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INSTITUTO TECNOLGICO DE CONKAL, YUCATN.


CARACTERIZACIN FISIOLGICA Y MOLECULAR DE Paecilomyces fumosoroseus (WIZE) BROWN & SMITH Y SU PATOGENICIDAD EN ESTADIOS INMADUROS DE Bemisia tabaci (GENNADIUS)

Tesis que presenta:

Ing. WILBERTH CHAN CUPUL

Como requisito parcial para obtener el grado de: MAESTRO EN CIENCIAS EN HORTICULTURA TROPICAL

Conkal, Yucatn, Mxico Agosto 2009

2 CONTENIDO Pgina I II II IV 1 2 3 5 5 6 7 7 8 9 9 10 11 12 14 16 17 20 23 24 24 24 25 25 25 26 26 28 28 29 29 30 31 31 31 32 32

NDICE DE CUADROS NDICE DE FIGURAS NDICE DE CUADROS DEL APNDICE INDICE DE FIGURAS DEL APNDICE RESUMEN SUMMARY I. INTRODUCCIN II. REVISIN DE LITERATURA 2.1. Generalidades de Bemisia tabaci 2.1.1. Clasificacin taxonmica 2.1.2. Distribucin geogrfica 2.1.3. Ciclo de vida 2.1.4. Daos ocasionados 2.1.5. Mtodos de control 2.1.5.1. Resistencia vegetal 2.1.5.2. Control cultural 2.1.5.3. Control qumico 2.1.5.4. Control biolgico 2.2. Mecanismo de accin de los hongos entomopatgenos 2.2.1. Caractersticas de Paecilomyces fumosoroseus 2.2.2. Antecedentes del uso de P. fumosoroseus contra B. tabaci Antecedentes de la caracterizacin molecular de P. 2.3 fumosoroseus III. HIPTESIS IV. OBJETIVOS 4.1 General 4.2 Especficos V. MATERIALES Y METODOS 5.1. Localizacin 5.2. Cra de B. tabaci 5.3. Plantas hospederas de para bioensayos 5.4. Reactivacin de los aislamientos 5.5. Obtencin de cultivos monospricos 5.6. Bioensayos de patogenicidad 5.6.1 Obtencin de estados inmaduros de B. tabaci 5.6.2 Obtencin de la suspensin de esporas 5.6.3. Bioensayos de patogenicidad en inmaduros de B. tabaci 5.6.4. Diseo experimental y anlisis de datos 5.7. Caracterizacin fisiolgica 5.7.1. Crecimiento diametral 5.7.2. Esporulacin 5.7.3. Porcentaje de germinacin

3 5.7.4. Diseo experimental y anlisis de datos Caracterizacin molecular mediante RAPD-PCR 5.8.1. Obtencin del micelio 5.8.2. Extraccin de ADN 5.8.3. Cuantificacin de ADN 5.8.4. Aplicacin de la tcnica RAPD-PCR 5.8.5. Anlisis estadstico VI. RESULTADOS Y DISCUSIN 6.1. Patogenicidad en huevos de B. tabaci 6.2. Patogenicidad en ninfas de B. tabaci 6.2.1. Tiempo letal medio (TL50) 6.2.2. Concentracin letal media (CL50) 6.3. Caracterizacin fisiolgica 6.3.1. Crecimiento diametral 6.3.2. Esporulacin 6.3.3. Tasa de germinacin 6.4 Caracterizacin molecular 6.4.1. Extraccin y cuantificacin del ADN 6.4.2. Seleccin de iniciadores RAPD 6.4.3. Anlisis RAPD-PCR VII. CONCLUSIONES VIII. LITERATURA CITADA IX. APNDICE 5.8. 33 33 34 34 35 36 37 38 38 40 42 43 45 45 46 47 49 49 50 51 56 58 67

4 NDICE DE CUADROS Pgina Cuadro 1. Nomenclatura de los aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus. Tiempo letal medio en ninfas de B. tabaci por efecto del hongo P. fumosoroseus al aplicar una suspensin de 1x107 esporas ml-1. Concentracin letal media (CL50) de los aislamientos de P. fumosoroseus. Medias error estndar del desarrollo in vitro de los aislamientos P. fumosoroseus. Secuencia y nmero de fragmentos amplificados por los iniciadores evaluados. Matriz de similaridad gentica construida a partir de los perfiles RAPD a travs del coeficiente Jaccard. 27

Cuadro 2.

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Cuadro 3.

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Cuadro 4

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Cuadro 5

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Cuadro 6

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5 NDICE DE FIGURAS Pgina Figura 1. Mortalidad en huevos de Bemisia tabaci por efecto de la aplicacin de una suspensin de 1x107 esporas ml-1 del hongo Paecilomyces fumosoroseus (24 3 C, 72 5% HR, 16L: 8O). Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05). Mortalidad en ninfas del 1er instar de Bemisia tabaci por efecto de la aplicacin de una suspensin de 1x10 7 esporas ml-1 de Paecilomyces fumosoroseus (24 3 C, 72 5% HR, 16L: 8O). Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05). Cuantificacin de ADN genmico de aislamientos polispricos de Paecilomyces fumosoroseus. Carriles 1) Marcador de peso molecular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Seleccin de iniciadores empleando el aislamiento Pf-Tim (Monosprico M1) de Paecilomyces fumosoroseus. 1) Marcador de peso molecular 1 kb, 2) OPB 01, 3) OPB 02, 4) OPB 03, 5) OPB 04, 6) OPB 05 7) OPB 06, 8) OPB 07, 9) OPB 08, 10) OPB 09, 11) OPB 10. Perfil RAPD de cinco aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus obtenido con el primer OPB 10. 1) Marcador de peso molcular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Dendrograma obtenido a partir de los perfiles RAPD de cinco aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus y dos de Beauveria bassiana. 39

Figura 2.

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Figura 3.

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Figura 4.

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Figura 5

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Figura 6

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II

6 NDICE DE CUADROS DEL APNDICE Pgina Cuadro 1A. Anlisis de varianza de la mortalidad acumulada en huevos de B. tabaci a los 7 das despus de la inoculacin de una suspensin de de 1x10 -7 esporas ml-1 de P. fumosoroseus. Anlisis de varianza de la mortalidad acumulada en ninfas del primer instar de B. tabaci a los 12 das despus de la inoculacin de una suspensin de 1x10 7 esporas ml-1 de P. fumosoroseus. Anlisis de varianza de la tasa de crecimiento diario de la colonia de los aislamientos de P. fumosoroseus. Anlisis de varianza de la esporulacin de los aislamientos de P. fumosoroseus Anlisis de varianza del porcentaje de germinacin por hora de los aislamientos de P. fumosoroseus. 67

Cuadro 2A.

67

Cuadro 3A.

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Cuadro 4A.

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Cuadro 5A.

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III

7 NDICE DE FIGURAS DEL APNDICE Pgina Figura 1A. Perfil RAPD de los aislamientos polispricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 02. 1) Marcador de peso molcular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal, 6) Paesin, 7) HBb5 y 8) HBb22. Perfil RAPD de los aislamientos polispricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 06. 1) Marcador de peso molcular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Perfil RAPD de los aislamientos polispricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 07. 1) Marcador de peso molcular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Perfil RAPD de los aislamientos polispricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 09. 1) Marcador de peso molcular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. 68

Figura 2A.

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Figura 3A.

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Figura 4A.

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IV

8 RESUMEN

El uso de insecticidas qumicos en el manejo de Bemisia tabaci ocasiona serios daos al ambiente y la seleccin de poblaciones resistentes. Una alternativa promisoria es el biocontrol mediante hongos entomopatgenos. En el presente estudio se evalu la patogenicidad de Paecilomyces fumosoroseus en huevos y ninfas del 1er instar de Bemisia tabaci y se caracterizaron fisiolgica y molecularmente los aislamientos evaluados. La patogenicidad se evalu por inmersin de hojas que contenan inmaduros de B. tabaci en soluciones de 1x104 a 1x107 esporas ml-1. La caracterizacin fisiolgica se evalu mediante la tasa de crecimiento diario del dimetro de la colonia (TCD), esporulacin y la tasa de germinacin de esporas (TGE). La caracterizacin molecular se realiz mediante el uso de marcadores moleculares RAPDs. La mortalidad en huevos por efecto del hongo oscil entre 21.2 y 61.9%. Los aislamientos ms patognicos en ninfas con menor concentracin letal media (CL50) fueron Paesin y Pf-Tim con 2.6x104 y 5.5x104 E. ml-1. El Tiempo letal medio (TL50) ms bajo lo obtuvo Paesin con 3.7 das. El aislamiento Pf-Rg mostr la mayor TCD con 0.25 cm da-1, Paesin present la esporulacin ms alta con 4.5x10 6 E. ml-1. La TGE fue mayor en Pf-Tiz con 33.1% hora-1. Las huellas genticas y el rbol filogentico evidenciaron la agrupacin de los aislamientos de P. fumosoroseus en un solo grupo, fuera del grupo de los empleado (Beauveria bassiana) con un promedio se similaridad interna de 68.2%, lo que demuestra una baja variabilidad gentica entre los aislamientos evaluados.

9 SUMARY

The use of chemical insecticides for the control of Bemisia tabaci has caused several damage at environmental and selection of resistant populations. A promising alternative is the biocontrol by entomopathogenic fungi. In the present study was evaluated the pathogenicity of Paecilomyces fumosoroseus on eggs and first nstar nymphs of Bemisia tabaci and the physiology and molecular characterization of the isolates tested. The bioassay of pathogenicity was realized by leaves immersion that contained the inmatures whiteflies inside of four solutions of spores (1x104-1x107 spores per ml). The physiology characterization was tested by means the rate of daily grow of colony diameter (RGCD), sporulation and the rate of spore germination (RSG). The molecular characterization was realized using molecular markers RAPDs. The mortality eggs by fungis effect oscillated between 21.2 to 61.9 percent. The isolates highest pathogenic in nymphs with less lethal concentration (LC50) were Paesin and Pf-Tim with 2.6x104 y 5.5x104 spores per ml. Paesin obtained the less lethal time (LT50) with 3.7 days. In the physiology characterization, Pf-Rg showed the highest RGCD with 0.25 centimeters per day, Paesin presented the highest sporulation with 4.5x106 spores per ml. The RSG was highest in Pf-Tiz with 33.1% per hour. The fingerprinting and the phylogenetic tree showed to grouping of P. fumosoroseus isolates outside of control group used (Beauveria bassiana) with an internal similarity average of 68.2 percent, this study showed a low genetic variability between the isolates tested.

10 I. INTRODUCCIN

La mosquita blanca Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) es una plaga polfaga que afecta el desarrollo de numerosos cultivos en regiones tropicales y subtropicales del mundo (Gmez et al., 2007). En Mxico es la especie ms comn e importante en trminos econmicos que limita la produccin de cultivos hortcolas y ornamentales (Sotero et al., 2007), debido a los daos que ocasiona de manera directa con la extraccin de savia y debilitamiento de las plantas e indirectas como las fumaginas, alteraciones fitotxicas y transmisin de enfermedades de etiologa viral (Brown, 1994; Perring, 1996; Marcano, 2001).

