Carrera: Ingeniería Química

Materia: Ingeniería Ambiental

Maestra: Luisiana Morales Zamudio

Integrantes:
Escamilla Vega Yadira 21071495
Lozano Reyes Erandy Lizeth 21070821
Maldonado Ortiz Fatima Monserrat 21070749
Pérez Treviño Ingrid Lynelle 21070693
Reyes Ramírez Adriana 21070783
Rodríguez Márquez Alexa Norelly 21070772
Urbina Meza Hannia Guadalupe 21071486
Actualmente, uno de los problemas más serios que enfrenta el mundo es la deposición de
metales pesados y sus toxicidades. Los metales pesados tienen muchos efectos nocivos
que no solo afectan la salud humana, sino que también afectan a otra fauna y flora.
El aumento de la deposición de metales pesados en el medio ambiente es causado por
diversas actividades antropogénicas. Entre los metales pesados como el plomo, el cromo,
el mercurio, el uranio, el selenio, el zinc, el arsénico, el cadmio, la plata, el oro y el níquel
El hongo Aspergillus sp. Aislada del centro de tratamiento de aguas residuales, Kalyani fue identificada como
una cepa tolerante al plomo (Pbþ2) mediante experimentos de suplementación con altas concentraciones de Pb
y finalmente fue identificada como A. foetidus MTCC8876 por The Microbial Type Culture Collection and Gene Bank
(MTCC) El aislamiento y enumeración de los microorganismos se realizó en medio CD sólido como lo describen
Raper y Thom (1949), que contenía (por litro): KH2PO4 (1 g), NaNO3 (2 g), MgSO4 (0,5 g), KCl ( 0,5 g), FeSO4 (0,01 g),
ZnSO4 (0,01 g), glucosa (40 g). Aquí se usó glucosa-1-fosfato en lugar de KH2PO4 como fuente de fosfato porque la
precipitación de fosfato de plomo se formó en presencia de fosfato inorgánico en el medio. El pH del medio se
ajustó a 8 antes del autoclave mediante la adición adecuada de solución de HCl 0,2 M y NaOH 0,2 M (si es
necesario). Se añadió estreptomicina al medio para detener el crecimiento bacteriano. Todas las placas se
dejaron incubar a 30 °C en una incubadora durante 72 h para el crecimiento fúngico.
 Las conidias de la cepa conservada se tomaron en agua estéril que contenía una/dos gotas de Tween 80 y se
agitaron vigorosamente. La suspensión de conidios debidamente diluida se tomó para esparcirla sobre medio CDA
suplementado con Pb(NO3)2 y se dejó crecer en una incubadora a 30 °C durante 72 h para obtener la colonia
contable. La colonia mejor desarrollada que tenía conidios negros se preservó en cultivo inclinado CDA. Los cultivos
inclinados se subcultivaron rutinariamente cada 1 mes antes del uso experimental en el mismo medio; Se usó como
inóculo una suspensión de esporas preparada a partir de un cultivo de 8 días.
.

Se cultivó A. foetidus MTCC 8876 mediante el método del matraz de agitación en condiciones aeróbicas. Se utilizó caldo CD líquido
para el crecimiento del hongo. Se transfirieron 100 ml de medio CD estéril a una serie de matraces cónicos de 500 ml. Los
matraces cónicos se inocularon con suspensión de esporas de la cepa de prueba (1010 conidias en 1 L) y se agitaron a 175 rpm a
32 C en un agitador orbital. Para los estudios enzimáticos y biomoleculares, se agregaron por separado al medio de crecimiento
cinco concentraciones diferentes de Pb(II).
 El tiol total se analizó mediante el método modificado de Ellman (1959). Se tomaron 0,2 g de micelio
fúngico (crecido a diferentes concentraciones de metal) para cada muestra y se molieron en un
mortero preenfriado con 0,6 g de alúmina y se extrajo con 4 ml de tampón de fosfato 50 mM
enfriado con hielo (pH 7,0) con y sin EDTA 50 mM. El homogeneizado se centrifugó a 2000 g durante
20 min a 4 C y se recogió el sobrenadante. Se mezclaron tres mililitros del sobrenadante con 2 ml
de tampón fosfato (pH 7,0) y 5 ml de agua destilada y se mezcló bien. Se añadieron 20 ml de
solución de DTNB 0,01 M a 3 ml de la mezcla de reacción, se agitó bien y se registró la absorbancia
a 412 nm.

