UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE MEDICINA - ESCUELA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

TÉCNICAS DE INVESTIGACIÓN EN BIQUIÍMICA

CENTRIFUGACIÓN CROMATOGRAFÍA
La centrifugación es una técnica de separación que se utiliza para aislar o
concentrar partículas suspendidas en un líquido aprovechando la diferente ¿QUÉ ES?
velocidad de desplazamiento según su forma, tamaño o peso al ser
sometidas a una fuerza centrífuga. Una técnica de separación de
La ley de Stokes determina que, bajo determinadas condiciones de proteínas, fundamentándose en
centrifugación, cada partícula sedimenta a una velocidad diferente, de propiedades fisicoquímicas,
modo que las partículas de mayor tamaño equivalente y densidad tenderán como:
a sedimentar en primer lugar, siendo el tamaño la variable de mayor Tamaño
influencia. carga
hidrofobicidad
Capacidad de unión al
ligando
Solubilidad
Adsorción
Volatilidad
Se desarrolla en dos fases:
Fase estacionaria
Fase móvil o eluyente

DESCRIPCIÓN DEL EQUIPO CLASIFICACIÓN

Según la disposición de la fase
estacionaria
Cromatografía en columna
Cromatografía plana
TUBOS En papel
Capa fina

Según el estado físico de la fase móvil y estacionaria

Cromatografía de líquidos: la fase móvil es un líquido y la estacionaria
puede ser sólido o líquido inmiscible en un sólido.
Cromatografía de gases : la fase móvil es un gas y la estacionaria sólido o
líquido
Máquina que aplica Cromatografía de fluido supercrítico: fase móvil es un fluido supercrítico y la
CENTRÍFUGAS una fuerza centrífuga
estacionaria puede ser sólido o líquido.
sostenida para
impeler la materia
hacia fuera del
centro de rotación

ROTORES Según los mecanismos físico o químicos responsables:

Cromatografía de exclusión de tamaño
El rotor es la parte de
la centrífuga que Las proteínas emergen en orden
descente de sus radios de
sostiene los tubos de stokes
muestra durante la
centrifugación. .
Radios de stokes
Es la medida del volumen
efectivo ocupado por la
APLICACIONES proteína a medida que
PROCEDIMIENTO desciende
IMPORTANTES
Colocar el tubo de muestra en uno Cromatografía por intercambio iónico
de los receptáculos del rotor.
Por interacciones carga
Compensar el tubo de muestra carga de la proteína y los
colocando otro tubo al lado opuesto, grupos funcionales , la elusión
se da en orden inverso a
con un volumen de líquido idéntico al dicha interacción.
de la muestra.
Cromatografía por afinidad
Cerrar herméticamente el
compartimento del rotor y poner en Se fundamenta en la selectividad a
funcionamiento la centrífuga. ligandos, donde luego las proteínas
purificadas van eluyen por competencia
con ligandos libres o usando urea, ph
ácido, etc.
Cromatografía por interacción hidrofóbica

RESPONSABILIDAD SOCIAL UNIVERSITARIA PROMOCIÓN LXI

INMUNOLOGÍA 2023 GRUPO 11
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TÉCNICAS DE INVESTIGACIÓN EN BIQUIÍMICA

ELECTROFORESIS
Es una de las metodologías más utilizadas en el
laboratorio en todo lo relacionado con el trabajo
con ácidos nucleicos.
Mediante la electroforesis podemos separar
fragmentos de ADN, ARN o proteínas en función de
su tamaño y carga eléctrica
Se usa una corriente eléctrica para mover las
IMPORTANTE moléculas a través de un gel o de otra matriz.
Los poros del gel o la matriz actúan como un
tamiz, lo cual permite que las moléculas más
pequeñas se muevan más rápido que las
moléculas más grandes
ESPECTROFOTOMETRIA
Es una técnica de investigación empleada en
bioquímica para medir la cantidad de luz
absorbida por una reacción química.
La mayoría de las reacciones químicas clínicas de
rutina implican vincular una reacción química o
enzimática con el desarrollo de un producto
coloreado que se mide mediante
espectrofotometría de absorción.
Diferentes compuestos absorben luz a diferentes longitudes
de onda; la energía de la luz absorbida excita los electrones
a un orbital inestable.
La absorbancia de la luz a una longitud de onda específica
en el rango visible o ultravioleta es directamente proporcional
a la concentración del producto final coloreado y, por tanto,
a la concentración del analito en la muestra.