Actualmente los insecticidas qumicos son el mtodo de control ms utilizado en el combate de esta plaga, cuyo costo vara de acuerdo al nivel de toxicidad, siendo los ms baratos los ms utilizados por los agricultores. Esta actividad ejerce efectos adversos en la salud del hombre, el medio ambiente y genera poblaciones de insectos altamente resistentes a estos insecticidas (Palumbo et al., 2001). Por lo tanto, en la ltima dcada se ha incrementado el inters por el uso de mtodos alternativos de control compatibles con el hombre y el ambiente.

El uso de hongos entomopatgenos para el control biolgico de Bemisia tabaci constituye una alternativa promisoria debido a que estos microorganismos causan epizootias que juegan un papel importante en la regulacin de poblaciones de insectos y no son nocivos hacia organismos benficos (Torres et al., 1993; Vargas, 2003).

11 Al menos 20 especies de hongos entomopatgenos parasitan a mosquitas blancas, entre ellos destacan los gneros Beauveria, Verticillium, Aschersonia y Paecilomyces. Sin embargo, Paecilomyces sp. es el genero de mayor importancia de estudio para insectos hompteros como lo es Bemisia tabaci, destacando dentro de este genero la especie Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown and Smith (Dos Santos y Pozo, 2003; Pucheta et al., 2006).

Debido a su diversidad gentica el hongo Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromycotina: Hyphomycetes) esta ampliamente distribuido por todo el mundo, puede encontrarse en el suelo e infectando a diversos insectos de numerosos ordenes (Smith, 1993). Se han reportado variaciones entre los diferentes aislamientos de P. fumosoroseus ya que algunos presentan mayor especificidad y eficiencia a ciertas especies de insectos por lo que es importante evaluar los diferentes aislamientos basndose en criterios moleculares (Tigano-Milani et al., 1995; Azevedo et al., 2000; Obornk et al., 2000; Fargues et al., 2002; Delleau-Cloudet et al., 2005; Gauthier et al., 2007).

Por lo que el objetivo de este trabajo fue evaluar la patogenicidad de aislamientos del hongo entomopatgeno Paecilomyces fumosoroseus sobre estados inmaduros de Bemisia tabaci, as como caracterizar fisiolgica y molecularmente los aislamientos con la perspectiva a largo plazo de establecer una alternativa ms para el control biolgico de esta plaga en regiones tropicales.

12 II. REVISIN DE LITERATURA

2.1 Generalidades de Bemisia tabaci

Las mosquitas blancas son insectos diminutos, raramente de ms de 2-3 mm de longitud, los adultos de ambos sexos son alados, pertenecen a la familia Aleyrodidae, que se divide en 2 subfamilias: Aleurodicinae y Aleyrodinae (Alean, 2003). La subfamilia Aleurodicinae es considerada la ms primitiva, sus individuos se caracterizan por la presencia de secreciones de cera en forma de filamentos dorsales o algodonosas. La subfamilia Aleyrodinae es la ms evolucionada, sus ninfas se caracterizan por presentar secreciones largas y dorsales; de color transparente, amarillo o negro y se alimentan principalmente de plantas herbceas, comprende ms de 1,000 especies descritas y es la ms ampliamente distribuida con diecisiete gneros destacando los siguientes tres: Bemisia, Aleurocanthus y Aleurotrachelus (Caballero, 1992; Castillo 1996).

El genero Bemisia comprende 37 especies reconocidas entre las cuales la ms destacada es Bemisia tabaci por ser cosmopolita y polfaga, capas de atacar a ms de 500 especies y variedades de cultivos (Callejas y Ochando, 2005). Su distribucin mundial parece estar relacionada con la implementacin de los monocultivos, sus diferentes prcticas agrcolas y por tener una amplia plasticidad en diferentes hospedantes (Horowitz et al., 2003). Se conocen aproximadamente 24 biotipos relacionadas principalmente con hospedantes y regiones geogrficas especificas, los cuales se han identificado y caracterizado de diferente manera (Zhang et al., 2005), por lo que muchos autores coinciden en que Bemisia tabaci representa un complejo de biotipos dentro del genero Bemisia (Muiz, 2000; Perring, 2001).

13 2.1.1 Clasificacin taxonmica

La clasificacin de la familia Aleyrodidae est basada en la estructura de la exuvia pupal del cuarto nstar ninfal y no de las estructuras morfolgicas de los adultos (Mound y Halsey, 1978; Byrne y Bellows, 1991; Arcos, 2005).

Reino: Animal Divisin: Exopterygota Clase: Insecta Orden: Hemptera Suborden: Homptera Familia: Aleyrodidae Gnero: Bemisia Especie: tabaci (Gennadius)

Sinonimias: Aleurodes tabaci (Gennadius), Bemisia goldingi (Corbertt), Bemisia gossypiperda (Masra Lamba), B. longispina (Priesner Hosny); B. nigeriensis (Corbertt) (Arcos, 2005)

2.1.2 Distribucin geogrfica

El Oriente y la India se han considerado como el centro de origen de Bemisia tabaci, de donde fue dispersada por el hombre hacia al continente Americano y Africano. Actualmente se encuentra afectando diversos cultivos en todas las regiones tropicales y subtropicales del mundo. No obstante en las ltimas dos

14 dcadas, Bemisia tabaci ha invadido todos los continentes con excepcin de la Antrtica (Naranjo et al., 2002). En Mxico se ha reportado como plaga de importancia econmica en Guanajuato, Veracruz, Baja California Sur, Sonora, Michoacn, Chiapas, Durango, Coahuila, Oaxaca, Sinaloa, San Lus Potos, Tamaulipas y Yucatn, (Daz y Ramrez, 1993; Soria et al., 1996).

2.1.3 Ciclo de vida

Es un insecto chupador que se localizan en el envs de las hojas de sus hospedantes, presentan metamorfosis incompleta; es decir su ciclo biolgico incluye una etapa de huevo, cuatro estados ninfales y el adulto (Bautista et al., 2002; Bautista, 2006). Segn Saunders et al., (1998) los huevos de B. tabaci comprenden un periodo de 5 a 10 das para pasar al estado ninfal y son depositados en forma individual o en grupos. El nmero mximo de huevos que puede ovipositar una hembra vara de 48 a 500 segn la especie, las condiciones ambientales y la planta hospedante.

El estado ninfal presenta cuatro instares de los cuales solo el primero es mvil gracias a la presencia de patas bien desarrolladas, el cual es conocido como gateador (Carabali, 2004). Posteriormente pasa por otras tres instares de desarrollo, en cada caso de mayor tamao, hasta transformarse en adulto o mosquita este periodo comprende de 12 a 28 das, dependiendo de las condiciones y planta hospedera en donde se desarrolle (Saunders et al., 1998; Bautista, 2006). El adulto, recin emergido, es de color amarillo plido y sus alas son ligeramente transparentes, aunque luego adquieren un color blanco debido al polvo ceroso que las cubre. Diez horas despus de la emergencia, los machos adultos estn aptos para iniciar el cortejo. Copulan varias veces y las hembras presentan mayor longevidad que los machos (Bautista et al., 2002).

15 2.1.4 Daos ocasionados

El tipo de dao varia segn la raza o biotipo, cuando el nmero de ninfas y adultos son altos causan dao directo, por su alimentacin mediante la extraccin de savia provocando el debilitamiento de las plantas, a su vez causan daos indirectos secretando sustancias azucaradas que favorecen el desarrollo de hongos como Capnodium spp. causantes de fumaginas, los cuales tienen un efecto adverso en la fotosntesis, al impedir la llegada de luz a la superficie foliar (CIAT, 1986; Marcano, 2001). Otro de los daos poco conocidos de Bemisia tabaci son las alteraciones fitotxicas o sndromes en cucurbitceas, como el tomate, brcoli y lechuga (Perring, 1996).

Sin embargo, en la actualidad el mayor dao indirecto de Bemisia tabaci es ser el vector transmisor de por lo menos 100 virus de tipo geminivirus carlavirus, luteovirus, nepovirus, potyvirus y closterovirus (Brown, 1994). Por la vasta gama de cultivos hortcolas que afecta y al dao que ocasiona de forma directa como indirecta, siendo la causante de grandes perdidas econmicas es considerando como unas de las principales plagas del siglo XXI (Antonio et al., 2001).

2.1.5 Mtodos de control

Un buen control de las poblaciones de Bemisia tabaci se logra con un programa adecuado de manejo integrado, que implica la aplicacin oportuna de diversos mtodos de control, entre las tcticas ms empleadas se encuentran la resistencia vegetal, control cultural, control qumico, control biolgico y el control microbiano.

16 2.1.5.1 Resistencia vegetal. Es un mtodo que puede ser explotado por presentar un gran potencial como estrategia de manejo en un programa integrado (McAuslane, 1996). La resistencia de las plantas a insectos puede utilizarse en diversos cultivos. Varias caractersticas de las plantas pueden conferirle resistencia, tales como composicin nutrimental del follaje, forma de las hojas, el nmero y distribucin espacial de tricomas, pH, concentracin de taninos y fenoles (Castro, 2006).

Uno de los casos mas exitosos de resistencia vegetal a moscas blancas son los estudios realizados por el CIAT en el cultivo de yuca evaluando por ms de dos dcadas la resistencia a la mosquita blanca Aleurotrachelus socialis Bondar en ms de 6,000 variedades de Yuca. Demostrado que los clones MECU 72, MECU 64, MPER 335 y MPER 317 han manifestado de manera consistente un alto nivel de resistencia (Vargas et al., 2002).

Con respecto a B. tabaci se ha encontrado resistencia vegetal en cultivares de algodn como el BRS Aroeira, BRS Verde, BRS Ita 90-2 y BRS Ipe (Castro, 2006). En otro trabajo de resistencia vegetal Toscano et al., (2002) evaluaron genotipos silvestres de Lycopersicon spp encontrando un alto nivel de antibiosis en los genotipos L y c o p e r s i c o n pennellii (LA 716) y Lycopersicon

hirsutum f. glabratum (PI 134417). Sin embargo para llegar a obtener resultados como estos es necesario de una estricta disciplina y un largo periodo de estudios cientficos para obtener resultados similares para cada cultivo susceptible.

2.1.5.2 Control cultural. El uso de plantas o cultivos secundarios asociados a uno o ms cultivos primarios como barrera o trampa y las coberturas vivas para el combate de una plaga en del marco del manejo integrado de plagas (MIP) se ubican dentro del combate ejercido como prcticas culturales (Salas, 2004). El

17 cual consiste en la manipulacin deliberada del ambiente para hacerlo menos favorable a las plagas, con el fin de interrumpir sus ciclos reproductivos, reducir la disponibilidad de alimentos y favorecer la multiplicacin de sus enemigos naturales (Metcalf y Luckmann 1975).

El uso de plantas o cultivos en varias modalidades (asociado, barrera, intercalado y trampa, entre otros) como prcticas agrcolas para combatir diferentes plagas ha sido informado por varios investigadores (Gutirrez 1999, Smith y McSorley 2000). Sin embargo, hasta ahora las evaluadas han incluido fechas de siembra y veda, eliminacin de malezas, destruccin de residuos de cultivos, semilleros protegidos, cubiertas flotantes, alta densidad de siembra, barreras vivas, coberturas al suelo, cultivos asociados y riego por aspersin (Hilje 2000, Hilje et al. 2001).

