidos
biológicos, como el líquido cefalorraquídeo, ya que se puede realizar el
diagnóstico rápido de la meningitis criptocócica.
● Azul de lactofenol → se usa para el examen de hongos.
● Yodo (lugol) → se usa para la observación de parásitos en heces. El colorante
incrementa el contraste y permite distinguir los leucocitos de las estructuras
parasitarias.
● Azul de metileno → tiñe de azul leucocitos y bacterias.

Tinciones diferenciales
Las tinciones diferenciales resaltan la estructura del microorganismo.
Estas tinciones constan de 4 pasos: un colorante primario que tiñe
uniformemente todo el material, seguido de un mordiente que forma un
complejo con este colorante; a continuación se procede a decolorar, con ello se
elimina el colorante primitivo, excepto en las estructuras que han retenido el complejo
y, por último, se aplica un segundo colorante (secundario o de contraste) que tiñe los
gérmenes que no retuvieron el primario, así como el resto de la preparación y de este
modo se aprecia la diferenciación.

TINCIÓN DE GRAM
El método consiste en los siguientes pasos:
1. Colocación de la muestra en un portaobjetos con una gota de agua o suero.
2. Fijación por calor (con mechero o con tratamiento por alcohol).
3. Adición del colorante cristal violeta o violeta de genciana. Se espera 30
segundos y se lava con agua.
4. Tratamiento con lugol, que actúa como mordiente para formar un complejo
estable con el cristal violeta. Se espera 30 segundos y se lava con agua.

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5. Decoloración con alcohol o alcohol acetona al 30%. Se retira en cuanto se

observa que ya no se elimina colorante. Se lava con agua.
6. Tratamiento con colorante safranina, que actúa como colorante de contraste. Se
elimina con agua y se procede al secado.
La tinción de Gram aporta información sobre la morfología, disposición y composición
de las bacterias y permite diferenciar dos grupos fundamentales: grampositivas (color
violeta) y gramnegativas (color rojo-rosado).

TINCIÓN DE GIEMSA
Se utiliza una mezcla de azul de metileno y eosina. Se basa en el distinto carácter
ácido-base de los componentes celulares. La eosina tiene iones con carga negativa y
tiñe de color naranja y rosa los componentes básicos de las células; el azul de metileno
tiñe de azul y violeta los elementos ácidos celulares.
El método sigue los siguientes pasos:
1. Se fija la preparación con metanol durante 5 minutos y se deja secar.
2. Se cubre la muestra con el colorante Giemsa preparado en agua destilada al 3%.
Se deja actuar el colorante por 40 minutos y se lava con agua destilada.
El citoplasma de los protozoos se tiñe de azul verdoso, se tiñen de azul los cuerpos de
inclusión de virus y se observan en color violeta algunas bacterias de interés clínico.

OTRAS TINCIONES DIFERENCIALES

● Tinción de Gram modificada para anaerobios → utiliza carbolfucsina como
colorante de contraste. Se obtiene así una mejor visualización de los bacilos
anaerobios gramnegativos.
● Tinción de hematoxilina férrica → se usa para la identificación de protozoos
fecales. También permite observar larvas y huevos de helmintos.
● Tinción de azul de ortotoluidina → se emplea en la observación de
Pneumocystis.
● Tinción de verde malaquita → es útil para la visualización de esporas. Con esta
tinción, las esporas se tiñen de verde y las bacterias permanecen en color rosa.

Tinciones ácido-alcohol resistentes

Se utilizan tinciones ácido-alcohol resistentes para teñir microorganismos
que contienen ácidos grasos de cadena larga en su estructura, lo que los
hace resistentes a la coloración, salvo que ésta sea forzada con calor o
bajo la acción de un detergente.

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
Es la tinción de referencia de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR):
micobacterias, etc. El método consiste en las siguientes operaciones:
1. Se cubre la preparación, fijada previamente, con carbolfucsina. Se calienta
pasando un hisopo empapado con alcohol ardiendo sin permitir que hierva, se
espera 5 minutos a que se enfríe y se repite la operación hasta 3 veces. A
continuación se lava con agua.

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2. Se decolora con alcohol clorhídrico hasta que el portaobjetos aparezca

transparente. Se retira con agua.
3. Se colorea con azul de metileno, colorante de contraste y se retira lavando con
agua.
4. El microorganismo ácido-alcohol resistente se tiñe de rojo y el resto permanece
en color azul.

