Espectrometría y Fluorometría

Dpto. BOS. Área de Fisiología Vegetal

Jesús Pascual (pascualjesus@uniovi.es). Despacho 310.
 ¿Por qué vemos sustancias coloreadas?

Espectro de absorción de disOntos compuestos:

¡Parte del espectro es absorbido y parte es reflejado!

Ejemplo de moléculas vegetales que tienen un sistema de enlaces

conjugados y estructura atómica que emite colores vivos (cromóforo):
Antocianinas Flavonoides Taninos+Flavon. Carotenos
Qué le puede ocurrir a la luz
Dispersión: al atravesar un material las ondas lumínicas se separan en función de su
longitud de onda. Por ejemplo, al atravesar un prisma las ondas son más desviadas por la
refracción cuanto menor sea su longitud de onda.

Refracción: cambio de dirección que experimenta una onda al pasar de un medio a otro.
Se produce cuando los índices de refracción de los medios son diferentes y las ondas
inciden de forma oblicua.

Difracción: fenómeno físico por el cual las ondas se desvían al encontrar un obstáculo o
atravesar una rejilla.
Los fenómenos de dispersión y difracción son empleados por el monocromador para seleccionar una longitud de onda.

Dispersión-Refracción Refracción Monocromador

¿Qué ocurre cuando la radiación atraviesa nuestra muestra?
Absorción: Al atravesar una solución, los analitos que se encuentran en ella (disueltos o
en suspensión) van a absorber parte de la radiación incidente. Esto ocurrirá de forma
caracterísFca para cada molécula, en función de la transición electrónica producida.

Transición electrónica: La luz vis o UV puede ser absorbida por los electrones de valencia,
que son “promocionados” a un estado excitado. Si la energía (frecuencia) de la onda
incidente es correcta, estos electrones ocuparán un orbital vacío. Las diferencias entre
energías absorbidas dependerán de los disFntos orbitales. La energía absorbida se
disipará en forma de calor, o de calor + luz de energía más baja (fluorescencia,
fosforescencia).
¿Qué ocurre cuando la radiación atraviesa nuestra muestra?

Emisión: Proceso por el cual los electrones excitados retornan a su estado

fundamental emitiendo luz. Estas emisiones se denominan radiactivas y pueden ser
fluorescentes o fosforescentes. La energía de la luz emitida siempre es menor a la
longitud de onda incidente (llamada de excitación).
Internal =
internal
conversion =
disipación en
forma de calor

Fluorescencia y
Fosforescencia

Fluorescencia de la clorofila, feofiCna, y cPPB Fosforescencia SYBR Green, una molécula fluorescente
al ser expuestas a radiación UV.
Transmitancia y Absorbancia

Transmitancia óp-ca: Fracción de luz incidente, a una longitud de onda definida, que pasa a través
de una muestra. T = I / I0 I0: Intensidad rayo incidente, I: Intensidad tras pasar por la muestra.
Absorbancia óp-ca: -Log10(I/I0) = -Log10(T)

Absorbancia y transmitancia son úIles en una región específica del campo electromagné-co (160-
780 nm, UV-Vis). No siendo úIl en longitudes de onda fuera de ese rango.

En los estudios espectrofotométricos se • La disolución del analito debe mantenerse en

suele trabajar con la absorbancia. Puesto
que esta se comporta de manera lineal.
Relación entre Absorbancia y Transmitancia:
algún Ipo de recipiente transparente, o cubeta.
• En las dos interfases aire/pared de la cubeta, así
como en las dos interfases pared/disolución
Ienen lugar reflexiones.
• La atenuación del haz resultante es un factor
importante.
Transmitancia y Absorbancia

Aproximadamente el 8,5% de un haz de luz amarilla se pierde por reflexión en su paso a través de
una cubeta de vidrio rellena de agua.

La atenuación del haz puede ocurrir como consecuencia de la dispersión causada por moléculas
grandes y, a veces, de la absorción por las paredes del recipiente.