2.1.5.3 Control qumico. Durante las dos ltimas dcadas nuevos insecticidas qumicos han sido introducidos ofreciendo una diversidad de modos de accin y rutas de actividad. Entre estos productos los ms empleados son los nicotinoides como el imidacloprid, tiamethoxan, thiacloprid y pymetrozine. En lo que se refiere a las reguladores de crecimiento los ms concurridos son el pyriproxyfen y buprofezin (Gutirrez et al., 2007; Sotero et al., 2007). Aunque los nuevos atributos bioqumicos y las actividades biolgicas de estos insecticidas los han hecho efectivos, su uso intensivo ha ocasionado prdida de la susceptibilidad sobre este insecto (Palumbo et al., 2001), como la ha documentado Erdogan et al. (2008) quienes encontraron altos niveles de resistencia en B. tabaci a insecticidas Piretroides, organoclorados y reguladores de crecimiento.

18 2.1.5.4 Control biolgico. Se han identificado diversas especies de parasitoides, depredadores y hongos entomopatgenos para B. tabaci. Los parasitoides estn representados por dos gneros de la familia Aphelinidae (Encarsia y Eretmocerus) y uno de la familia Platygasteridae (Amitus) (Vzquez, 2002). Aunque la mayoria de las referencias sobre la actividad de los parasitoides no atribuyen la capacidad de regular satisfactoriamente las poblaciones de B. tabaci, varios informes reflejan su potencial en programas donde se combinen la conservacin y otras tcticas de manejo. As, Serrano et al. (1996) observaron en reas de policultivos en el salvador tasas de reduccin poblacional de B. tabaci de hasta el 80% en frjol y el 60% en tomate, bsicamente por Encarsia y Eretmocerus.

Los depredadores son ms diversos, ubicados bsicamente en los rdenes Neuroptera, Coleoptera, Hemiptera y Diptera de la clase insecta (Vzquez, 2002). Los cuatro agentes mas comunes y comercialmente producidos para el control biolgico de moscas blancas son Macrolophus caliginosus Wagner (Hemiptera: Miridae), Dicyphus tamaninii Wagner (Hemiptera: Miridae), Delphastus pusillus (LeConde) (Coleoptera: Coccinellidae) y Delphastus hesperus (Coleoptera: Coccinellidae) (Coollen, 2005) Los adultos y ninfas de M. caliginosus son efectivos para suprimir las poblaciones de B. tabaci (Jakobsen et al., 2002).

Los hongos entomopatgenos son considerados como los patgenos ms promisorios contra B. tabaci, ya que pueden infectar a los insectos directamente a travs de la penetracin de su cutcula. As como sus mltiples mecanismos de accin que les confiere una alta capacidad para evitar que el hospedero desarrolle resistencia (Alean, 2003). Las especies ms comunes como controladores de las mosquitas blancas son los hongos Deureromycetes: Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown & Smith, Verticillium lecanii (Zmm.)

19 Viegas, Aschersonia aleyrodis Webber y Beauveria bassiana (Blsamo) Vuillemin (Fransen, 1990; Lacey et al., 1999; Ayhan y Kubilay, 2005).

Por ejemplo en Dominicana McGuirre (1995) inform de un hongo que controla a la mosquita blanca B. tabaci durante la estacin de lluvia. Mendoza et al. (1995) refirieron que en la zona central del litoral ecuatoriano colectaron dos especies de hongos entomopatgenos y se han registrado hasta un 95% de mortalidad en adultos de B. tabaci por efecto de estos microorganismos. Igualmente Serrano et al., (1995) hallaron en el Salvador una epizootia intensa de Paecilomyces spp., que consideraron muy agresiva sobre poblaciones de B. tabaci, especialmente en adultos. Serra et al. (1996) evalu la eficacia de aislamientos importantes y nativos de hongos entomopatgenos en

ornamentales y cultivos hortcolas severamente afectados por B. tabaci, encontrando porcentajes de control superiores al 50% con el hongo P. fumosoroseus.

2.2 Mecanismo de accin de los hongos entomopatgenos.

Los hongos entomopatgenos inician su proceso infectivo en los insectos hospederos cuando las esporas viables son retenidas por contacto en la superficie cuticular del insecto, mientras encuentran un espacio propicio para establecer la asociacin patgeno-hospedero y formar los tmulos germinales y el apresorio, que facilitarn la invasin del hongo. Se ha sugerido que iones divalentes como el Ca+2 y el Mg+2 reducen las fuerzas de repulsin electrosttica de la superficie cuticular del insecto, por lo que pueden afectar su hidrofobicidad y promover la adhesin pared celular fngica-cutcula, creando condiciones favorables para el establecimiento de la espora y la subsecuente invasin del hospedero (Tanada y Kaya, 1993; Pucheta et al., 2006).

20 La germinacin de la espora se inicia con el hinchamiento de la misma, que es favorecido por una humedad alta alrededor del 70% durante aproximadamente 14 horas. La germinacin es disparada por mensajeros que generalmente son carbohidratos presentes en las protenas cuticulares del insecto. La hidratacin de la espora es favorecida por la accin antidesecante de su cubierta mucilaginosa, que adems funciona como protector ante la presencia de polifenoles txicos y enzimas, secretadas por sistema inmune del insecto (Pucheta et al., 2006).

Al germinar la espora da lugar a la formacin de un tubo germinativo mediante el proceso de polarizacin tpico del crecimiento apical de los hongos produciendo un apresorio (Tanada y Kaya 1993). El tubo germinativo rastrea y reconoce la superficie del insecto para la localizacin de sitios receptores, habilitando a la hifa para la penetracin de la cutcula (Wessels, 1999). El apresorio sirve para el anclaje de la espora y ejerce una presin hacia el interior del insecto. Paralelamente, el hongo excreta una gran cantidad de enzimas entre las que se incluyen proteasas, quitinasas, quitobiasas, lipasas, lipooxigenasas y otras enzimas hidrolticas, que van degradando la cutcula y proporcionan a su vez nutrientes al hongo (Monzn, 2001).

Una vez dentro del insecto, el hongo prolifera formando cuerpos hifales secundarios, que se ramifican en la procutcula conformada principalmente de fibrillas lameladas. Posteriormente, los cuerpos hifales se encuentran con la capa epidrmica y con su respectiva membrana basal y se diseminan a travs del hemocele (Deshpande, 1999). As invaden diversas estructuras como tejidos musculares, cuerpos grasos, tubos de Malpighi, mitocondrias, retculo endoplsmico y membrana nuclear agotando los nutrientes debido al crecimiento del hongo de tal modo que el hospedero muere por inanicin, destruccin de rganos internos y liberacin de toxinas. Finalmente la hifas

21 penetran de adentro hacia fuera y emergen a la superficie iniciando la formacin de esporas cuando las condiciones ambientales son adecuadas (Gillespie y Claydon, 1989; Pucheta et al., 2006).

2.2.1 Caractersticas de Paecilomyces fumosoroseus

El gnero Paecilomyces spp presenta hifas hialinas a amarillosas, septadas, de paredes delgadas. La mayora presenta ramificaciones verticiladas o

irregularmente ramificadas, llevan en su parte terminal en cada rama grupos de filides, las cuales pueden ser solitarias. Las filides constan de una porcin basal cilndrica o hinchada, adelgazndose abruptamente a menudo para formar un cuello muy notorio. Los conidiforos llevan cadenas de conidias; stas son hialinas, unicelulares y de forma ovoide (Bustillo, 2001).

Este gnero tiene dos subdivisiones Paecilomyces e Isarioidea. La primera divisin se caracterizan por no ser entomopatgenos y telmrficos, mientras que la divisin Isarioidea se caracterizada por ser entomopatgenos y telmrficos. Dentro de la divisin Isarioidea existen cinco especies con potencial biocontrolador de plagas, estas son: P. fumosoroseus, P. lilacinus, P. farinosus, P. amoenoroseus y P. javanicus. (Humber, 1998). El hongo Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown y Smith es un entomopatgeno de un amplio rango de hospederos y distribucin geogrfica, ha sido aislado del suelo y de insectos de diversas familias (Dos santos y Poso, 2003). Crece con micelio blanco, las conidias son menores a 3.5 m, el color de la colonia puede ser rosado-gris, rosado-oscuro, gris y el reverso de la colonia cultivada in vitro es amarilla (Humber, 1998). Las infecciones causadas por P. fumosoroseus se reconocen por el color rosado plido (Bustillo, 2001).

22 2.2.2 Antecedentes del uso de P. fumosoroseus contra B. tabaci

En la seleccin de aislamientos con mayor actividad biocontroladora de Bemisia tabaci el CATIE (2003) realizo evaluaciones en Colombia y Costa Rica de diversos hongos entomopatgenos. Las evaluaciones a los 6 das despus de la inoculacin arrojaron porcentajes bajos de control (<25%) para la mayora de los aislamientos evaluados, con excepcin del aislamiento Pc015c1 de Paecilomyces fumosoroseus que alcanz 46.3 %. Los porcentaje de mortalidad fueron mucho mayores a los 13 das alcanzando hasta un 90 % de control con el aislamiento Pc007 de Paecilomyces fumosoroseus en Colombia y porcentajes de 80.6 a 87.7% para los aislamientos 485 y 486 ambos de P. fumosoroseus de Costa Rica.

Skrobek (2001) evalo el potencial biocontrolador de 10 aislamientos de los hongos entomopatgenos sobre larvas del primer nstar de Bemisia tabaci biotipo B. Los resultados mostraron diferencias significativas en la virulencia de los aislamientos sobre la mortalidad total a los 6 das despus de la aplicacin de una suspensin de 1x107 esporas ml-1. El rango de mortalidad oscilo entre el 15 y 80%. Los aislamientos P1 y P2 de P. fumosoroseus causaron la mortalidad ms alta con un 80%. En un estudio comparativo sobre la capacidad patognica de aislamientos nativos de los hongos entomopatgenos y productos comerciales formulados como el Preferred (P. fumosoroseus), BotaniGard (B. bassiana) y Mycotal (V. lecanii) sobre Bemisia tabaci biotipo B Saito y Sugiyama (2005) encontraron la mortalidad ms alta para el aislamientos nativo PF3110 de P. fumosoroseus (98%) pero no encontraron diferencia estadstica significativa con los productos comerciales Preferred y BotanicGard con 90.6 y 97.2% de mortalidad respectivamente.

23 En trabajos realizados por Osborne et al., (1990) encontraron un porcentaje alto de mortalidad entre el 70 y 90% en ninfas del cuarto instar de Bemisia tabaci al aplicar la cepa Apopka 97 de Paecilomyces fumosoroseus a una concentracin de 1.0 x 106 esporas ml-1. En cultivos ornamentales como la Gerbera sp. en la Republica Dominica el hongo P. fumosoroseus ha mostrado una eficiencia de control mayor al 50% sobre ninfas Bemisia tabaci (Serra et al., 1996). Tambin se ha observado el efecto biocida de P. fumosoroseus sobre otras especies de mosquitas blancas como lo demostr Alean (2003) quien evalo aislamientos nativos de Colombia de hongos entomopatgenos sobre huevos y ninfas de la mosquita blanca de la Yuca Aleurotrachelus socialis Bondar (Homptera: Aleyrodidae). De los aislamientos evaluados el CIAT 212 de P. fumosoroseus obtuvo un porcentaje de mortalidad de 48.5%.

