DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS BÁSICAS

GUÍA DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA

SEGUNDO AÑO
SEGUNDO SEMESTRE ACADÉMICO

2011 - II LIMA - PERÚ

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Introducción
El Manual de Prácticas de Microbiología tiene como objetivo orientar a los alumnos a un mejor conocimiento y aplicación de los procedimientos de identificación y aislamiento de la variada flora microbiana de importancia en medicina humana. La microbiología es una disciplina que estudia la biología de los microorganismos capaces de producir enfermedad. Desde que se describiera por primera vez la morfología de las bacterias (Leeuwenhoek .Siglo XVII), luego el aislamiento y diagnóstico de distintos microorganismos sobre todo en las dos últimas décadas del Siglo pasado en la que se inicia la denominada “Época dorada de la bacteriología” esta ha evolucionado tremendamente. Continuamente se describen procesos infecciosos así como situaciones nuevas en los pacientes motivando ello la disponibilidad de información científica relacionada con la microbiología clínica y la infectología. Los avances tecnológicos con aumento de la automatización, el desarrollo de la biología molecular, la química de los ácidos nucleicos, los avances en inmunología clínica y los conocimientos de la patogenicidad microbiana hacen necesario la revisión continua de los textos de microbiología. Tenemos el convencimiento que ésta orientación académica proporcionará a los alumnos de la Asignatura de Microbiología los recursos para preveer el inicio del padecimiento , así como la base para la orientación terapéutica y la prevención de las enfermedades infecciosas. Se da una relación concisa de los métodos de laboratorio empleados en el estudio de las bacterias, hongos, rickettsias y virus. Con tal motivo serán expuestos conceptos y ejercicios fundamentales, con lo que esperamos uniformar criterios acorde con la actualizada tecnología. Los trabajos de laboratorio se han ordenado metodológicamente a fin de facilitar la aplicación de los conceptos básicos y así llegar al diagnóstico de los diferentes procesos infecciosos en humanos. El objetivo de estas prácticas consiste en familiarizar al alumno con algunas de las técnicas más comúnmente utilizadas en los laboratorios de Microbiología y permitir la observación experimental de los conceptos aprendidos durante las clases teóricas. Debemos dejar establecido que el presente Manual de Prácticas , no es una compilación amplia del tema, sino un Manual que contiene los requerimientos básicos y orientación, adecuando los recursos y procedimientos que contribuirán a cimentar la formación integral del médico humano. Como docentes, nos sentiremos satisfechos si al final del curso se han cumplido los objetivos, utilizando los elementos y procedimientos de diagnóstico en el proceso enseñanza – aprendizaje.

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Generalidades
El estudio de las bacterias y de su estructura es particularmente difícil, debido al tamaño que presentan, siendo éste entre 1 y 6 micras. Para su observación se requiere el empleo del microscopio de luz , el cual , no proporciona el suficiente poder de resolución que permite observar las diferentes estructuras de las bacterias lo que hace necesario el uso del microscopio electrónico. Para la observación y estudio de las bacterias se utilizan diversos métodos. El más simple de ellos consiste en la observación en fresco, de esta manera se visualizan características someras que proporcionan una idea del tamaño, forma y en ciertas especies la movilidad; estos aspectos pueden mejorarse con el empleo del microscopio de contraste de fase. Otra tecnología que permite observar con mayor claridad a las bacterias, lo constituyen los métodos tintoriales , que facilitan el estudio de la forma , agrupamiento, y afinidad a diversos colorantes. Entre las técnicas de mayor utilidad destaca la tinción de Gram, la cual permite clasificar a las bacterias según su afinidad tintorial en Gram positivas y Gram negativas. Existen grupos bacterianos que para su observación requieren otras técnicas como la de Ziehl-Neelsen, la cual identifica a las bacterias ácido-alcohol resistente. Algunas bacterias poseen ciertas estructuras importantes que pueden ser evidenciadas mediante técnicas de coloración especial como por ejemplo, para observar cápsula, esporas, flagelos . Para realizar el diagnóstico de hongos y virus existen técnicas particulares, las mismas que serán descritas en los capítulos correspondientes.

Normas de Bioseguridad
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Disposiciones Generales
En general en todo laboratorio deben seguirse normas que garanticen la calidad de las técnicas y asimismo, la seguridad en el trabajo. En el caso particular del Laboratorio de Microbiología donde se trabaja con materiales susceptibles de contaminación accidental, se recomienda la adopción rigurosa de normas de seguridad e higiene a fin de evitar el riesgo de infección de las personas que en él trabajan. Con tal motivo, en el Laboratorio de Microbiología se consideran cuatro niveles de seguridad biológica, según los microorganismos con los que se trabaja : ▪ Nivel 1 : Microorganismos no patógenos y patógenos oportunistas ▪ Nivel 2 : Microorganismos o muestras con un potencial de riesgo moderado ▪ Nivel 3 : Microorganismos y muestras de alto riesgo; los trabajos se realizan en cabinas de seguridad , nunca en las mesas. ▪ Nivel 4 : Microorganismos de altísimo riesgo , solo se hacen en laboratorios de experimentación y no en laboratorios de microbiología clínica . Se requiere este nivel cuando se maneja microorganismos de riesgo, especialmente virus, también con algunas bacterias y hongos. De toda forma durante las prácticas se recomienda seguir las siguientes recomendaciones : 1. No será permitido ingresar a la Sala de Prácticas sin el respectivo mandil. Como medida de precaución no dejar sobre las mesas de trabajo prendas de vestir o cualquier otro objeto diferente al material asignado para el ejercicio. 2. Observar en todo momento las medidas de asepsia con el material de trabajo . Los profesores de cada grupo les indicarán la metodología a seguir. 3. Está prohibido comer, beber y/o fumar durante las clases prácticas, así como llevarse los dedos , el lápiz o cualquier otro objeto a las proximidades de la boca y ojos. 4.La evaluación de los alumnos de las asignaturas correspondientes al Departamento de Ciencias Básicas se regirá según el Reglamento de Evaluación de Estudiantes de Pregrado , Período Lectivo 2011. 5. Por razones de seguridad, ningún material de prácticas saldrá de la sala de trabajo. En caso que se rompa algún material de vidrio con cultivo bacteriano , avisar de inmediato al profesor para que disponga la inmediata desinfección y limpieza. 6. Uno de los instrumentos de trabajo , el asa o mango de Kolle , terminado el ejercicio programado deberá ser esterilizado mediante flameado , de acuerdo con las instrucciones dadas por el profesor. 7. Todo material de trabajo como son: láminas portaobjetos, laminillas o pipetas, deberán ser depositadas en los bocales de vidrio con solución desinfectante, los que estarán a la vista en cada mesa. Si fuera material de desecho , como restos de algodón , papel, etc. , depositarlos en los recipientes para la basura, nunca en la

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mesa de trabajo o en el suelo . Los tubos, placas de Petri o frascos de cultivo se dejarán en canastillas o depósitos destinados para ser esterilizados. 8. Los profesores estarán en todo momento atentos para orientar y/o resolver cualquier duda que se presente en el desarrollo de las prácticas. 9. Cada alumno debe disponer obligatoriamente del Manual de Prácticas, el que deberá ser estudiado con anterioridad a cada ejercicio, de forma tal que tenga conocimiento previo de los ejercicios que se van a presentar.

Material y Equipo básico en las prácticas de Microbiología
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En el campo de la microbiología médica se requieren de conocimientos básicos, indispensables para facilitar el estudio de los diferentes microorganismos ; por tal motivo es necesario que el alumno se familiarice desde el principio con el material y equipos empleados en el aislamiento e identificación de los microorganismos (bacterias, hongos y virus) . Ellos deben ser debidamente preparados y posteriormente esterilizados para asegurar que los ejercicios reúnan los requisitos exigidos para el trabajo microbiológico. A continuación se describen algunos de ellos: ▪ Asa y aguja de siembra : Muy usada en la práctica microbiológica, hecha de alambre de platino o de otro material , se inserta en un mango que facilita su manejo. El alambre puede ser recto o terminar en forma de pequeño anillo. ▪ Autoclave : Aparato para esterilización por vapor bajo presión , provisto de manómetro y una llave que regula la presión y la temperatura a la que desea esterilizar. ▪ Cabina de Flujo laminar : Equipo que proporciona área estéril , para los trabajos microbiológicos, en especial en cultivos , evitando la interferencia de los microorganismos de contaminación ambiental. ▪ Centrífuga : Aparato diseñado para acelerar la separación de partículas sólidas suspendidas en líquidos. ▪ Contador de colonias : Sirve para contar electrónicamente y de forma exacta las colonias de microorganismos. ▪ Crioviales : Pequeños tubos cónicos de polipropileno resistentes a muy bajas temperatura (- 4ºC). Usados para guardar muestras en la congeladora. Ejemplo: suero, cepas virales. ▪ Estufa : Aparato de dimensiones diversas , donde se incuban los cultivos, generalmente a 37ºC. ▪ Filtros esterilizantes : Para dejar libre de contenido microbiano a productos en estado líquido, los que por su naturaleza no pueden ser sometidos a la acción del calor en sus diferentes modalidades. ▪ Gradilla : Soporte para tubos de ensayo. ▪ Jarra de anaerobiosis : Instrumento útil para el aislamiento de bacterias anaerobias ya que permite un cierre hermético no dejando ingresar oxígeno. ▪ Lámina portaobjetos : Lámina de vidrio que se utiliza para preparar frotis bacterianos. ▪ Matraces y balones : Recipientes volumétricos de gran utilidad para la preparación y almacenamiento de soluciones, colorantes , reactivos , medios de cultivo , etc. Los balones se diferencian de los matraces por tener una base esférica con fondo plano. En ambos los cuellos terminan en un discreto reborde lo que les confiere resistencia.

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▪ Mechero de Bunsen : Mechero de gas , en el que éste se mezcla con aire antes de producir la flama. Se utiliza para esterilizar el asa de siembra. ▪ Medios de cultivo : Mezcla de nutrientes esenciales para el crecimiento de microorganismos .En su composición se incluye un número balanceado de nutrientes y un determinado volumen de agua. De acuerdo con su consistencia pueden ser líquidos, semisólidos y sólidos. Se presentan en forma deshidratada. ▪ Microscopio : Instrumento óptico utilizado para la observación de microorganismos que no son visibles a simple vista. ▪ Pipetas : Son tubos cilíndricos de diversos materiales, pueden ser graduadas y sirven para medir volumen conocido de líquido. Otras no son graduadas y se utilizan para la transferencia de líquidos. ▪ Pipetas Pasteur : Varillas de vidrio de 4 mm de diámetro y de 20 a 30 cm de longitud. Se les emplea para la toma de pequeños inóculos de siembra. ▪ Pipeteadores automáticos : Pipetas que absorben de forma automática sin necesidad de uno aspirar, pequeños volúmenes (1µl a 1 000 µl ) de muestras. ▪ Placa de Petri : recipiente de vidrio o plástico que , en general se usa para contener medio de cultivo y proporciona una suficiente área para el crecimiento bacteriano.

Autoclave

Cabina de Flujo laminar

PRÁCTICA Nº 1 OBTENCIÓN Y MANEJO DE MUESTRAS CLÍNICAS

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OBJETIVOS ▪ Realizar los procedimientos adecuados para asegurar las medidas de bioseguridad apropiadas. ▪ Conocer las técnicas de toma de muestra y manejo de las diferentes muestras clínicas para su óptimo procesamiento. ▪ Conocer las precauciones para el manejo y transporte de muestras clínicas. INTRODUCCIÓN En términos de la efectividad del Laboratorio de Microbiología , nada es más importante que la apropiada selección , colección y transporte de las muestras clínicas. Estos procedimientos quedan inutilizados muchas veces por falta de cuidado y métodos defectuosos usados en la recolección y manejo de las muestras. Independientemente del hecho que algunos tipos de muestras requieren metodología de recolección muy especiales, podemos enumerar algunos aspectos generales que deben ser tenidos en cuenta al coleccionar las muestras clínicas : ▪ La muestra debe ser representativa del proceso infeccioso. ▪ Cuando se va a proceder a tomar un espécimen clínico, es importante evitar la contaminación con microorganismos saprofitos del área. Esta flora normal puede interferir con la interpretación del cultivo y enmascarar la presencia del verdadero agente etiológico de la enfermedad. ▪ Seleccionar el lugar anatómico correcto de donde se obtendrá el espécimen y utilizar la técnica apropiada y los instrumentos o elementos adecuados para su obtención . Especialmente en el caso de investigar microorganismos anaerobios. ▪ Nunca refrigerar una muestra por anaerobios. ▪ Coleccionar un apropiado volumen de la muestra. Insuficiente material puede ser causa de resultados falsos negativos. ▪ Junto con la muestra se debe enviar una solicitud de análisis en la que debe figurar el nombre del paciente, número de identificación personal, procedencia, tipo de muestra, fecha y hora de colección, especificar región anatómica, diagnóstico clínico, duración de la enfermedad, terapia antibiótica , prueba requerida e iniciales del funcionario que tomó la muestra. ▪ El paciente debe ser informado en forma clara y sencilla de acuerdo a su grado de instrucción sobre los procedimientos a realizar. ▪ Obtener en lo posible muestras antes de administrar antibióticos o agentes antimicrobianos. Si se han administrado, informar de ello al laboratorio. A menudo un líquido cefalorraquídeo no revela patógenos bacterianos en frotis ni cultivo, cuando se ha tomado un antibiótico en las 24 horas anteriores. ▪ Colocar la muestra en un recipiente estéril y adecuado para su transporte como cajas, gradillas, bandejas, llevando en la base papel absorbente embebido en desinfectante , con el fin de asegurar la sobrevivencia del posible agente infeccioso, evitar derrame del espécimen y mantener medidas de bioseguridad apropiadas.

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▪ Ordenar siempre un frotis para tinción o coloración de Gram, para los especímenes que procedan de cavidades asépticas y anotar su interés en determinado microorganismo. CRITERIOS DE RECHAZO DE UNA MUESTRA ▪ Hoja de solicitud de análisis no llenada correctamente ▪ Muestras sin rotular o inadecuadamente rotuladas ▪ Muestras sin medios de transporte adecuado, en contenedores quebrados, rotos o con derrames ▪ Muestras secas o con contaminación obvia ▪ Muestras sin preservación adecuada Las muestras más frecuentes en los estudios microbiológicos son : ■ ORINA : En las muestras de orina se pueden realizar diferentes análisis como : examen microscópico de orina, urocultivo, determinación de algunos residuos de medicamento (doping) e investigación de microorganismos especiales como Leptospira. El éxito de estos exámenes dependerá de la técnica con que se tome la muestra y sobre todo del tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y el análisis, ya que el proceso de descomposición que se sucede en la orina por acción de las bacterias allí presentes , modifica el parámetro de los componentes y muy especialmente altera la carga microbiana. Procedimiento ▪ Lavarse las manos ▪ Las pacientes mujeres deben realizar previamente el lavado de los genitales externos con agua y jabón y de adelante hacia atrás, mientras que los hombres solo lo realizarán en el caso de solicitarse cultivos. ▪ Secarse con un apósito estéril ▪ Las muestras deben colocarse en un frasco de boca ancha y tapa de rosca estériles, depositar aproximadamente entre 30 y 40 ml de preferencia la primera muestra de la mañana a través del chorro medio (miccionar una buena cantidad en el inodoro y luego en el envase). ▪ En mujeres la micción debe ser separando los labios mayores de la vulva. En hombres se hace la retracción del prepucio de manera que el chorro de orina salga directamente . ▪ Tapar el frasco con precaución , evitando contaminar la muestra y/o derramarla. ▪ En casos de niños pequeños utilizar bolsas colectoras adheridas a los genitales. ▪ La muestra debe ser enviada inmediatamente al laboratorio. En caso de no ser posible refrigerarla no más de 4 horas. ■ HECES : Las muestras de heces se solicitan para examen bacteriológico, virológico, bioquímico y para la búsqueda de parásitos. Las muestras de heces de un paciente sospechoso de enfermedades diarreicas deben colectarse antes de la administración de cualquier antibiótico.

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Procedimiento ▪ Muestra evacuada : La persona debe defecar en un recipiente limpio y seco, teniendo cuidado de no miccionar para que ésta no se mezcle con orina. ▪ Hisopado rectal : La muestra se obtiene con un hisopo de algodón estéril , el cual se desenvuelve y se lubrica antes de su uso, introduciéndolo en el medio de transporte , de preferencia Cary Blair, y luego se introduce en el recto , unos 3 cm, mediante movimientos de rotación. El hisopo con la muestra se introduce hasta el fondo del tubo que contiene el medio de transporte (Cary Blair o Amies). El frasco con la muestra o tubo con el medio de transporte se pueden conservar a temperatura ambiente hasta su procesamiento o envío al laboratorio, no más de 12 horas. No se debe refrigerar la muestra. ■ HEMOCULTIVO : La sangre de los individuos sanos es estéril. Una afluencia repentina de bacterias habitualmente es eliminada del torrente circulatorio en un período de tiempo corto de minutos a horas, excepto cuando existe una infección masiva o está presente un foco intravascular infectado. Básicamente cuando las bacterias se multiplican a tasas que exceden el sistema retículoendotelial para eliminarlas , se habla de BACTERIEMIA. El término FUNGEMIA se utilizar para designar la presencia de hogos en sangre. Siempre que exista una razón para sospechar de una bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre o hemocultivo. Procedimiento ▪ Los hemocultivos se obtendrán antes de iniciar la terapia antibiótica, el incumplimiento de este punto puede dar lugar a resultados falsamente negativos, pudiendo comprometer la vida del paciente. ▪ Los microorganismos de la piel pueden contaminar la sangre durante la extracción, dificultando la interpretación de los resultados. Además algunos contaminantes actúan como patógenos oportunistas , por lo que se debe ser muy cuidadoso durante la extracción. ▪ La toma debe realizarse por venopunción y para ello se debe hacerse : • Lavado de manos y utilización de guantes estériles • Limpiar con jabón líquido o alcohol el lugar de la punción • Aplicar durante un minuto povidona yodada, dejar secar • Desinfectar los tapones de los frascos • Efectuar la extracción • No airear los frascos • Nunca debe hacerse la extracción a través de catéteres , salvo en aquellas circunstancias en que se indica específicamente. • Cuando la extracción se realice con adaptador , se debe esterilizar o ser de un sólo uso.