El ensayo de prolina se llevó a cabo por el método de Chinard (1952). Se molieron 0,2 g de micelio
fresco con 0,4 g de alúmina en un mortero helado y se extrajo con 4 ml de ácido sulfosalicílico al 3%.
El homogeneizado se centrifugó a 2000 g durante 20 min. Se pipetearon dos mililitros del
sobrenadante en un tubo de ensayo de 10 ml y se añadieron al sobrenadante 2 ml de ácido acético
glacial y 2 ml de reactivos ácido-ninhidrina. El tubo se tapó con una canica de vidrio y se calentó a
100 C durante 45 min y posteriormente se colocó en un baño de hielo para enfriar los tubos a
temperatura ambiente y se agregaron 4 mL de tolueno a cada tubo. Los tubos se sellaron con
tapones de vidrio y se agitaron vigorosamente durante 2 min y se dejaron reposar durante 15 min
para completar la separación de fases.
 El contenido de malondialdehído (MDA), un producto final de la peroxidación lipídica, se determinó utilizando el
método descrito por Dhindsa et al. (1981). Se añadió una alícuota de 0,5 mL de extracto a 1 mL de ácido
tricloroacético al 20 % (v/v) y ácido tiobarbitúrico al 0,5 % (v/v). La mezcla se calentó en un baño de agua a 95 C
durante 30 min y se enfrió a temperatura ambiente. Se centrifugó a 10.000 g para 10 minutos; se leyó la
absorbancia del sobrenadante a 532 y 600 nm. El valor de absorbancia para la absorción no específica a 600 nm
se restó del valor a 532 nm. La cantidad de MDA (pigmento rojo) se calculó utilizando la absorbancia ajustada y el
coeficiente de extinción 155 mM1 cm1.

Se liofilizaron 0,5 g de micelio fresco con nitrógeno líquido y se molieron con 1 g de alúmina en un mortero
helado y se extrajo usando 8 ml de tampón de fosfato helado 50 mM (pH 7,0) que contiene polivinilpirrolidona al
1% en un baño de hielo. El homogeneizado se centrifugó a 15.000 g durante 20 min a 4 °C. El sobrenadante se usó
para el ensayo de actividad catalasa. La actividad de la enzima catalasa se midió usando el método de Chance y
Maehly.
 La actividad de la enzima glutatión reductasa se determinó espectrofotométricamente a 25 °C, según el método
de Carlberg y Mannervik (1985). El procedimiento de extracción de enzimas fue el mismo que se mencionó para la
determinación de la actividad CAT. El sistema de ensayo contenía tampón de fosfato de potasio 500 mM (pH 7,3),
que incluía EDTA 1 mM, GSSG 1 mM y solución de NADPH 4 mM.

La actividad de la peroxidasa hacia el guayacol se ensayó mediante el método modificado de

Maehly y Chance. Este método consiste en el ensayo de tetraguayacol como producto coloreado
de la oxidación del guayacol en la muestra investigada. La mezcla de ensayo contenía fosfato de
potasio 50 mM (pH 7,0), 100 ml de extracto enzimático, guayacol 20 mM y H2O2 6 mM. La
absorbancia se registró a 470 nm.
El método de Lowry et al. (1951) para medir el contenido de proteínas en los experimentos anteriores.

Se prepararon muestras para SEM según Gharieb et al. (1995). En la preparación de muestras para estudios de
microscopía electrónica, el micelio resistente a Pb (II) recién cultivado se lavó repetidamente con tampón de
fosfato (pH -7,0) y se fijó en glutaraldehído al 5% usando el mismo tampón de pH 7,0 durante 4 h. La muestra se
lavó de nuevo con el mismo tampón y se secó en una solución de alcohol graduada que oscilaba entre el 30 % y
el 100 % dos veces con cada intervalo de tiempo de media hora..

La preparación de muestras para AAS de llama para detectar Pb se realizó mediante un método modificado de
Greenberg et al. (1995) según 1 g de micelio o 1 mL de medio gastado se colocó en un matraz Erlenmeyer y se
adicionaron 3 mL de HNO3 concentrado y 1 mL de HCl concentrado. Esta mezcla se calentó durante 3 h a 85 C
hasta que se completó la solubilización de la muestra y luego se diluyó a un volumen de 25 ml con agua
desionizada
El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA unidireccional seguido de comparaciones múltiples
post-hoc mediante el método de Duncan utilizando spss 14. La diferencia se consideró significativa
cuando P < 0,05.
El efecto tóxico de Pb (II) sobre la cepa de prueba, A. foetidus, se midió analizando el peso seco del micelio
cultivado durante 96 h en caldo líquido que contenía diferentes concentraciones de Pb (II). El crecimiento del
hongo aumentó inicialmente en casi un 20 % con el tratamiento de 200 mg L1 de Pb (II), seguido de una
disminución gradual con un mayor aumento del tratamiento con Pb(II).