Preparación del
gel de agarosa SE UTILIZA UN → ESPECTROFOTÓMETRO

Instrumento capaz de emitir luz en diferentes longitudes

Preparación de
de onda y medir la cantidad de luz absorbida o
P las muestras transmitida por la muestra en cada longitud de onda.
R El espectrofotómetro genera un gráfico llamado
espectro de absorción, que muestra cómo la muestra
O interactúa con la luz en función de la longitud de onda.
C
E Carga de las
muestras y corrida
D del gel PROCEDIMIENTO
I
M Se coloca una muestra en una
celda o cubeta transparente, que
I permite el paso de la luz.
Conectar los cables a la
E fuente alimentación y La muestra se expone a una
N aplicar un voltaje fuente de luz, que emite una serie
T de longitudes de onda
O Un detector mide la intensidad
de la luz transmitida a través de
la muestra.

Esta intensidad se compara con la intensidad de la luz incidente, y se calcula

TECNICAS
Electroforesis de proteinas en gel de
poliacrimida
Mas usada para la purificación,
análisis y caracterización de
proteínas.
Electroforesis de proteínas en gel de
agar.
mas empleados para separar acidos
nucleicos, como fragmentos de ADN.
VENTAJAS
Facilita la separación de una mezcla
de proteínas a partir de su peso
molecular.
El uso de gel de poliacrilamida hace
que sea estable en un amplio rango
de pH, temperatura y fuerza iónica.
Método de poca duración, de baja
complejidad para la separación e
identificación de proteínas
la absorbancia de la muestra.
VENTAJAS
Permite la determinación rápida y
precisa de la concentración de
sustancias químicas en una muestra.
Puede ser aplicada en diferentes
áreas como la bioquímica, la
farmacología o la química
ambiental.
VENTAJAS Es una técnica no destructiva, lo que
significa que la muestra analizada
Esto no se puede utilizar en no se ve afectada durante el
ácidos nucleicos. proceso de medición.
No se puede llegar a determinar Es una técnica relativamente
la actividad enzimática, económica y fácil de usar. Los
equipos espectrofotométricos son
interacciones proteicas,
accesibles en términos de costo y la
cofactores proteicos, etc. en las
preparación de muestras suele ser
proteínas aisladas.
sencilla, lo que facilita su
Las mediciones no suelen ser tan
implementación tanto en
precisas laboratorios académicos como en la
industria.
DESVENTAJAS
Esta técnica solo proporciona
información sobre la cantidad de
sustancias presentes en una
muestra, pero no permite identificar
las diferentes componentes de
dichas sustancias. Por lo tanto, para
obtener información más detallada
sobre una muestra, pueden ser
necesarias técnicas adicionales.
Puede verse limitada por la
interferencia de otras sustancias
presentes en la muestra. Si la
muestra contiene compuestos que
absorben en la misma región del
espectro que el analito de interés,
puede haber una sobreestimación o
subestimación de la concentración
real.

