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PCR para micoplasma aviar 223

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PCR multiplex de micoplasmas patógenos aviares

Mazhar I Khan

1. Introducción
Se han aislado y caracterizado más de 20 especies de micoplasma de fuentes
aviares.(1). Se sabe que solo cuatro especies de micoplasmas aviares causan
pérdidas económicas en la producción avícola comercial.Mycoplasma
gallisepticum(Mg) la infección comúnmente causa enfermedad respiratoria
crónica (ERC) en pollos y sinusitis infecciosa en pavos(2),M. sinoviae(Ms) la
infección ocurre con mayor frecuencia como una infección respiratoria superior
subclínica y sinovitis en pollos y pavos(3),M. iowae(Mi) causa disminución en la
incubabilidad y alta mortalidad embrionaria en pavos(4), yM. meleagridis (Mm) es
la causa de una enfermedad de los pavos transmitida por el huevo en la que la
lesión principal es una aerosaculitis en la progenie, lo que conduce a una menor
incubabilidad y anomalías esqueléticas en los pavos jóvenes.(5).
La identificación de cualquiera de estos organismos de micoplasma aviar es de gran
importancia para la industria avícola, donde el diagnóstico rápido es de suma importancia.
Tanto los procedimientos serológicos como los de aislamiento se han utilizado para el
diagnóstico de micoplasmas aviares. Sin embargo, las reacciones cruzadas entre especies y
las reacciones inespecíficas(6)a menudo dificultan las pruebas serológicas, mientras que el
aislamiento de los micoplasmas es difícil y requiere mucho tiempo. Métodos moleculares,
como sondas de ADN.(7–9)y reacción en cadena de la polimerasa (PCR)(10–14), se han
desarrollado como alternativas a los métodos serológicos y de cultivo convencionales para
detectar tipos específicos de microorganismos micoplasmáticos en muestras clínicas. Por
otro lado, las infecciones múltiples de micoplasmas patógenos aviares tampoco son
infrecuentes en parvadas de pollos y pavos. Parvadas de pollos reproductores especialmente
comerciales infectadas con Mg y Ms(15–17)necesitan ser diferenciados y diagnosticados con
cultivo y serología, así como pruebas de amplificación PCR(6).

De:Métodos en Biología Molecular, vol. 216: Detección por PCR de patógenos microbianos: métodos y protocolos
Editado por: K. Sachse y J. Frey © Humana Press Inc., Totowa, NJ

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Detección simultánea de múltiples bacterias(18–20)o viral(21,22)infecciones y genes

defectuosos(23)se han descrito utilizando técnicas de amplificación por PCR multiplex.
Este enfoque puede ser muy específico, sensible y rentable, lo que lo convierte en una
alternativa atractiva al cultivo convencional y los métodos de PCR específicos para
micoplasmas aviares individuales en muestras clínicas sospechosas de múltiples
infecciones. Este capítulo describe un protocolo de PCR multiplex para micoplasmas
aviares patógenos que fue desarrollado y optimizado en nuestro laboratorio.(24).

2. Materiales

1. Proteinasa K (solución madre de 2 mg/mL).

2. Fenol-cloroformo-alcohol isoamílico: 25:24:1 (v/v/v), equilibrado con 50 mMETRO
Tris-HCl, pH 8,0.
3. Dodecilsulfato de sodio (SDS): solución madre al 10 % (p/v).
4. Acetato de sodio: 3METRO, pH 5,2.
5. Etanol: 100% (v/v) helado y 70% (v/v).
6. Amortiguador TE: 10 mMETROTris-HCl pH 7,6, 1 mMETROEDTA.
7. Tampón de amplificación de PCR (10X): 500 mMETROKCI, 100 mMETROTris-HCl, pH 8,3, 15 m
METROMgCl2, gelatina al 0,1 % (p/v) (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.).
8. MgCl2: 25 metrosMETROsolución.
9. Mezcla de dNTP (se compone de dATP, dCTP, dGTP y dTTP): 2,5 mMETROcada uno
(Applied Biosystems).
10. Ampli Taq®ADN polimerasa de oro: 5 U/μL (Applied Biosystems).
11. Cebadores de oligonucleótidos para PCR: solución de trabajo Mg 11,14 nmol/mL cada cebador;
Ms 14,17 nmol cada cebador; Mm 30,66 nmol/ml cada cebador; Mi 420 nmol/mL cada
cebador en agua estéril (para secuencias,vertabla 1; para las condiciones de
almacenamiento, verNota 1).
12. ADN de control positivo: 100 ng/μL de cada especie de micoplasma patógeno aviar,
es decir, Mg, Mm, Mi, Sra.
13. Tubos de microcentrífuga: 1,8 y 0,5 mL.
14. Termociclador automatizado: Modelo 480 GeneAmp®PCR System (Applied
Biosystem), u otro modelo comparable.
15. Aparato de electroforesis en gel horizontal.
16. Agarosa: 1,5 % (p/v), grado ultrapuro (Bethesda Reseach Laboratories, Bethesda, MD, EE.
UU.).
17. Tampón de electroforesis: tampón Tris-borato (0,045METROTris-borato, 0,001METROEDTA, pH
8,0).
18. Bromuro de etidio: solución madre de 10 mg/ml, conservar en frasco oscuro a temperatura
ambiente (verNota 2).
19. Colorante de seguimiento (solución madre 6X): azul de bromofenol al 0,25 % y sacarosa al 40 %
(p/v) en agua, almacenar a 4°C.
20. Películas Polaroid y cámara.
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tabla 1
Cebadores de PCR para micoplasmas patógenos aviares