■ MUESTRAS FARINGEAS Y AMIGDALARES :

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Más del 70 % de procesos están ocasionados por virus : rinovirus , coronavirus, adenovirus(3,4,7,14,21), parainfluenza, virus de la gripe, virus coxsakie A y otros enterovirus, virus Epstein-Barr y virus herpes simple tipo I Entre el 10 y 20 % de la faringitis agudas en niños de 5 a 10 años, están ocasionados por Streptoccoccus pyogenes. Otras bacterias patógenas son : Streptococcus grupos C o G, Corynebacterium diphteriae, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae . Procedimiento ▪ Las muestras de exudado faringo-amigdalar se obtienen con la ayuda de un depresor lingual, tocando con la torunda todas las partes con exudados, membranas o zonas de inflamación. Se deben frotar las criptas tonsilares y la faringe posterior. ▪ No se requieren medidas especiales para su transporte y conservación. ▪ La toma de muestra de la epiglotitis , debido al riesgo de complicaciones, se hace por un especialista en las condiciones adecuadas. ▪ Es recomendable realizar hemocultivos. ■ MUESTRAS NASALES : Procedimiento La muestra se obtiene introduciendo una torunda para cultivo, previamente embebida en suero fisiológico estéril, unos 2 cm en la nariz y girando suavemente contra la mucosa de la superficie nasal. ■ CATÉTERES : El estudio bacteriológico de los catéteres , nos va a permitir en ocasiones conocer el agente causal de una bacteriemia relacionada con el catéter y prevenir que aparezca dicha bacteriemia. Para valorar su importancia podemos decir que de una u otra forma el 82 % de las bacteriemias nosocomiales se relacionan con la presencia de catéteres. Vías de infección : a. Piel y catéter : en los catéteres periféricos y de corta duración b. Endoluminal : en las vías centrales tunelizadas. Procedimiento ▪ Desinfectar con alcohol al 70 % una zona de la piel de unos 10 cm correspondientes a la zona de entrada del catéter ▪ Retirar el catéter con la máxima asepsia, con la ayuda de pinzas y tijeras estériles, cortar los 5 cm distales del catéter que corresponde a la porción intravascular. ▪ Introducir el segmento del catéter en un recipiente estéril correctamente identificado ▪ La muestra debe ser enviada al laboratorio en un período de tiempo menor de 30 minutos. Cuando no sea posible deberá ser guardada en refrigeración a 4º C ■ LÍQUIDOS ESTÉRILES :

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El fundamento es la búsqueda de agentes patógenos u oportunistas, que pueden estar presentes en los líquidos o fluidos orgánicos . En este grupo incluimos líquidos producidos , ya sea de forma espontánea o bien provocada a nivel de las serosas, en las que habitualmente no existen microorganismos y son presumiblemente estériles. Su buen manejo presenta un triple interés por : • La trascendencia de esta patología por su elevada morbilidad o mortalidad • Dificultad de diferenciar patógenos y oportunistas como consecuencia de cuidados terapéuticos instaurados o prótesis aplicadas previamente. • Posibilidad de contaminación exógena, sea en la obtención o en su manipulación, siendo por ello muy importante extremar las medidas de asepsia, de recogida y procesamiento. Muestras • Líquido • Líquido • Líquido • Líquido ascítico o peritoneal articular o sinovial pericárdico pleural

Procedimiento ▪ La obtención de estos líquidos es un procedimiento médico ▪ La toma se realiza por punción percutánea (toracocentesis, paracentesis, punción pericárdica o punción articular) ▪ Para el estudio bacteriano se requerirá de 1 a 10 ml; para líquido de diálisis peritoneal se requerirá de un volumen superior a 100 ml. ▪ Para evitar la coagulación de algunos líquidos se utilizará heparina sin conservantes, ya que otros anticoagulantes podrían tener acción antibacteriana. ▪ Los recipientes idóneos son los viales de transporte para anaerobios ▪ Los frascos de hemocultivo también son útiles para cultivar líquidos biológicos estériles. Si se sospecha de anaerobios colocar la muestra luego de ser extraída en un frasco para anaerobios. ■ LÍQUIDO CÉFALORRAQUIDEO (LCR) La meningitis es un proceso inflamatorio del Sistema Nervioso Central, que afecta a las leptomeninges y al líquido cefalorraquídeo . Se trata de una urgencia médica y requiere un diagnóstico y tratamiento precoz . Su morbimortalidad , en meningitis agudas bacterianas , se relaciona directamente con el retraso en el inicio de la terapéutica. Los casos esporádicos de meningitis agudas bacterianas , se relacionan directamente con el retraso en el inicio de la terapéutica, aparecen en edades extremas de la vida, ocurriendo el 75 % de los casos en menores de 1 año. Muestra ▪ La toma de la muestra la realiza el médico tratante o el patólogo clínico del laboratorio. ▪ Se obtendrá antes de instaurar cualquier terapia antimicrobiana , siempre que las condiciones lo permitan. ▪ LCR se obtiene por punción lumbar ▪ Generalmente se obtendrán dos tubos, el primero se enviará para el estudio bioquímico, el segundo para el estudio microbiológico con el mayor volumen

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posible. ▪ El tubo más turbio se enviará a Microbiología. ▪ Se debe solicitar simultáneamente hemocultivos, porque las meninges suelen ir acompañadas de un proceso bacteriémico ▪ El volumen mínimo para el estudio bacteriológico rutinario es 1 ml, aunque es preferible disponer de volúmenes superiores. Para hongos o micobacterias se necesitarán al menos 2 ml adicionales por cada uno de los estudios, siendo deseable llegar a los 10 ml. ▪ La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues algunos agentes etiológicos como Streptococcus pneumoniae pueden lisarse rápidamente a partir de la primera hora de su recogida ▪ Si no fuera posible se mantendrá en estufa entre 35 a 37ºC y una parte se incubará en frasco de hemocultivo, que se mantendrá en idénticas condiciones. ▪ Si no se dispone de estufa se mantendrá a temperatura ambiente. Nunca se refrigerará pues se afectará la viabilidad de Neisseria meningitidis y H. influenzae. Procesamiento del líquido cefalorraquídeo ▪ Centrifugar a 1 500 hasta 3 000 revoluciones durante 15 a 20 minutos. En caso de líquidos muy purulentos no será necesario centrifugar. ▪ Recoger el sobrenadante con pipeta de Pasteur estéril y conservarlo a 4ºC en frigorífico. ▪ Sembrar el sedimento con pipeta de Pasteur en : agar Sangre a 35 - 37ºC, atmósfera de CO2 ,agar Chocolate a 35 - 37ºC atmósfera de CO2 ,caldo Tioglicolato o caldo Infusión Cerebro Corazón BHI a 35 - 37ºC por 72 horas. ▪ Se realizarán tres extensiones para tinción : tinción de Gram, Azul de metileno, Wright. ■ EXTRACCIÓN DE SANGRE PERIFÉRICA : 1. Colocar sobre la mesa de trabajo todo el material que se necesitará para ejecutar la obtención de la muestra. 2. Lavarse las manos previamente a la extracción de la sangre y si es preciso colocarse guantes. 3. El paciente deberá sentarse cómodamente de manera que el brazo quede colocado paralelamente a la mesa de trabajo , donde se realizará la extracción se sangre. 4. Apoyar el brazo del paciente sobre un pequeño cojín bajo el codo. Con la palma de la mano hacia arriba. 5. Con la mano izquierda tirar del extremo de la ligadura, cruzándolo y a continuación introducir este extremo por debajo de la parte principal de la ligadura aproximadamente dos dedos por encima de la flexión del codo. Ésta se deberá ajustar solo lo suficiente para aminorar la corriente sanguínea y dilatar la vena , sin apretar tanto que reduzca el paso de la sangre por las arterias. 6. Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatación de las venas.

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7. Con el dedo índice de la mano izquierda palpar la vena en la que se introducirá la aguja. 8. Desinfectar la zona de la piel donde se realizará la punción con un pedazo de algodón embebido en alcohol yodado. 9. Tomar la jeringa con la mano derecha, colocar la yema del dedo índice sobre la base de la aguja. 10. Colocar la aguja sobre la vena con el bisel hacia arriba, introducir la aguja en el centro de la vena sin titubeos., de 1 a 1,5 cm aproximadamente. 11. Luego de extraer la sangre por punción venosa, retirar la aguja de la jeringa y colocarla en un depósito de metal ( para autoclavar o incinerar); verter lentamente la sangre en un tubo o en el caldo de cultivo.

EVALUACIÓN 1. ¿Por qué una muestra de líquido cefalorraquídeo no debe ser refrigerada , si no se envía de inmediato al laboratorio? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… 2. ¿Cuáles son los agentes etiológicos de la meningitis aguda en neonatos, niños y adultos? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… 3. ¿En qué casos se debe tomar una muestra de aspirado bronquial? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………

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4. ¿Cuál es el volumen se sangre requerido para realizar un hemocultivo en un neonato, niño y en un adulto?, ¿cuáles son los agentes etiológicos más frecuentes de una septicemia en cada caso? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… PRÁCTICA Nº 2 COLORACIONES BACTERIANAS SIMPLES

OBJETIVOS ▪ Explicar la coloración Azul de metileno. ▪ Identificar la diferencia entre coloración simple y coloración diferencial INTRODUCCIÓN Debido al pequeño tamaño de los microorganismos , se requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro (lo más usado) o de campo oscuro, para hacer la descripción morfológica de estos. La observación de los frotis teñidos es lo más recomendable. El frotis se prepara haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superficie transparente, en la cual se fijan y se tiñen los microorganismos. Las coloraciones son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener (o no), determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante. Estos colorantes pueden ser de distintos tipos: ▪ Catiónicos : sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina. ▪ Aniónicos : Con carga negativa, no penetran en el interior de la célula, de modo que no tiñen las células sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina. ▪ Liposolubles: se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: Negro sudán. Los colorantes aumentan el contraste combinándose químicamente con el protoplasma microbiano y permiten localizar estructuras específicas del microorganismo y diferenciarlos en su forma, tamaño, agrupación y afinidad a

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ciertos colorantes . Las bacterias pueden presentar las siguientes formas esféricas (cocos), estos a su vez disponerse en cadenas (estreptococos) , en pares (diplococos), o en racimos (estafilococos), sarcinas, en forma alargadas cilíndricas (bacilos) y espirales (espiroquetas y espirilos). De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son : ▪ Simples : Utilizan un solo colorante. Las células presentan una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma distinta frente a un colorante . El colorante tiñe las células como en el caso de : Azul de metileno, Safranina o no la tiñe : Nigrosina. ▪ Diferenciales : Los diferentes tipos de células presentan distinta composición química y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar a los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. Ejemplos: tinción de Gram y Ziehl-Neelsen, ambas utilizan más de un colorante. ▪ Selectivas: Distintas estructuras celulares tienen diferente composición química de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ejemplos: tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizar uno o más colorantes.

■ COLORACIÓN AZUL DE METILENO Es una coloración simple que permite observar presencia o ausencia de microorganismos y distinguir algunas formas bacterianas : cocos, bacilos , espirilos. Se utiliza el Azul de metileno, el cual se agrega sobre la extensión por un minuto , luego del cual se enjuaga , se deja secar a temperatura ambiente y se observa al microscopio con la lente de mayor aumento. MATERIALES ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Guantes quirúrgicos estériles Hisopos estériles Láminas portaobjetos Mechero de alcohol Jeringa de 10 cc Algodón y alcohol yodado Ligadura

METODOLOGÍA ■ HISOPADO FARÍNGEO 1. El profesor, con la colaboración de un alumno, enseñará a tomar una muestra de

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exudado faríngeo. El paciente ( en este caso el alumno), se sentará cómodamente de frente al profesor , el área debe tener buena iluminación para que permita visualizar adecuadamente el sitio anatómico a examinar. 2. Indicar abrir la boca y con ayuda del bajalengua deprimir la lengua para favorecer que la faringe quede expuesta, con un hisopo estéril frotar firmemente la pared posterior de la faringe y las amígdalas, particularmente en donde existan puntos blancos o áreas que presenten signos de inflamación o sangrado. 3. Cuando el paciente no tenga amígdalas, la muestra se obtendrá del fondo de las fosas amigdalinas. Al retirar el hisopo tener la precaución de no hacer contacto con ninguna otra área de la boca. 4. A partir de la muestra tomada, se realizará el aislamiento por el método de aislamiento en estría en placa, se utilizarán placas de agar sangre , agar chocolate y agar manitol salado. 5. Antes de eliminar el hisopo , realizar una extensión para preparar un frotis, fijar la muestra y teñir con una tinción simple (Azul de metileno) para observar : • Morfología de la bacteria • Agregación o tipo de distribución bacteriana.

RESULTADOS ■ Frotis de hisopado faríngeo :
Hisopo

Lámina portaobjetos Aislamiento en estría

■ Coloración simple : Azul de Metileno

• Cubrir el frotis con colorante Azul de metileno por un minuto • Lavar con agua corriente • Dejar secar a temperatura ambiente

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1. Cubrir con Azul de metileno

2. Lavar con agua

Graficar lo observado al microscopio

EVALUACIÓN 1. ¿Cuáles son las estructuras celulares o moléculas que pueden ser observadas cuando se emplea la tinción simple?. Ejemplos de dos (2) colorantes que podrían utilizarse para realizar una tinción simple. ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… 2. ¿Cuáles son las desventajas o limitaciones de la tinción simple ? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………

PRÁCTICA Nº 3 COLORACIONES BACTERIANAS COMPUESTAS COLORACIÓN DE GRAM OBJETIVOS ▪ Explicar el fundamento de la coloración de Gram. ▪ Ejecutar la técnica de coloración más usada en bacteriología : coloración de Gram. ▪ Establecer la diferencia entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas. INTRODUCCIÓN Descrita por Christian Gram en 1884, permitiendo dividir a las bacterias en dos grupos taxonómicos : Gram positivas y Gram negativas. En esta técnica se deben tener en cuenta tres aspectos fundamentales : • Las bacteria Gram positivas retienen firmemente el colorante inicial • Al añadir el mordiente se forma un complejo molecular de gran tamaño • La penetración está condicionada por la permeabilidad de la pared celular. Los mecanismos antes mencionados se relacionan con la composición química de la pared de las bacterias. Las bacterias Gram positivas contienen una mayor

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cantidad de mureína, ácido tecoico, pocas proteínas y algunas contienen polisacáridos. Las bacterias Gram negativas poseen poca mureína, una elevada cantidad de lípidos , proteínas y polisacáridos y no contienen ácido tecoico. La mureína en las bacterias Gram positivas impide que el complejo cristal violetayodo sea eliminado por el decolorante alcohol–acetona, ya que es insoluble en alcohol. El alto contenido de lípidos en la pared de las bacterias Gram negativas ocasiona que el complejo cristal violeta – yodo sea eliminado o disuelto por el decolorante. Al finalizar la coloración las bacterias Gram positivas quedan teñidas con el cristal violeta : morado y la bacterias Gram negativas quedan teñidas con el colorante de contraste : safranina : rojo. MATERIALES ▪ Cultivos en medio líquido de Escherichia coli y Staphylococcus sp. ▪ Asa bacteriológica ▪ Equipos de coloración para tinción de Gram ▪ Mechero, portaobjetos y puentes para tinción ▪ Microscopio METODOLOGÍA Preparar un frotis de cada uno de los cultivos de Escherichia coli y Staphylococcus sp Preparación del frotis para la tinción ▪ Trabajar en un área aproximadamente de 10 cm de distancia de la llama del mechero ( zona considerada estéril ), flamear el asa, hasta el rojo vivo y dejarla enfriar por 30 segundos ▪ Con un lápiz graso identificar cada una de las láminas portaobjetos donde se van a realizar las preparaciones. ▪ Destapar el tubo con el cultivo, empleando para el propósito los dedos anular y meñique , introducir el asa, tomar una pequeña muestra de cultivo. ▪ Depositar el material en el centro de una lámina portaobjetos y extenderlo en un área aproximadamente de 0,5 cm. ▪ Cuando se trata de cultivos de medio sólido , colocar una gota de agua destilada sobre la superficie , descargar la muestra y homogeneizar. Dejar que la preparación seque espontáneamente al aire libre. ▪ Fijar la preparación pasándola rápidamente sobre la llama del mechero , evitando un calentamiento excesivo para evitar que el material se carbonice. ▪ Con un lápiz graso identificar cada una de las preparaciones. ♦ Para la realización de un buen frotis se deben cumplir las siguientes condiciones : ▪ Utilizar láminas limpias y en perfecto estado, libre de rayones y de manchas, deben ser previamente pasadas por la llama del mechero para eliminar trazas de grasa y no se deben tocar con las yemas de los dedos . ▪ Debe ser delgado, translúcido y homogéneo para que, durante el proceso de tinción, reciba en toda su superficie el mismo tratamiento con las diferentes sustancias químicas y se debe usar para la preparación la técnica aséptica.

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▪ Utilizar un mínimo de cultivo cuando es un medio sólido. ▪ Cuando se trabaja a partir de un medio líquido debe tomarse suficiente cantidad : una muestra con el asa de siembra. Técnica de coloración de Gram : • Cubrir las preparaciones con cristal violeta , durante un minuto, lavar ligeramente con agua corriente. • Cubrir con lugol durante un minuto, lavar ligeramente con agua corriente. • Decolorar con la mezcla alcohol – acetona , escurrir de 5 a 6 gotas y lavar con agua corriente • Cubrir con safranina durante 30 segundos , lavar con agua corriente y dejar secar. • Colocar sobre la coloración una gota de aceite de inmersión . • Observar al microscopio con la lente de mayor aumento.

1. Cubrir con cristal violeta (1 minuto)

2. Lavar con agua corriente

3. Cubrir con lugol (1 minuto)

4. Lavar con agua corriente

5. Decolorar con alcohol acetona (5 a 6 gotas)

6. Lavar con agua corriente

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7. Cubrir con safranina (30 segundos)

8. Lavar con agua corriente

Bacteria Gram positiva

Bacteria Gram negativa

RESULTADOS Graficar lo observado al microscopio

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EVALUACIÓN 1. ¿Cuáles son las principales precauciones del manejo del microscopio y por qué se debe utilizar el aceite de inmersión al hacer el estudio microscópico de las bacterias ? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………

2. ¿Cuáles son las fuentes de error más frecuentes en la preparación de un frotis? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… PRÁCTICA Nº 4 MEDIOS DE CULTIVO MÉTODOS DE SIEMBRA

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OBJETIVOS ▪ Comprender la utilidad de los medios de cultivo en el trabajo microbiológico. ▪ Diferenciar los distintos medios de cultivo de acuerdo a su consistencia y función. INTRODUCCIÓN Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes, que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. Debido a que la diversidad metabólica de los microorganismos es muy amplia, la variedad de los medios de cultivo también lo es. La mayoría de los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados , que es preciso rehidratar La preparación de un medio de cultivo se reduce a pesar la cantidad del medio y disolverlo en agua destilada ( libre de inhibidores de crecimiento), siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de los componentes previamente esterilizados en la autoclave. CONDICIONES GENERALES ▪ Presentar todos los elementos necesarios, en sus proporciones y/o cantidades necesarias. ▪ pH adecuado ▪ Condiciones osmóticas adecuadas ▪ Estéril y preservado de cualquier contaminación. ▪ Medio fresco ya que se desecan y pierden humedad, concentrándose el resto de los componentes. COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CUTIVO ▪ Agua : destilada o desionizada ▪ Agar : se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo. ▪ Azúcares : son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son : glucosa, lactosa y sacarosa. ▪ Extractos : son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales, obtenidos con agua y calor. Ejemplo : extracto de carne , de levadura, de malta. ▪ Peptonas : son proteínas hidrolizadas , se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales. ▪ Fluidos corporales : sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo, son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos. ▪ Sistemas amortiguadores : son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. Ejemplo : fosfatos bisódicos o bipotásicos. ▪ Indicadores de pH : son indicadores ácido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el medio. ▪ Agentes reductores : sustancias que se añaden al medio para crear condiciones que

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permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ejemplo : cisteína, tioglicolato. CLASIFICACIÓN ▪ Por su consistencia • Medio de cultivo líquido: caldo Nutritivo, caldo Selenito, caldo Peptonado • Medio de cultivo semisólido: agar Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM), agar Movilidad, Indol y Ornitina (MIO) • Medio de cultivo sólido: agar Sangre, agar Mac Conkey, agar Manitol salado. ▪ Por su función o fines especiales • Medios nutritivos (simples): con nutrientes mínimos para que las bacterias poco exigentes desarrollen . Ejemplo: caldo y agar Nutritivo. • Medios nutritivos enriquecidos: son medios simples a los que se añaden ciertos productos a manera de suplemento nutritivo que permiten el aporte de factores de crecimiento. Ejemplo: agar Sangre, agar Chocolate. • Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que por su composición química favorecen o permiten la multiplicación de unos microorganismos, inhibiendo parcialmente la de otros. Ejemplo: caldo Selenito, caldo Peptonado alcalino. • Medios selectivos: permiten el crecimiento sólo de la especie que se desea aislar, para lo cual se les agrega colorantes bacteriostáticos: Azul de metileno, Verde malaquita, Verde brillante. Ejemplos: agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella (SS), agar Manitol salado. • Medios diferenciales: contienen sustancias nutritivas y un indicador de pH que permite detectar las reacciones bioquímicas específicas de los microorganismos. Ejemplo: agar Triple azúcar (TSI),agar Úrea, agar Citrato de Simmons. • Medios de transporte: permite mantener viables a los microorganismos durante el traslado al laboratorio. Ejemplo: caldo Hafna, Cary Blair, Stuard.

MATERIALES ▪ Caldo nutritivo : en matraz y tubos ▪ Agar nutritivo en matraz ,placas y tubos ▪ Agar Mac Conkey, agar Salmonella-Shigella, agar Manitol salado, agar Chocolate, agar Triple azúcar (TSI), agar Úrea, agar Citrato de Simmons, agar SIM.

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METODOLOGÍA Observar y diferenciar los medios de cultivo proporcionados en la práctica. ■ Medios Simples:

■ Medios Enriquecidos:

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■ Medios Selectivos:

■ Medios Selectivos:

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EVALUACIÓN 1. ¿Qué medios de cultivo utilizaría para cultivar una secreción abdominal en la que se sospecha de bacterias anaerobias? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… 2. ¿Qué medios de cultivo se utilizan cuando se sospecha de ? : ▪ ▪ ▪ ▪ Vibrio cholerae : Clostridium botulinum : Brucella spp : Campylobacter jejuni :

3. ¿Qué precauciones se deben tener antes de sembrar en medios para anaerobios? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………

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MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO

OBJETIVOS ▪ Conocer y realizar las diferentes técnicas de siembra y aislamiento bacteriano. ▪ Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo puro. INTRODUCCIÓN En Microbiología se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos (inóculo), de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los profesores de práctica. La principal advertencia consiste en trabajar siempre próximos a la llama del mechero que , debido a las corrientes de convección verticales que genera es capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama. Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el número de células bacterianas (inóculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo estéril. Al querer aislar una especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos deben emplearse técnicas de aislamiento lo que permite, obtenerlas en forma pura. Esto implica la utilización de medios tanto simples como especiales , mayormente sólidos de acuerdo a la naturaleza del microorganismo. Las técnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas : ▪ Por siembra : es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo con un medio de cultivo, para que en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de incubación , pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. La finalidad es el aislamiento para tener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra problema (orina, heces, secreciones, agua servida). La siembra puede ser : ▪ Por inoculación ▪ Por estrías simples ▪ Por dispersión o agotamiento ▪ Por puntura ▪ Por diluciones sucesivas : consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del inóculo, ésta se utiliza cuando se tienen muestras líquidas ( orina, agua ) , se realiza haciendo diluciones a las muestras : 1 :100, 1:1 000, 1:10 000 etc. Luego se siembra cada dilución en placas de Petri con medios de cultivo.