Para compensar todos estos efectos, la potencia del haz transmiIdo por la disolución del analito se
compara con la potencia del haz transmiIdo por una cubeta idénIca que sólo conIene disolvente.
A esta muestra se la denomina “blanco”.
Ley de Lambert-Beer
Además, cuando un haz de luz atraviesa un medio absorbente de espesor constante, la cantidad de
energía luminosa absorbida por el medio varia en forma directamente proporcional a la concentración
del absorbente en el medio (Ley de Beer)

A=-Log10(T)=Log10(I/I0)=εbc

Denominándose ε – Coeficiente de extinción molar (µg/mL)-1 cm-1 o M-1cm-1

b – distancia recorrida por la luz (estándar 1 cm)
c – concentración

Carácter aditivo de la absorbancia: de una disolución es igual a la suma de absorbancias de sus

componentes
b I0

I0 I I
Límites de la Ley de Lambert-Beer

Limitaciones reales de la ley

-A concentraciones altas (generalmente > 0,01 M), la distancia media entre las moléculas
responsables de la absorción disminuye hasta el punto en que cada molécula altera la distribución de
carga de las moleculas vecinas.
-e depende del índice de refracción de la muestra. Como la magnitud de la interacción depende de
la concentración, la aparición de este fenómeno da lugar a desviaciones de la linealidad entre la
absorbancia y la concentración.

Limitaciones Químicas
Se produce cuando el analito se disocia, asocia o reacciona con el disolvente para dar productos que
presentan propiedades de absorción diferentes de las del analito.

HIn H+ + In-
Color 1 Color 2

Limitaciones Instrumentales
El cumplimiento estricto de la Ley de Beer sólo se observa para radiaciones monocromá-cas
(radiación formada por una sola longitud de onda) y éstas en la prácIca no se consiguen, ya que con
los disposiIvos disponibles (filtros, monocromadores) se obIenen una banda de longitudes de onda
más o menos simétrica en torno a la deseada
 Espectrometría, conceptos básicos

Esquema de un
espectrofotómetro

Fuente de radiación
• Lámpara de Deuterio o Hidrógeno Lámpara de
Deuterio
(Región UV 160-375 nm)
• Lámpara de Tungsteno
(Región Visible, IR cercano)
• Arco de Xenón Lámpara de
Tungsteno
(Espectro conFnuo 150-800 nm)
 Espectrometría, conceptos básicos

Esquema de un
espectrofotómetro

Selector de longitudes de onda

• Filtros
• Monocromadores
Recipiente para muestra
• Cubetas de cuarzo, sílice, plásFco.
Detector de radiación
• Fotodiodos o fotomulFplicadores
Tipos de espectrofotómetros: haz sencillo y doble haz
Tipos de espectrofotómetros: Diodos

El espectrofotómetro de disposiAvo de diodos

El espectrofotómetro de disposiFvo de fotodiodos uFliza una ópFca inverFda
respecto del convencional: toda la luz de la fuente atraviesa la muestra, luego es
dispersada en un monocromador que en lugar de una ranura de salida Fene en el
plano focal un disposiFvo que integra en un pequeño circuito varios cientos de
detectores Fpo fotodiodo de silicio. El número de elementos varía actualmente
entre 64 y 4096, siendo los más comunes de 512 y 1024 elementos. La resolución
de estos sistemas es menor (2nm) a la de un espectrofotómetro clásico
Tipos de espectrofotómetros: espectrofotómetros de microvolumen
(Fibra óptica)
 Importancia de la resolución de un instrumento

Resolución-ancho espectral del instrumento (spectral bandwidth):

Como regla general, el ancho de media banda instrumental debe ser como máximo 1/10 del ancho
de media banda espectral de la banda de absorción a medir. Dado que la mayoría de las moléculas
en solución presentan en fase líquida bandas de absorción con anchos medios entre 20 y 40 nm, un
instrumento con “resolución” de 2 nm es generalmente adecuado. A veces encontramos casos
parJculares (Ej.: vitamina B12) con anchos de banda del orden de 10 nm. En este caso, la
cuanJficación con un instrumento de 2 nm daría un error por defecto del orden del 2-3%, mientras
que con un equipo de 1nm de ancho de banda el error sería despreciable.
 Importancia de la resolución de un instrumento