En otro estudio de patogenicidad en la mosca blanca del invernadero Trialeurodes vaporariorum Westood (Homoptera: Aleyrodidae) Avery et al., (2004) encontraron el porcentaje de emergencia de adultos mas bajo para la cepa Trinidad de P. fumosoroseus al aplicar una suspensin de 1.2x106 esporas ml-1 en ninfas del cuarto nstar bajo un rgimen de luz constante y 100% de humedad, en la cual encontraron el 29.20% de eclosin o sobrevivencia (70% mortalidad). Al evaluar la cantidad de proteasas producidas por el hongo P. fumosoroseus en el proceso infecto sobre T. vaporariorumr Castellanos et al., (2007) encontraron porcentajes elevados de mortalidad en ninfas del primer y segundo instar por arriba del 90%.

Dos Santos y Pozo (2003) aislaron y evaluaron la patogenicidad de P. fumosoroseus y otras especies de hongos entomopatgenos como alternativa para el manejo de T. vaporariorum en Uruguay. Los aislamientos mostraron un marcado efecto patognico sobre los estados inmaduros de T. vaporariorum, con un porcentaje de mortalidad mayor al 78%. La mayor mortalidad se obtuvo

24 con los aislamientos de P. fumosoroseus en un rango de 88.7 a 91.9%. Otros resultados similares fueron encontrados por Ayhan y Kubilay (2005) al evaluaron la patogenicidad in vitro de nueve aislamientos de P. fumosoroseus en ninfas de T. vaporariorum a los seis das despus de la inoculacin de una suspensin de 1 x 107 esporas ml-1, encontrando siete aislamientos con una mortalidad acumulada significativa por arriba del 70%.

2.3 Antecedentes de la caracterizacin molecular de P. fumosoroseus

El hongo entomopatgeno

Paecilomyces fumosoroseus es de amplia

distribucin geogrfica y rango de hospederos, capaz de infectar insectos de diversos ordenes y de todos los estados de desarrollo. Por lo que algunos aislamientos de P. fumosoroseus son producidos comercialmente en algunos pases, principalmente para el manejo de la mosquitas blancas como Bemisia tabaci y Trialeurodes vaporariorum en invernadero y campo abierto (Osborne y Landa, 1992; Wraigth et al., 2000). Por lo tanto la correcta caracterizacin genotpica y fenotpica de este microorganismo antes de su liberacin en programas de biocontrol es de suma importancia (Azevedo et al., 2000; Fargues et al., 2002; Gauthier et al., 2007).

Con la finalidad de agrupar e identificar las especies y biotipos de hongos entomopatgenos, se aplican las tcnicas moleculares como los estudios isoenzimticos, anlisis de polimorfismo en la longitud de fragmentos de restriccin (RFLP), anlisis de polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) y anlisis de polimorfismo de ADN amplificado al azar (RAPD) (Vargas, 2003).

25 Los marcadores moleculares del tipo RAPDs son una poderosa herramienta para la identificacin de especies o cepas, la estimacin de la variabilidad gentica entre aislamientos y la construccin de dendrogramas a partir de distancias calculadas (Welsh y McClelland 1990; Williams et al.1990). Este mtodo por medio de la huella gentica es considerado de una alta sensibilidad para la deteccin de la variabilidad entre individuos relacionados cercanamente y menos en especie polimrficas. Los marcadores RAPD han sido usados exitosamente para estimar la variabilidad gentica intraspecifica e

interespecifica de los hongos entomopatgenos (Tigano-Milani et al. 1995).

De

los

numerosos

estudios

de

diversidad

gentica

en

hongos

entomopatgenos, nicamente unos pocos ha sido reportados en lo que concierne a P. fumosoroseus. Tigano-Milani et al. (1995) Al estudiar la variabilidad gentica de 15 aislamientos de P. fumosoroseus, uno de Paecilomyces lilacinus y un grupo de 9 Paecilomyces sp (sin especificacin) por RAPD-PCR empleando primers arbitrarios, encontraron que la mayora de los aislamientos de P. fumosoroseus y Paecilomyces spp. fueron agrupados en tres grupos genticos con un porcentaje por arriba del 56 % de similaridad interna. Arbitrariamente dos de los tres grupos genticos fueron estrechamente relacionados con el tercer grupo (76% de similaridad) y completamente diferentes del segundo grupo (nicamente 14% de similaridad), en conclusin los grupos genticos no se relacionaron entre si a pesar de ser aislados del mismo hospedero y regin geografa.

En otro estudio de variacin molecular realizado con ADN ribosomal mediante RAPD-PCR de 7 aislamientos de P. fumosoroseus, 5 de P. tenuipes y 5 Paecilomyces spp. Azevedo et al., (2000) encontraron una extensa variabilidad en la huella digital para diferenciar todos los aislamientos amplificados. Los aislamientos fueron separados en dos grandes grupos genticos, el primer

26 grupo estuvo formado por todos los aislamientos de P. fumosoroseus y los cinco aislamientos sin identificacin (Paecilomyces spp), el segundo grupo incluyo todos los aislamientos de P. tenuipes. No obstante la alta divergencia gentica obtenida fue de 0.75 usando un amplificador comn para todos los aislamientos (primer OPAK-16). En consecuencia los aislamientos sin identificacin (Paecilomyces spp.) obtuvieron un promedio de similaridad entre si de 92.5%. Esta alta similaridad gentica se debi a que estos aislamientos fueron obtenidos de una misma zona epizotica (Paran, Brasil)

Obornk et al., (2000) usaron marcadores moleculares RAPD-PCR para la reconstruccin de la filogenia de los hongos entomopatgenos P.

fumosoroseus, P. lilacinus, P. farinosus y V. lecanii. Emplearon nueve primers que produciern 107 caractersticas binarias reproducibles (2 constantes 107 variables). Las distancias genticas fueron variables entre los hongos. Sin embargo, todos los aislamientos de P. fumosoroseus evaluados pertenecieron al mismo grupo

27 III. HIPTESIS

Al menos uno de los cinco aislamientos polispricos de Paecilomyces fumosoroseus o alguno de sus cultivos monospricos ocasiona mortalidad mayor al 90% de los estados inmaduros de Bemisia tabaci bajo condiciones de laboratorio.

Las huellas genticas y la caracterizacin fisiolgica permiten observar diferencias entre los aislamientos polispricos de Paecilomyces fumosoroseus.

28 IV. OBJETIVOS

4.1 General

Caracterizar fisiolgica y molecularmente los aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus y evaluar su patogenicidad en inmaduros de Bemisia tabaci.

4.2 Especficos

1. Evaluar

la

patogenicidad

de

aislamientos

polispricos

cultivos

monospricos de Paecilomyces fumosoroseus en huevos y ninfas del primer instar de Bemisia tabaci bajo condiciones de laboratorio.

2. Caracterizar el desarrollo fisiolgico in vitro de los aislamientos polispricos y cultivos monospricos de Paecilomyces fumosoroseus por medio del crecimiento diametral, esporulacin y germinacin de esporas.

3. Detectar polimorfismos entre los aislamientos polispricos de Paecilomyces fumosoroseus empleando la tcnica de Amplificacin de Fragmentos Polimorficos al Azar por Reaccin en Cadena de la Polimerasa (RAPDPCR).

29 V. MATERIALES Y MTODOS

5.1 Localizacin

Los experimentos de patogenicidad y la caracterizacin fisiolgica de los asilamientos se realizaron el laboratorio de entomologa y fitopatologa del Instituto Tecnolgico de Conkal, ubicado en el Km 16.3 de la antigua carretera Mrida-Motul. La caracterizacin molecular de los aislamientos se realiz el laboratorio de biologa molecular del Colegio de Postgraduados campus Campeche situado en la calle Nicaragua N 91 tercer piso entre Tamaulipas y Circuito Baluartes col. Santa Ana.

5.2 Cra de Bemisia tabaci

Se estableci la colonia de cra de B. tabaci en jaulas entomolgicas de aluminio y malla antiafidos de 1.2 x 1.2 x 1 m. Con un aspirador bucal se colectaron 200 adultos de B. tabaci en invernaderos cercanos a la zona de estudio, estos fueron liberados dentro de las jaulas entomolgicas sobre plantas de Capsicum chinense como planta hospedera, dispuestas en macetas de plstico rellenadas de cosmopeet (Cosmocel, Canad) como sustrato de soporte, posteriormente a los dos das los insectos introducidos fueron retirados de nuevo, dejando desarrollar a la generacin que haban ovipositado hasta generar adultos en la colonia de cra, los cuales fueron empleados para la obtener los estados inmaduros de B. tabaci para los ensayos de patogenicidad.

30 5.3 Plantas hospederas para bioensayos

El material vegetal utilizado para evaluar la patogenicidad de los aislamientos de P. fumosoroseus sobre huevos y ninfas de B. tabaci correspondi a plantas de Capsicum chinense de 45 a 50 das de edad de la variedad Seminis, sembradas en vasos de unicel con sustrato comercial Cosmopeet mantenidas con riego y una fertilizacin bsica con Urea (1g/Lt de agua) y MAP (1g/Lt de agua), las cuales se mantuvieron en invernadero a una temperatura de 28 2C y una humedad relativa de 75 5% hasta antes de la infestacin de B. tabaci.

5.4 Reactivacin de los aislamientos

Los hongos fueron sembrados en medio de cultivo Sabouraud Dextrosa Agar SDA (Merck, Alemania). El medio de cultivo se realiz agregando 65 g de SDA en 1 litro de agua destilada estril, se agit durante 10 minutos hasta homogenizar la mezcla, posteriormente se esteriliz en una autoclave a 125 libras de presin durante 25 minutos. Al enfriarse el medio de cultivo se aplic 2 ml de cloranfenicol como antibitico para evitar el crecimiento de bacterias saprofitas que puedan contaminar el medio de cultivo.

Una vez preparado el medio de cultivo se verti en cajas de Petri para la siembra del hongo, esto se realiz dentro de una cmara de flujo laminar por las condiciones aspticas necesarias. Una vez listas las cajas de Petri con medio de cultivo se inocularon por medio de una asa de platino esporas de los aislamientos iniciales para su reproduccin, las cuales se utilizaron para obtener las soluciones conidiales para evaluar el efecto patognico de los aislamientos.

31 Los aislamientos del hongo P. fumosoroseus, fueron provistos por el laboratorio de control biolgico del Comit Estatal de Sanidad Vegetal del estado Yucatn. Estas cepas fueron aisladas de mosquitas blancas parasitadas que se encontraban en cultivos a cielo abierto con el clima tropical prevaleciente. Tambin se incluyo dentro del experimento un producto comercial a base de esporas de P. fumosoroseus conocido como Paesin distribuida por laboratorios Agrobiolgicos del Sureste S.A de C.V. El cual fue reaislado en cajas de Petri como se describi con anterioridad.