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Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al examen macroscópico : morfología de las colonias, actividades bioquímicas o características inmunológicas de los microorganismos aislados.

Tomado de Microbiología Tomo II de Granados 2ª edición

Técnica de siembra por diluciones sucesivas

MATERIALES ▪ Asa de siembra en aro y en punta ▪ Tubos de vidrio de 16 x150mm ▪ Tubos de caldo Nutritivo con cultivo mixto bacteriano : Staphylococcus aureus y Escherichia coli ▪ Placas con agar Nutritivo, agar Sangre y agar Manitol salado ▪ Tubos con caldo y agar Nutritivo ▪ Suero fisiológico estéril ▪ Mechero de Bunsen METODOLOGÍA ■ Manejo del asa bacteriológica o de siembra :

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El profesor demostrará el manejo adecuado del asa y explicará las precauciones que se deben tener en la toma de la muestra : ▪ Esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar quemar a las bacterias ▪ Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo líquido, ya que en este lugar se encuentra una mayor concentración de microorganismos. ▪ Observar que al retirar el asa del tubo esté cubierta por una película líquida.
El asa de siembra se toma del mango como si fuera un lápiz

El tapón del tubo se toma con el dedo meñique La boca del tubo se flamea después de abrirlo y antes de cerrarlo

■ Método de siembra por agotamiento : aislamiento a partir de un cultivo mixto ▪ Con un lápiz graso marcar por detrás de la placa que contiene el agar , las líneas como está indicado en la figura Nº 1, por lo que quedarán tres sectores : el sector uno (1) el más pequeño de los otros dos , servirá para descargar el asa. ▪ Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio líquido , cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla. ▪ Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y sembrar trazando una serie de líneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector uno (1) . Esto mismo se puede hacer colocando la placa de Petri sobre la mesa y con la palma de la mano , hacer un movimiento rápido para levantar el fondo que contiene el medio de cultivo, como lo indicará el profesor. ▪ Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados , hasta que el sector uno (1) quede a la izquierda y el sector dos (2) hacia arriba. Sin volver a tomar el inóculo, trazar un zigzag un poco más abierto en el sector dos (2), invadiendo el sector uno (1) en las primeras líneas del zigzag , pero no en las últimas.

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▪ Girar nuevamente la placa 90 grados , ahora el sector dos (2) estará a la izquierda y el sector tres (3) hacia la derecha. ▪ Hacer un nuevo zigzag en el sector tres (3), invadiendo el sector dos (2) . Este paso puede repetirse sembrando un cuarto sector. ▪ Incubar las placas a 37º C durante 24 horas. Las placas ya sembradas deberán colocarse con la tapa hacia abajo y la parte que contiene el agar sembrado hacia arriba.

1

1

2

3

2 3

Figura Nº 1

Figura Nº 2

■ Método de siembra en caldo de cultivo ▪ Coger el asa de siembra en aro , esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar por unos segundos. ▪ Abrir la placa que contiene el agar con el crecimiento bacteriano y con la ayuda del asa de siembra coger una colonia bien aislada (figura Nº 1) . ▪ Luego destapar un tubo con caldo de cultivo (figura Nº 2), coger la torunda, que está dentro de este con el dedo meñique de la mano con que se está cogiendo el asa de siembra con la colonia ▪ Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se desprenda la colonia del asa de siembra. ▪ Introducir la torunda, tapar el tubo, llevar a esterilizar el asa de siembra y homogeneizar bien el caldo. ▪ Llevar a incubar a 37º C por 12 horas.

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Figura Nº1 Figura Nº2

Transcurrido el tiempo de incubación, observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo líquido y sólido ▪ Medio líquido : la turbidez indica desarrollo ▪ Medio sólido : presencia de colonias RESULTADOS Realizar la lectura, observar y graficar los resultados. ▪ Staphylococcus aureus

Agar Nutritivo

Agar Sangre

Agar Manitol Salado

▪ Escherichia coli

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Agar Nutritivo

Agar Sangre

Agar Manitol Salado

EVALUACIÓN 1. ¿Qué método de siembra usaría en cada uno de los casos siguientes? • Cultivo de heces : • Cultivo de líquido cefalorraquídeo : • Contaje de colonias en urocultivo :

2. ¿Por qué el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo bacteriano? ¿Qué sustancias se le pueden agregar par hacerlo enriquecido para bacterias Gram positivas? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………

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3. ¿Cuál es la importancia de un cultivo puro? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………

PRÁCTICA Nº5 ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO : ANTIBIOGRAMA OBJETIVOS ▪ Entender el fundamento del antibiograma , el modo en que se realiza y las principales fuentes de error. ▪ Conocer los principales métodos de susceptibilidad a un antimicrobiano. ▪ Evaluar la sensibilidad o resistencia a diversos antibióticos de una bacteria de crecimiento rápido aislada en prácticas anteriores. El método utilizado es el de difusión en agar o de Kirby-Bauer. INTRODUCCIÓN La actividad de los antimicrobianos (antibióticos y quimioterápicos) debe ser evaluada “in vitro” para obtener la información que permitirá decir si un microorganismo es susceptible o resistente a determinado producto. Los antimicrobianos actúan produciendo toxicidad selectiva , no actúan directamente sobre el huésped, sino que se combinan químicamente con

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determinados sistemas de los microorganismos , enfocando así la acción sobre los microorganismos más que sobre el huésped. La determinación de la mínima concentración inhibitoria (MIC) nos proporciona la dosis mínima necesaria del quimioterápico para impedir el desarrollo bacteriano, lo que permite hacer estudios de uso clínico y detectar mutantes resistentes. Dos son los procedimientos empleados para conocer ésta información, el método del tubo dilución y el del disco difusión en agar, a éste último se le denomina : antibiograma. ■ Acción de los antibióticos ▪ La actividad antimicrobiana in vitro determina: a. La potencia de un agente antibacteriano en solución b. Su concentración en los líquidos del cuerpo o en los tejidos c. La sensibilidad de un microorganismo a concentraciones conocidas del medicamento. ▪ Inhibición de síntesis de pared celular: Penicilina, Cefalosporinas, Bacitracina, Vancomicina, Novobiocina. ▪ Alteración de la permeabilidad de la membrana celular: Anfotericina B, Colistina, Nistatina, Polimixina. ▪ Inhibición de la síntesis proteica : Aminoglucósidos ( Kanamicina, Amikacina , Estreptomicina ), Tetraciclinas, Cloramfenicol, Macrólidos ( Eritromicina ), Lincomicinas. ▪ Inhibición de síntesis de ácidos nucleicos : Ácido Nalidíxico, Novobiocina, Sulfonamidas, Trimetropin, Rifampicina. ■ Medición de la actividad antimicrobiana Esta se determina mediante los métodos de dilución o difusión, utilizando un microorganismo standard y una cantidad conocida del antimicrobiano. Para ello se utilizan las pruebas de dilución en tubos y el método de difusión. ■ Prueba de dilución En éste ensayo se incorporan cantidades conocidas de antimicrobianos en medios líquidos, se inoculan después con las bacterias en prueba y se incuban. El punto final se toma cuando la cantidad de sustancias antimicrobiana es capaz de inhibir el crecimiento o de matar a las bacterias en prueba. ■ Método de difusión ▪ Preparación del inóculo La técnica del antibiograma sólo es aplicable a especies bacterianas en cultivo puro. Por ello previamente se procederá, si es preciso, a hacer un aislamiento en placa. Cultivar la bacteria aislada en un tubo con medio líquido apropiado (caldo Nutritivo, Infusión cerebro corazón) o preparar una suspensión directa a partir del cultivo en placa usando el siguiente método: a. Tomar una colonia aislada con el asa y resuspender en el tubo de solución salina frotando en la pared del tubo. b. Homogeneizar bien y ajustar la densidad óptica con un patrón de turbidez Nº 0,5 de Mac Farland : 0,5 ml de cloruro de bario 0,048 M a 99,5 ml de ácido sulfúrico 0,36 N 0,18 M. Esto equivale a 108 células/ml . Diluir si es necesario la suspensión o añadir más inóculo. c. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez, sumergir una torunda estéril en la suspensión, rotar la torunda estéril varias veces. Presionando

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firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del líquido, para remover el exceso de inóculo. d. Inocular la superficie seca de la placa con agar Mueller Hinton estriando con una torunda en tres direcciones mediante rotación de la placa, para asegurar una distribución uniforme del inóculo, dejar secar la placa a temperatura ambiente por 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido. e. Colocar los discos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estéril (o con un aplicador automático) presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo son la superficie del agar. Distribuir los discos uniformemente de modo que estén a una distancia de 15 mm del borde de la placa y a 25 mm uno del otro (el diámetro de los discos según las normas de la Organización Mundial de la Salud debe ser de 6 mm), no deben colocarse más de 6 discos en una placa. La dificultad de éste método está en las diferentes velocidades de crecimiento para los diversos microorganismos. El uso de un disco para cada antibiótico estandarizado , permite dar el informe de S (sensible), I (intermedio) y R (resistente) ■ Factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in vitro : ▪ El pH del medio, ya que algunos antibióticos son más activos a pH ácido (Nitrofurantoína), otros a pH alcalino (Aminoglucósidos , Sulfonamidas) ▪ Los componentes del medio, en este caso las proteínas séricas fijan a las penicilinas desde 40 % para la Meticilina y 98 % para la Dicloxacilina. ▪ Estabilidad de los medicamentos , a la temperatura de la incubadora varios agentes antimicrobianos pierden su actividad. ▪ Cuanto más grande sea el inóculo bacteriano, más baja será la sensibilidad del microorganismo. ▪ Cuanto más tiempo se prolonga la incubación, mayor es la oportunidad de presentarse las mutantes resistentes , igualmente los microorganismos que crecen rápido y activamente son más sensibles a la acción de los antibacterianos que aquellos que se encuentran en fase de reposo. ■ Dilución en tubo ▪ Se obtiene un resultado cuantitativo , destacando dos características importantes : ▪ Concentración mínima inhibitoria (CMI) : es la concentración mínima de antimicrobiano que inhibe el crecimiento de un microorganismo. ▪ Concentración mínima bactericida (CMB) : es la concentración que mata a los microorganismos. Normalmente la CMI es suficiente para combatir una determinada infección, ya que los mecanismos inmunitarios se encargan de eliminar al microorganismo. MATERIALES ▪ Caldo de cultivo con suspensión bacteriana a la escala de turbidez de Nº 0,5 de Mc Farland ▪ Placas de Petri con agar Mueller Hinton ▪ Torundas estériles ▪ Discos impregnados con diferentes antibióticos ▪ Pinzas estériles. METODOLOGÍA

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▪ Sumergir la torunda en caldo tripticasa de soya con cepa bacteriana , presionar firme sobre las paredes del tubo y extender uniformemente en la superficie de la placa de agar Mueller Hinton. ▪ Colocar con la ayuda de pinzas, los discos impregnados con diferentes antibiótico sobre la superficie del agar. ▪ Los discos deben quedar a una distancia de 25 mm entre ellos. ▪ Incubar a 37°C durante 24 horas.

Realizar la lectura, observar y anotar los resultados. ■ Lectura de los discos de sensibilidad El diámetro de la zona de inhibición se mide con una regla milimetrada, colocada debajo de la placas de Petri. El límite del área de inhibición está dado por la inhibición completa del desarrollo, tal como se puede apreciar a simple vista.Los milímetros de la lectura serán llevados a la tabla correspondiente para traducir su interpretación en los términos : Sensible (S), Intermedio (I) ,Resistente (R).

Tomado del Manual de laboratorio para la identificación y prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos de patógenos bacterianos de importancia para la salud pública en el mundo en desarrollo. Organización Mundial de la Salud 2004.

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Sensible

Resistente

Lectura de lo halos de Inhibición de los discos de sensibilidad
Quimioterápico Ampicilina AM Amikacina AK Ac. Nalidíxico AN Cefalotina CF Cefoxitina CTX Ceftriaxona CRO Cloranfenicol C Kanamicina K Nitrofurantoina FD Sulfatrimetoprim SXT Ciprofloxacino CIP Concentración del Disco mcg 10 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 30 ug 300 ug 231,2 ug 5 ug Halo de Inhibición Sensible Intermedio Resistente +17 14-16 -13 +17 -15 +19 14-18 -13 +18 15-17 -14 +21 16-10 -15 +21 14-20 -13 +18 15-18 -14 +18 14-17 -13 +17 15-16 -14 +16 11-15 -10 +21 16-20 -15

Antibiótico

S

I

R

Antibiótico

S

I

R

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EVALUACIÓN 1. ¿Qué importancia clínica tiene el antibiograma? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… 2. Mencione cuatro (4) posibles causas de error en el procesamiento o lectura del antibiograma. ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… 3.. ¿En qué casos es necesario realizar la concentración mínima inhibitoria? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………… PRÁCTICA Nº 6 DIFERENCIACIÓN BIOQUÍMICA DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS OBJETIVOS ▪ Reconocer las características morfológicas y en los cultivos de las bacterias Gram positivas ▪ Identificar bioquímicamente las diferentes bacterias Gram positivas de importancia

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clínica. INTRODUCCIÓN Existen una gran variedad de bacterias Gram positivas de importancia clínica con forma de cocos como Staphylococcus aureus, especies de Streptococcus , principalmente S. pneumoniae y cocos anaerobios : Peptostreptococcus. Entre los bacilos Gram positivos patógenos más comunes tenemos Bacillus anthracis, Clostridium, Gardnerella, Listeria , Corynebacterium. Todas esta bacterias se encuentran causando procesos infecciosos en los seres humanos y en algunos casos estas se encuentran colonizando alguna parte del cuerpo junto con bacterias de la flora normal. Por eso se hace necesario para su aislamiento e identificación realizar toma de muestras y procesamiento bacteriológicos correctos. Dentro de los Gram positivos, los cocos y en especial las especies de Streptococcus y los Staphylococcus son los más fáciles de aislar e identificar mediante observación de hemólisis, pruebas bioquímicas o diferenciales específicas como la prueba de catalasa para diferenciar Staphylococcus de Streptococcus , la prueba de coagulasa para diferenciar Staphylococcus patógenos de los no patógenos, la reacción de Quellung para distinguir neumococos etc. MATERIALES ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Cultivos de Streptococcus pneumoniae en agar Sangre Cultivo de Staphylococcus aureus en agar Manitol salado y agar Sangre Tubos con plasma (1ml ) y pipetas graduadas de 1 ml estériles Reactivo de peróxido de hidrógeno Equipo para la coloración de Gram Láminas portaobjetos Asas bacteriológicas Mecheros Microscopios

METODOLOGÍA Pruebas bioquímicas para Staphylococcus y Streptococcus ▪ Observar el tipo de hemólisis que presentan las placas de agar Sangre ▪ Realizar la prueba de catalasa con una colonia de la placa de agar Sangre y con una de Manitol salado. ▪ Para la prueba de coagulasa , en dos tubos con un ml de plasma cada uno, depositar en uno 0,5 ml del cultivo de Staphylococcus aureus y en otro un ml de Streptococcus epidermidis . Incubar 30 minutos a 37º C. ▪ Preparar un frotis con las colonias que han desarrollado en el agar Sangre y en agar Manitol salado.

Preparación de Frotis :

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1. Con el asa de siembra tomar una colonia de la placa de Petri

2. Extender la muestra sobre la lámina portaobjetos

3. Fijar el extendido con la llama del mechero

METODOLOGÍA La identificación de Staphylococcus y Streptococcus, se basa en la morfología de las colonias que se observan en los cultivos primarios y en el tipo de hemólisis en agar Sangre. Sin embargo para evitar errores de interpretación , se emplean pruebas bioquímicas como :

■ Prueba de Catalasa La catalasa es una enzima que cataliza la descomposición de peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Se encuentra presente en la mayoría de los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos excluyendo los estreptococos. La prueba se considera positiva cuando se produce una efervescencia rápida con desprendimiento de burbujas : la enzima catalasa convierte el peróxido de hidrógeno , en agua y oxígeno molecular. Esta prueba se emplea para diferenciar los géneros Micrococcus y Staphylococcus : catalasa positivo del género Streptococcus : catalasa negativo.

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negativo. Con el asa de siembra se toma una colonia del cultivo del microorganismo y se coloca en la lámina
Peróxido de hidrógeno

Figura Nº 1

Figura Nº 2

(+) BURBUJEO :
Staphylococcus

(-) NO BURBUJEO :
Figura Nº 3 Streptococcus

Tomado de Diagnóstico Microbiológico de Bailey y Scott 11ª edición

POSITIVO

NEGATIVO

■ Fermentación del manitol El agar Manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de Staphylococcus patógenos en cultivos mixtos, ya que se aprovecha la capacidad de los Staphylococcus de desarrollar en presencia de Cloruro de sodio (Na Cl) al 7,5 % y la de fermentar manitol, en este caso se observará la formación de un halo amarillo en el agar circundante a las colonias.

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■ Coagulación del plasma Staphylococcus aureus produce una proteína llamada coagulasa , capaz de aglutinar el plasma tratado con oxalato, citrato o heparina en presencia de un factor contenido en el suero. Este factor sérico reacciona con la coagulasa , activando el fibrinógeno y produciendo un coágulo o trombo de fibrina. La coagulasa se presenta en forma unida (adherida a la célula) y en forma libre. El estudio de la actividad coagulasa se puede llevar a cabo en un tubo de ensayo (para coagulasa libre) y en portaobjetos (coagulasa nido), también llamado factor de agregación , la prueba en tubo se hace poniendo un ml de plasma al que se le agrega una asada de un cultivo nocturno de S. aureus. Se incuba la mezcla a 37º C durante 4 horas y se considera positivo ante cualquier grado de coagulación.

(+) PRUEBA POSITIVA
Formación de coágulo Staphylococcus aureus

Coágulo

(-) PRUEBA NEGATIVA No hay formación de coágulo Staphylococcus epidermidis

No se forma coágulo

Tomado de Diagnóstico Microbiológico de Bailey y Scott 11ª edición

POSITIV

NEGATIVO

RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS • Streptococcus

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Hemólisis

Fermentación del manitol

Prueba de catalasa

• Staphylococcus aureus

Fermentación del manitol

Prueba de catalasa

Prueba de coagulasa

• Staphylococcus epidermidis

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Fermentación del manitol

Prueba de catalasa

Prueba de coagulasa

EVALUACIÓN 1. Mencione dos (2) pruebas bioquímicas que permitan diferenciar: • Streptococcus pneumoniae : • Streptococcus pyogenes : 2. Realice un flujograma para la identificación de bacteria Gram positivas

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… PRÁCTICA Nº 7 IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS PSEUDOMONA

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OBJETIVOS ▪ Conocer los procedimientos de identificación bioquímica de las principales bacteria Gram negativas. ▪ Interpretar los resultados de las pruebas bioquímicas y correlacionarlas con la diferentes especies de bacterias Gram negativas. INTRODUCCIÓN Las bacterias Gram negativas pueden presentarse como bacilos o cocos siendo los primeros los más abundantes tanto en el hombre como en los animales. Varios de estos microorganismos pertenecen a la flora intestinal normal , algunos están asociados a infecciones entéricas y a procesos infecciosos (especialmente cuando éstas bacterias invaden otros órganos o sistemas). Es posible que las infecciones procedan de un reservorio animal , de un portador sano o de la diseminación endógena de la bacteria en una persona susceptible, pudiéndose ver afectado cualquier órgano del cuerpo. Familia de bacilos entéricos Esta familia Enterobacteriaceae, incluye a varios patógenos que causan síndromes diarreicos . Un gran número de ensayos han sido desarrollados a manera de identificar rápidamente al patógeno, para que posteriormente el médico, con base en el reporte, indique el tratamiento adecuado o para que los epidemiólogos puedan localizar la fuente de infección. Dentro de los bacilos Gram negativos , las enterobacterias son responsables del 30 a 35 % de todas las septicemias, más del 70 % de todas las infecciones del tracto urinario y muchas infecciones intestinales. Dentro de las especies de enterobacterias que son los agentes etiológicos de infecciones entéricas tenemos : Salmonella , Shigella, y Escherichia coli. Estas pueden producir cuadros diarreicos e infección sistémica , que son procesos infecciosos que se diseminan generalmente por vía sanguínea o linfática. Medios de aislamiento primario Son medios selectivos porque permiten el desarrollo de algunas bacterias e inhiben el desarrollo de otras. Esta capacidad puede ser moderada (agar Eosina azul de metileno (EMB) y Mac Conkey) y alta (agar Salmonella-Shigella, Desoxicolato y Citrato) o completamente específica (Sulfato de bismuto y Verde brillante). Algunos de los medios selectivos contienen lactosa y un indicador de pH, lo que permite desde el principio tener colonias aisladas de bacterias fermentadoras como Escherichia coli y no fermentadoras de la lactosa : Salmonella, Shigella. Medios diferenciales : Pruebas Bioquímicas Son aquellos en los que se pone de manifiesto las propiedades metabólicas de los microorganismos frente a diferentes sustratos. Existen medios que permiten observar una, dos o más características metabólicas de la bacteria inoculada . Entre los más utilizados están : ▪ Agar Triple Azúcar (TSI): medio sólido que contiene glucosa, sales de hierro y un indicador de pH. Permite conocer la capacidad de la bacteria para fermentar los carbohidratos. Se detecta la producción de sulfuro de hidrógeno (H2S), así como

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de gas. El tubo se siembra por picadura y en estría por lo que se debe observar tanto el fondo como la superficie del medio ▪ Agar Lisina Hierro (LIA) : medio sólido que contiene lisina, sales de hierro, glucosa y un indicador de pH. Se determina la descarboxilación y desaminación oxidativa de la lisina, la producción de ácido sulfhídrico o sulfuro de hidrógeno (H2S) y la fermentación de glucosa. Se siembra por picadura y estría. ▪ Medio para Sulfuro , Indol y Movilidad (SIM) : medio semisólido, se utiliza en la producción de sulfuro de hidrógeno, la formación de Indol y movilidad. Se inocula con una única punción con asa de siembra recta a través del centro, hasta una profundidad de unos dos tercios del medio. ▪ Agar Citrato de Simmons : medio sólido que contiene citrato de sodio, compuesto que puede ser utilizado como única fuente de carbono, por algunas bacterias. Se siembra por picadura y estría • Agar Úrea (Método de Christensen) : medio sólido, se utiliza para determinar la capacidad de un organismo para producir la enzima ureasa, que hidroliza la úrea . La hidrólisis de la úrea produce amoníaco y anhídrido carbónico. La formación de amoníaco alcaliniza el medio y el cambio de pH se detecta por el cambio de color del rojo fenol de naranja pálido a magenta. Existen más pruebas bioquímicas que pueden utilizarse como complemento a las ya descritas como son : rojo de metilo, Voges Proskawer, utilización de malonato, las cuales ayudan a determinar la especie del microorganismo aislado. En ocasiones a pesar de recurrir a diversas pruebas metabólicas, no se consigue la identificación , siendo necesario realizar reacciones inmunológicas para llegar al diagnóstico definitivo. BACTERIAS PIÓGENAS GRAM NEGATIVAS Otro grupo menos abundantes en especies pero de gran importancia clínica son las bacterias piógenas Gram negativas, que pueden ser cocos o cocobacilos . Las enfermedades que producen por lo general incluyen la acumulación de abundantes cantidades de pus y afectan frecuentemente el aparato genital o respiratorio. Dichas enfermedades comprenden : uretritis purulenta (gonococo) , meningitis , neumonías , bronquitis, sinusitis, otitis media, conjuntivitis, epiglotitis etc. Las bacterias piógenas Gram negativas patógenas en humanos son : Neisseria, Haemophilus, Bordetella, Moraxella. Las bacterias del género Neisseria son diplococos Gram negativos inmóviles, cuyos lados adyacentes son aplanados y ligeramente cóncavos. Sólo dos especies de este género son patógenas exclusivamente de humanos : Neisseria gonorroheae o gonococo, agente causal de la enfermedad de transmisión sexual, la gonorrea y la N .meningitidis o meningococo productos comensales para el hombre y que habitan principalmente el tracto respiratorio superior. Esporádicamente se pueden comportar como patógenos oportunistas N. sicca y N. mucosa.

