Universidad Industrial de Santander

Facultad de Salud Escuela de

Microbiología Programa de Nutrición y Dietética
Microbiología e inocuidad de alimentos – 2023-II

Guía de laboratorio
Tinción de Gram – Tinción de esporas y azul de lactofenol
Desarrollo de competencias:
● Comprender la importancia de la coloración de Gram y las coloraciones que se van a utilizar durante
el semestre en la asignatura.
● Reconocer las diferentes morfologías y agrupaciones bacterianas.
● Diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.
TINCIÓN DE GRAM

Las técnicas de coloración son imprescindibles para el estudio formal de las bacterias por microscopía
óptica, ya que las tinciones permiten resaltar su morfología (coco, bacilo, diplococos, cocobacilo),
agrupación (racimo, cadena, tétradas, sarcinas, empalizada), o diferenciar estructuras específicas como
flagelos, cápsulas, endosporas, gránulos metacromáticos, inclusiones citoplasmáticas, entre otras. En
muchos casos, elegir la tinción adecuada direcciona la metodología a seguir para lograr la correcta
identificación de las bacterias. Las dos coloraciones más usadas en bacteriología clínica son la coloración
de Gram y la de Ziehl Neelsen (ZN), esta última usada en bacterias ácido alcohol resistentes.

Morfología bacteriana

Imagen 1: Modificado de https://microbioenergetica.squarespace.com/bacteriologa/2014/7/17/formas-y-tipos-bacterianos

La coloración de Gram, fue creada en 1884 por el microbiólogo danés Hans Christian Gram. Esta tinción
Permite la visualización de bacterias, principalmente en muestras clínicas, así como una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana a través de tres características: la morfología celular, la
coloración que adoptan y su agrupación
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias en la composición de las paredes celulares de las
bacterias Gram positivas y Gram negativas, en donde las primeras se visualizan de color morado, y las
segundas de color rosado o rojizo.

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Imagen 2: Representación esquemática de la pared celular de las bacterias Gram negativos y Gram positivas
Fuente: https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/05pared.htm 25/08/2023

Debido a estas diferencias constitutivas de la pared de Gram positivas y Gram negativas, ambos tipos de
bacterias se tiñen diferencialmente, siendo crucial en este proceso la proporción de peptidoglicano
presente ya que es el material que confiere rigidez a la pared celular bacteriana. Durante la coloración de
bacterias Gram positivas el cristal violeta se fija al peptidoglicano de la pared celular y junto con el lugol
(mordiente), producen el complejo cristal violeta-yodo el cual es insoluble en soluciones acuosas. Al poseer
una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, estas bacterias son resistentes
a la acción del solvente orgánico alcohol/acetona por lo que al adicionarlo, este actúa deshidratando los
poros de la pared, cerrándolos, lo que impide que el complejo cristal violeta/yodo se escape y se mantenga
la coloración azul-violeta.

En las bacterias Gram negativas por otro lado, el complejo cristal violeta-yodo se fija a la membrana lipídica
externa, por lo que al adicionar el alcohol/acetona este disuelve los lípidos presentes en la pared, y debido a
que la capa de peptidoglicano es demasiado delgada, esta no logra retener el complejo cristal violeta/yodo
formado previamente, por lo cual este se libera. Esto da como resultado la pérdida de la coloración azul-
violácea, es decir la decoloración de la pared celular. Finalmente, para facilitar la visualización de bacterias
Gram negativas se utiliza un colorante secundario o de contraste, que habitualmente es de color rojo como
la safranina o la fucsina. Por lo que al final de la coloración de contraste las células Gram negativas se
visualizaran de color fucsia o rojo, y las Gram positivas permanecerán de color violeta.

A pesar de la gran utilidad de la coloración de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya
que la reacción puede variar por varios factores:
● Edad del cultivo: cultivos viejos de bacterias Gram positivas pueden perder capas de peptidoglicanos y
teñirse como Gram negativos.
● Medio de cultivo.
● Técnica de coloración empleada: al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo
que bacterias Gram positivas se tiñan como Gram negativas.
● Presencia de sustancias inhibitorias como antibióticos.
● Procesos de esporulación.

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TINCIÓN DE WIRTZ CONKLIN O COLORACIÓN DE ESPORAS

Esta coloración es útil en microbiología de alimentos, ya que permite la identificación de bacterias

esporuladas, generalmente pertenecientes a los géneros Bacillus y Clostridium, algunas de las cuales
producen enfermedades de transmisión alimentaria.
Las esporas son estructuras que contienen el material genético de la bacteria y que resisten largos
periodos sin agua ni elementos nutricionales, en condiciones de calor o frío extremo. Algunas esporas
siguen siendo viables después de miles de años e incluso después de procesos con altas temperaturas.
Las esporas emergen rápidamente cuando absorben agua, se disuelve su cubierta y se forma una nueva
pared celular (la envoltura de las bacterias).