Cuadro 1. Nomenclatura de los aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus. Aislamiento


Pf-Tim Pf-Tiz Pf-Hal Pf-Rg Paesin

Hongo
P. fumosoroseus P. fumosoroseus P. fumosoroseus P. fumosoroseus P. fumosoroseus

Hospedante
Bemisia tabaci Bemisia tabaci Bemisia tabaci Bemisia tabaci ---------

Origen
Timucuy (Yuc.-Mex.) Tizimin (Yuc.-Mex.) Halacho (Yuc.-Mex.) Zacapa (Guatemala) Sinaloa (Comercial)

5.5 Obtencin de cultivos monospricos

Los cultivos monospricos, se realizaron de acuerdo a la metodologa descrita por Ayala et al. (2005); se obtuvo una suspensin de esporas de cada aislamiento polisprico por medio de un raspado de la colonia, la suspensin obtenida se ajust a una concentracin de 100 esporas ml-1 empleando una cmara de Neubauer (Marienfeld, Alemania). Se aplicaron 200 L de esta suspensin en cajas de Petri con SDA vaciado en capa fina, al reverso de la caja Petri se trazaron cuadros de 0.5 cm2, las cajas se incubaron a temperatura ambiente (24 3 C, 72 5% HR), se revisaron cada 24 horas, al microscopio ptico a 4 y 10x, para marcar con un punto el cuadrante donde se encontraba

32 una sola espora con tubo germinativo. Al cabo de 2 das se observaron las colonias en crecimiento provenientes de la espora localizada el cual se le considera un cultivo monosprico por lo que fueron transferidas a una caja de petri con medio SDA para su completo desarrollo.

5.6 Bioensayos de patogenicidad

Se evalo la patogenicidad del hongo P. fumosoroseus en huevos y ninfas del primer instar de Bemisia tabaci bajo condiciones de laboratorio, fueron aplicados cuatro diferentes concentraciones de esporas para el calculo de la concentracin letal media (CL50) y el tiempo letal medio (TL50) de los 15 aislamientos evaluados

5.6.1 Obtencin de estados inmaduros de B. tabaci

Se tomaron diez insectos adultos de la colonia de cra con un aspirador bucal, se depositaron en una jaula clip y se sujetaron en una hoja de la planta hospedera, dejando a los insectos ovipositar durante un periodo de 24 horas. Posteriormente los adultos y la jaula clip fueron retirados y se contabilizaron el nmero de huevos por hoja. En el caso de ninfas, estos huevos se dejaron desarrollar en un periodo de 7 das hasta obtener ninfas en el primer instar. nicamente se dejaron entre 30 huevos o ninfas por hoja como unidad experimental (Muiz y Nombela, 2001).

33 5.6.2 Obtencin de la suspensin de esporas

Una suspensin de esporas por cada aislamiento se obtuvo de los crecimientos en medio de cultivo Sabouraud Dextrosa Agar. De las colonias en cajas de Petri una vez esporuladas (15 das), se cosecharon las esporas de cada aislamiento agregando 10 ml de agua destilada estril ms 0.5 l de Tween al 30% como dispersante de esporas, posteriormente se le realizo un raspado a la colonia por medio de una esptula estril, se extrajo el raspado y se filtro en un dial con gasas estriles evitando el paso de micelio e impurezas, obteniendo una suspensin stock el cual fue ajustada a las concentraciones a evaluar mediante una cmara de Neubauer (Gindin et al., 2000).

5.6.3 Bioensayos de patogenicidad en inmaduros de B. tabaci

Se evalo la patogenicidad de los cinco aislamientos polispricos y dos aislamientos monospricos de cada polisprico, haciendo un total de 15 aislamientos evaluados en huevos y ninfas de Bemisia tabaci. Para los bioensayos de patogenicidad, fueron tratados nicamente 30 huevos y 30 ninfas por hoja como unidad experimental. Cuatro suspensiones de esporas a concentraciones de 1x104, 1x105, 1x106, 1x107 esporas ml-1 se aplicaron a las hojas con huevos y/o ninfas por medio de inmersin de hoja durante 15 segundos, se dejaron secar y se incubaron bajo condiciones de laboratorio para su evaluacin. Las evaluaciones fueron realizadas diariamente empleando un microscopio estereoscopio.

34 Para el caso de huevos se contabilizaron los huevos micosados, deformes, eclosionados y no eclosionados. Mientras que para las ninfas se contabilizaron las ninfas micosadas, ninfas muertas, ninfas deformes por deshidratacin, cambios de coloracin, destruccin de rganos internos visibles y ninfas eclosionadas. Adems de estos parmetros patognicos se midieron las variables ambientales de temperatura y humedad empleando un

higrotermometro digital (Serra et al., 1996; Gindin et al., 2000).

5.6.4 Diseo experimental y anlisis estadstico

Este experimento se realizo bajo un diseo completamente al azar con 15 tratamientos y 4 repeticiones, la unidad experimental consinti en una hoja con 30 huevos y/o 30 ninfas de B. tabaci. Los resultados de mortalidad dado en porcentaje tanto en huevos como en ninfas fueron analizados mediante un anlisis de varianza y una comparacin de medias Tukey (P=0.05) por medio del programa estadstico GraphPad (San Diego, California). Para el clculo de TL50 y CL50 se realiz un anlisis Probit para la mortalidad diaria acumulada con el programa estadstico SAS Ver. 8.1 (SAS Inc. USA).

5.7 Caracterizacin fisiolgica

La caracterizacin fisiolgica de los aislamientos se realiz mediante la evaluacin del desarrollo in vitro del hongo reflejado por el crecimiento diametral de la colonia, produccin de esporas (esporulacin) y porcentaje de germinacin.

35 5.7.1 Crecimiento diametral

Se realizo depositando en el centro de una caja de Petri con medio de cultivo Sabouraud Dextrosa Agar 1 L de una suspensin de 1 x 107 esporas ml-1. Las cajas de Petri se incubaron a una temperatura de 24 3 C, humedad relativa de 72 5% y fotoperodo de 16h luz y 8h oscuridad, durante 15 das. Se realizaron mediciones diarias del dimetro de la colonia, calculando la tasa de crecimiento diario en cm da-1 (Skrobek, 2001).

5.7.2 Esporulacin

La produccin de esporas se determino empleando la metodologa descrita por Gindin et al., (2000) para el conteo de esporas. Se agreg a las colonias en cajas de Petri 10 ml de agua destilada estril ms 0.5 L de Tween al 30%. Posteriormente se realizo el raspado de la colonia empleando un esptula estril, seguido se extrajo el raspado y se filtro en un dial evitando el paso de impurezas y micelio mediante una gasa estril, obteniendo una solucin, de la cual se mido la concentracin de esporas depositando 5 L de la solucin en una cmara de Neubauer, contabilizando las esporas mL-1 bajo un microscopio compuesto con el ocular en 40x.

5.7.3 Porcentaje de germinacin

Para cuantificar el porcentaje de germinacin de esporas, se ajusto la suspensin stock a una concentracin de 1x107 esporas ml1. Se tomaron 2 L y se colocaron en un punto dentro de una caja Petri con medio SDA, se colocaron cinco puntos por caja Petri, una caja por cada aislamiento. Sobre estos puntos

36 se colocaron cubreobjetos, se observo la germinacin de las esporas en intervalos de 1 hora hasta lograr un 100% de germinacin para cada muestra. Se contabilizaron al azar 100 esporas empleando un contador manual, se diferenciaron las esporas germinadas y no germinadas obteniendo as de manera directa el porcentaje de germinacin. Se considero a la espora germinada, cuando se observo la presencia del tubo germinativo con el doble de tamao de la espora (Skrobek, 2001).

5.7.4 Diseo experimental y anlisis estadstico

Para los experimentos de desarrollo in vitro se utiliz un diseo completamente al azar con 15 tratamientos y 5 repeticiones cada uno. Los datos se analizaron con un anlisis de varianza y comparacin de medias Tukey (P=0.05) empleando el programa estadstico GraphPad (San diego, California).

37 5.8 Caracterizacin molecular mediante RAPD-PCR

Para la caracterizacin gentica del hongo se emplearon los 5 aislamientos polispricos de P. fumosoroseus, previamente caracterizados fisiolgicamente y evaluados patgenicamente sobre inmaduros de B. tabaci.

5.8.1 Produccin de biomasa y extraccin del ADN

5.8.1.1 Produccin de biomasa. Los aislamientos de P. fumosoroseus fueron sembrados en Caldo Dextrosa Sabouraud (40 g de dextrosa, 5 g de peptona de carne y 5 g de peptona de casena para un litro) adicionado con cloramfenicol 100 g L-1 (Pharmacia) para evitar la contaminacin bacteriana. Con una esptula esterilizada a calor se cortaron cuadros de 1 cm 2 de una colonia de 2 semanas de edad, estos fueron depositados en matraces de 250 ml conteniendo 50 ml de medio de cultivo lquido, los matraces se mantuvieron en agitacin orbital a 22 C durante 5 das. El micelio se recuper por filtracin por gravedad utilizando papel estril Whatman No 2, lavndolo dos veces con agua ultrapura estril y un buffer de lavado (100mM de Tris-HCL pH 8.5, 150 mM de NaCl, 5 mM EDTA). El micelio extrado se deposit en tubos Eppendorf de 1.5 mL y fue almacenado a -80 C para su posterior extraccin de ADN.

5.8.1.2 Extraccin del ADN. La extraccin del ADN se realiz de acuerdo al protocolo desarrollado Raeder y Broda (1985) con ligeras modificaciones. El micelio congelado se deposit en proporcin aproximada de 200 mg por muestra en morteros estriles y fueron macerados con nitrgeno lquido hasta formar un polvo fino. El micelio pulverizado se coloc en un tubo Eppendorf adicionndole 500 uL del buffer de extraccin (200 mM de Tris-HCl pH 8.5, 250 mM de NaCl, 25 mM de EDTA, 0.5% de SDS), se mezcl de manera

38 homognea durante 10 minutos mediante un vortex. A la suspensin formada con el buffer y los restos celulares extrados, se les adiciono un volumen de fenol-cloroformo. La suspensin se mantuvo 10 minutos en agitacin constante, al trmino del tiempo, se realiz una remocin celular por centrifugacin a 12,000 rpm durante 10 minutos.

La fase acuosa se recuper en un tubo Eppendorf y se le agreg un volumen de cloroformo y eliminar los residuos de fenol. La solucin se mezcl de manera homognea en un vortex y se centrifug a 12,000 rpm por cinco minutos. La fase acuosa se recuper en otro tubo Eppendorf adicionndole un volumen de isopropanol fri, posteriormente la solucin fue centrifugada por cinco minutos a 12,000 rpm para recuperar los cidos nucleicos en forma de pastilla. La pastilla se lav dos veces con etanol al 70% y fue suspendida en 100 uL de agua ultrapura estril.

Para eliminar el ARN contaminante se agreg 3 L de RNAsa (5 ng/uL), encubando la muestra por 30 minutos a 37 C, al termino de la incubacin se realiz una limpieza de la RNAsa con fenol-cloroformo y cloroformo con la misma metodologa mencionada anteriormente, al final se precipit con isopropanol hasta obtener la pastilla, la cual fue lavada dos veces con etanol al 70% y secada por centrifugacin al vaci. Finalmente la pastilla fue suspendida en 50 L de agua ultrapura estril.

5.8.1.3 Cuantificacin del ADN

El estado fsico del ADN se determin por electroforesis en gel de agarosa al 1.2% corrido a 90 V por una hora, el gel se ti con bromuro de etidio observndose en un transluminador con luz ultravioleta. En todas las

39 electroforesis se emple 1 L de marcador de peso molecular de 1kb Leader (Gibco Lab). Una vez confirmado el estado fsico aceptable del ADN cromosmico, se cuantific por medio de un espectrofotmetro BeckmanCoulter modelo DU 530 (USA), empleando el programa DNA de doble cadena (dsDNA).