OTRAS TINCIONES ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES

● Tinción de Kinyoun → es una modificación de la tinción de Ziehl-Neelsen que
permite la tinción en frío con la misma utilidad.
● Tinción acidorresistente modificada → es similar a la tinción de Ziehl-Neelsen,
pero utiliza un decolorante más débil (alcohol sulfúrico).

Tinciones fluorescentes
Para la visualización de tinciones fluorescentes se requiere un
microscopio de fluorescencia, que se sirve de la propiedad de los
fluorocromos de emitir energía al ser sometidos a una luz ultravioleta.
● Tinción de auramina-rodamina → ambos fluorocromos actúan del
mismo modo que la carbolfucsina en la tinción de Ziehl-Neelsen; el decolorante
es alcohol clorhídrico y el colorante de contraste que se emplea es
permanganato de potasio. La técnica permite el cribado rápido de las
micobacterias en la rutina del laboratorio.
● Tinción de blanco de calcoflúor → es útil para teñir la pared celular de hongos y
parásitos de forma rápida. Puede combinarse con KOH para aclarar la muestra.
● Tinción de inmunofluorescencia directa → utiliza pigmentos fluorescentes
adheridos a anticuerpos específicos para el microorganismo que se desea teñir.

Técnicas de determinación del crecimiento

El crecimiento bacteriano se puede medir con varios sistemas:
● Se puede detectar en un contador de células, que mide el número
de bacterias suspendidas en un determinado volumen.
● Como medio óptico de recuento celular o bacteriano se utiliza
normalmente una cámara de Neubauer o de Petroff-Hausser.
● Existen métodos indirectos para detectar el crecimiento, como la medida de los
productos metabólicos de desechos de los microorganismos.
● En la turbidimetría, cuando se somete un tubo con una suspensión de bacterias
a una fuente de luz en un espectrofotómetro, se puede medir la transmitancia
de dicha suspensión en unidades de densidad óptica.

Descripción macroscópica de los cultivos

La descripción macroscópica de los cultivos responde a las técnicas de
aislamiento que se emplean, así como al tipo de medio de cultivo:
En medios líquidos el crecimiento se puede apreciar cierta opacidad con
distribución en anillo. Este anillo se observa en distinta posición a lo largo del tubo,

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según los requerimientos de oxígeno del germen en crecimiento: en la superficie se

sitúan los microorganismos aerobios estrictos, los microaerófilos dejan un segmento
libre de crecimiento en la superficie, los anaerobios estrictos se desarrollan en el fondo
del tubo y las bacterias facultativas aparecen en toda la longitud del tubo.
En medios sólidos el crecimiento se detecta mediante la observación de unidades
formadoras de colonias (UFC). El aspecto que presentan las colonias es muy variable y
forma parte de los caracteres fenotípicos que ayudan a identificar el microorganismo.
● El tamaño de la UFC puede variar de puntiforme a varios milímetros.
● El color habitual, blanco o grisáceo, puede mostrar matices amarillentos,
rosados, verdosos, etc. Es necesario también explorar las modificaciones del
color del medio, la presencia de hemólisis, etc.
● La forma habitual de la UFC es redondeada y de apariencia lisa, pero también
pueden mostrarse con aspecto festoneado, espiculado, con contorno regular o
irregular; en relación a su volumen pueden tener forma plana, elevada sobre el
medio o hundida sobre la superficie del agar.
● La consistencia y la textura otorgan a la colonia un aspecto seco o húmedo.
Pueden aparecer lisas, viscosas o mucosas, mates o brillantes, pueden ser
móviles o inmóviles sobre la superficie de la placa.
● El olor también ayuda a identificar una colonia, pero comporta riesgos y debe
hacerse con mucha precaución y sólo cuando se ha descartado que sea
algunas bacterias peligrosas.
Cuando se examina un cultivo, se ha de registrar el tiempo de crecimiento, el medio o
los medios en los que se observa el crecimiento y el aspecto externo de las colonias.

Pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas ponen de manifiesto las características
metabólicas de las bacterias. Pueden ser de varios tipos: las que
demuestran la presencia de una enzima preformada o las que evalúan la
capacidad de crecer en presencia de ciertos factores o de metabolizar
algunos sustratos que hay en el medio de cultivo.
Se pueden clasificar en 4 grupos: pruebas inmediatas, pruebas rápidas (lectura en
menos de 6 horas), pruebas diferidas (lectura en 18-48 horas) y pruebas de
sensibilidad/resistencia.

