II.2.1.

3 Determinación de la actividad de lipoxigenasa

La determinación de la actividad de lipoxigenasa cuantitativa fue realizada en las
muestras sin tratamiento y en las inactivadas por 1, 1.5 y 2 minutos de tratamiento térmico
mediante el Método Surrey Modificado (Surrey, 1964). Para la preparación del sustrato se
disolvieron 2.5 ml de buffer borato de pH 9 0.05 M junto con 0.125 ml de Tween 20.
Luego se
agregaron 0.125 ml de Ácido Linoleico dispersando y 0.35 ml de hidróxido de sodio
agitando
hasta lograr un color traslúcido. Luego se llevó a pH 6.4 con ácido clorhídrico.
Para el extracto enzimático, se extrajo la enzima homogeneizando 10 gramos de harina
de arveja con 300 ml de agua destilada a 1 °C, en licuadora durante 1.5 y 1 minutos a
velocidad media. Luego se filtró inmediatamente a través de un colador de malla abierta y
se
utilizó el extracto enzimático en forma inmediata para la mezcla reaccionante. La solución
sustrato (27 ml) fue transferida a un vaso de precipitado ubicado en un baño termostatizado
a
25 °C. Se aireó mediante una corriente de aire con un agitado continuo durante 2 minutos.
La
reacción se comenzó por la adición de 3 ml de extracto enzimático recientemente
homogeneizado. A los 15 segundos –determinados con un cronómetro auxiliar- se lleva 1
ml
de la mezcla reaccionante a un tubo conteniendo 2 ml de alcohol etílico absoluto (blanco).
Las
alícuotas de 1 ml de la mezcla reaccionante fueron transferidas en tubos de vidrio con 2 ml
de
alcohol etílico absoluto, a los tiempos 1, 2, 3, 4 y 5 minutos, agitando cuidadosamente. El
alcohol etílico absoluto actúa como inhibidor de la reacción. A cada uno de los tubos se le
agregaron 7 ml de alcohol etílico al 60%. Se centrifugó a alta velocidad durante 10
minutos.
Las muestras fueron transferidas a cubetas de cuarzo, y se leyeron a 234 nm. en
Espectofotómetro Spectronic modelo Génesis, Milton Roy Company, Rochester, USA.
Los resultados se expresaron como unidad de actividad de lipoxigenasa (uA / g. min).
La actividad enzimática residual se calculó como el % de la actividad enzimática de la
arveja
tratada con respecto a la actividad de la arveja cruda.

http://bibliotecavirtual.unl.edu.ar:8180/tesis/bitstream/1/145/1/tesis.pdf