Especificidad del cebador Secuencia (5'– 3') Referencia

mg 1 M. gallisepticum GGATCCCATCTCGACCAGGAGAAAA 11
mg 2 CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA
EM 1 M. sinoviae GAAGCAAATAGTGATATCA 10
EM 2 GTCGTCTCGAAGTTAACAA
milímetro 1 M. meleagridis GGATCCTAATATTAATTTAAACAAATTAATGA 14
milímetro 2 GAATTCTTCTTTATTATTATTCAAAAGTAAAGTAC
MI 1 M. iowae GAATTCTGAATCTTCATTTCTTAAA 13
mi 2 CAGATTCTTTAATAACTTATGTATC

3. Métodos
3.1. Coleccion de muestra
1. Las muestras traqueales de aves sospechosas vivas deben obtenerse con hisopos estériles.
2. Coloque las muestras de hisopo en medio de transporte (agua esterilizada) a 4°C.
3. Mantenga el medio de transporte a 4°C.

3.2. Preparación de la muestra

La preparación de muestras es fundamental para garantizar la calidad y la reproducibilidad de

la PCR, especialmente cuando se trabaja con muestras clínicas (verNota 3).

1. Exprima las muestras de hisopos en el medio de transporte y deseche el hisopo.

2. Transfiera 1,5 ml de medio de transporte al tubo de microcentrífuga.
3. Microcentrífuga la muestra durante 15 min a 14.000gramoa las 4°C.
4. Decantar el sobrenadante.
5. Vuelva a suspender el precipitado en 400 μL de tampón TE.

3.3. Aislamiento de ADN

1. Agregue 40 μL de SDS al 10 % para lisar las células en 400 μL de tampón TE.

2. Añadir 10 μL de proteinasa K (la concentración final será de 20 μg/mL).
3. Incubar a 37°C durante 1 h.
4. Extraer las muestras en un tubo de microcentrífuga con un volumen igual de alcohol fenol-
cloroformisoamílico (25:24:1) equilibrado con 50 mMETROTris-HCl, pH 8,0.
5. Mezclar en vórtex la mezcla durante 30 s.
6. Microcentrífuga la muestra durante 2 min a 14.000gramoa temperatura ambiente.
7. Transfiera la capa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga.
8. Repetirpasos 4–6.
9. Precipitar el ADN mediante la adición de 1/10 de volumen de 3METROacetato de sodio y 2-2,5 volúmenes de
etanol al 100 % enfriado con hielo.
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10. Incubar durante 20 min a –70°C.

11. Centrifugar la muestra durante 15 min a 14.000gramo.
12. Decantar el sobrenadante.
13. Lave el sedimento con etanol al 70 %.
14. Seque al aire el precipitado debajo de la campana y resuspender en 20 μL de tampón TE.
15. Use 10 μL de extracto de ADN de muestra para la prueba de PCR (verSubtítulo 3.4., pasos 10–
12, ySubtítulo 3.5.).