El diagnóstico definitivo de una infección gonocócica se hace por el aislamiento en cultivo de N. gonorrhoeae.

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Para el diagnóstico del gonococo, el lugar de la toma de la muestra dependerá de la edad, sexo y de las características de la infección. La tinción de Gram es el método de elección para el examen directo de las muestras. Son oxidasa positiva. Para los cultivos , el medio debe ser de preparación reciente, bien hidratado y precalentados. Se utilizan medios selectivos como agar Thayer Martin modificado. Se debe utilizar un medio no selectivo ya que algunas cepas pueden inhibirse por los antimicrobianos contenidos en los medios selectivos. Debe estar además en una atmósfera que contenga de 3 a 5 % de CO2. El diagnóstico de la infección meningocócica, se hace con el aislamiento de N. meningitidis a partir de líquido cefalorraquídeo, sangre, líquido sinovial, pleural o pericárdico. Las más utilizadas son las dos primeras. Con la tinción de Gram se observan como diplococos Gram negativos, crecen en los medios de cultivo enriquecidos y su crecimiento se favorece con una atmósfera de CO2. Son oxidasa positivo y fermentan los carbohidratos. MATERIALES ▪ Placas con agar Eosina azul de metileno sembradas con cepas problemas. ▪ Placas con medio Mac Conkey, Eosina azul de metileno (EMB) y SalmonellaShigella ▪ Tubos con medio TSI, Citrato de Simmons, LIA, ÚREA, SIM, sin sembrar y sembrados con cepa problema ▪ Asas de siembra ▪ Reactivo de Kovacs ▪ Láminas fijadas con frotis de líquido cefalorraquídeo con tinción de Gram. ▪ Microscopio ▪ Aceite de inmersión ▪ Placas de cultivo con agar Chocolate. METODOLOGÍA ■ Enterobacterias ▪ En las prácticas se harán los trabajos de laboratorio que nos permitan observar las características de cultivo y con ello su identificación ▪ A partir de uno de los tubos problema, tomar con el asa de siembra previamente esterilizada una muestra y sembrar por estrías en los medios Eosina azul de metileno y Salmonella – Shigella. Incubar a 37ºC por 24 horas. ▪ Transcurrido el tiempo de incubación , observar la morfología de las colonias de las placas sembradas (Mac Conkey, EMB y S-S). ▪ Seleccionar una colonia y realizar cultivos en los tubos de TSI, Citrato de Simmons, LIA y SIM. Esto se hace por puntura en los medios y luego en estrías en la parte de inclinación (pico de flauta) como lo indicará el profesor en cada medio. Llevar a incubar a 37ºC por 18 a 24 horas. ▪ Hacer la lectura de las pruebas bioquímicas, interpretar y realizar la identificación del microorganismo proporcionado.

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■ Interpretación Bioquímica Agar Triple Azúcar (TSI): ▪ Fermentación de glucosa : en la picadura (fondo del tubo) el medio vira a color amarillo. Es una reacción débil. ▪ Fermentación de sacarosa : en todo el tubo el medio cambia a amarillo, principalmente en el fondo, donde se intensifica el color debido a la reacción de la glucosa. ▪ Fermentación de lactosa : en la superficie el medio vira a amarillo. Debido a la fermentación puede hacer producción de gas, lo que se manifiesta por la presencia de burbujas en el medio. ▪ Producción de ácido sulfhídrico o sulfuro de hidrógeno (H2S): por degradación enzimática de aminoácidos que contienen azufre originan un precipitado de color negro. La producción de H2S tiene lugar en ambiente ácido, de ahí que el precipitado negro se concentre en el fondo del tubo, donde se generan ácidos a partir de la glucosa. Así , un fondo negro indica que existe acidez en el fondo del tubo, aunque el color amarillo se haya enmascarado con el precipitado negro. Agar Lisina Hierro (LIA) : ▪ Descarboxilación de lisina : el medio se alcaliniza y se observa lila o ligeramente morado en la superficie. ▪ Fermentación de la glucosa : en el fondo del tubo el medio vira a amarillo. ▪ Desaminación de la lisina : vira a color rojizo en la superficie del medio. Es característico de Proteus y Providencia. ▪ Producción de H2S : precipitado de color negro ( por el mecanismo citado anteriormente). Agar Citrato de Simmons : ▪ Utilización de citrato como fuente de carbono : el medio vira a color azul. Agar Úrea : ▪ Los microorganismos que hidrolizan la úrea producen un cambio de color en el pico de flauta de naranja pálido a magenta. Medio para Sulfuro, Indol y Movilidad (SIM) : ▪ Motilidad: Los cultivos móviles muestran un crecimiento difuso o turbidez lejos de la línea de inoculación , por lo que observando si el crecimiento está solo en la picadura o se extiende a los lados de ella, se puede determinar si el microorganismo es inmóvil o móvil. ▪ Indol : la aparición transcurridos unos segundos, de un anillo de color rojo en la interfase entre el reactivo y el cultivo indica la presencia de indol y, por lo tanto , la prueba se considera positiva. El indol es capaz de reaccionar con el grupo aldehído

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del reactivo originando un complejo de color rojo. ▪ Producción de H2S: precipitado de color negro ( por el mecanismo citado anteriormente).

Escherichi a coli

Klebsiella

Salmonell a

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Shigella

RESULTADOS Realizar la lectura e identificación de los microorganismos, observar y anotar los resultados.

• Escherichia coli :

TSI

LIA

Citrato de Simmons

Úrea

SIM

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• Klebsiella sp

TSI

LIA

Citrato de Simmons

Úrea

SIM

• Proteus sp

TSI

LIA

Citrato de Simmons

Úrea

SIM

• Salmonella sp

TSI

LIA

Citrato de Simmons

Úrea

SIM

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• Shigella sp

TSI

LIA

Citrato de Simmons

Úrea

SIM

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PSEUDOMONA Las especies pertenecientes al género Pseudomonas son ubicuos, se encuentran en la tierra, materia orgánica en descomposición, en la vegetación, en el agua. También podemos encontrar estos microorganismos en el ambiente hospitalario, en lugares húmedos, como comida, baños, respiradores. No forman parte de la flora normal del ser humano con excepción de los pacientes hospitalizados y en pacientes ambulatorios inmunodeprimidos. Debido a las sencillas necesidades de crecimiento y a la versatilidad nutricional , se logra su amplia distribución ambiental, siendo capaces de utilizar un gran número de compuestos orgánicos como fuentes de carbono y nitrógeno. Son bacilos Gram negativos móviles rectos o ligeramente curvos, que son aerobios estrictos, la mayoría de las cepas son móviles por medio de uno o más flagelos polares; utilizan glucosa y otros hidratos de carbono de manera oxidativa; y suelen ser citocromo oxidasa positivos El género Pseudomonas se divide en cuatro grupos : Grupo fluorescente, Grupo Stutzeri, Grupo Alcalígenes y Grupo con pigmento amarillo. Grupo fluorescente : Pertenecen a este grupo las especies : Pseudomona aeruginosa, Pseudomona fluorescens y Pseudomona putida , las cuales se caracterizan por la producción de un pigmento pioverdina hidrosoluble que da fluorescencia blanca a verde azulada bajo luz ultravioleta de longitud de onda larga (400 nm). Sólo una especie, Pseudomona aeruginosa , produce el pigmento hidrosoluble azul llamado piocianina. Pseudomona aeruginosa produce un aspecto característico cuando crece en una placa de agar sangre , se pueden observar grandes colonias grises y presenta beta hemólisis. Las colonias tienen un aspecto de piel de caimán y con brillo metálico. La exudación de pus azulado, con olor similar a las uvas , por la producción de piocianina es característico en las heridas infectadas por este microorganismo. La piocianina es un antibiótico que puede permitir que la Pseudomona aeruginosa exista en la naturaleza, también puede desempeñar un papel en la nutrición , al funcionar como una forma de adquirir fosfatos inorgánicos. Se puede realizar una identificación rápida de Pseudomona aeruginosa si se observan las siguientes características : morfología típica de las colonias, producción de pigmentos difusibles, olor a fruta y positividad en la prueba de oxidasa.

CARACTERÍSTICAS DEL GRUPO FLUORESCENTE : PRUEBA PIOVERDINA PIOCIANINA MATERIALES ▪ Placas con agar Nutritivo sembrada con cepa problema. ▪ Asas de siembra Pseudomona aeruginosa + + Pseudomona fluorescens + Pseudomona putida + -

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Pseudomon a aeruginosa

piocianina

RESULTADOS

EVALUACIÓN 1.¿Cuáles son las principales enterobacterias causantes de cuadros diarreico? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… 2. Realizar un flujograma para la identificación de bacterias Gram negativas.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………………………………………………………………………………………………………………

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……………………………………………………………………………………………………… PRÁCTICA Nº 8 IDENTIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE MYCOBACTERIUM COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN

OBJETIVOS ▪ Conocer los riesgo y precauciones durante el procesamiento de muestras con micobacterias. ▪ Conocer el procesamiento de las muestra para el estudio de micobacterias. ▪ Explicar el fundamento de la coloración de Ziehl-Neelsen. ▪ Ejecutar la técnica de coloración de Ziehl-Neelsen. INTRODUCCIÓN El género Mycobacterium está integrado por más de 100 especies, presentan alto contenido de ácidos micólicos en su pared que retienen las anilinas utilizadas como colorantes : fucsina , auramina, aun después de ser tratadas con alcohol-ácido de modo que todas las especies se presentan como ácido-alcohol resistentes (BAAR). El complejo Mycobacterium tuberculosis comprende varios agentes etiológicos de tuberculosis M.tuberculosis , M.africanum y M.canetti , los cuales son primariamente patógenos en el hombre. M.tuberculosis y M.africanum son las especies de micobacterias más importantes por ser altamente patógenas para el hombre y muy transmisibles de persona a persona por aerosoles expulsados por la tos de pacientes con lesión pulmonar. La muestra más examinada en la investigación de Mycobacterium tuberculosis es la de esputo debido a que la tuberculosis pulmonar es la más frecuente, sin embargo dado que la enfermedad puede manifestarse en cualquier órgano , con menor frecuencia puede requerirse la investigación de muestras como orina, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido ascítico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias, las cuales deben procesarse también para cultivo. La muestra de esputo mucopurulenta proveniente del árbol bronquial que se obtiene después de un esfuerzo de tos, es la que asegura mayor probabilidad de que se puedan observar bacilos, debe tener un volumen aproximado de 3 a 5 ml .Se recomienda analizar 2 ó 3 muestras de cada sintomático respiratorio. La primera muestra debe obtenerse en el momento de la consulta y la segunda al día siguiente al despertar por la mañana. Puede obtenerse una tercera muestra al momento de entregar al laboratorio la segunda muestra. El envase debe ser de boca ancha y con tapa de rosca. Si la muestra de esputo no va a ser procesada el mismo día, se debe introducir cada envase en una bolsa de polietileno y anudar la bolsa por encima de la tapa , se conservarán en refrigeración a 4º C, para impedir la proliferación de la flora secundaria, preferentemente dentro de una caja de plástico. Para manipular las muestras y sobre todo los pasajes a otros medios de cultivo es importante hacerlos en la cabina de seguridad. Para que la baciloscopía sea positiva es preciso que la muestra contenga entre 5 000 y 10 000 bacilos por ml de muestra.

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Las micobacterias se multiplican con más lentitud que otras bacterias patógenas para el hombre a causa de su pared celular hidrófoba, que las hace agruparse e inhibe la permeabilidad celular a los nutrientes El medio de cultivo más conocido es el Löwenstein-Jensen. La temperatura óptima de crecimiento es de 37ºC. Los cultivos se revisarán diariamente hasta un total de 60 días , pasados los cuales si no hay crecimiento se considerarán negativos. Lectura de los extendidos Observar cada campo microscópico en superficie y profundidad , moviendo el tornillo micrométrico antes de desplazarse al siguiente campo; seguir un recorrido en líneas rectas, para recorrer el extendido evitando repetir la lectura de los campos , ejemplo : de izquierda a derecha. El número mínimo de campos a examinar es de 100 , los cuales pueden ser leídos por un microscopista experimentado en cinco . Los bacilos se observarán como bastoncillo delgados , ligeramente curvos, rojo fucsia, destacándose claramente contra en fondo azul. Pueden presentarse aislados, apareados o agrupados. Escala semicuantitativa para los extendidos examinados por tinción Ziehl-Neelsen
Resultado del examen microscópico No se encuentran BAAR en 100 campos observados Se observan de 1 a 9 BAAR en 100 campos observados Se observan entre 10 y 99 BAAR en 100 campos observados Se observan de 1 a 10 BAAR en 50 campos observados Se observan más de 10 BAAR en 20 campos observados Informe No se observan bacilos ácido-alcohol resistentes Nº exacto de bacilos en 100 campos Positivo (+) Positivo (++) Positivo (+++)

Tinción de Ziehl-Neelsen La ácido-alcohol resistencia es la propiedad que tienen las micobacterias de captar en su pared fucsina fenicada y retenerla aun con la acción de los decolorantes como la mezcla de ácido y alcohol . Esta característica se debe al alto contenido lipídico fundamentalmente fosfolípidos, ceras y ácidos micólicos. MATERIALES ▪ Muestras de esputo inactivadas (autoclavadas) de pacientes Bk positivos ▪ Frotis fijos de Mycobacterium tuberculosis a partir de esputos ▪ Tubos con medios de cultivo Löwestein-Jensen mostrando colonias de micobacterias ▪ Equipo de coloración para tinción de Ziehl-Neelsen ▪ Mecheros ▪ Láminas portaobjetos ▪ Microscopios METODOLOGÍA Preparación y fijación del extendido

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1. Ordenar las muestras 2. Numerar las láminas portaobjetos 3. Tomar la muestra y la lámina portaobjetos y colocarlas por detrás del mechero, de manera que la llama quede entre el operador y el frasco 4. Destapar con cuidado el envase 5. Partir un aplicador en dos. Tomar una parte del aplicador con la mano izquierda y la otra con la mano derecha entre el pulgar y el índice y con los extremos irregulares seleccionar la partícula más densa o purulenta de la muestra 6. Colocar las partículas seleccionadas sobre la lámina portaobjetos y extenderla con movimientos suaves . Dejar secar el extendido a temperatura ambiente 7. Desechar el aplicador en un frasco que contenga una solución de hipoclorito de sodio al 1 %. 8. Cerrar el envase de la muestra 9. Cuando el extendido haya secado, pasarlo sobre la llama del mechero por tres (3) o cuatro (4) veces para fijarlo. Tinción de Ziehl-Neelsen 1. Cubrir totalmente la superficie del extendido con fucsina básica fenicada 2. Con la llama de un hisopo embebido de alcohol calentar suavemente por debajo de los extendidos, con movimientos de vaivén, hasta observar que se desprenden los primeros vapores blancos 3. En el término de 5 minutos calentar tres veces hasta la emisión de vapores. No dejar hervir la fucsina porque la pared de los bacilos puede destruirse y colorearse mal. 4. Dejar enfriar y enjuagar con abundante agua 5. Cubrir todo el extendido con la solución decolorante y dejar actuar por tres minutos. Enjuagar con abundante agua 6. Cubrir todo el extendido con solución de Azul de metileno, dejar actuar por un minuto 7. Enjuagar con abundante agua 8. Dejar secar al medio ambiente

1. Cubrir con fucsina básica fenicada

2. Calentar suavemente

con ayuda del hisopo (5 minutos) 59

3. Enjuagar con abundante agua

4. Cubrir con solución decolorante (3 minutos)

5. Enjuagar con abundante agua

6. Cubrir con Azul de
metileno (1 minuto)

7. Enjuagar con abundante agua

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Bacilos ácido-alcohol resistentes

Medio de cultivo Löwenstein-Jensen

Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis

RESULTADOS Realizar la observación microscópica de las láminas y graficar los resultados.