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INMUNOLOGÍA 2023 GRUPO 11
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TÉCNICAS DE INVESTIGACIÓN EN BIQUIÍMICA

TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE REACCIÓN EN CADENA DE POLIMERASA
Implica el aislamiento y manipulación del DNA para elaborar moléculas
quiméricas, así como varias técnicas y reactivos únicos. Se basa en la FUNDAMENTO PROBLEMA: ↓ Disponibilidad y concetración
creación de nuevas combinaciones de segmentos de DNA que no se de ácidos nucleícos
encuentran de manera natural
Nucleasas de Restricción: Rotura específica del DNA
TÉCNICAS Secuenciación: Determina límites de un gen
Hibridación de ácidos nucleicos: Localización de OBSERVACIÓN:
UTILIZADAS secuencias de DNA/RNA
Clonación del DNA: Fragmento de DNA se integra a
una bacteria generando copias idénticas

ENZIMAS DE RESTRICCIÓN Permite la amplificación in vitro de fragmentos de ADN a partir

de una cadena de ADN molde.
2022
Se notificó 179 casos de transmisión silvestre DESCRIPCIÓN DEL EQUIPO
distribuidos en la región amazónica y algunos EQUIPO:
valles interandinos y 39 casos de rabia canina
focalizados en la provincia de Arequipa y un Termociclador.
caso en el distrito de Puno. COSUSTRATOS :
2023 El molde de ADN, los
desoxirribonucleótidos, los
No se notificaron casos de rabia humana. Pero cebadores o primers y la enzima
sí 2 casos de rabia canina en Arequipa, en el ADN polimerasa.
distrito de Alto Selva Alegre y Sabandía.
MEDIO DE REACCIÓN :
Tubo de ensayo.

PROCEDIMIENTOS
CLONACIÓN CELULAR DESNATURALIZACIÓN: NOTA: Las etapas 2, 3,
+ Las cadenas de ADN son calentadas y 4 "n" veces, hata
alcanzar la
separadas en cadenas simples a 95 °C. amplificación deseada
Amplifica el DNA y permite producción de moléculas de DNA idénticas + Tiempo = 20-30 seg. (depende de la # de
para uso diverso triple enlace G-C )
HIBRIDACIÓN:
FUNCIONES + Unión de los primers a las dianas en el
Clonar una secuencia ADN (en el extremo 3')
específica, para EXPRESAR +Procedimiento: máxima especificidad y
PROTEÍNA sensibilidad (50-60 °C)
ELEMENTOS + El éxito de la unión depende del # de
DNA pasajero, quimérico o copias del ADN diana y el tiempo
híbrido (Inserto que deseo EXTENSIÓN:
clonar) ANÁLISIS DEL PRODUCTO:
+ Se alcanza la T° óptima del
Vector (Plásmidos bacterianos, funcionamiento de la ADNpol
se replican con independencia) + Da buenos resutados usar
Huesped (E. coli, maquinaria de ETAPAS tiempos de 20-40seg para
500pb hasta 1,2 kilobases
replicación) 1. Aislamiento de DNA gracias a
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DESNATURALIZACIÓN:
2. Preparación del VECTOR + Las hélices de separan por la T°
3. Unión del FRAGMENTO de +Es más corta que la primera,
DNA FORÁNEO a un VECTOR depende del diseño de cada PCR
(Plásmido) FASE DE EXTENCIÓN FINAL:
4. Introducción de VECTOR-
INSERTO (Híbrido) en HUESPED + Se añade un periodo de incubación a
72° de 5-12min
por TRANSFORMACIÓN + Y se completa la elongación
5. Propagación (Cultivo) y
selección de
TRANSFORMANTES (Expresión APLICACIONES IMPORTANTES
+ rápido)
6. Estabilidad de información Detección de enfermedades hereditarias
genética (GENOTECA) CONSIDERACIONES: Detección de enfermedades infecciosas
Técnica de alta sensibilidad Test de paternidad
Gran reproducibilidad
Gran eficiencia Análisis de ADN antiguo
Genera resultados Comparación de la expresión genética
confiables en poco tiempo Mutagénesis (cambios genéticos)
y fáciles de analizar
Genotificación de polimorfosis
Hallar cantidades pequeñas de células
cancerosas
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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REFERENCIAS
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https://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/centrifugaci
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8. Graham J. Biological Centrifugation. Garland Science; 2020.