Pruebas inmediatas
● Catalasa → es una enzima que se encuentra en la mayoría de los
microorganismos que poseen citocromos. La catalasa convierte el peróxido de
hidrógeno en agua y el oxígeno se puede observar en forma de burbujas.
● Oxidasa → esta prueba detecta la presencia de oxidasa, enzima que activa la
oxidación del citocromo, el cual reduce el oxígeno molecular para producir
agua o peróxido de hidrógeno, según la especie.

Pruebas rápidas
● Ureasa → esta enzima desdobla la urea formando dos moléculas de amoniaco.

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● Hidrólisis del hipurato → detecta la presencia de hipuricasa, capaz de degradar

el hipurato sódico. Esta reacción se detecta al agregar ninhidrina.
● Indol → sirve para detectar la presencia de enzima triptófano desaminasa, que
degrada el triptófano y produce indol. Se revela mediante el reactivo de Kovacs.
● Pirrolidonil peptidasa (PYR) → detecta la cantidad de pirrolidonil peptidasa que
actúa sobre un determinado sustrato.
● Leucina aminopeptidasa (LAP) → se utiliza para la detección de esta enzima.

Pruebas diferidas
● Medio TSI (triple sugar iron) → es un medio sólido dispuesto en pico de flauta.
Lleva rojo fenol como indicador, glucosa, lactosa, sacarosa, citrato férrico
amónico y tiosulfato sódico para revelar la formación de sulfuro ferroso, que
ennegrece el tubo. La fermentación de la glucosa colorea en amarillo el fondo
del tubo y el resto del tubo queda de color rosa. La fermentación de lactosa deja
todo el tubo amarillo. Si se produce gas, el medio se rompe o se separa del tubo.
● Medio bilis-esculina → si es germen es capaz de hidrolizar esculina, se produce
esculetina, que reacciona con el citrato férrico y produce un complejo de color
negro-pardo.
● Reacción de Voges-Proskauer → mide la producción de acetoína con la adición
de un oxidante fuerte que oxida la acetoína a diacilo de color rojos.
● Fermentación ácida mixta → se demuestra con la capacidad de un
microorganismo de producir etanol y ácidos, como los ácidos láctico, butírico y
acético, que disminuyen el pH del medio y hacen virar el indicador rojo de
metilo a rojo cuando son positivos.
● Reducción de nitratos → sirve para detectar la capacidad de un organismo de
reducir nitrato a nitrito.
● Coagulasa → permite detectar la capacidad de coagular el plasma por acción de
la enzima coagulasa.
● Fenilalanina → la fenilalanina desaminasa es una enzima que capacita a un
microorganismo para desaminar el aminoácido fenilalanina formando ácido
fenilpirúvico, lo que provoca una acidez que se pone de manifiesto al añadir
unas gotas de cloruro férrico.
● Desoxirribonucleasa → ciertas bacterias tienen la capacidad de hidrolizar
enzimáticamente el ADN produciendo una mezcla de polinucleótidos.
● Descarboxilasas → la descarboxilación ataca el extremo carboxilo de los
aminoácidos para reducirlos a una amina y dióxido de carbono. Los tres
aminoácidos que se investigan son arginina, lisina y ornitina.
● Lipasa → esta enzima descompone las grasas en ácidos grasos y glicerol.
● Lecitinasa → en presencia de esta enzima se forma un halo opaco alrededor de
la colonia.
● Citrato de Simmons → con esta prueba se determina si un microorganismo es
capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono, con lo que se produce
una alcalinización del medio.

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● Malonato → se prueba la capacidad de los microorganismos de utilizar citrato

como única fuente de carbono, con lo que se produce una alcalinización del
medio.
Las galerías comerciales son sistemas semiautomáticos y automáticos que combinan
distintas propiedades (bioquímicas y morfológicas) en forma de galerías, paneles o
tarjetas miniaturizadas, que se incuban y se leen de forma automática.

Pruebas de sensibilidad/resistencia
Algunas de las pruebas utilizadas en microbiología son: novobiocina, bacitracina,
optoquina, solubilidad en bilis, entre otras.

Antibiograma
El tratamiento de una infección requiere conocer no sólo el
microorganismo que la produce, sino también su sensibilidad a los
antibióticos. De forma general, los antibióticos pueden clasificarse, según
su forma de actuación, en bactericidas y bacteriostáticos. Los antibióticos bactericidas
son los que destruyen bacterias y los antibióticos bacteriostáticos son los que impiden
la división celular, evitando que proliferen los microorganismos.