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BACTERIAS ANAEROBIAS Las bacterias anaerobias han sido encontradas en infecciones que comprometen todos los órganos y regiones anatómicas del cuerpo. Los abscesos más profundos y las lesiones necrosantes que involucran anaerobios son polimicrobianos y pueden incluir aerobios obligados, anaerobios facultativos, microaerófilos como microorganismos acompañantes. Estos microorganismos, de forma conjunta con el trauma, la éstasis vascular o la necrosis tisular, reducen la tensión de oxígeno y el potencial de oxidoreducción en los tejidos y proveen las condiciones favorables para la multiplicación de los anaerobios obligados. En las últimas décadas , las infecciones anaerobias se han vuelto más comunes, para lo cual existen dos probables explicaciones : a) el aislamiento por parte del laboratorio de las bacterias anaerobias ha mejorado de modo que las infecciones endógenas no son más mal diagnosticadas o pasan inadvertidas , b) una proporción mayor de pacientes está recibiendo fármacos inmunosupresores por neoplasias u otras enfermedades , lo que deriva en la resistencia del huésped inmunodeprimido. Las infecciones anaerobias primarias se establecen fácilmente en áreas de tejido dañado y la bacteriemia, diseminación metastásica de las bacterias con formación de abscesos distantes y una cadena progresiva de eventos , pueden suceder a veces con un desenlace mortal. Es importante el aislamiento e identificación de las bacterias anaerobias debido a que estas se asocian a una elevada morbimortalidad y a que el tratamiento varía según la especie implicada. Aislamiento de bacterias anaerobias Selección de las muestras para el cultivo : Debido a que los anaerobios residentes a menudo están presentes en grandes cantidades como flora normal en las superficies de las mucosas , incluso la contaminación mínima de una muestra puede dar resultados erróneos. Todos los materiales recogidos de lugares que carecen de flora natural como líquidos corporales que no sea orina, exudados de abscesos profundos, aspirados con aguja fina y biopsias de tejidos pueden ser cultivados para bacterias anaerobias. Recolección y transporte de las muestras: Al tomar muestras de piel o mucosas, se debe se descontaminar la superficie, para lo cual se debe utilizar jabón , alcohol etílico al 70 % y tintura de yodo por un minuto ( en círculos concéntricos comenzando por el centro), también se puede utilizar yodopovidona al 10 % , luego de lo cual se espera al menos 2 minutos antes de la extracción de la muestra . El material para el cultivo anaerobio se obtiene mejor por biopsia de tejidos o por punción y aspiración . El empleo de hisopos no es una alternativa adecuada debido a la exposición excesiva de la muestra a los efectos de la desecación , la posibilidad de contaminación durante la recolección y a que los microorganismos pueden quedar retenidos dentro de las fibras del hisopo. Si se utiliza un hisopo, este debe provenir de un sistema de transporte exento de oxígeno. Un factor crucial para la viabilidad de los cultivos anaerobios es el transporte de las muestras; el efecto letal del oxígeno atmosférico debe ser nulo hasta que la muestra pueda procesarse en el laboratorio. Ya no se acepta tapar de nuevo una jeringa ni el transporte de la aguja y la jeringa al laboratorio debido a los problemas secundarios a lesiones por punción . Por lo tanto incluso los aspirados deben inocularse en el mismo tipo de tubo o frasco ampolla libre de oxígeno. La muestra (pus,líquidos corporales u otro material líquido) se inocula a través del tapón de goma después de extraer todo el aire de la jeringa y la aguja. Si sólo se puede obtener una muestra con hisopo, se requiere de un dispositivo especial para la recolección con una atmósfera libre de oxígeno. Cuando se reinserta el hisopo, debe de tenerse cuidado de no inclinar el recipiente , lo que

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provocaría la salida y el desplazamiento del anhídrido carbónico o el nitrógeno libre de oxígeno al aire ambiental. El tejido puede colocarse en una pequeña cantidad de líquido para preservarlo de la desecación y luego colocarlo en una bolsa para anaerobiosis. Todas las muestras deben mantenerse a temperatura ambiente hasta su procesamiento en el laboratorio, dado a que la refrigeración puede oxigenar la muestra. Todas las muestras deben ser remitidas al laboratorio lo antes posible. Examen directo de los materiales clínicos : El análisis macroscópico de las muestras es importante para establecer la presencia de anaerobios, datos orientadores serán el hallazgo de un olor fétido, el aspecto purulento de muestras líquidas así como el hallazgo de tejido necrótico y gas. En los portaobjetos preparados para la tinción de Gram, es más útil la fijación con metanol que el calor; se deben observar características celulares y el fondo del frotis y en la tinción de Gram , observar la forma, tamaño, disposición de las bacterias y registrar el número de microorganismos presentes . Observar características morfológicas distintivas como : presencia de esporas, ramificaciones, filamentos con corpúsculos esféricos, formas granulares. La tinción de Gram permite determinar características celulares, las tinciones de Wright y Giemsa a veces pueden revelar información adicional. Las tinciones de naranja de acridina son las más útiles para detectar bacterias en hemocultivos, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido articular y exudados. Procesamiento de las muestras Las muestras para cultivos anaerobios pueden procesarse en la mesa de trabajo común con incubación en jarras o bolsas para anaerobiosis o en una cámara anaerobia. Jarras para anaerobiosis : el sistema que más se utiliza para crear una atmósfera anaerobia es la jarra para anaerobiosis; para lo cual se utiliza una jarra plástica transparente ( disponible en el comercio) con una tapa que se cierra para hacerla hermética. Las condiciones de anaerobiosis pueden obtenerse mediante el uso de un sobre que se adquiere en el comercio, generador de hidrógeno y CO2, que se activa con el agregado de agua o con la humedad proveniente de las placas de agar. La anaerobiosis se alcanza luego de 1 a 2 horas. Bolsas plásticas anaerobias : Es una bolsa de plástico transparente , de varios tamaños, con capacidad para una a tres placas de Petri de 100 mm de diámetro, un generador de gas H2-CO2 que produce una atmósfera cuando se le agrega agua, partículas de catalizador de paladio frío y resazurina como indicador. La bolsa se sella con calor luego de la activación del generador para permitir el mantenimiento de las condiciones anaerobias. Incubación de los cultivos En la mayoría de los casos, la temperatura adecuada es de 35 a 37°C, para el aislamiento primario de bacterias anaerobias a partir de muestras clínicas. Las placas inoculadas en las mesas de trabajo y colocadas en las jarras de anaerobiosis deben incubarse al menos 48 horas y reincubarse por otros 2 a 4 días para permitir que los microorganismos de crecimiento lento formen colonias; algunos anaerobios como ciertas especies de Actinomyces y Eubacterium, crecen más lentamente y las colonias no pueden detectarse si las jarras se abren antes. Si las jarras se abren pronto, algunos de los microorganismos de crecimiento lento pueden morir debido a la exposición de oxígeno. Debe evitarse la exposición prolongada de las placas

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recién inoculadas al aire ambiental, ciertos anaerobios encontrados en muestras clínicas como Peptostreptococcus anaerobius , pueden no crecer o mostrar un retraso prolongado en el desarrollo cuando las placas recién inoculadas se mantienen en el aire ambiental. CUADRO N°1 : Incidencia de anaerobios como flora normal de los seres humanos Tracto Intestino Genitales Uretra Vagina Respiratorio externos Superior BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Bacteroides 0 +/2 +/+/+/Prevotella 0 2 2 1 +/1 Porphyromonas 0 1 1 D D +/Fusobacterium 0 2 1 D D +/Veillonella 0 2 1 0 D 1 BACTERIAS GRAM POSITIVAS Finegoldia 1 2 2 1 +/1 magna Micromonas 1 2 2 1 +/1 micros Clostridium +/+/2 +/+/+/Actinomices 0 1 1 0 0 +/Bifidobacterium 0 1 2 0 0 +/Eubacterium 0 1 2 D D 1 Lactobacillus 0 1 1 0 +/2 Propionibacteriu 2 1 +/+/+/1 m D:Desconocido; 0: No se encuentra o raro; +/-: irregular; 1: por lo común presente; 2 : Presente en grandes cantidades CUADRO N°2 : Muestras que no deben cultivarse en medios para anaerobios HISOPADOS FARÍNGEOS O NASOFARÍNGEOS Hisopados gingivales Muestras broncoscópicas o esputo Contenido gástrico, contenido de intestino delgado, heces, hisopados rectales, fístulas colonocutáneas Superficies de úlceras por decúbito, hisopados de muestras de costras de abscesos, revestimientos mucosos Materiales adyacentes a la piel o las mucosas Orina de micción espontánea Hisopados cervicales o vaginales MATERIALES ▪ Placas con agar Chocolate ▪ Jarra anaerobia GÉNERO Piel

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RESULTADOS

EVALUACIÓN 1. ¿Qué personas son más susceptibles a la contaminación con Mycobacterium tuberculosis? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… 2. ¿A quiénes se les llama multidrogorresistentes? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… 3. ¿En qué casos se hace necesario realizar una prueba de susceptibilidad antibiótica a los pacientes con tuberculosis? ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………

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………………………………………………………………………………………………… PRÁCTICA Nº 9 CULTIVO DE MUESTRAS CLÍNICAS: UROCULTIVO Y COPROCULTIVO OBJETIVOS ▪ Conocer el procedimiento para el cultivo de una muestra clínica. ▪ Identificar los microorganismos más frecuentes causantes de patologías clínicas. ▪ Conocer las condiciones para una adecuada toma de muestra para cultivo de una muestra clínica. ■ CULTIVO DE ORINA: UROCULTIVO La infección del tracto urinario (ITU) , se define como la presencia y multiplicación de microorganismos en el tracto urinario con invasión de tejidos adyacentes. La presencia de leucocitos en la orina , indica una respuesta inflamatoria del tracto urinario, la mayoría de las veces debido a una invasión tisular por bacterias. Por lo general la piuria, está presente en las ITU , por lo que se le considera un criterio diagnóstico para ésta enfermedad. La mayoría de las ITU son causadas por bacilos Gram negativos de las enterobacterias , siendo la Escherichia coli y Klebsiella sp, los más frecuentemente aislados , en infecciones no complicadas. También pueden ser causa de ITU otros bacilos Gram negativos como Proteus sp , Enterobacter sp y Pseudomona aeruginosa sobre todo en pacientes sometidos a instrumentación, portadores de catéteres urinarios, con anomalías anatómicas o funcionales del tracto urinario y en pacientes hospitalizados. Entre las bacterias Gram positivas pueden estar Staphylococcus epidermidis y Enterococcus sp. En la mayoría de las ITU , se recupera un único microorganismo en la orina. La presencia de más de una especie bacteriana puede deberse a una contaminación de la muestra o pacientes con infecciones complicadas como por ejemplo litiasis , abscesos renales o sondaje prolongado. El diagnóstico definitivo de la ITU se hace mediante el cultivo de orina : urocultivo . Hay que considerar que por cuidadosa que sea la técnica de toma de muestra ( salvo punción suprapúbica) , es difícil excluir la contaminación de la orina con las bacterias del tramo distal de la uretra , lo que puede causar interpretaciones erradas. La orina de micción media es la más recomendable para el urocultivo. En pacientes femeninas es recomendable el lavado de genitales externos, en el paciente masculino retraer la piel del prepucio. La primera parte de la micción casi siempre estás contaminada con la flora bacteriana uretral, por lo cual se debe descartar . La micción media debe recogerse en un envase estéril. Se recomienda obtener la primera muestra de orina de la mañana , donde se encuentra mayor número de bacterias. El cultivo de orina se realizará para identificar y cuantificar el número de bacterias presentes por mililitro en la orina, lo que se expresa en unidades formadoras de colonias (UFC) . La muestra de orina debe enviarse el laboratorio en el plazo

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máximo de 2 horas a temperatura ambiente, puesto que la orina es un buen medio de cultivo para muchas bacterias y la multiplicación de los gérmenes entre el momento de la toma de muestra y el cultivo, alterará los resultados. Es recomendable que en todas las muestras de orina para urocultivo , se realice un examen microscópico cuantitativo , para determinar el número de leucocitos por milímetro cúbico. MATERIALES ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Frasco estéril de 100 ml Asa de siembra calibrada 0,01ml Pipetas graduadas de 1ml estériles Placas con agar Mac Conkey y Eosina azul de metileno Láminas portaobjetos , laminilla Equipos de coloración para tinción de Gram Centrífuga y microscopio

METODOLOGÍA ▪ Evitar la contaminación de la muestra, utilizando equipos estériles: frascos, pipetas, placas de Petri, tubos de pruebas estériles. ▪ Examen directo: • Centrifugar aproximadamente 10 ml de orina por tres (3) minutos a 3 000 rpm y luego decantar el sobrenadante y observar el sedimento al microscopio a lente de 40X ▪ Cultivo ▪ Con el asa de siembra calibrada : 0,01 ml, previa agitación de la muestra , tomar una muestra con el asa y sembrar por estrías en agar Mac Conkey, previamente dividida en cuatro cuadrantes , empezando las estrías por el primer cuadrante y sin esterilizar el asa continuar la siembra en el segundo, tercer y cuarto cuadrante. ▪ Rotular la placa e incubar 24 horas a 37º C.

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RESULTADOS Realizar la lectura de la placa y a partir de una colonia bien aislada realizar las pruebas bioquímicas para la diferenciación. Realizar el contaje de colonias para obtener el recuento total de UFC/ml.

Sedimento urinario

Agar Mac Conkey

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TSI

Citrato

LIA

SIM

■ CULTIVO DE HECES: COPROCULTIVO La diarrea puede definirse como el proceso de eliminación frecuente de heces, disminución de su consistencia o ambas cosas. El diagnóstico etiológico se realiza mediante el cultivo de los microorganismos presentes en la materia fecal : Coprocultivo , realizándose primero el aislamiento y luego la identificación de las bacteria presentes en las heces. Las bacterias causantes de diarreas más frecuentes son : Salmonella, Shigella y Escherichia coli enteropatógena .También puede producirse cuadros diarreicos por : Campylobacter sp, Yersinia enterocolítica ,Vibrio cholerae, Staphylococcus aureus y Clostridium difficile. Para realizar este procedimiento se requiere que la muestra se colecte en el curso de la enfermedad, antes de iniciar tratamiento y que se deposite en un frasco estéril, procurando no mezclarla con la orina. Si esto no es posible es conveniente conservar la muestra en un medio de transporte adecuado manteniendo en refrigeración hasta su siembra. Muestras inaceptables: ▪ Muestras no conservadas de más de 4 a 6 horas. ▪ Muestras múltiples el mismo día ▪ Muestras contaminadas con orina. METODOLOGÍA ▪ Examen Directo El examen microscópico directo de las heces permite la observación de polimorfonucleares, lo que sugiere la infección de por un patógeno invasivo. Examen en fresco y/o tinción de Azul de metileno de Loeffler. Tinción de Gram : permite observar polimorfonucleares y flora predominante. ▪ Inoculación El coprocultivo se realiza a partir de muestras recién emitidas de preferencia, de las cuales se inoculan los medios de cultivo.

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•Medios diferenciales Para diferenciar a los bacilos entéricos fermentadores de lactosa (L+) de los no fermentadores de lactosa (L -), e inhibir el crecimiento de la flora Gram positiva aerobia: agar Mac Conkey, agar Eosina azul de metileno, agar Endo. •Medios selectivos Para inhibir el crecimiento de la mayoría de las enterobacterias y permitir el crecimiento de Salmonella spp y Shigella spp : agar Xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) y agar Salmonella – Shigella (SS) •Medio líquido Utilizar medio Selenito F para suprimir el crecimiento de la flora normal durante las horas iniciales de incubación. Se resiembran en medio sólido a partir de las 6 horas. Este medio de cultivo es fundamental para el estudio de portadores asintomáticos. •Medios especiales Vibrio spp Medio de enriquecimiento: agua peptonada alcalina a partir de 6 horas , subcultivar en agar Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sucrosa (TCBS) Medio selectivo :TCBS Campylobacter medio selectivo : medio CAMP MATERIALES •Muestra de heces •Placas de Petri con agar SS, EMB •Tubos con caldo Selenito •Láminas portaobjetos y laminillas •Asas de siembra •Tubos con medios diferenciales o bioquímicos. RESULTADOS Realizar la lectura de los medios de cultivo y las colonias sospechosas , realizar las pruebas bioquímicas para diferenciar las especies de enterobacterias.

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TSI

Citrato

LIA

SIM

■ CULTIVO DE SANGRE: HEMOCULTIVO Mielocultivo La detección de microorganismos viales en muestras de sangre tiene gran importancia diagnóstica. Cuando bacterias u hongos se multiplican a una razón que supera la capacidad del sistema retículoendotelial del torrente sanguíneo , se produce bacteriemia y fungemia. Bacteriemia persistente o crónica ocurre cuando no se ha podido localizar o drenar adecuadamente, el foco de la infección. La entrada directa de bacteria al torrente sanguíneo ocurre en infecciones intravasculares como : endocarditis, fístulas arteriovenosas, aneurismas micóticos, flebitis supurativas, catéteres intravenosos infectados y arteriales permanentes. Es importante comprender las circunstancias en que puede desarrollar una bacteriemia para planificar los métodos de diagnóstico así como la interpretación de los resultados. Las fuentes de bacteriemias son : sistema genitourinario 25 %, sistema respiratorio 20 % , abscesos 10%, heridas quirúrgicas 5 % , otros sitios conocidos 10 % y sitios desconocidos 25 %. Siempre que exista una razón para sospechar de bacteriemia se debe practicar el cultivo de la sangre, periférica o medular. Ya que en muchas ocasiones solo se puede establecer el diagnóstico mediante este procedimiento. El aislamiento de un microorganismo de los hemocultivos es transcendente porque establece el diagnóstico etiológico de la bacteriemia y permite la elección del tratamiento. Sepsis agudas, osteomielitis, meningitis , neumonía , pielonefritis: en estos casos el hemocultivo debe considerarse un procedimiento de urgencia. Bacteriemia continua de origen intravascular como endocarditis, infecciones asociadas a catéteres , de origen desconocido, con sospecha de fungemia e inmunodeprimidos, la muestra se puede tomar en cualquier momento.

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Bacteriemias intermitentes: lo ideal es realizar la prueba cuando el paciente presenta escalofríos o poco después o durante del pico febril. Entre el 14 y 25 % de los pacientes hospitalizados, tienen sospecha de bacteriemia y en un 14 % de los casos esta prueba establece el diagnóstico. INDICACIONES • Fiebre alta aunque en neonatos y ancianos la bacteriemia puede cursar con hipotermia y deterioro general, shock no explicado, infecciones localizadas, leucopenia, leucocitosis o trombopenia no relacionada con procesos hematológicos . • Siempre se deben realizar en un mínimo de dos (2) horas. • Nunca debe refrigerarse antes de su envío , puede conservarse en estufa. MATERIALES Cultivos en medios Ruíz -Castañeda METODOLOGÍA Se observarán los medios usados para hemocultivo. RESULTADOS Grafique lo observado en la práctica.

■ EXUDADOS VAGINALES (exocervicales) La mucosa vaginal tiene una flora microbiana normal , cuyo crecimiento y consideración son importantes para el estudio microbiológico de las infecciones vaginales. Se pueden considerar tres situaciones : • Conocer cuando se altera el equilibrio de esta flora colonizante • Búsqueda de agentes exógenos , trasmitidos normalmente por vía sexual • Detección de portadoras de determinados microorganismos La mayoría de las situaciones clínicas que pueden ser objeto de estudios microbiológicos para el aislamiento o visualización del agente etiológico son : • Vulvovaginitis : agentes etiológicos más frecuentes : Cándida spp , principalmente C. albicans; Trichomonas vaginalis y virus Herpes simple. La presencia de un cultivo puro de otros microorganismos observados en tinción de Gram con leucocitos , puede tener significación. • Vaginosis : desde el punto de vista microbiológico se caracteriza por la ausencia o disminución de la flora mixta compuesta por Gardnerella vaginalis, anaerobios (Mobilluncus, Bacteroides, cocos anaerobios) y Mycoplasma hominis. • Infección gonocócica : la endocervicitis gonocócica cursa con leucorrea , el exudado vaginal no es la muestra adecuada para el diagnóstico por lo que se recomienda la obtención de exudado endocervical. Tipos de estudios microbiológicos •Cultivo bacteriano •Cultivo de levaduras •Despistaje de Streptococcus agalactiae

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•Cultivo de virus Herpes simple ya que requiere de toma de muestra y medio de transporte y cultivos especiales, se realiza por petición expresa del clínico. Toma de muestra • No debe usarse antiséptico previo a la toma de la muestra . Si se utiliza espéculo, lubricar con agua caliente. • Se recomienda tomar dos (2) hisopados . • Se introduce un hisopo estéril en la vagina y se recoge la muestra de la zona de mayor exudado o en su defecto del fondo del saco vaginal posterior. Se introduce el hisopo en el medio de transporte. • El envío de la muestra al laboratorio debe de ser de inmediato siempre que sea posible. Cuando no se pueda procesar la muestra de inmediato, se mantendrá en refrigeración o a temperatura ambiente. • Si se sospecha de infección gonocócica, no refrigerar la muestra. • Tiempo máximo de procesamiento con medio de transporte : 24 horas. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Uno de los hisopos se empleará para el examen microscópico y el otro para el cultivo. Examen microscópico : es el único método aceptado para el diagnóstico microbiológico de la vaginosis bacteriana. Se hará una extensión del hisopo en lámina y tinción de Gram. Cultivo : se pueden establecer diferentes combinaciones de medios en función de la orientación diagnóstica : agar Sangre en atmósfera de CO2 , agar Chocolate en atmósfera de CO2, Mac Conkey, agar Thayer Martin en atmósfera de CO2, medio para Gardnerella en atmósfera de CO2 , Sabouraud con antibiótico u otro medio para Cándida, caldo para cultivo de Trichomona vaginalis. Examen de la muestra Examen microscópico : en el exudado vaginal normal se observará flora regional con predominio de morfotipo Lactobacillus sp y células epiteliales Presencia de leucocitos Presencia de levaduras o pseudohifas Presencia única o abundante , de cualquier otro microorganismo Exudado característico de vaginosis bacteriana Presencia de células clue : células epiteliales recubiertas por bacilos o cocobacilos Gram variables. Ausencia o escasos leucocitos. Flora mixta alterada. Examen en medios de cultivo El examen en medios de cultivo : examinar todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no hay crecimiento de patógenos , incubar hasta la 48 horas , a excepción del cultivo en agar Mac Conkey que se descarta a las 18 horas. El agar Thayer Martin se incubará hasta 72 horas si es negativo.