5.8.2 Aplicacin de la tcnica RAPD-PCR

Se utiliz la tcnica de ampliacin aleatoria de ADN polimrfico (RAPD) por Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) para detectar la variabilidad entre los aislamientos de P. fumosoroseus. Para ello se evaluaron 10 iniciadores al azar del Kit OPB de Operon Technologies (California, USA) utilizando un solo ADN para analizar el nmero de bandas obtenidas por cada iniciador y seleccionar aquellos que permitieran establecer un buen patrn de bandas en la huella gentica particularmente de cada aislamiento (Tabla 2).

Tabla 2. Secuencias de los iniciadores evaluados. Iniciador universal OPB 01 OPB 02 OPB 03 OPB 04 OPB 05 OPB 06 OPB 07 OPB 08 OPB 09 OPB 10 Secuencia 5-GTTTCGCTCC-3 5-TGATCCCTGG-3 5-CATCCCCCTG-3 5-GGACTGGAGT-3 5-TGCGCCCTTC-3 5-TGCTCTGCCC-3 5-GGTGACGCAG-3 5-GTCCACACGG-3 5-TGGGGGACTC-3 5-CTGCTGGGAC-3

40 Las reacciones se realizaron en un volumen total 25 L, conteniendo lo indicado en la tabla 3. Se utiliz ADN de referencia de un hongo entomopatgeno previamente extrado (Beauveria bassiana). La amplificacin se realiz en un termociclador Techgene modelo FTgene2D (Technege, USA) con el programa de amplificacin desglosado en la tabla 4. Los productos de amplificaciones fueron separados en una cmara de electroforesis Thermo EC 340 (Thermo scientific, USA) en gel de agarosa al 1% utilizando 1X del buffer Tris-BoratoETDA (TBE) a 80 V durante 3 horas, los geles se tieron con bromuro de etidio y se visualizaron en un transluminador con luz ultravioleta.

Tabla 3. Componentes de las reacciones RAPD-PCR. Reactivo ADN Iniciador dNTPs MgCl2 Buffer PCR Taq ADN polimerasa H20 Ultrapura estril Total Cantidad 1.0 uL 2.0 uL 1.5 uL 2.0 uL 2.5 uL 0.5 uL 15.5 uL 25.0 uL Concentracin 80 ng uL-1 20 pmol uL-1 50 mM c/u 50 mM 10X 2.5 U

Tabla 4. Programa de amplificacin. Paso Desnaturalizacin inicial Desnaturalizacin Alineamiento Extensin Extensin final Ciclo 1 40 1 Temperatura 94 C 94 C 36 C 72 C 72 C Tiempo 5 min 1 min 1 min 2 min 7 min

41 5.8.3 Anlisis de la caracterizacin molecular

Para el establecimiento de las huellas genticas derivadas de cada uno de los iniciadores evaluados, se construy una matriz binaria asignando valores de 0, en caso de ausencia del fragmento y 1 cuando esta estuvo presente en cada uno de los aislamientos. A partir de la matriz binaria se elabor una matriz de proximidad mediante el coeficiente Jaccard, que cuantific el grado de similaridad entre cada par de objetos. Las agrupaciones para la elaboracin del dendrograma se realiz mediante el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Aritmetic Averages) o promedios no ponderados, el cual se someti a un anlisis de reagrupamiento (Bootstrapping) con 1000 replicas mediante el programa FreeTree Ver. 0.9.1.50 (Pavlicek et al., 1999). El dendrograma se visualiz con el programa TreeView Ver. 4.1 (Page, 1996).

42 VI. RESULTADOS Y DISCUSIN.

6.1 Patogenicidad en huevos de B. tabaci

De los quince aislamientos evaluados sobre huevos de B. tabaci los aislamientos Pf-Hal M1 y Paesin presentaron los porcentajes de mortalidad ms altos con 61.92% y 61.32% respectivamente. El efecto de estos aislamientos result significativamente superior (P<0.05) (Cuadro 1A) al efecto de los aislamientos Pf-Tiz, Pf-Hal, Pf-Rg M1 y Pf-Tiz M2, con 33.32, 21.25, 31.25 y 33.21%, respectivamente. El testigo obtuvo el porcentaje de mortalidad ms bajo con el 9.79% (Figura 1).

En otros estudios se han encontrado valores inferiores a los obtenidos en el presente trabajo. Por ejemplo, Lacey et al., (1999) al evaluar la patogenicidad de P. fumosoroseus en huevos de B. tabaci encontraron valores de mortalidad menores al 20% al aplicar una solucin conidial de 1x10 3 esporas/cm2. En otras especies de mosquitas blancas, P. fumosoroseus ha causado efectos similares a los encontrados en el presente estudio, Alean (2003) al evaluar el efecto ovicida de P. fumosoroseus sobre la mosquita blanca Aleurotrachelus socialis Bondar (Homptera: Aleyrodidae) encontr porcentajes de mortalidad entre 40 y 60% similares a los encontrados en este experimento.

Para efectos de comparacin es preciso mencionar la actividad ovicida de otras especies de hongos entomopatgenos en B. tabaci. Por ejemplo, Gindin et al. (2000) encontraron que Verticillium lecanii ocasion entre el 14 y 26% de mortalidad en huevos de B. tabaci al aplicar una suspensin de 1x107 esporas ml-1. Skrobek (2001) report que Metarhizium anisopliae ocasion mortalidades

43 entre 33 y 45% a los 6 das posteriores a la aplicacin de una suspensin de 1x107 esporas ml-1. Estos trabajos previos resaltan los resultados encontrados en este trabajo y sugieren los aislamientos Paesin y Pf-Hal M1 son ms patognicos en huevos de B. tabaci que otros hongos evaluados.

100

80

Mortalidad (%)

60

ab c

a ab abc abc abc

a ab abc abc d ab c

40

bcd de

cde

bc d e

20

0
Pf-Tim Pf-Hal Pf-Tim M1 Pf-Tim M2 Pf-Rg M1 Pf-Hal M1 Pf-Rg M2 Paesin M1 Paesin M2 Pf-Hal M2 Pf-Rg Paesin Pf-Tiz M1 Pf-Tiz M2 Testigo Pf-Tiz

Aislamientos

Figura1. Mortalidad en huevos de Bemisia tabaci por efecto de la aplicacin de una suspensin de 1x107 esporas ml-1 del hongo Paecilomyces fumosoroseus (24 3 C, 72 5% HR, 16L: 8O). Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05).

6.2 Patogenicidad en ninfas de B. tabaci

El potencial de control de los quince aislamientos de P. fumosoroseus se evalu en ninfas del primer instar de B. tabaci. Los resultados mostraron diferencia significativa (P<0.05) (Cuadro 2A) en el porcentaje de mortalidad a los 12 das

44 despus de la aplicacin. El aislamiento Pf-Rg caus el porcentaje de mortalidad ms alto con 92.1%, con respecto a los aislamientos Pf-Tiz , Pf-Hal, Pf-Tim M1, Pf-Rg M1, Pf-Tiz M2, Pf-Tim M2, Pf-Rg M2 y Pf-Hal M2, que presentaron valores de 66.43, 54.09, 61.07, 56.48, 65.18, 60.75, 59.15 y 60.23%, respectivamente. El aislamiento Pf-Rg fue mucho ms patognico que sus dos aislamientos monospricos evaluados. Sin embargo ocurri lo contrario con los aislamientos Pf-Tiz y Pf-Hal, donde los aislamientos monospricos fueron ms patognicos que sus respectivos polisprico. El testigo present el porcentaje de mortalidad ms bajo con 9.52%

Los valores de mortalidad encontrados en este trabajo fueron mayores a los reportados por Scorsetti et al., (2008), quienes al evaluar en ninfas de B. tabaci la patogenicidad del hongo P. fumosoroseus aplicando una suspensin de 1x107 esporas ml-1, encontraron valores de mortalidad entre el 26.6 y 76.6% a los 7 das posteriores a la aplicacin. Skrobek (2001) evalu la patogenicidad de P. fumosoroseus sobre el primer instar ninfal de B. tabaci biotipo B, los valores de encontrados a los 6 das posteriores a la inoculacin de una suspensin de 1x107 esporas ml-1, fueron aproximadamente del 80%.

En otros estudios de patogenicidad realizados por Osborne et al., (1990), encontraron un porcentaje mortalidad entre el 70 y 90% en ninfas del cuarto instar de Bemisia tabaci al aplicar la cepa Apopka 97 de P. fumosoroseus a una suspensin 1x106 esporas mL-1. Otros resultados indican que los aislamientos evaluados en este ensayo fueron ms virulentos. Por ejemplo , Saito y Sugiyama (2005) al evaluar aislamientos nativos de Japn de P. fumosoroseus y aislamientos comerciales sobre estadios ninfales de B. tabaci (biotipo B) encontraron la mortalidad ms alta en el aislamiento nativo PF3110 con 98%, al aplicar una suspensin de 6x107 esporas ml-1, seis veces mayor a la suspensin mas alta evaluadas en el presente trabajo.

45

100 abc bc

a abc ab abc bc c c abc abc bc bc bc bc

Mortalidad (%)

80

60

40

20

0
Pf-Tim Pf-Hal Pf-Tim M1 Pf-Tim M2 Pf-Rg M1 Pf-Hal M1 Pf-Rg M2 Paesin M1 Paesin M2 Pf-Hal M2 Pf-Rg Pf-Tiz M1 Pf-Tiz M2 Testigo Paesin Pf-Tiz

Aislamientos

| Figura 2. Mortalidad en ninfas del 1er instar de Bemisia tabaci por efecto de la aplicacin de una suspensin de 1x107 esporas ml-1 de Paecilomyces fumosoroseus (24 3 C, 72 5% HR, 16L: 8O). Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05).

6.2.1 Tiempo letal medio (TL50)

Con base en el anlisis probit se calcularon los tiempos letales medios (TL50) de cada aislamiento empleando la suspensin ms alta evaluada (1x107 esporas ml-1). Este valor indica el tiempo requerido para obtener el 50% de mortalidad de la poblacin tratada. El asilamiento Paesin fue estadsticamente diferente al resto de los aislamientos evaluados con un valor de 3.7 das, los aislamientos Pf-Hal, Pf-Rg M2 y Pf-Tim M1 obtuvieron los valores ms altos de TL 50 con 6.36, 6.71 y 6.08 das, respectivamente (Cuadro 2). Otros estudios sobre tiempos letales medios de P. fumosoroseus en B. tabaci, han encontrado resultados similares a los obtenidos en el presente estudio. Por ejemplo, Saito y Sugiyama (2005) al evaluar la patogenicidad de P. fumosoroseus sobre B. tabaci a una suspensin de 7.4x107 esporas ml-1, encontraron un valor de TL50

46 de 3.8 das. Lo mismo registraron Gindin et al., (2000) al encontrar un TL50 de 3.8 das, por lo que estos valores son muy cercano a los obtenidos por el aislamiento Paesin del presente ensayo.