Mecanismos de actuación de los antibióticos

Los antibióticos pueden actuar a través de los siguientes mecanismos:
● Afectando la pared celular, lo que permite que salga el contenido celular o que
entre líquido, lo que diluye las células. De esta forma actúan las penicilinas, las
cefalosporinas, la vancomicina y la bacitracina.
● Alterando la membrana celular, con lo que se afectan los sistemas de transporte
de sustancias. Actúan así la anfotericina C, la polimixina y la colistina.
● Interfiriendo en la biosíntesis de proteínas. Los antibióticos pueden actuar en
los diferentes pasos de transcripción y traducción. Así operan el cloranfenicol, la
estreptomicina, la kanamicina, las tetraciclinas y los macrólidos.
● Inhibiendo la síntesis de ADN.
● Por antagonismo competitivo, como las sulfamidas.

Conceptos generales y terminología de los estudios de sensibilidad

Con relación con los antibióticos, las bacterias pueden ser susceptibles, intermedias o
resistentes.
● Susceptible → una infección producida por el microorganismo puede tratarse
adecuadamente con el antibiótico.
● Intermedio → una infección causada por el microorganismo puede tratarse con
las concentraciones adecuadas de antibiótico.
● Resistente → la infección no puede tratarse con dicho antibiótico.
En los estudios de sensibilidad antimicrobiana se utilizan los siguientes términos:
● Concentración inhibitoria mínima (CIM) → es la menor concentración de la
sustancia antimicrobiana con la que no se produce el crecimiento de un
determinado microorganismo.

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● Concentración letal mínima (CLM) → es la menor concentración de la sustancia

antimicrobiana con la que no quedan microorganismos viables de una
determinada cepa.
● Resistencia → un microorganismo es resistente a un agente antimicrobiano
cuando su sensibilidad es muy pequeña, de forma que se necesita una gran
concentración de este para impedir el crecimiento de aquel.
● Sensibilidad → concentración de un agente antimicrobiano con la que se inhibe
o elimina el crecimiento de un microorganismo.

Prueba de difusión en disco

Como medio se usa agar Müeller-Hinton, que se coloca en una placa de Petri, se deja
enfriar y se almacena en el refrigerador. Cuando se vaya a usar la placa, se coloca la
misma en la estufa de cultivo a 37 °C, con la tapa entreabierta, por unos minutos con
el fin de que se pierda la humedad por evaporación.
Para inocular el medio, se sumerge un hisopo con punta de algodón en la suspensión
bacteriana y se desliza el hisopo por toda la superficie de la placa hasta conseguir un
inóculo uniforme.
Los discos (monodiscos) con los antibióticos se aplican sobre la superficie de la placa
inoculada con pinzas estériles. Se presionan los discos sobre el agar con las pinzas
para asegurar el contacto completo con la superficie del agar.
Quince minutos después de aplicar los discos, se invierten las placas y se las incuba a
37 °C. Transcurridas de 16 a 18 horas, se examinan las placas y se miden los diámetros
de las zonas de inhibición.
El antibiótico se difunde en el agar y, cuando alcanza concentraciones inhibitorias,
impide el crecimiento del microorganismo. El diámetro de la zona de inhibición está
correlacionada con el logaritmo de la CIM.
El procedimiento de difusión en disco, además de ser una prueba estandarizada, y ser
reproducible, es una prueba sencilla que no necesita equipos especiales y proporciona
resultados categóricos que se interpretan fácilmente, y es la más flexible de las
pruebas disponibles, ya que pueden seleccionarse los discos. Asimismo, es la más
barata de las pruebas de sensibilidad.

Bibliografía
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📚 Fundamentos de interpretación clínica de los exámenes de laboratorio. Ruiz Reyes,
G., Ruiz Argüelles, A. 3° Edición. Editorial Panamericana (2017)
📚 Técnicas y métodos de laboratorio clínico. González de Buitrago, JM. 3° Edición.
Elsevier (2010)
📚 Textbook of Diagnostic Microbiology. Mahon, C. 6° Edición. Elsevier (2019)
📚 Diagnostic Microbiology, Bailey & Scott´s. Tille, P. 14° Edition. Elsevier (2017)
📚 Medical Microbiology. Kayser, F., Bienz, K., Eckert, J., Zinkernagel, R. 10° Edición.
Thieme Stuttgart (2005)

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