3.4. Preparación de la mezcla de reacción

para la amplificación (verNota 4)
1. La reacción de amplificación se lleva a cabo en 100 μL vol. (También son posibles reacciones de 50 μL.
En ese caso, las cantidades de todos los reactivos deben reducirse a la mitad).
2. Agregue 10 μL de tampón de amplificación de PCR en un tubo de microcentrífuga de 500 μL.
3. Agregue 2 μL (200 μMETRO) de cada dNTP.
4. Añadir 2 μL (concentración final 2,5 mMETRO) de MgCl2.
5. Agregue 1 μL (2,5 U) de ADN polimerasa AmpliTaq Gold.
6. Agregue 3 μL de cada cebador (un total de 24 μL) como se indica entabla 1. Las
concentraciones finales serán de 334 pmol para Mg, 425 pmol para Ms, 920 pmol para Mm y
420 pmol para Mi.
7. Agregue 10 μL del extracto de ADN de las muestras de hisopo preparadas según
Subtítulo 3.3.(Para controles positivos, use 100 ng de ADN de cada especie de
micoplasma disueltos en 10 μL de agua).
8. Agregue agua destilada estéril para completar el volumen total a 100 μL.
9. (Opcional) Si usa un termociclador que requiere capas de aceite, agregue 50 μL de aceite mineral.

3.5. Amplificación
Ejecute la PCR de acuerdo con el siguiente perfil de temperatura-tiempo:
desnaturalización inicial a 94°C durante 5 min, luego 35 ciclos de desnaturalización a 94°C
durante 1 min, recocido a 50°C por 1 min, extensión a 72°C por 2 min, extensión final a 72°C
durante 10 minutos y luego ajuste la temperatura final a 4°C hasta su uso posterior.

3.6. Detección de productos amplificados

por electroforesis en gel de agarosa

1. Preparar gel de agarosa al 1,5 % en tampón de electroforesis.

2. La configuración del aparato, la preparación y el funcionamiento de los geles deben realizarse de
acuerdo con el procedimiento descrito enárbitro.25.
3. Inyecte un volumen apropiado de producto de PCR amplificado con colorante de rastreo en la ranura del gel,
por ejemplo, 10–15 μL de producto más 3 μL de colorante de rastreo.
4. Ejecute la electroforesis.
5. Teñir el gel con bromuro de etidio, luego exponerlo a la luz ultravioleta para visualizar las
bandas y fotografiarlo. Un ejemplo se muestra enFigura 1.
PCR para micoplasma aviar 227

Fig. 1 Electroforesis en gel de agarosa de productos amplificados por PCR multiplex a

partir de ADN purificado de micoplasmas aviares conocidos. Carril 1, marcador de 123 pb;
carril 2, Mm (RY39), Mg (S6), Mi (695), Ms (WVU1853); carril 3, Mm (RY39), Mi (695), Ms (WUV
1853); carril 4, Mg (S6), Mi (695), Ms (WVU1853); carril 5, Mm (RY39); carril 6, Mg (S6); carril 7,
Mi (695); carril 8, Ms (WUV1853); carril 9, control negativo (tampón de PCR). Reimpreso con
permiso deárbitro.24.

4. Notas
1. Los cebadores deben dividirse en alícuotas en pequeñas cantidades, y una alícuota de cebadores de PCR
debe usarse a la vez y colocarse en 4°C hasta que se use. Todas las demás alícuotas deben almacenarse –20
°C.
2. El bromuro de etidio es un mutágeno poderoso y moderadamente tóxico. Se deben usar
guantes cuando se trabaja con soluciones que contienen este tinte. Después de su uso, estas
soluciones deben descontaminarse por uno de los métodos descritos enárbitro.25.
3. Las muestras de hisopos traqueales se pueden usar directamente sin incubar durante la
noche en medio de micoplasma de Frey(26). En caso de lotes negativos, la incubación
durante la noche en medio de Frey mejorará la sensibilidad de la PCR multiplex.
4. El procesamiento previo a la PCR de muestras de micoplasma y la mezcla de reactivos
debe realizarse en una sala designada para tal fin. El termociclador debe guardarse en
otra habitación para evitar la contaminación por arrastre.
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5. Periódicamente, la amplificación por PCR multiplex debe realizarse en micoplasmas

positivos conocidos y no relacionados, como Mg, Ms, Mm, Mi, así como
M. gallinarumyM. gallinacium, para comprobar la validez de la especificidad y la sensibilidad
del ensayo.

Expresiones de gratitud

El autor agradece a la Sra. Hang Wang y al Dr. Amin A. Fadl por el desarrollo y la
optimización de la PCR multiplex para las micoplasmasas patógenas aviares. Este trabajo fue
apoyado en parte por fondos provistos por la subvención Hatch del Departamento de
Agricultura de los Estados Unidos.

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