Imagen 3: Representación esquemática de la coloración de Esporas

Fuente: https://core.ac.uk/download/pdf/158830872.pdf 25/08/2023

AZUL DE LACTOFENOS: HONGOS

La solución de azul de lactofenol es una solución de tinción lista para usar para la tinción de hongos en
microbiología con muestras de origen humano o cultivos. El material se tiñe en un solo paso con solución
de azul de lactofenol. Los hongos aparecen de color azul oscuro.
Esta solución lista para usar es especialmente para frotis de material bacteriológico y secados al aire.

Imagen 3: Representación esquemática del montaje con azul de lactofenol

Fuente: https://www.lifeder.com/azul-de-lactofenol 25/08/2023

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METODOLOGIA

Procedimiento para el montaje de muestras para coloración de Gram

1. Prenda el mechero sin guantes con el breaket.
2. Tome el asa de argolla y esterilícela adecuadamente hasta que quede roja.
3. Deje atemperar el asa de argolla
4. Incline un poco el medio de cultivo líquido suministrado e introduzca el asa de argolla en el
caldo.
5. Ponga el asa de argolla en la lámina portaobjeto debidamente marcada con su nombre, tocando
la argolla del asa con el líquido que tomó.
6. Deje secar la lámina a temperatura ambiente, cerca al mechero.
7. Pase la lámina 3 veces por la llama del mechero para fijarla.
8. Lleve la lámina al sitio de coloración y coloréela con la técnica de Gram.
9. Finalizada la coloración, deje secar la lámina.
10. Guarde la lámina para observarla en el microscopio la próxima clase.

Procedimiento para el montaje de muestras para coloración de Esporas

1. Prenda el mechero sin guantes con el breaket.
2. Tome el asa recta y esterilícela adecuadamente hasta que quede roja.
3. Deje atemperar el asa recta
4. En una lámina porta objeto ponga una gota (10 uL) de solución salina en la mitad de la lámina
5. Incline un poco el medio de cultivo sólido suministrado y toque con el asa recta una colonia.
6. Sumerja el asa recta con la colonia tomada en la solución salina y haga un ligero circulo
extendiéndola en la lámina portaobjeto.
7. Marque la lámina portaobjeto con su nombre idealmente con lápiz marcador de vidrio.
8. Deje secar la lámina a temperatura ambiente, cerca al mechero.
9. Pase la lámina 3 veces por la llama del mechero para fijarla.
10. Lleve la lámina al sitio de coloración y coloréela con la técnica de esporas.
11. Finalizada la coloración, deje secar la lámina.
12. Guarde la lámina para observarla en el microscopio la próxima clase.

Procedimiento para el montaje de muestras para montaje de azul de lactofenol

1. Prenda el mechero sin guantes con el breaket.
2. Tome el asa recta y esterilícela adecuadamente hasta que quede roja.
3. Deje atemperar el asa recta de hongos gruesa
4. En una lámina porta objeto ponga una gota (10 uL) de azul de lactofenol en la mitad de la
lámina
5. Incline un poco el medio de cultivo sólido suministrado y toque con el asa recta una parte de la
colonia.
6. Sumerja el asa recta con la colonia tomada en el azul de lactofenol y haga un ligero circulo
extendiéndola suavemente en la lámina portaobjeto.
7. Ponga encima del azul de lactofenol, 1 laminilla cubreobjeto.
8. Marque la lámina portaobjeto con su nombre idealmente con lápiz marcador de vidrio.
9. Con ayuda de las docentes, haga el montaje en el microscopio para su visualización. Procure
tomar fotos o registro o dibujos de lo que se observa porque le servirá para el desarrollo de su
informe de laboratorio.

Para tener en cuenta: El informe de laboratorio incluye esta práctica y la siguiente.

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Bibliografía

Madigan, M., Martinko, J., & Parker, J. (1999). Brook. Biología de los microorganismos. (P. H. I. (UK) Ltd.,
Ed.) (8° ed., p. 1064). Madrid-España.

Olivas, E., & Alarcon, L. (2004). Manual de prácticas de Microbiología básica y Microbiología de alimentos.
Programa de Nutrición. (1° ed., p. 107). Ciudad Juárez- México: Universidad Autónoma Ciudad Juárez.

Tortora, G.-J., Funke, B.-R., & Case, C.-L. (2007). Introducción a la microbiología. (Editorial Médica
Panamericana, Ed.) (9° ed., p. 959). Buenos Aires-Argentina: Editorial- Médica-Panamericana

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