Para efectos de comparacin cabe mencionar que los tiempos letales de P. fumosoroseus en moscas blancas es variado como lo describen otros trabajos. Por ejemplo, en ninfas de Trialeurodes vaporariorum se ha encontrado tiempos letales (TL50) de 4.4 a 4.7 das al aplicar una suspensin de 1x108 esporas ml-1. (James, 2001). Valores entre 4.1 a 4.7 das de TL50 fueron encontrados por Coollen (2005) al aplicar una suspensin de 9x106 esporas ml-1 de P. fumosoroseus sobre T. vaporariorum. Por otro lado Dos santos y Pozo (2003) encontraron un valor menor de TL50 de 3.04 das en T. vaporariorum al aplicar una suspensin de 3.5x107 esporas ml-1. Por lo que se pone en manifiesto que existe diferencia en patogenicidad entre los diferentes aislamientos evaluados.

Cuadro 2. Tiempo letal medio en ninfas de B. tabaci por efecto del hongo P. fumosoroseus al aplicar una suspensin de 1x107 esporas ml-1. Aislamientos TL50 (Das) IC (Das) Pendiente Pr>f Paesin 3.72 a 3.41 - 4.04 3.47 <0.0001 Paesin M1 4.94 b 4.65 - 5.28 4.50 <0.0001 Paesin M2 4.69 b 4.44 - 4.97 4.02 <0.0001 Pf-Tiz 4.66 b 4.22 - 5.22 2.93 <0.0001 Pf-Tiz M1 5.39 bc 5.03 - 5.84 4.00 <0.0001 Pf-Tiz M2 5.50 bc 5.23 - 5.97 3.91 <0.0001 Pf-Hal 6.36 c 5.76 - 7.22 2.53 <0.0001 Pf-Hal M1 5.08 b 4.63 - 5.66 3.26 <0.0001 Pf-Hal M2 6.13 bc 5.58 - 6.90 2.89 <0.0001 Pf-Rg 4.35 b 4.11 - 4.59 5.86 <0.0001 Pf-Rg M1 6.01 bc 5.54 - 6.66 3.86 <0.0001 Pf-Rg M2 6.71 c 6.21 - 7.42 4.03 <0.0001 Pf-Tim 5.04 b 4.70 - 5.45 3.70 <0.0001 Pf-Tim M1 6.08 c 5.67 - 6.64 4.46 <0.0001 Pf-Tim M2 5.53 bc 5.25 - 5.87 3.78 <0.0001 TL50=Tiempo letal medio, IC=intervalo de confianza. Valores con letras iguales son estadsticamente iguales segn traslape de los intervalos de confianza.

47 6.2.2 Concentracin letal media (CL50)

Al

analizar

los

resultados

obtenidos

despus

de

aplicar las

cuatro

concentraciones de los aislamientos de P. fumosoroseus sobre ninfas de de B. tabaci, al cabo de los 12 das se encontr una mayor mortalidad a medida que se aument la concentracin de esporas. Segn el anlisis Probit se encontraron cuatro grupos de los cuales los valores de CL50 ms bajos fueron para el aislamiento Paesin y Pf-Tim con 2.6x104 y 5.5x104 esporas ml-1, respectivamente. Esto indica que estos aislamientos fueron ms virulentos contra B. tabaci que el resto de los aislamientos evaluados. Las CL50 ms alta obtenida fueron para los aislamientos Pf-Rg M2 y Pf-Rg M1 con 3.3 x106 esporas ml-1 y 7.2x106 esporas ml-1 respectivamente (Cuadro 3).

Respecto a los resultados obtenidos con la CL50, estos fueron inferiores al obtenido por el CATIE (2006), al evaluar el aislamiento Colombiano Pc 013 de P. fumosoroseus sobre B. tabaci con una CL50 de 2.4x105 esporas ml-1. En otro ensayo Coollen (2005) al evaluar cinco suspensiones de esporas de P. fumosoroseus encontr una CL50 de 1.33x105 esporas ml-1 siendo ms alta que los del presente ensayo. Sin embargo, existen reportes de CL50 ligeramente inferiores a los obtenidos en este experimento, tales como los de Saito y Sugiyama (2005), quienes al evaluar aislamientos nativos y comerciales del Japn de P. fumosoroseus sobre B. tabaci, encontraron una CL50 de 1.1x104 esporas ml-1. En otro experimento similar con aislamientos Uruguayos, Dos santos y Pozo (2003) encontraron una CL50 de 1.31x104 esporas ml-1 del P. fumosoroseus sobre ninfas de B. tabaci. Tambin Castellanos et al., (2007) encontraron valores de CL50 de 1.1x103 y 2.5x104 esporas ml-1 de los aislamientos EH-503/3 y EH-503/3 de P. fumosoroseus sobre B. tabaci.

48 Cuadro 3. Concentracin letal media (CL50) de los aislamientos de P. fumosoroseus Aislamiento CL50 (Esporas ml-1) IC (Esporas ml-1) Pendiente Pr>f 4 4 4 Paesin 2.6 x 10 a 1.2x10 - 4.7x10 0.31 <0.0001 Paesin M1 1.4 x 105 b 9.4x104 - 2.1x105 0.36 <0.0001 5 5 5 Paesin M2 4.0 x 10 c 2.9x10 - 5.4x10 0.48 <0.0001 Pf-Tiz 3.5 x 105 c 2.0 x105 - 5.9x105 0.28 <0.0001 5 5 5 Pf-Tiz M1 3.2 x 10 c 2.3x10 - 4.3x10 0.48 <0.0001 Pf-Tiz M2 1.3 x 106 d 8.7x105 - 2.4x106 0.33 <0.0001 6 6 6 Pf-Hal 2.3 x 10 d 1.6x10 - 3.3x10 0.53 <0.0001 Pf-Hal M1 5.7 x 105 c 3.9x105 - 8.3x105 0.41 <0.0001 6 6 6 Pf-Hal M2 1.8 x 10 d 1.1x10 - 3.0x10 0.37 <0.0001 Pf-Rg 1.5 x 105 b 1.1x105 - 2.0x105 0.53 <0.0001 6 6 7 Pf-Rg M1 7.2 x 10 d 3.7x10 - 1.7x10 0.30 <0.0001 Pf-Rg M2 3.3 x 106 d 2.1x106 - 5.5x106 0.42 <0.0001 Pf-Tim 5.5 x 104 a 3.4x104 - 8.2x104 0.40 <0.0001 6 6 6 Pf-Tim M1 2.0 x 10 d 1.1x10 - 4.1x10 0.28 <0.0001 Pf-Tim M2 2.8 x 106 d 1.9x106 - 4.4x106 0.47 <0.0001 CL50=Concentracin letal medio, IC=intervalo de confianza. Valores con letras iguales son estadsticamente iguales segn el anlisis Probit.

6.3 Caracterizacin fisiolgica

6.3.1 Crecimiento diametral

Se observ diferencia estadstica significativa (P<0.05) (Cuadro 5A) en la tasa diaria de crecimiento diametral de los aislamientos evaluados (Cuadro 4). El aislamiento Pf-Rg mostr el mayor crecimiento diametral con 0.25 cm da-1 en comparacin a los aislamientos Pf-Tiz M2, Pf-Hal M1 y Pf-Rg M2 con 0.20 cm da-1 cada uno, al igual que al aislamiento Pf-Tiz con 0.21 cm da-1. Evaluaciones previas de crecimiento in vitro de P. fumosoroseus han mostrado valores similares de crecimiento diametral a los encontrados en este trabajo, por ejemplo, el CATIE (2006) reporta que el crecimiento diametral promedio de

49 diversas cepas nativas de P. fumosoroseus de Colombia y Costa Rica fueron del orden de 0.159 cm da-1.

Sin embargo, los resultados encontrados, difieren substancialmente de los reportados por Skrobek (2001), quien encontr un crecimiento de 0.36 cm da-1 en dos aislamientos de P. fumosoroseus sembrados en medio SDA. Aunque en tal experimento, la incubacin se realiz a 26 C, esta tasa alta de crecimiento diametral de la colonia, pudo deberse a que la incubacin se llev a cabo bajo un rgimen de oscuridad total. Se ha comprobado que la tasa de crecimiento diametral de la colonia est fuertemente influenciada por la temperatura, al respecto, Vidal et al., (1997) al evaluar la tasa de crecimiento radial de 37 aislamientos de P. fumosoroseus en medio sinttico, encontraron un rango de crecimiento de 0 a 0.5 cm da-1 bajo condiciones de temperaturas de 20 a 30 C.

6.3.2 Esporulacin

En cuanto a la esporulacin sobre medio de cultivo SDA, se observ una diferencia estadstica significativa (P<0.05) (Cuadro 6A) nicamente para el aislamiento Paesin con 4.55x106 esporas ml-1 en comparacin a los aislamientos Pf-Rg M2 y Pf-Tim M2 con 1.58x106 y 1.38x106 esporas ml-1 respectivamente.

Estos resultados fueron similares a los encontrados por Skrobek (2001) al medir la esporulacin del hongo P. fumosoroseus en medio de cultivo SDA encontrando valores que van de 2 a 3x10 6 esporas ml-1. Sin embargo la esporulacin en medios de cultivo sintticos es mucho menor que la obtenida con otros sustratos, comparado con la produccin masiva del hongo al

50 empleando arroz donde se pueden obtener esporulaciones que en promedio de 1x109 esporas g-1 (CATIE, 2006). Por lo que la esporulacin de un aislamiento, esta por los factores de crecimiento como la metodologa de extraccin de las esporas y sustratos empleados.

6.3.3 Tasa de germinacin

Se encontr una diferencia estadstica significativa para la tasa de germinacin por hora (P<0.05) (Cuadro 7) para el aislamiento Pf-Tiz con 33.1% respecto a los aislamientos Pf-Hal M2 (26.83%) y Pf-Hal M1 (25.58%). El resto de los tratamientos fueron estadsticamente iguales entre si. La tasa de germinacin de esporas de los aislamientos evaluados en este trabajo se considera alta. En otros trabajos, se ha documentado que se requieren hasta 24 horas para obtener 100% de germinacin de esporas (Vidal et al., 1997), comparado con los resultados presentados en este trabajo, que requirieron mximo 9 horas para lograr la germinacin total de las esporas.

La velocidad de crecimiento y germinacin de los hongos entomopatgenos ha sido asociada a su capacidad patognica (Heale et al., 1989; Estrada et al., 1997). Por lo que se esperara entonces que el Pf Rg que presento 92.18% de mortalidad en ninfas de B. tabaci se ha el que presente mayor TCD y TGH. Sin embargo Pf-Rg presento un TCD de 0.24 cm da-1 y 32.33% de TGH, dichos valores fueron estadsticamente iguales a los ms altos obtenidos por Pf-Rg M1 (0.25 cm das-1) en TCD y Pf-Tiz con la TGH ms alta de 33.16%, lo que pone en manifiesto lo citado por dichos autores.