El contenido de proteína intracelular aumentó

inicialmente con el tratamiento con Pb y alcanzó los
valores máximos en el tratamiento. Luego, el contenido
de proteína se redujo gradualmente con un mayor
aumento en el tratamiento con Pb (II)

Se observó fuga de proteínas intracelulares en el

medio gastado durante el crecimiento de la cepa junto
con Pb. la fuga de proteína aumentó gradualmente con
el aumento de la concentración de Pb (II) en el medio
de cultivo.
 Se encontró que el contenido de prolina intracelular del hongo aumentaba gradualmente con la
concentración de Pb.

El contenido de tiol intracelular aumentó gradualmente con el

aumento del estrés por Pb durante el crecimiento del hongo en
medio líquido. La cepa sintetizó la máxima cantidad de tioles en el
tratamiento..

Hubo una cantidad significativa de fuga de tiol en el medio gastado durante el crecimiento de la cepa en
condiciones de tensión de Pb que mostró un aumento gradual con el aumento de la tensión de Pb(II).
 La actividad de la catalasa aumentó inicialmente con el aumento de la
concentración de Pb (II) y la actividad máxima se observó en el
tratamiento con 200 mg L1 de Pb con un aumento de 1,48 veces Se notó
una disminución gradual con un mayor aumento en el tratamiento con
Pb.

La actividad del glutatión reductasa (GR) aumentó gradualmente con el aumento de la concentración de Pb (II) y
alcanzó el máximo con un tratamiento de 1000 mg L1 de Pb.

Las actividades de GPX y SPX aumentaron gradualmente con el aumento del estrés por Pb (II) y mostraron actividades
máximas con un tratamiento de 1000 mg L1 de Pb.

La espectroscopia de rayos X de energía dispersiva confirmó la presencia de Pb junto con carbono (C) y oxígeno (O)
dentro de esos cristales.
Los resultados mostraron que los contenidos de Pb (II) en la biomasa total aumentaron con el aumento
de la concentración de Pb y se encontró un contenido máximo de Pb (512,35 g/kg de micelio) para el grupo
de tratamiento con 1000 mg L1 de Pb.

Los resultados mostraron que la biomasa fúngica podría absorber una gran cantidad de Pb del medio de
cultivo durante el crecimiento a concentraciones de 200, 400 y 600 mg L1 de Pb.

La absorción mínima de Pb fue de 384,97 mg/kg de micelio, observada con el tratamiento de 1000 mg L1
de Pb y la máxima fue de 1011,50 mg/kg, encontrada con el tratamiento de 200 mg L1 de Pb.

La cepa de prueba pudo eliminar una cantidad significativa de Pb del medio de cultivo líquido, la eficacia
de eliminación de Pb de la cepa disminuyó con un mayor aumento en el tratamiento con Pb.
Siendo que el estudio mostró que la cepa de prueba, A. foetidus MTCC 8876 es
altamente tolerante a Pb (II). Resultados similares se encontraron durante el
crecimiento de Aspergillus nidulans con dosis de cadmio. Aunque el contenido
de biomasa puede disminuir gradualmente a una mayor concentración de
plomo, se observa que la cepa de prueba puede soportar una concentración
de plomo tan alta. Por lo tanto, la cepa de hongos de prueba puede usarse
como una herramienta biológica para la biorremediación de plomo. La fuga de
proteína intracelular aumentó gradualmente con el aumento de la
concentración de Pb(II). De este resultado indica que la estabilidad de la
membrana celular se vio obstaculizada con el aumento de las dosis de Pb.
Algunos miembros importantes de la familia de los tioles son capaces de unir
iones de metales pesados a través de la coordinación de tiolatos en hongos
 Hemos aislado la cepa A. foetidus con adaptación a largo plazo a ambiente
contaminado con metales pesados. En el estudio se usaron altas
concentraciones de Pb y la cepa de prueba de A. foetidus. Hasta la fecha,
ninguna otra cepa de hongos podía tolerar una concentración tan alta de
plomo en el medio. Los cambios adaptativos en las comunidades
microbianas, sus actividades metabólicas y la capacidad de producción de
biomasa las llevan a sobrevivir y funcionar bajo estrés. La cepa posee
algunos mecanismos celulares inherentes para contrarrestar la toxicidad
por Pb como resultado de su adaptación previa al ambiente contaminado
con metales pesados. Esta propiedad hace que la cepa sea más adecuada
para la biorremediación de Pb.