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•Agar Sangre : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial Streptococcus pyogenes o Streptococcus pneumoniae. •Agar Chocolate : presencia de microorganismos en cantidad variable , en especial Haemophilus sp. •Agar Mac Conkey : presencia de enterobacterias. •Agar Thayer Martin : presencia de colonias grises brillantes de distintos tamaños, oxidasa positivo, compatibles con gonococo. •Medio Gardnerella : presencia de colonias β hemolíticas puntiformes en gran cantidad posiblemente Gardnerella vaginalis. •Agar Sabouraud : presencia de levaduras. ■ SECRECIÓN URETRAL La uretritis es el síndrome más común dentro de las Enfermedades de Transmisión Sexual (ETS), aunque muestra un claro descenso en las últimas décadas en relación con otras ETS, tanto en España como en otros países desarrollados. Atendiendo a su etiología se clasifican en uretritis gonocócica y no gonocócica (UNG) , siendo estas últimas las más frecuentes en países desarrollados. N. gonorrhoeae es responsable en nuestro medio de menos del 25 % de todos los episodios de uretritis. Los restantes son causados por C. trachomatis, Ureaplasma urealyticum y por un número variable de otros potenciales patógenos en los que la asociación causa-efecto con la uretritis está menos aclarada . La asociación de más de un patógeno como causa de la uretritis es más que anecdótica y la más frecuente de ellas es la asociación de C. trachomatis y N. gonorrhoeae. Un dato significativo es la presencia de T. vaginales como único agente encontrado hasta en un 4 % de las uretritis no gonocócicas. Cuadros de uretritis pueden estar causados por la presencia de condilomas intrauretrales. La gonorrea usualmente se desarrolla a los 2 a 6 días tras la exposición, en tanto que la UNG es variable, desde 1 a 5 semanas. Tanto las uretritis gonocócicas como las no gonocócicas producen supuración uretral, disuria y escozor. El diagnóstico de uretritis se establece si al menos se dan de los siguientes supuestos ▪ Síntomas : historia de secreción uretral y/o disuria ▪ Demostración con tinción Gram : más de 5 leucocitos polimorfonucleares por campo de 1 000 aumentos en el examen directo de la secreción uretral. Los pacientes con síntomas de uretritis, sin secreción, visible, deben ser examinados, pidiéndoles que no miccionen en las 4 a 8 horas previas a la toma de muestra . Se obtienen los 5 a 10 primeros ml de orina y tras la centrifugación a 400 rpm se examinan al microscopio de 400 aumentos. La presencia de más de 15 leucocitos polimorfonucleares por campo confirma el diagnóstico de uretritis. Los síntomas de la uretritis gonocócica puede permanecer hasta más de 7 días, por ello la uretritis postgonocócica se suele diagnosticar después de transcurrido este período. En el examen con tinción de Gram, la presencia de diplococos Gram negativos (DGN) intracelulares , establece el diagnóstico de uretritis gonocócica. La presencia de células inflamatorias en el exudado uretral en ausencia de diplococos Gram negativos y cultivo negativo para establecer el diagnóstico de UNG.

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El éxito del diagnóstico microbiológico de la uretritis gonocócica depende de la correcta obtención, transporte y procesamiento de muestras. En cada muestra deben emplearse dos hisopos, uno para el cultivo y otro para la extensión del exudado uretral para realizar la tinción de Gram. Las muestra para cultivo deberán inocularse en medios selectivos (Thayer Martin modificado, Martin- Lewis ) e incubarse de modo inmediato a 35 a 37ºC durante 72 horas en una atmósfera de 3 a 10 % de CO2 y humedad. Cuando esto no sea posible , es necesario inocular las muestras en medio de transporte (Stuart o Amies ) . Examen microscópico : en la secreción uretral se debe observar presencia de células y bacterias, en especial diplococos Gram negativos intra y extracelulares. Evaluar : presencia de leucocitos polimorfonucleares. Examen en medios de cultivo : examinar, todos los medios a las 18 y 24 horas. Si no hay crecimiento de patógenos , incubar hasta la 48 horas. El agar Thayer Martin se incubará hasta 72 horas si es negativo. Agar Sangre : Streptococus pyogenes o Streptococus pneumoniae Agar Chocolate : Haemophilus sp, Thayer Martin ,gonococo. Pruebas bioquímicas : a las colonias sospechosas realizar las pruebas bioquímicas : Prueba de oxidasa y fermentación de carbohidrato para Neisseria.

EVALUACIÓN 1. Esquematizar un flujograma de urocultivo

2 .¿Cuáles son los agentes bacterianos más frecuentes, que se aislan en los cultivos de catéteres intravenosos? ……………………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………………………

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……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… 3. Esquematizar un flujograma de secreción de herida.

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… PRÁCTICA Nº 10 DIAGNÓSTICO MICOLÓGICO: HONGOS AMBIENTALES OBJETIVOS ▪ Conocer las técnicas para la toma de muestra en el diagnóstico micológico. ▪ Identificar los productos patológicos de donde se pueden aislar los agentes etiológicos de las micosis humanas. ▪ Conocer las características de los exámenes directos, como de los cultivos de hongos. INTRODUCCIÓN La mayoría de los hongos tienen un hábitat saprofítico, presentan una variedad de morfología, desde las levaduras hasta los hongos filamentosos. Los hay comestibles, de interés para la industria alimentaria, química farmacéutica y los venenosos. Del gran número de especies estudiadas hasta la fecha (más de 250 000) muy pocas son capaces de colonizar al ser humano inmunocompetente, produciendo en éstos casos las enfermedades denominadas micosis. Los hongos que producen micosis en el ser humano se encuentran en dos estados morfológicos básicos: levaduras y mohos.

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▪ Levadura Puede definirse como un hongo unicelular, redondo u ovalado que se reproduce por gemación o fisión binaria. Una levadura también puede ser el estadio morfológico en el ciclo biológico de una especie filamentosa se denomina a esto dimorfismo. ▪ Mohos Son hongos multicelulares cuya estructura filamentosa se forma por el crecimiento continuo a partir de una espora .El elemento tubular que emerge de denomina “hifa”, el que sigue creciendo y ramificándose llegando a formar un conjunto entrelazado al que se denomina “micelio” o “talo”. Parte de las hifas se introducen en el sustrato y forman el “micelio vegetativo” y las que se proyectan hacia el exterior constituyen el micelio aéreo, muchas levaduras en determinadas circunstancias y dependiendo de la especie , pueden producir “pseudohifas”. El micelio aéreo muestra macroscópicamente diferentes características, lo cual contribuye a la identificación primaria; puede ser algodonoso, velloso, arrugado, polvoriento, cerebriforme, pigmentado o no, etc. En él se producen los elementos de propagación, las esporas y los conidios. Los micelios tienen la capacidad de germinar un nuevo sustrato y así producir un nuevo elemento. Este conjunto de características observadas sobre el medio de cultivo se denomina “colonia”. Los hongos como células eucarióticas poseen núcleo, nucleolo, retículo endoplasmático, ribosomas, mitocondrias, vacuolas, cuerpos lipídicos y otras inclusiones. Rodeando el citoplasma existe una membrana y una pared celular con características muy definidas. Se multiplican a través de estructuras que pueden ser asexuales o sexuales previa fusión del protoplasma y núcleo de células distintas. También lo hacen mediante crecimiento vegetativo expansivo como ocurre de rutina en el laboratorio con levaduras o fragmentos de micelio. Como en otras enfermedades infecciosas , las micosis se diagnostican en el laboratorio siguiendo el esquema clásico : examen directo, cultivos e inmunodiagnóstico. ▪ Examen directo El examen microscópico de la muestra patológica, escamas de piel, pelos, fragmentos de uñas, exudado purulento, LCR o biopsias, permite observar las características hifas, esporas , levaduras ,etc. Se hace una preparación en la lámina portaobjetos con una gota de hidróxido de potasio al 10% (KOH al 10 %). Para la cápsula de Criptococcus neoformans (LCR), se adiciona una gota de tinta china para visualizar la cápsula. En los exudados purulentos se recomienda realizar una tinción de Gram, Giemsa, y también Wright. Si se trata de cortes histológicos hacer una preparación con hematoxilina y eosina. ▪ Cultivos El medio más utilizado en micología clínica es el descrito por Sabouraud. A este medio base se le añade una cantidad superior de glucosa (40 X 100), denominándose así agar glucosado de Sabouraud (SGA) , al cual posteriormente se le han adicionado antibióticos con el fin de evitar la contaminación bacteriana y cicloheximida (actidiona) , para inhibir los hongos saprofitos.

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La incubación en micología médica es siempre en aerobiosis, oscilando el tiempo desde 2 a 3 días para levaduras y especies saprofitas. La temperatura de incubación es 32º C ; los dermatofitos y otros causantes de micosis cutáneas a 25 a 30 grados centígrados (temperatura ambiental) El producto patológico y la técnica de toma de muestra se elegirá de acuerdo con el tipo de micosis por investigar. MATERIALES ▪ Tubos de prueba conteniendo agar glucosado de Sabouraud (SGA) ▪ Cultivos de especies ambientales : Penicillum , Alternaria , Aspergillus, Hormodendrum ▪ Frasco con KOH al 10 % ▪ Asa de siembra METODOLOGÍA Observar macroscópicamente y realizar preparaciones con Azul de lactofenol para su observación microscópica.

Penicillum

Aspergillus fumigatus

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Aspergillus niger

Rhizopus

RESULTADOS Observar al microscopio (10X y 40X) las muestras directas.

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EVALUACIÓN

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1. Elaborar un cuadro comparativo de características morfológicas , nutricionales y sensibilidad a antibióticos de hongos y bacterias.

2. Mencionar y explicar brevemente las técnicas de diagnóstico directas e indirectas para hongos. ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………………… PRÁCTICA Nº 11

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DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUPERFICIALES Y CUTÁNEAS OBJETIVOS ▪ Describir las características de las colonias de hongos causantes de las micosis superficiales y cutáneas en cultivos con agar glucosado de Sabouraud y microscópicamente. INTRODUCCIÓN La colonización e invasión en mayor o menor grado de una especie fúngica se denomina “micosis”. Dentro de las micosis superficiales se incluyen las causadas por hongos que colonizan la superficie queratinizada de la piel o pelo. Varios son los agentes etiológicos que pueden colonizar la piel. Las infecciones cutáneas incluyen una variedad de procesos en los que se encuentran afectados piel y anexos (pelo y uñas). La infección puede estar limitado a la capa córnea o llegar a los estratos más profundos , sin invasión linfática. Producidos por los hongos denominados dermatofitos y las enfermedades por ellos producidas dermatofitosis. La dermatomicosis incluye a cualquier proceso micótico de la piel y el de dermatofitosis se reserva para los producidos por hongos dermatofitos. MICOSIS SUPERFICALES ▪ Piedra Negra Se caracteriza por la presencia de nódulos en la porción extrafolicular del pelo, pétreos y de color negro. El agente causal es Piedra hortae ▪ Piedra blanca Muestra nódulos blanco-grisáceos , que son masas agrupadas de hifas y pueden encontrarse en la parte distal o central de pelo axilar , pubiano y crural. Agente causal : Trichosporum cutaneo o T. beigelii. ▪ Tiña negra Es una infección superficial de la piel debido a la colonización de Hortaea werneckii. Se caracteriza por la presencia de manchas negro-marronáceas, no descamativas e indoloras , frecuente en las palmas , dedos y plantas , que en otro lugar de la piel. ▪ Pitiriasis versicolor Caracteriza lesiones furfuráceas a veces papulomatosas o eritematosas, confluentes con pigmento variable (hipo o hiperpigmentadas). Tiene como agente causal a Malassezia furfur, se localiza preferente en el tronco sobre todo hombros y espalda . Al examen microscópico detectan los grupos de levaduras con hifas MICOSIS CUTÁNEAS Dermatomicosis Micosis producida por Cándida albicans, hongo oportunista. Agente causal de intertrigos (submamario o inguinal) , eczema de pañales, onicomicosis con paroniquia y granuloma candidiásico., Además de C. albicans también pueden presentar onicomicosis Cándida stellatoidea, C.tropicalis, C. guillermondi y C parapsilosis.

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Las preparaciones teñidas con Gram , muestran levaduras Gram positivas redondas u ovales , con brotes de blastosporas de 3 a 4 μm acompañadas de pseudohifas de 3 a 10 micras de longitud. La mayoría de los medios de cultivo bacterianos son satisfactorios para el aislamiento de Cándida; de todas las formas se recomienda efectuar la siembra en medio de Sabouraud con antibióticos (cloranfenicol).Los medios que contienen actidiona (cicloheximida) inhiben el crecimiento de algunas especies . La incubación se realiza a temperatura ambiente (25 a 30º C) cuando se trata de medios con inhibidores y a 37ºC en el caso de medios enriquecidos exentos de sustancias inhibidoras. Al cabo de 24 a 48 horas se puede observar las colonias características de color blanco o crema, opacas, elevadas, lisas, brillantes o mates de 1 a 3 mm de diámetro. La prueba de filamentación y producción de clamidosporas características , son muy sencillas y útiles para la identificación de C. albicans. Dermatofitosis Es una infección fúngica de los tejidos queratinizados (piel, pelo, uñas) que ocurre en los seres humanos y animales producida por un grupo de hongos estrechamente relacionados denominados “dermatofitos”. Los agentes etiológicos de las dermatofitosis se clasifican en tres géneros : Epidermophyton , Microsporum y Trichophyton. El diagnóstico se puede hacer mediante : ▪ Examen directo Para el estudio micológico se procede a tomar la muestra, que en este caso sería , pelos, escamas de la piel o muestras ungueales que se toman con pinzas o bisturí estéril del centro o borde de la lesión y se colocan en una lámina. Se transportan entre dos láminas portaobjetos limpias y se observan directamente al microscopio, con una gota de hidróxido de potasio al 10 % (KOH ) cubierto con una laminilla. Al microscopio se pueden observar las artroconidias dentro del pelo (endotrix) o en forma de vaina alrededor del pelo (ectotrix). ▪ Cultivo Las muestras se siembran en SGA adicionando cicloheximida, que inhiben los hongos saprofitos. La identificación se hace sobre la base del aspecto macroscópico de las colonias entre ellos la producción de pigmento. Luego las características microscópicas , observación de macroconidias y microconidias y elementos accesorios sirven para definir cada género y especie. Observar el desarrollo de los hongos en estudio y anotar las características de sus colonias desarrolladas en SGA. MATERIALES Tubos sellados de SGA con cultivos de : Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans Microsporum gypseum, Microsporum canis Preparaciones en láminas portaobjetos coloreadas con azul de lactofenol.

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Cándida albicans

Trichophyton mentagrophyt es

Trichophyto n rubrum

Trichophyto n tonsurans

Microsporu m gypseum

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METODOLOGÍA Examinar al microscopio las láminas preparadas y esquematizar sus observaciones.

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EVALUACIÓN 1. ¿Qué características morfológicas en los cultivos presentan los siguientes hongos? • Epidermophyton flocosum : • Trichoporum cutaneum :

2. ¿Cuáles son las manifestaciones clínicas de las micosis producidas por : • Malassezia furfur : • Piedra hortae :

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………………

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PRÁCTICA Nº 12 DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SUBCUTÁNEAS, SISTÉMICAS Y OPORTUNISTAS OBJETIVOS ▪ Identificar microscópicamente los agentes etiológicos de las micosis subcutáneas ▪ Describir las características morfológicas de las colonias de los hongos causantes de las micosis subcutáneas. INTRODUCCIÓN Se consideran en este grupo las infecciones fúngicas que afectan el tejido subcutáneo, dermis y epidermis, causadas por hongos exógenos, saprofitos , cuyo hábitat es el suelo y las plantas. Las infecciones más frecuentes son : ▪ La esporotricosis debida al Sporotrix schencki, que se produce habitualmente por la penetración en la piel de astillas, espinas o tierra contaminada; una vez establecida la infección tiende a permanecer localizada en el tejido subcutáneo y a ser muy persistente. Se caracteriza por una lesión ulcerada en el punto de inoculación , que va seguida de la formación de nódulos y abscesos múltiples que siguen las vías de drenaje de los linfáticos superficiales. ▪ La cromomicosis (cromoblastomicosis), debido a Fonsecaea pedrosoi, Cladosporium carrionii y Phialophora verrucosum, que se caracteriza por el desarrollo de una pápula en el sitio de la inoculación, que más tarde se extiende formando lesiones verrugosas o tumorales , semejantes a una coliflor, puede haber infección secundaria y ulceración . Las lesiones , por lo general, están limitadas a los pies y las piernas, pero pueden afectar la cabeza, la cara, el cuello y otras superficies del cuerpo; también puede haber abscesos cerebrales. ▪ El micetoma (maduromicosis), debido a Nocardia y Streptomyces, que se caracteriza por lesiones destructivas localizadas, granulomatosas y supuradas, que habitualmente se localizan en los pies y las manos. Las lesiones se caracterizan por edema, coloración purpúrea y deformación tumoral del tejido subcutáneo, con la presencia de surcos sinusales que drenan pus, que contiene gránulos amarillentos o negros. La infección progresa gradualmente, atacando los huesos , los músculos y otros tejidos adyacentes, hasta que por último obliga a la amputación, a veces se produce la invasión más extensa afectando el cerebro y otros órganos internos . MATERIALES ▪ Tubos sellados de SGA con cultivos de: Sporotrix schenki Phialophora verrucosum ▪ Preparaciones en láminas coloreadas con azul de lactofenol. ▪ Microscopio

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METODOLOGÍA Examinar al microscopio las láminas preparadas y esquematizar sus observaciones.

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DIAGNÓSTICO DE LAS MICOSIS SISTÉMICAS Y OPORTUNISTAS OBJETIVOS ▪ Identificar microscópicamente los agentes etiológicos de las micosis subcutáneas ▪ Describir las características morfológicas de las colonias de los hongos causantes de las micosis subcutáneas INTRODUCCIÓN Las micosis sistémicas, son infecciones fúngicas que afectan varios órganos y tejidos. Se dividen en dos grupos : ▪ las producidas por especies consideradas patógenas con carácter endémico, este tipo de micosis se transmite por inhalación, ingesta o traumatismos . Blastomicosis y Paracoccidioidomicosis ▪ las producidas por especies oportunistas . Estas patologías se dan en huéspedes inmunodeprimidos (con transtornos endocrinos, inmunodefiencias, enfermedades oncohematológicas, alteraciones metabólicas y anatómicas , drogadictos endovenosos, pacientes bajo tratamiento prolongado con corticoides o citostáticos , sometidos a cirugía, dializados , quemados transplantados y cateterizados) , son causadas por hongos saprofitos del ambiente o comensales del cuerpo humano. Por ejemplo Cándida y Criptococcus La infección se adquiere por inhalación de conidios en la fase micelial , desarrollándose en el huésped un foco pulmonar primario. En caso del que paciente presente inmunodeficiencia puede producirse una diseminación sistémica. El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante la observación de la fase levaduriforme en los siguientes productos : expectoración, secreción de lesiones mucocutáneas y material de biopsia. La fase levaduriforme se puede obtener en cultivos enriquecidos, incubados a 37ºC. Estas pueden ser: ▪ Blastomicosis : Blastomyces dermatitis La infección comienza habitualmente en los pulmones y se difunde por vía hematógena causando lesiones destructivas focales en los huesos, piel, próstata y vísceras, en general no se afecta el tubo digestivo. Las lesiones cutáneas son particularmente manifiestas , parecen originarse como metástasis a partir de las lesiones pulmonares primarias que se abren a la superficie cutánea causando lesiones ulceradas y encostradas. Las lesiones se caracterizan por

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inflamación granulomatosa, microabcesos y progresiva destrucción de los tejidos, las calcificaciones son raras. ▪ Paracoccidioidomicosis o blastomicosis sudamericana (Paracoccidioides brasilensis) Las primeras lesiones aparecen en las mucosa de la boca, o de la nariz y se difunden por expansión directa, es decir a través de los límites cutáneo-mucosos, afectan la cara, en ocasiones , la diseminación se produce a través de los tejidos linfáticos incluyendo el bazo. En el tubo digestivo las lesiones comienza en el tejido linfoide submucoso y puede originar formación de úlceras e incluso perforaciones; pueden formarse abscesos subcutáneos que por extensión a la superficie cutánea , puede producir lesiones deformantes de gran tamaño, encrostadas o ulceradas. Las lesiones cutáneas constituyen abscesos piógenos y lesiones inflamatorias granulomatosas. ▪ Histoplasmosis : Histoplasma capsulatum Causada por la inhalación de esporas que lo conduce a una infección pulmonar, aparecen lesiones miliares distribuidas por todo el parénquima pulmonar y aumento de tamaño de los ganglios linfáticos. La infección inicial es benigna puede pasar completamente inadvertida o manifestarse como un infección respiratoria autolimitada. En un pequeño número de individuos la enfermedad progresa se disemina y causa lesiones en prácticamente todos los tejidos y órganos, aparece fiebre y postración, así como el aumento del tamaño de hígado , bazo y ganglios linfáticos simulando tuberculosis miliar ; en ocasiones puede evolucionar como una enfermedad pulmonar crónica con cavitación, simulando la tuberculosis pulmonar crónica. Las lesiones de los tejidos se caracterizan por la existencia de una inflamación granulomatosa. ▪ Coccidiomicosis : Coccidioides immitis La infección se establece por inhalación de esporas transmitidas por el aire aproximadamente el 60 % se pone de manifiesto únicamente por la adquisición de una hipersensibilidad de tipo retardado frente a los antígenos del hongo, en un 40 % se produce neumonitis aguda, acompañada con frecuencia de pleuresía y varias erupciones cutáneas, alrededor del 5 % desarrollan una enfermedad pulmonar crónica con cavitación que se asemeja a la tuberculosis pulmonar y conduce ocasionalmente a la calcificación; en menos del 1 % aparece una diseminación con lesiones granulomatosas asépticas en muchos órganos y tejidos, entre ellos, la piel, huesos articulaciones y meninges. Las lesiones de la neumonitis aguda son histológicamente semejantes a las causadas por bacterias piógenas , pero en la enfermedad pulmonar crónica y en las

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formas diseminadas , la inflamación es granulomatosa. ▪ Criptococosis Esto ocurre en particular en sujetos con inmunodeficiencia de las células T y se debe a Criptococus neoformans , este hongo se caracteriza por ser una levadura encapsulada. Su hábitat es el suelo contaminado con materia fecal de aves. La criptococosis es una de las enfermedades que sirve para definir el estadio SIDA en la enfermedad del virus de Inmunodeficiencia Humana. Dentro de las formas clínicas existe : Criptococosis pulmonar, del SNC, diseminada , cutánea y mucocutánea. El producto más frecuente de analizar es el LCR , en el que se observan las típicas levaduras capsuladas que se destacan por contraste negativo mediante emulsión con tinta china. ▪ Candidiasis : Cándida spp Las infecciones caudadas por Cándida son muy variadas, este hongo de tipo levaduriforme puede llegar a ser patógeno en humanos y animales en los cuales vive en estado saprofítico . La cavidad bucal y es resto del tracto gastrointestinal son los territorios preferentes donde C. albicans se encuentra en el 20 % de las personas y en menor proporción otras especies de Cándida. Por lo menos cinco condiciones favorecen el surgimiento de candidiasis : ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Cambios fisiológicos como diabetes y embarazo Uso prolongado de antibióticos o fármacos antitumorales e inmunosupresores Maniobras diagnósticas y terapéuticas agresivas : cateterismo, sondajes Debilidad general y/o desnutrición Infección por el virus de la Inmunodeficiencia Humana y drogodependencia.