51 Cuadro 4. Medias error estndar del desarrollo in vitro de los aislamientos P. fumosoroseus. Aislamiento TCD (cm da-1) Esporulacin (106 E. ml-1) TGH (% hora-1) Paesin 0.22 0.015 ab 4.55 0.36 a 30.24 3.08 abc Paesin M1 0.23 0.007 ab 2.87 0.40 abc 28.33 1.01 abc Paesin M2 0.22 0.006 ab 3.05 0.59 abc 30.16 1.54 abc Pf-Tiz 0.21 0.011 b 2.15 0.20 abc 33.16 0.09 a Pf-Tiz M1 0.23 0.006 ab 3.90 0.71 ab 28.41 0.55 abc Pf-Tiz M2 0.20 0.004 b 2.87 0.44 abc 29.83 0.55 abc Pf-Hal 0.22 0.015 ab 3.93 0.67 ab 29.58 0.34 abc Pf-Hal M1 0.20 0.005 b 2.51 0.26 abc 25.58 1.21 c Pf-Hal M2 0.22 0.000 ab 2.52 0.56 abc 26.83 1.69 bc Pf-Rg 0.24 0.004 ab 3.96 0.34 ab 32.33 0.52 ab Pf-Rg M1 0.25 0.004 a 3.26 0.72 abc 28.91 0.45 abc Pf-Rg M2 0.20 0.000 b 1.58 0.38 bc 30.41 0.92 abc Pf-Tim 0.22 0.007 ab 2.85 0.21 abc 29.16 0.95 abc Pf-Tim M1 0.23 0.006 ab 3.03 0.61 abc 30.33 0.30 abc Pf-Tim M2 0.20 0.009 b 1.38 0.25 c 32.00 0.36 ab Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05). TCD=Tasa de Crecimiento diario, TGH=Tasa de germinacin por hora.

52 6.4 Caracterizacin molecular

6.4.1 Produccin de biomasa

La siembra de los aislamientos en medio liquido Caldo Dextrosa Sabouraud permiti obtener entre 1 a 1.5 g de micelio filtrado, lo cual fue suficiente para la extraccin del ADN cromosmico de los aislamientos de P. fumosoroseus.

6.4.2 Extraccin y cuantificacin del ADN

La metodologa empleada permiti obtener ADN con el rendimiento y calidad suficiente para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Figura 3).

Figura 3. ADN cromosmico obtenido de los aislamientos de P. fumosoroseus. Carril 1) Marcador de peso molecular 1 kb Leader (Gibco, Lab), 2) PfTiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin.

53 6.4.3 Seleccin de iniciadores para la tcnica RAPD-PCR

Las amplificaciones se realizaron con el ADN de uno de los aislamientos (PfTim). Tomando como parmetros la presencia de bandas ms fuertes, ms definidas y con mayor numero, fueron seleccionados los iniciadores OPB 02, OPB 06, OPB 07, OPB 09 y OPB 10 para la caracterizacin molecular de los aislamientos (Figura 4).

Figura 4. Seleccin de iniciadores carril 1) Marcador de peso molecular 1 kb Leader (Gibco, Lab), 2) OPB 01, 3) OPB 02, 4) OPB 03, 5) OPB 04, 6) OPB 05 7) OPB 06, 8) OPB 07, 9) OPB 08, 10) OPB 09, 11) OPB 10.

54 6.4.4 Caracterizacin molecular

Los fragmentos amplificados mediante PCR empleando cinco iniciadores del kit OPB de Operon Technologies permitieron observar la huella gentica de los aislamientos evaluados, los cuales se muestran en las figuras #,#,#,#,#,#.

Figura #. Huella gentica del aislamiento Paesin empleando cinco iniciadores diferentes.

55

Figura #. Huella gentica del aislamiento Pf-Tiz empleando cinco iniciadores diferentes.

Figura #. Huella gentica del aislamiento Pf-Tim empleando cinco iniciadores diferentes.

56

Figura #. Huella gentica del aislamiento Pf-Rg empleando cinco iniciadores diferentes.

Figura #. Huella gentica del aislamiento Pf-Hal empleando cinco iniciadores diferentes.

57 De acuerdo a la matriz de similitud y al dendrograma se evidenci la formacin de dos grupos, el primero lo conforman todos los aislamientos de P. fumosoroseus con un promedio de similaridad interna de 68.2%. El promedio de similaridad es alto, lo que sugiere una baja variabilidad gentica entre los aislamientos de P. fumosoroseus. El segundo grupo esta formado por los dos aislamientos de referencia (Beauveria bassiana). La matriz de similitud indica que existe una relacin estrecha entre los aislamientos Pf-Tiz y Pf-Rg con un valor de 1.0, sin embargo, los aislamientos menos similares entre si fueron PfHal y Paesin con un valor de 0.38.

Cuadro 6. Matriz de similaridad gentica construida a partir de los fragmentos amplificados. Pf-Tiz Pf-Tiz Pf-Tim Pf-Rg Pf-Hal Paesin HBb 5 HBb 22 0.92308 1.00000 0.57143 0.53846 0.46667 0.40000 Pf-Tim Pf-Rg 0.92308 1.00000 0.92308 0.92308 0.53333 0.57143 0.61538 0.53846 0.43750 0.46667 0.37500 0.40000 Pf-Hal Paesin HBb 5 HBb 22 0.57143 0.53846 0.46667 0.40000 0.53333 0.61538 0.43750 0.37500 0.57143 0.53846 4.46667 0.40000 0.38462 0.42857 0.18750 0.38462 0.20000 0.13333 0.42857 0.20000 0.58333 0.18750 0.13333 0.58333

Figura 6. Dendrograma obtenido a partir de las amplificaciones de los cinco aislamientos de P. fumosoroseus y dos de B. bassiana.

58 Tigano-Milani et al. (1995) emplearon la tcnica de RAPD para analizar la variabilidad intra e interespecfica del gnero Paecilomyces, as como para realizar estudios epizootiolgicos de P. fumosoroseus. Una gran

heterogeneidad fue detectada entre los aislamientos de este hongo. A pesar de baja homogeneidad observada entre los aislamientos aislados de Bemisia tabaci, diferentes genotipos fueron identificados entre los aislados de poblaciones epizoticas de P. fumosoroseus en este insecto.

Azevedo et al. (2000) utilizaron RAPD para investigar la variabilidad molecular entre aislamientos de Paecilomyces y para identificar cinco aislamientos morfolgicamente atpicos, obtenidos de Bemisia tabaci, que posean alguna semejanza con P. fumosoroseus. La variabilidad observada en los productos de las amplificaciones fue suficiente para discriminar todos los aislamientos. La similaridad gentica entre los aislamientos no identificados y los de P. fumosoroseus fue mayor que aquella observada entre los aislamientos de referencia de esta especie.

Debido al valor de los hongos entomopatgenos como agentes de control biolgico, la caracterizacin molecular de estos microorganismos por medio de su huella gentica es de suma importancia para el reconocimiento de la especie, cuando esta no esta bien definida, as como para la proteccin y patente de las cepas caracterizadas, en el momento que se han desarrollados como productos formulados (bioplaguicidas) y se han distribuidos para su uso en el manejo de plagas agrcolas.

59 VII. CONCLUSIONES

El uso de hongos entomopatgenos para el manejo integrado de plagas de importancia agrcola como la mosquita blanca ha evolucionado notablemente, hasta el punto de encontrar formulaciones comerciales ha base de estos microorganismos. Sin embargo, es indispensable la caracterizacin molecular, fisiolgica y patognica de estos microorganismos antes de ser empleados como una alternativa de manejo. De los resultados obtenidos del presente trabajo sobre la caracterizacin fisiolgica y molecular de Paecilomyces fumosoroseus y su actividad patognica en estados inmaduros de Bemisia tabaci, se concluye lo siguiente:

Los aislamientos evaluados presentaron efecto ovicida sobre huevos de B. tabaci, los aislamientos con mayor actividad fueron Paesin y el aislamiento monosprico M1 de Pf-Hal, estos aislamientos son promisorios para el control preemergente de las ninfas de B. tabaci.

Todos los aislamientos evaluados a una concentracin de 1x107 esporas ml-1 fueron patognicos en ninfas del primer instar de B. tabaci. De acuerdo al porcentaje de mortalidad acumulada los aislamientos ms patognicos fueron Pf-Rg, Pf-Tim y Paesin junto con sus dos cultivos monospricos. Estos aislamientos se pueden considerar como posibles agentes biocontroladores de las poblaciones B. tabaci en cultivos agrcolas.

60 Los resultados obtenidos de acuerdo a los parmetros de tiempo letal medio (TL50) y concentracin letal media (CL50) reafirmar la efectividad patognica que tienen los aislamientos Paesin y Pf- Tim sobre ninfas de Bemisia tabaci.

La velocidad de crecimiento diametral fue estadsticamente igual entre los aislamientos evaluados, excepto para Pf-Tiz, Pf-Tiz M2, Pf-Hal M1, Pf-Rg M2 y Pf-Tim M2. La esporulacin fue aceptable para todos los aislamientos con una produccin mayor de 2x106 esporas ml-1, excepto para los aislamientos monospricos M2 de Pf-Rg y Pf-Tim. La viabilidad de los aislamientos expresado en porcentaje de germinacin por hora fue elevada con un promedio de 25.5%. La caracterizacin fisiolgica de P. fumosoroseus permite identificar variabilidad entre estos aislamientos y seleccionar los aislamientos con caractersticas adaptativas que

favorezcan su supervivencia y eficacia como micoinsecticidas.

El uso de los iniciadores RAPDs evaluados permiti diferenciar los cinco aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus de los dos aislamientos de referencia (Beauveria bassiana). Sin embargo se observ una baja variabilidad gentica entre los aislamientos de P. fumosoroseus.

Las huellas genticas obtenidas con la tcnica RAPD-PCR son una herramienta til en la proteccin y patente de los aislamientos. Ya que estas cepas tienen la finalidad de que en un futuro se han desarrollados como bioplaguicida para el manejo integrado de B. tabaci en zonas agrcolas.

61 VIII. LITERATURA CITADA

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70 IX. APNDICE

Cuadro 1A. Anlisis de varianza de la mortalidad acumulada en huevos de B. tabaci a los 7 das despus de la inoculacin de una suspensin de de 1x10-7 esporas ml-1 de P. fumosoroseus. F.V. Aislamientos Error Total DMS=4.5764 G.L. 15 48 63 S.C. 12792.00 3730.30 16523.00 C.M. 852.82 77.71 F.Cal. 10.97 Pr > F 0.0001

Cuadro 2A. Anlisis de varianza de la mortalidad acumulada en ninfas del primer instar de B. tabaci a los 12 das despus de la inoculacin de una suspensin de 1x10-7 esporas ml-1 de P. fumosoroseus. F.V. Aislamientos Error Total DMS=4.6627 G.L. 15 48 63 S.C. 19029 3872.10 22901 C.M. 1268.2 80.668 F.Cal. 15.72 Pr > F 0.0001

Cuadro 3A. Anlisis de varianza de la tasa de crecimiento diario de la colonia de los aislamientos de P. fumosoroseus. F.V. Aislamientos Error Total DMS=0.0085362 G.L. 14 45 59 S.C. 0.015093 0.012125 0.027218 C.M. 0.0010781 0.0002694 F.Cal. 4.00 Pr > F 0.0002

71 Cuadro 4A. Anlisis de varianza de la esporulacin de los aislamientos de P. fumosoroseus. F.V. Aislamientos Error Total DSM=0.504491 G.L. 14 45 59 S.C. 43.6649 42.3504 86.0153 C.M. 3.1189 0.9411 F.Cal. 3.31 Pr > F 0.0011

Cuadro 5A. Anlisis de varianza del porcentaje de germinacin por hora de los aislamientos de P. fumosoroseus. F.V. Aislamientos Error Total DMS=1.214377 G.L. 14 45 59 S.C. 221.133 245.387 466.520 C.M. 15.795 5.453 F.Cal. 2.90 Pr > F 0.0034