0.1nm de resolución 2nm de resolución

Resolución-ancho espectral del instrumento (spectral bandwidth):

Como regla general, el ancho de media banda instrumental debe ser como máximo 1/10 del
ancho de media banda espectral de la banda de absorción a medir. Dado que la mayoría de
las moléculas en solución presentan en fase líquida bandas de absorción con anchos medios
entre 20 y 40 nm, un instrumento con “resolución” de 2 nm es generalmente adecuado. A
veces encontramos casos parFculares (Ej.: vitamina B12) con anchos de banda del orden de
10 nm. En este caso, la cuanFficación con un instrumento de 2 nm daría un error por defecto
del orden del 2-3%, mientras que con un equipo de 1nm de ancho de banda el error sería
despreciable.
CuanMficación y fenoMpado de culMvos de microalgas

¿Cómo elegir la longitud de onda?

Abs 500 nm
Abs 600 nm
Abs 720 nm
Los infrarrojos nos permiten cuantificar la transpiración
Las medidas de fluorescencia de la clorofila son un gran indicador
del estado fisiológico de una planta
El marcador de estado fisiológico más empleado en plantas es el
cociente Fv/Fm. Esta basado en la medida de la fluorescencia
mínima (F0) y máxima (Fm) de la clorofila tras una adaptación a la
oscuridad (20-30 min).
Fv/Fm es un raFo normalizado dividiendo la fluorescencia
variable por la máxima, y representa la eficiencia cuánFca
máxima del PSII. Las plantas en condiciones ópFmas presentan
valores entre 0.79 to 0.84. Valores menores indican que la
Fluorímetro planta está someFda a algún Fpo de estrés.
Sistemas de fenoFpado masivo a nivel de laboratorio o de parcela:
Imagen hiperespectral

La imagen hiperespectral captura información

tanto espectral como espacial. La combinación
de esa información en una matriz de datos 3D
(información espacial en 2D + 1D multiespectro)

Saric et al., 2022. Trends in Plant Science. h/ps://doi.org/10.1016/j.tplants.2021.12.003

Imagen hiperespectral

Mishra et al., 2017. Biosystems Engineering. h/ps://doi.org/10.1016/j.biosystemseng.2017.09.009

Aplicaciones imagen hiperespectral en el fenoMpado de plantas
Detección de infecciones por patógenos

Botry4s cinerea,
un hongo necrotrofo

Col-0: genoCpo silvestre, resistencia intermedia

cyp79 b2/b3: mutante suscepCble
lacs2-3: mutante resistente

Pavicic et al., 2020. Plants. h/ps://doi.org/10.3390/plants10010158

Aplicaciones imagen hiperespectral en el fenotipado de plantas
Detección de infecciones por patógenos

Pavicic et al., 2020. Plants. h/ps://doi.org/10.3390/plants10010158

Aplicaciones imagen hiperespectral en el fenoMpado de plantas
Detección de infecciones por patógenos
Col-0: genoCpo silvestre, resistencia intermedia
cyp79 b2/b3: mutante suscepCble
lacs2-3: mutante resistente

Pavicic et al., 2020. Plants. https://doi.org/10.3390/plants10010158

Aplicaciones imagen hiperespectral en el fenoMpado de plantas
Evaluación del estado nutricional

Liu et al., 2020. Sensors. h/ps://doi.org/10.3390/s20164550

Sistemas automaMzados de fenoMpado a gran escala

hYps://www.youtube.com/watch?v=zVo5T
09J9tQ

hYps://datacloud.helsinki.fi/index.php/s/y
DJXsy2oPKJirb3

https://www.youtube.com/watch?v=t8zzM2Yj13s