El diagnóstico de la Candidiasis en el laboratorio incluye la demostración directa de Cándida mediante coloraciones Giemsa ,Gram en muestras clínicas y cultivo MATERIALES ▪ Tubos de SGA con cultivos de : ▪ Histoplasma capsulatum ▪ Cándida albicans ▪ Preparaciones en láminas con azul de lactofenol ▪ Microscopio METODOLOGÍA Observar de las muestras macroscópicamente Realizar preparaciones en láminas con azul de lactofenol y observar al microscopio (10x y 40x)

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PRÁCTICA Nº 13 DIAGNÓSTICO VIROLÓGICO OBJETIVOS ▪ Familiarizar al estudiante con las diferentes técnicas de aislamiento de virus aprovechando las propiedades que presentan ▪ Observar y caracteriza morfológicamente células cultivadas ▪ Explicar la importancia de las técnicas de cultivo de tejidos en virología y en otras disciplinas científicas. La demanda de los servicios de los laboratorios de virología clínica, han aumentado en las últimas dos décadas debido a la disponibilidad comercial de reactivos de alta calidad, el uso por parte de los médicos de fármacos antivirales específicos, el desarrollo de técnicas de diagnóstico rápido y la aplicación de los procedimientos de cultivo celular para virología al diagnóstico de otras enfermedades como infección genital por Chlamydia. Las enfermedades virales que requieren diagnóstico de laboratorio son las enfermedades de transmisión sexual, las diarreas, las enfermedades respiratorias en niños y adultos, las meningitis asépticas, las enfermedades congénitas y las infecciones en huéspedes inmunodeprimidos. CULTIVO CELULAR Los cultivos celulares comenzaron a principio del siglo XX, con cultivos de órganos completos y luego con métodos de células individualizadas : cultivos de células primarias (células somáticas de un animal de experimentación o tomadas de un paciente humano (que pueden mantenerse en cultivo durante un período breve de tiempo) o líneas celulares inmortalizadas, las cuales en condiciones adecuadas pueden continuar creciendo en cultivo indefinidamente. En 1952 Renato Dulbecco fue el primero que cuantificó virus animales, utilizando un ensayo de placas de lisis, técnica para la cual se preparan diluciones del virus con las que se infectan células crecidas en monocapas, que luego se recubren con agar blando para impedir la difusión del virus. Éste destruye las células en focos localizados que se observan al teñirse la monocapa. MECANISMOS DE LESIÓN CELULAR La infección viral origina una variedad de cambios que se detectan mediante el examen visual o bioquímico de las células infectadas, estos cambios se deben a la producción de proteínas y ácidos nucleicos víricos, y a las alteraciones biosintéticas de las células. En las células infectadas por virus se reconocen cambios fenotípicos comunes, denominados efectos citopáticos del virus , los cuales son : ● Forma alterada : las células adherentes que normalmente están pegadas a otras células ( in vivo ) o a un sustrato artificial ( in vitro ) pueden adoptar una morfología redondeada diferente de su apariencia aplanada normal . Se eliminan de la células los procesos de ampliación implicados en la adhesión y la movilidad. ● Despegamiento del sustrato : para las células adherentes , esta fase de daño celular sigue de la anterior. Ambos efectos son causados por la degradación parcial

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o la disrupción del citoesqueleto, el cual se encarga de mantener la forma de la célula. ●Lisis : es el caso más extremo, la célula entera se rompe, se pierde la integridad de la membrana y la célula se puede hinchar por la absorción de líquidos extracelulares y finalmente estalla. Éste es un caso extremo de daño celular, no todos los virus causan este efecto, aunque pueden causar otros efectos citopáticos. La lisis es beneficiosa para un virus ya que constituye un método para liberar nuevas partículas víricas de una célula infectada. ●Fusión de membranas : las membranas de las células adyacentes se fusionan originando una masa de citoplasma que contiene más de un núcleo : sincitio, o dependiendo del número de células que se fusionan : célula gigante. Las células fusionadas tienen vida corta y luego se lisan. ●Permeabilidad de membranas : diversos virus causan un aumento en la permeabilidad de membranas, permitiendo la entrada de iones extracelulares como el sodio. La traducción de algunos ARNm víricos es resístente a altas concentraciones de iones de sodio , permitiendo la expresión de genes víricos a expensas de mensajeros celulares. ●Cuerpos de inclusión : son áreas de la células en las que se han acumulado componentes víricos. Se trata frecuentemente de sitios de ensamblaje de viriones y algunas inclusiones celulares consisten en acúmulos cristalinos de partículas víricas. No está claro si estas estructuras dañan a la célula, pero frecuentemente están asociadas a virus que causan lisis celular , como los herpesvirus. ●Apoptosis : la infección vírica puede activar la apoptosis ( muerte célular programada ), mecanismo implicado en el crecimiento normal y el desarrollo de los organismos. INMUNODIAGNÓSTICO ■ ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO La prueba de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) o inmunoensayos ligados a enzimas (EIAs) en la cual el antígeno o anticuerpo está adsorbido a una fase sólida , constituye uno de los primeros inmunoensayos enzimáticos primeramente descritos por Engvall y Perlmann en 1971 y luego aplicados al diagnóstico microbiológico por Voller y colaboradores. ELISA tiene la ventaja sobre las técnicas de inmunofluorescencia (IF) de su mayor sensibilidad ya que , la enzima actúa catalíticamente y de forma objetivable , por lo que es posible medir la densidad óptica de la coloración final. Las enzimas son seguras, de bajo costo y estables, si se comparan con los radio-isótopos utilizados en radioinmunoensayo (RIA). En la actualidad estas pruebas están tomando un rol importante en los laboratorios médicos y de investigación, porque brindan una alternativa viable, mediante la cual es posible realizar la identificación de muchos virus a nivel de género. Están reemplazando a los RIA en muchos laboratorios, por su comparable sensibilidad sin los problemas de manejo, eliminación y corto tiempo de vida de los materiales radioactivos . Debido a su objetividad, facilidad de automatización y posibilidad de trabajar con un gran número de muestras, estos ensayos inmunoenzimáticos están

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reemplazando parcialmente a técnicas en el laboratorio como : inmunofluorescencia y aglutinación. Estos ensayos presentan tres piezas constantes que originan distintos tipos de EIA en función de cómo se combinen : el analito (antígeno {Ag} o anticuerpo {Ac} ), el conjugado (de antígeno o de anticuerpo) y el sustrato. Utilizan enzimas como marcadores inmunoquímicos que permiten valorar las uniones antígeno-anticuerpo que se producen tras un periodo de incubación, con la adición posterior de un sustrato. ● Fundamento La prueba de ELISA se basa en la reacción antígeno-anticuerpo, uno de los cuales debe ser de reactividad conocida. El color se genera por la interacción de un sustrato cromogénico y una enzima que ha sido acoplada al anticuerpo detector. Si debe medirse el anticuerpo, se coloca el antígeno en la fase sólida, como una capa de captura. Después de la reacción del antígeno con el suero del paciente, la capa de detección puede ser un reactivo antiinmunoglobulina clase específica (IgM o IgG) para detectar respuesta de anticuerpos clase específicos Dentro de los parámetros fisicoquímicos que intervienen en la unión del antígeno con el anticuerpo tenemos: ▪ Fuerzas de Van der Walls producidas por el movimiento de átomos en la superficie de las moléculas generado por un cambio eléctrico. Son fuerzas débiles presentes cuando la proximidad del Ag y el Ac es grande. ▪ Fuerzas electrostáticas originadas por la fuerza de atracción entre moléculas de carga iónica opuesta, como sucede con los grupos NH3+ (amoníaco)que reaccionan ávidamente con el grupo COOH- (grupo carboxilo). ▪ Uniones por puentes de hidrógeno son de carga energética baja entre átomos electropositivos de hidrógeno y átomos electronegativos de oxígeno o nitrógeno. ● Metodología Los métodos de ELISA se dividen en : ■ ELISA directo : ensayo ELISA simple de dos capas Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados e indican la presencia de antígeno en la solución analizada. Se debe incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno buscado y controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido). ■ ELISA indirecto Las placas ELISA se preparan de igual forma que en el método directo, los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos : uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpo secundarios por cada primario. ■ ELISA sándwich : ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la

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muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo. Fijación del Antígeno a la fase sólida : La reacción inmunológica tiene lugar en la fase sólida, ésta puede ser de plástico, vidrio o nitrocelulosa. Los más usados son los de plástico, dentro de éstos los de poliestireno gammairradiados y los de cloruro de polivinilo ya que tienen mayor capacidad para formar enlaces estables que los de poliestireno no tratados. El antígeno diluido en buffer es adherido a la fase sólida por enlaces electrostáticos entre los sitios activos del plástico y regiones de la proteína responsables de esta interacción. El buffer puede ser carbonato a pH 9,6 o buffer fosfato salino ( PBS 1X ) a pH 7,4. La estabilidad de los enlaces electrostáticos, el tiempo de incubación y la temperatura son factores importantes a tener en cuenta para evitar pérdidas de las proteínas y que pueden afectar la sensibilidad del ensayo. ▪ Reacción con anticuerpo : La reacción del antígeno con el anticuerpo se debe realizar en condiciones similares a las fisiológicas : pH 7,4, temperatura de 37ºC y concentración salina equivalente a 0.15M de cloruro de sodio (NaCl). El tiempo puede variar entre 1 a 3 horas. Moléculas no específicas en solución pueden adherirse a la fase sólida afectando el resultado final del ensayo, para disminuir este riesgo se suele agregar al medio de reacción un exceso (0,1% a 1%) de una proteína inerte para que compita eficientemente por los sitios de unión inespecíficos en la fase sólida. Esta proteína puede ser seroalbúmina bovina, caseína, suero entero, gelatina u otros. También es necesario añadir al medio Tween 20 (Monolaurato de polioxietileno sorbitán { surfactante } )para evitar uniones inespecíficas de macromolécula. Por este motivo es agregado en los tampones de dilución y de lavado. ▪ Adición del conjugado enzimático : El conjugado enzimático se prepara por unión covalente de una enzima con el anticuerpo; esta enzima puede ser peroxidasa de rábano (Horseradish peroxidase { HRP } ), fosfatasa alcalina (Alcaline Phosphatase { AP } ) o beta-galactosidasa. Los criterios a tomar en cuenta en la selección de la enzima apropiada son su toxicidad, estabilidad, disponibilidad, viabilidad de conjugarla eficazmente con el anticuerpo elegido, sensibilidad y costo. Las condiciones de reacción entre el conjugado y el complejo formado por la unión antígeno-anticuerpo son similares a las descritas en la etapa anterior. ▪ Adición del sustrato:

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La elección del sustrato va de acuerdo con el tipo de enzima presente en el conjugado. El sistema AP hidroliza al p-nitrofenil fosfato o p-nitrofenol generando un producto soluble de color amarillo. El sistema HRP reduce al sustrato peróxido de hidrógeno produciendo oxígeno que oxida a otros compuestos cromógenos tales como: ♦ Tetrametilbenzidina (TMB) : la oxidación genera un producto de color azul oscuro. ♦ o-phenylene diamine (OPD): es oxidado a un producto coloreado que puede variar de color naranja a pardo oscuro. ♦ Ácido azino-(3-etil)-benzo-sulfónico (ABTS) : la oxidación genera un producto que puede variar del color al azul. La intensidad del color desarrollado es de acuerdo con la cantidad de enzima presente en la reacción. La lectura se realiza en un espectrofotómetro a 405 nanómetros PRUEBA RÁPIDA PARA VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANA Uno de los pilares básicos de la lucha contra el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) es la detección precoz de las personas infectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). El diagnóstico precoz ofrece la posibilidad de beneficiarse de la terapia antirretroviral en las etapas precoces de la infección, así como intentar modificar las conductas que favorecen la transmisión del virus a otras personas. ♦ Descripción de las pruebas de detección rápida del VIH Son ensayos de lectura visual que pueden realizarse con equipamiento mínimo y generan un resultado en menos de 15 minutos en comparación con la prueba estándar de cribado con técnicas de EIA, de las cuales no se dispone del resultado hasta al cabo de unas horas o días. Tanto la prueba de detección rápida como el EIA detectan anticuerpos específicos del VIH. Se han establecido los diferentes criterios que debería cumplir una prueba de detección rápida del VIH: ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ ▪ Presentar alta sensibilidad y especificidad (>99%) Ser reproducible Ser fácil de aprender, realizar e interpretar Ser precisa Ser de fácil almacenamiento No requerir equipamiento adicional No tener carácter invasivo

Durante la realización de las pruebas de detección rápida, se recomienda que los pacientes reciban información y asesoramiento sobre la enfermedad y la infección. Si la prueba es negativa, se considera un negativo definitivo a no ser que haya posibilidades de que se encuentre en el período ventana de exposición (primeros 3 a 6 meses de post exposición) . Si el resultado es positivo, se considera un resultado preliminar que debe confirmarse con técnicas de EIA y con la prueba Western blot . Los resultados indeterminados se deberían repetir en un mes. La mayoría de las pruebas de detección rápida del VIH se comercializan con un equipo o kit que

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incluye todo lo necesario para realizar la prueba y no requiere un equipamiento especializado. En general, disponen de un control de procedimiento incorporado en el equipo o kit. Para la muestra, se puede utilizar sangre entera (más fácil de realizar), plasma o suero, y los resultados se interpretan visualmente. ♦ Capacidad diagnóstica de las pruebas de detección rápida del VIH Es difícil realizar una comparación de la capacidad diagnóstica de las numerosas pruebas de detección rápida comercializadas ya que son, muy distintas entre ellas. Los principios de acción más frecuentes en estas pruebas son la aglutinación, la inmunoconcentración (flow through), la inmunocromatografía (lateral flow) y la fase sólida (solid phase). El método de producción y de combinación específica de los antígenos varía entre las distintas pruebas de detección. La mayoría incluye uno o más antígenos del virus VIH-1 (gp41, gp120, gp160) y VIH-2 (gp36). Otros incorporan el antígeno core (p24). Actualmente, existe controversia en la duración del período ventana entre 3 ó 6 meses. En general, se recomienda el alta médica a los 6 meses después de una actividad de riesgo de infección. ■ PRUEBA DE INMUNOFIJACIÓN DE DOT-BLOT Prueba para la detección del VIH en la cual los antígenos virales se encuentran unidos a una membrana de nitrocelulosa dentro de un contenedor plástico. Los antígenos utilizados son recombinantes o sintéticos. Se utilizan conjugados de antiinmunoglobulina ligados a una enzima que se fija al anticuerpo del paciente. La adición del sustrato permite la visualización del color en el papel. Su ventaja y principal indicación es la posibilidad de identificación entre los dos tipos de virus . Las pruebas son rápidas y fáciles de realizar, pero son costosas. Muchas producen resultados en 5 ó 15 minutos. TÉCNICAS DE INOCULACIÓN EN ANIMALES DE LABORATORIO Este fue el primer método que se utilizó para el aislamiento de virus , demostrándose la reacción positiva por la muerte y los cambios histológicos o clínicos. Existen factores negativos en el uso de animales de laboratorio : el confinamiento de los mismos de tal manera que no se pueda impedir una infección cruzada a otros animales y al personal de laboratorio, la presencia de enfermedades víricas latentes en los animales de experimentación que pueden activarse por el mismo trauma que supone la inoculación con la consiguiente interferencia a la hora de la interpretación de los resultados . Debe elegirse cuidadosamente el tipo y la edad del animal que va a utilizarse , así como la vía de inoculación, ya que cada especie tiene su propia sensibilidad y cada virus sus propios requerimientos respecto a un tipo de células . El animal más utilizado es el ratón de menos de dos días de edad especialmente como animal de rutina con fines diagnóstico siendo el que proporciona el principal método de aislamiento de los virus Coxsakie A. ► el ratón lactante se utiliza en virología para : ♦ Inocular por vía intracerebral (0,06 ml) : Herpes simple ♦ Inocular por vía subcutánea (0,06 ml) : infección por Coxsakie, Arbovirus y Reovirus ♦ Inocular por vía intradérmica (0,02ml) virus Coxsakie ► el ratón adulto se utiliza : ♦ Inocular por vía intracerebral (0,03ml) o intraperitoneal hasta 2 ml de encefalitis ♦ Inocular por vía intracerebral : rabia, coriomeningitis linfocitaria

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♦ Inocular por vía intranasal ( 0,05 ml): Influenza A,B y C ♦ Inocular por vía intraperitoneal o intracerebral para obtención de inmunosueros. ► la cobaya se utiliza para : ♦ Inocular por vía intraperitoneal hasta 5 ml de coriomeningitis linfocitaria ♦ Inocular por vía intraperitoneal o intramuscular para obtención de inmunosueros hasta un ml. ► el conejo se utiliza para : ♦ Inocular por vía intradérmica Herpes tipo B ♦ Inocular por vía intradérmica para la obtención de vacunas ♦ Inocular por vía intravenosa hasta 2 ml o intramuscular hasta 2 ml o intraperitoneal hasta 2 ml para la obtención de inmunosueros. Materiales : jeringa con aguja de 1 ml, embudo de cristal, tubos de ensayo, algodón. Reactivos : alcohol etílico de 70º, éter etílico, solución de inoculación Técnica : a) Anestesiar al ratón con un algodón empapado de éter etílico colocado en el interior de un embudo invertido , introducir en él el ratón. b) rasurar la zona a inyectar e inyectar la solución de inoculación en el lugar de inoculación que puede ser : IC intracraneal, IM intramuscular, IN intranasal, SC subcutánea, ID intradérmica, IV intravenosa, IP intraperitoneal. Interpretación de los resultados : Se manifiesta la infección en el ratón ,se observará ésta por la sintomatología , la muerte o la elevación del título de anticuerpos. Se observará durante dos o más semanas el animal inoculado

TÉCNICAS DE INOCULACIÓN EN EMBRIÓN DE POLLO Existen varios métodos de inoculación de huevos fértiles , dependiendo del virus que desea cultivarse. Una vez inoculados, los huevos se incuban a temperaturas entre 35 y 38ºC ( dependiendo del virus). Antes de proceder a la inoculación de un huevo debe limpiarse cuidadosamente su superficie con alcohol. ● Inoculación corio-alantoidea

Tomado de Microbiología Granados 1aedición

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♦ Edad del embrión : 10 a 12 días ♦ Método : Examinar el huevo en ovoscopio provisto de lámpara de 100 vatios . Ésta técnica llamada de iluminación permite apreciar los vasos sanguíneos del embrión , la cámara de aire con claridad a través de la cáscara. Con un lápiz se delimitar la cámara de aire así como también el punto en que el corio-alantoides es bien notorio y desarrollado. Practicar una cámara de aire artificial de la siguiente manera: a) Quitar un pequeño triángulo de cáscara de encima del corio-alantoides sin dañar la fárfara b) Utilizando una aguja de disección incidir cuidadosamente la fárfara sin dañar la membrana corio-alantoidea que está debajo. c) Realizar una pequeña abertura en la cámara de aire y valiéndose de un gotero realizar una succión suave en el agujero hecho anteriormente. La membrana corioalantoidea se separa de la fárfara efectuándose entonces la inoculación a través de la hendidura de la misma. Sellar la abertura e incubar durante 2 a 4 días examinando diariamente ● Inoculación en saco amniótico ♦ Edad del embrión: 7 a 14 días ♦ Método Proceder como para la inoculación corio-alantoidea. Cuando la membrana corioalantoidea aparezca se aumenta el tamaño del orificio . A través de la membrana corio-alantoidea y utilizando unas pinzas estériles se extrae una parte de la membrana amniótica. Inocular en la cavidad amniótica, sellar e incubar. ● Inoculación de saco alantoideo ♦ Edad del embrión : 10 días ♦ Método Se procede como en la inoculación corio-alantoidea pero sin extraer la membrana. Inocular directamente en la cavidad alantoidea . Con el agujero realizado en la cámara de aire se evita el reflujo del inóculo motivado por la presión. Sellar e incubar. ● Inoculación en saco vitelino ♦ Edad del embrión: 3 a 8 días ♦ Método Se efectuará la inoculación directa a través de la cámara de aire, puesto que a la edad señalada el saco vitelino rellena casi por completo el huevo. Sellar e incubar. ♦ Examen Colocar el huevo en una placa de Petri, sobre algodón empapado en desinfectante. Utilizando tijeras y pinzas estériles eliminar la cáscara de encima de la cámara de aire. Extraer la membrana interna (fárfara) y colocarla en agua destilada estéril. Examinarla para apreciar lesiones. La identificación de virus aislados en huevos puede hacerse por técnicas de neutralización o de fijación del complemento con sueros específicos. Es posible neutralizar tanto el efecto particular producido por el virus como la formación de placas o muerte del embrión, como en el caso de los myxovirus, neutralizar o inhibir la propiedad de estos virus de aglutinar los hematíes. Las pruebas de fijación de complemento tienden a dar reacciones de grupo más que específicas de tipo.

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Tomado de Manual de Técnicas de Microbiología Médica Baker

PRÁCTICA Nº 14 REVISIÓN OBJETIVO ▪ Fortalecer el conocimiento de los procedimientos desarrollados a lo largo de las prácticas de laboratorio de microbiología.

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Fuentes de Información ■ Arenas R. Micología Médica Ilustrada.2ª edición.2005. Editorial Mc Graw Hill ■ Bailey & Scott. Diagnóstico Microbiológico .11ª edición 2004.Editorial Médica Panamericana. ■ Granados R. Microbiología Tomo II.2ª edición.2003.Editorial Thomson Paraninfo ■ Jawetz, Melnick y Adelberg. Microbiología Médica 18ª edición 2005 Editorial Manual Moderno ■ Koneman Diagnóstico Microbiológico 6ª edición .2008.Editorial Médica Panamericana ■ Murray P. Microbiología Médica.5ª edición 2008.Editorial Elsevier ■ Sherris Microbiología Médica. 4ª edición.2005.Editorial Mc Graw Hill ■ Baker F.J, Breach M.R. Manual de Técnicas de Microbiología Médica.1990.Editorial Acribia ■ Cann A Principios de Virología Molecular. 4ª edición.2005. Editorial Acribia ■ Organización Panamericana de la Salud. Oficina Sanitaria Panamericana Regional de la Organización Mundial de la Salud. Garantía de calidad en el diagnóstico serológico de la Infección por el virus de la inmunodeficiencia humana . Publicación Nº 42 ■ Ministerio de Sanidad y Política Social. Cataluña .España. Prueba de detección rápida de la infección por VIH. AATRM Núm. 2007/3 ■ Cristhopher Donat’s Cruz Malpica. Estandarización de la prueba de Ensayo Inmunoenzimático para la detección de anticuerpos IgG en sueros humanos para el virus Phlebotomus fever. Tesis para optar el título de químico farmacéutico. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Facultad de farmacia y Bioquímica 2001 http://sisbib.unmsm.edu.pe/Bibvirtual/tesis/Salud/Cruz_M_C/generalidades.htm ■ Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Procedimientos en Microbiología Clínica. www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap6.htm ■ Moura AC Diversidade genética, densidade populacional e potencial de promoҫão de crescimento de rizobactérias associadas ao cacaueiro [Tesis Maestría].Bahia :

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Universidade Federal do Rencôcavo ; 2007. ■ Chaves L Aspectos bioquímicos e moleculares de bacterias isoladas de terra preta antropogênica (TPA) na região da Amazônia Brasileira.[Tesis Maestría] Piracicaba : Universidade de Sâo Paulo; 2007

GLOSARIO DE MICROBIOLOGÍA Ácido-alcohol resistencia: Propiedad de las especies del género Mycobacterium, por la que las células teñidas con carbolfucsina caliente no se decoloran al tratarlas con alcohol ácido. Ácido desoxirribonucleico (ADN): Gran molécula de ácido mucleico que se encuentra principalmente en losc cromosomas de los núcleos celulares y que es portadora de la información genética de las células vivas. Ácido nucleico: Polímero de nucleótidos. Véase ácido desoxirribonucleico y ácido ribonucleico. Ácido ribonucleico (RNA): Polímero de nucleótidos unidos por un esqueleto de fosfato-ribosa. Interviene en la síntesis de proteínas. Acidófilo: Organismo que crece de manera óptima en un medio ácido. Característica de la célula u organismo celular que tiene afinidad por los colorantes ácidos. Adherencia: Propiedad de las bacterias que les permite adherirse (pegarse) a las superficies de la célula hospedadora. Ácido desoxirribonucleico (ADN): Gran molécula de ácido nucleico que se encuentra principalmente en los cromosomas de los núcleos celulares y que es portadora de la información genética de las células vivas. 3´: Marca el final de una cadena de una molécula de ADN. El término 3´ se refiere a la posición de la base relativa a la molécula de azúcar en la armazón del ADN. 5´: Marca el principio de una cadena de una molécula de ADN. El término 5´ se refiere a la posición de la base relativa a

la molécula de azúcar en la armazón del ADN. cADN : biblioteca de secuencias de ADN ADN mitocondrial: Contiene 16,569 bp de ADN, además de 37 genes que codifican algunas proteínas y moléculas de ARN relacionadas con la función mitocondrial. Este material se hereda por vía materna. Cuando se forma el cigoto, el espermatozoide aporta su genoma, pero no su genoma mitocondrial. El ADN mitocondrial lo aporta el ovocito Aerobio: Microorganismo que vive y crece en presencia de oxígeno libre. Aerobio estricto: Microorganismo que no puede crecer en ausencia de oxígeno. Aerobio facultativo: Microorganismo capaz de crecer en condiciones anaerobias pero que se desarrolla mas rápidamente en un media aerobio. Agente antimicrobiano: Producto que mata o inhibe el desarrollo de microorganismos. Agudo: En relación a una enfermedad o síntoma que comienza bruscamente con una intensidad marcada para desaparecer después de un período relativamente corto de tiempo. Amiloide. Que se vuelve azul con el yodo Análogo: Sustancia química idéntica a otra, excepto en un grupo funcional. Anticuerpos: Proteínas globulares que aglutinan al antígeno. Poseen 2 sitios iguales para la fijación del antígeno. Se compone de 2 cadenas iguales livianas L de 220 aminoácidos, (Low -molecular weight- = bajo peso molecular) y 2 cadenas pesadas H de 440 aminoácidos, (High molecular weight = Alto peso molecular).

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Anaerobio: Microorganismo capaz de vivir y crecer en condiciones anaerobias. Anaeróbico: Entorno carente de oxígeno. Generalmente se refiere a un hábitat microbiano. Anafilaxia (choque anafiláctico): Reacción alérgica violenta causada por una reacción entre un antígeno y un anticuerpo. Antibiótico: Agente químico producido por un organismo que es dañino para otros organismos. Antígeno: Sustancia que interacciona con un receptor de las células T o con una inmunoglobulina. Ápice o apical. Extremo superior o punta de una cosa.. Argenta. Plateada. Asca : Célula madre de los hongos Ascomycetes : Donde se encuentran las esporas. Asexual : Reproducción que no requiere la unión de los núcleos. Atenuación : Selección de cepas de un microorganismo patógeno que no son virulentos, pero que mantiene intacta su capacidad inmunitaria. Bacteria : Microorganismo unicelular de la especie Esquizomicetos .El género presenta variedades morfológicas y sus componentes pueden ser alargados (bacilos), redondeados (cocos), o en forma de coma (vibrios). La naturaleza de la enfermedad que producen es diferente en cada bacteria. Basidio : Célula más bien ancha y corta que lleva en su exterior a las esporas de algunos hongos superiores. Basidioesporas : Esporas propias de los basidiomycetes. Basidiomycetes : Hongo superior cuyas esporas se sitúan en la parte exterior de los basidios.

Basófilos : Producen y almacenan: histamina, factor quimiotáctico eosinófilo anafiláctico, y otras sustancias. Su función aparente es la hipersensibilidad rápida, como el asma alérgica. La reagina IgE se une fácilmente a la membrana y si un antígeno específico se aglutina a este complejo se libera histamina, heparina y otros mediadores. También tienen un rol en las alergias por contacto. Betalactamasa : Antibióticos del tipo de la penicilina, formados por una anillo betalactámico heterocíclico, con cuatro átomos. Bactericida : Sustancia antimicrobiana con capacidad para matar bacterias. Bacteriemia : Aparición transitoria de bacterias en sangre. Bacteriófago :Virus que infecta células procarióticas. Bacteriostático: Sustancia con capacidad para inhibir el crecimiento bacteriano, pero sin matar a la bacteria. Brote: Aparición de gran número de casos de una enfermedad en un corto periodo de tiempo. Cápside: Cubierta proteica de un virus. Carcinógeno: Sustancia que inicia la formación de un tumor. CD4 Células T moléculas superficiales, cooperadoras/inductoras Célula: Unidad fundamental de los seres vivos. Con excepción de la célula bacteriana, todas las demás poseen núcleo, citoplasma y diversos orgánulos que están rodeados por una membrana citoplasmática. Células B: Linfocitos dependientes de la médula ósea; precursoras de las células plasmáticas, sintetizan y liberan inmunoglobulinas. Células cooperadoras: Basófilos, eosinófilos y mastocitos. Célula Gram negativa: Célula procariótica cuya pared celular contiene relativamente poco peptidoglicano pero que tiene una membrana externa

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compuesta por lipopolisacárido, lipoproteína y otras macromoléculas complejas. Relativo a la coloración rosada de la contratinción que se utiliza para teñir microorganismos. Célula Gram positiva: Célula procariótica cuya pared celular está formada principalmente por peptidoglicano y que carece de la membrana externa de las células Gram negativas. Relativo a la coloración, célula que conserva el color violeta de la tinción que se utiliza en el método Gram para tedñir microorganismos Células T: linfocitos dependientes del Timo, responsables de la inmunidad celular. Clamidospora : Célula hifal, encerrada por una gruesa pared celular. Claviforme : En forma de clava. Colonia: Grupo de microorganismos de un cultivo procedentes de una sola célula. Tienen diferentes características morfológicas de tamaño, forma y color. Columnela : Parte central estéril de la gleba de muchos Gasteromycetes y Myxomicetes que en forma de columna sale de la base del exoperidio. Congénita, anomalía: Anomalía generalmente estructural presente en el momento del nacimiento que puede ser heredada , adquirida durante la gestación u ocasionada en el parto. Congénita, enfermedad: Defecto físico o mental presente en el momento del nacimiento que puede ser heredada, o causada por la influencia de factores ambientales durante el embarazo. Conidio : Espora de origen asexual que no se encuentra en el himenio. Conidióforo : Hifa que llevan los conidios. Contagio: Transmisión de una enfermedad, se refiere sobretodo a infecciones.

Contagioso: Que es transmisible. Por contacto directo o indirecto. Crateriforme : Que tiene forma de cráter. Crónico: Enfermedad o proceso que se desarrolla lentamente y persiste por largo tiempo, con frecuencia toda la vida. Dehiscente : Que tiende a abrirse por sí solo. Desinfectante: Agente que mata microorganismos, pero que puede ser también dañino para los tejidos humanos. Dextrinoide : Se dice de las esporas que con un reactivo yodado toman coloración rojiza. EBV: Epstein-Barr Virus, = VEB en español = Virus de Epstein Barr. Eosinófilos: Células producidos en la médulas ósea , pueden aumentar su producción si las células progenitoras son estimuladas por la interleucina 5 segregada por los linfocitos T. Su nivel aumenta en las infestaciones por parásitos, en reacciones alérgicas, en el asma y en alguna patología del miocardio. Endémico (a): En relación a una enfermedad o a un microorganismo propio de una zona geográfica o una población. Endocitosis: Proceso en el que una partícula es introducida intacta en una célula animal. La fagocitosis (incorporación de cuerpos sólidos) y la pinocitosis (incorporación de sustancias líquidas) son dos tipos de endocitosis. Enfermedad de transmisión sexual (ETS): Enfermedad que se transmite por contacto sexual. Entérico: Referido al intestino. Enterotoxina : Toxina que afecta al intestino Epidémico (a): Que afecta a un número significativamente grande de personas al mismo tiempo. Se refiere también a la enfermedad que se transmite rápidamente en una población que puede oscilar entre un área demográfica delimitada o cerrada.

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Epidemia: Enfermedad que se presenta al mismo tiempo en una gran cantidad de individuos de una población. Epidemiología: Estudio de la incidencia, distribución y causa de las enfermedades en el hombre. Espora : Corpúsculo reproductor de las plantas criptogámicas. Esporangio : Estructura a modo de saco cuyo contenido protoplasmático se convierte en gran cantidad de esporas. Esporocitos : Recipiente hueco: estructura que contiene las esporas. Esporulación : Acción y efecto de esporular: producir esporas. Esterigma : Pequeña rama o estructura hifal que sostiene un esporangio, un conidio o una basidióspora. Exotoxina: Toxina que se libera al exterior de la célula. Fagocito Célula capaz de rodear engullir y digerir microorganismos y detritus celulares. Los macrofagos y las células del sistema reticuloendotelial son fagocitos no circulantes. Los leucocitos y los macrófagos libres circulan en la sangre. Falso negativo: Resultado incorrecto de una prueba diagnóstica que indica equivocadamente la ausencia de la enfermedad. Falso positivo: Resultado incorrecto de una prueba diagnóstica que indica la existencia de la enfermedad. Fiebre: Elevación anormal de la temperatura corporal por encima de 37° C causada por una enfermedad. Filiforme : Que tiene forma o apariencia de hilo. Fotofobia: Sensibilidad ocular anormal a la luz. Fungemia: Presencia de hongos en la sangre.

Fúngico : Relativo a los hongos. Fusiforme : En forma de huso. Gangrena: Muerte o necrosis de un tejido como consecuencia de isquemia, o invasión bacteriana, afecta con mayor frecuencia las extremidades, pero puede desarrollarse también en órganos internos (intestino, vesícula biliar). Germen: Cualquier microorganismo, especialmente los patógenos. Hábitat. Lugar donde vive. Hemólisis : Presencia de restos de eritrocitos lisados alrededor de una colonia desarrollada en una placa de agar sangre de carnero. Hemólisis alfa : Las colonias están rodeadas por una destrucción parcial de los eritrocitos y pérdida de algo de hemoglobina en el agar lo que resulta en una coloración verde (hemólisis incompleta). Hemólisis beta : Las colonias están rodeadas por una zona de hemólisis completa (clara, transparente) debido a una destrucción total de los eritrocitos Hemoptisis: Expulsión de sangre de la vías respiratorias con la tos. Hemorragia: Pérdida externa o interna de una gran cantidad de sangre en un período corto de tiempo. Hialina. Transparente como el vidrio o parecido a él. HTLV-1: Retrovirus asociado a la leucemia de células T .Endémico en el Caribe, Japón y Sur-este USA. Ictericia: Coloración amarillenta de la piel, mucosas y conjuntivas ocasionada por aumento de la bilirrubina. Incubación : Mantenimiento de cultivos bacterianos en condiciones favorables para su desarrollo y multiplicación. Infección : Invasión y multiplicación de microorganismos en un huésped, pudiendo progresar hacia una

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enfermedad. El término enfermedad infecciosa se aplica cuando aparecen signos y síntomas como resultado de la infección. Infección intrahospitalaria (IIH) : Infección que se adquiere luego de 48 horas de permanecer en el establecimiento de salud y que el paciente no portaba a su ingreso. Se consideran también a aquellos procesos infecciosos que ocurren hasta 30 días luego del alta. Infección por gotitas: Infección adquirida por inhalación de microorganismos patógenos suspendidos en las partículas de líquidos procedentes de una persona infectada a través del estornudo o la tos. Inmunocompetente: Persona que presenta un estado óptimo de su inmunidad, celular y humoral que le permite resistir a un proceso infeccioso. Inmunodeficiente-inmunodeprimido: Persona que en el que existe un estado anormal del sistema inmunitario, por lo que la inmunidad humoral o celular o humoral son inadecuadas y disminuyen la resistencia a las infecciones. Inmunidad celular: Respuesta inmunitaria con ausencia de anticuerpos, se necesitan linfocitos activos. Inmunidad humoral: Respuesta inmunitaria caracterizada por la síntesis y liberación de anticuerpos. Inóculo: Alicuota de una muestra que es transferida a un medio de cultivo. Limpieza: Es la remoción mecánica de toda materia extraña con el objeto de disminuir el número de microorganismos. Se realiza a través del arrastre mecánico, sin embargo no se asegura la eliminación de éstos. Linfocitos :Células básicas de la inmunidad adquirida. Macrófago : Célula fagocítica del sistema reticuloendotelial. Mácula : Mancha.

Medio de cultivo: Medio artificial de sustancias nutritivas necesarias para el crecimiento y multiplicación de laa bacterias in vitro, que puede encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido. Meningitis : Infección o inflamación de las meninges que son las membranas que recubren el cerebro y la médula espinal. Metabolismo: Proceso de degradación y biosíntesis enzimática que tiene lugar dentro de una célula y por medio del cual se mantienen las actividades nutricionales y funcionales. Micelial : Relativo al micelio o propio de él. Micélico : Perteneciente o tocante al micelio. Micelio : Aparato nutritivo o talo de los hongos. Parte vegetativa del hongo formada por el entrelazamiento de las hifas. Micosis : Infección causada por un hongo. Microaerofílico: Organismo que crece y se reproduce mejor en la presencia de una tensión del 5% de oxígeno, 10% de anhídrido carbónico y 85% de nitrógeno. Microorganismo viable: Es aquel que es capaz de reproducirse. Mitógeno : Sustancia que induce la mitosis. Monocitos : Leucocito mononuclear producido en la médula ósea, fagocítico, en tránsito por sangre periférica. Tienen receptores Fc. Los monocitos con los macrófagos componen el sistema mononuclear fagocítico del sistema reticuloendotelial. Según el estímulo pueden funcionar como células citotóxicas. Necrosis : Muerte de una porción de tejido como consecuencia de una enfermedad o lesión. Nucleótidos, bases: · Adenina (A),Timina (T),Guanina (G), Citosina (C)

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Oncogén : gen que estimula la reproducción celular. Oxidación: Reacción química que implica la pérdida de electrones de los átomos. Mezcla de una sustancia con el oxígeno y un aumento en la valencia. Paciente : Persona que recibe un cuidado sanitario, que esta hospitalizado o enfermo. Plásmido : ADN de forma circular, situada fuera del cromosoma, a veces porta información genética y se replica de modo independiente. Patógeno : Microorganismo capaz de producir enfermedad. Polimorfa: Que puede tener varias formas. Predisposición: Estado de una persona de ser susceptible a determinado estímulo. Prevalencia : Número de casos nuevos de una enfermedad durante un tiempo determinado. Reconstituir: Restablecer la forma original de una sustancia previamente alterada para su conservación y almacenamiento, mediante la combinación con un líquido adecuado. Registro: Documento que provee evidencias objetivas de las actividades efectuadas o de los resultados obtenidos. Riesgo : Estado de vulnerabilidad de una persona o una población frente a una enfermedad. Riesgo, factor de : Cualquier factor (ambiental o fisiológico) que produce en una persona o población un estado de vulnerabilidad ante un suceso nocivo (enfermedad-infección). Secuencia : Orden que siguen las bases de nucleótidos en una cadena de ADN. Septicemia : Infección sistémica que se caracteriza por la aparición de patógenos en sangre circulante que provienen de

una infección localizada en cualquier lugar del organismo. Siembra primaria : Inoculación de una muestra a un medio de cultivo simple, selectivo o de enriquecimiento. Shock : Estado fisiológico anormal que se caracteriza entre otras por disminución del gasto cardíaco, aumento de la frecuencia cardíaca, disminución de la presión arterial. Es la primera fase de la reacción del organismo frente a una lesión traumática. Shock séptico : Shock causado por la septicemia debido a la liberación de endotoxinas bacterianas que están en la corriente sanguínea Subcultivo : Pasaje de bacterias viables derivadas de otro cultivo a un medio de cultivo nuevo. Traducción : Formación de una secuencia de aminoácidos a partir de una secuencia de bases de una molécula de ARNm. Transcripción : Transferencia de la información genética del ADN por medio de la síntesis de una copia de ARN de una plantilla de ADN. Translocación : Transferencia de un fragmento de un cromosoma a otro, y también el desplazamiento del ARNm por el ribosoma durante la traducción. Traducción : Segundo paso de la expresión genética: es la síntesis de proteínas a partir de un molde ó plantilla de mARN, donde la secuencia de aminoácidos está determinada por la información contenida en el mARN UFC: Unidad formadora de colonia. Vector: Portador capaz de transmitir una enfermedad .Los vectores biológicos son por lo general artrópodos en los cuales el microorganismo infectante completa su ciclo vital.

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