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INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CONKAL, YUCATÁN.
CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA Y MOLECULAR DE Paecilomyces fumosoroseus (WIZE) BROWN & SMITH Y SU PATOGENICIDAD EN ESTADIOS INMADUROS DE Bemisia tabaci (GENNADIUS)

Tesis que presenta:

Ing. WILBERTH CHAN CUPUL

Como requisito parcial para obtener el grado de: MAESTRO EN CIENCIAS EN HORTICULTURA TROPICAL

Conkal, Yucatán, México Agosto 2009

2 CONTENIDO Página I II II IV 1 2 3 5 5 6 7 7 8 9 9 10 11 12 14 16 17 20 23 24 24 24 25 25 25 26 26 28 28 29 29 30 31 31 31 32 32

ÍNDICE DE CUADROS ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE CUADROS DEL APÉNDICE INDICE DE FIGURAS DEL APÉNDICE RESUMEN SUMMARY I. INTRODUCCIÓN II. REVISIÓN DE LITERATURA 2.1. Generalidades de Bemisia tabaci 2.1.1. Clasificación taxonómica 2.1.2. Distribución geográfica 2.1.3. Ciclo de vida 2.1.4. Daños ocasionados 2.1.5. Métodos de control 2.1.5.1. Resistencia vegetal 2.1.5.2. Control cultural 2.1.5.3. Control químico 2.1.5.4. Control biológico 2.2. Mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos 2.2.1. Características de Paecilomyces fumosoroseus 2.2.2. Antecedentes del uso de P. fumosoroseus contra B. tabaci Antecedentes de la caracterización molecular de P. 2.3 fumosoroseus III. HIPÓTESIS IV. OBJETIVOS 4.1 General 4.2 Específicos V. MATERIALES Y METODOS 5.1. Localización 5.2. Cría de B. tabaci 5.3. Plantas hospederas de para bioensayos 5.4. Reactivación de los aislamientos 5.5. Obtención de cultivos monospóricos 5.6. Bioensayos de patogenicidad 5.6.1 Obtención de estados inmaduros de B. tabaci 5.6.2 Obtención de la suspensión de esporas 5.6.3. Bioensayos de patogenicidad en inmaduros de B. tabaci 5.6.4. Diseño experimental y análisis de datos 5.7. Caracterización fisiológica 5.7.1. Crecimiento diametral 5.7.2. Esporulación 5.7.3. Porcentaje de germinación

3 5.7.4. Diseño experimental y análisis de datos Caracterización molecular mediante RAPD-PCR 5.8.1. Obtención del micelio 5.8.2. Extracción de ADN 5.8.3. Cuantificación de ADN 5.8.4. Aplicación de la técnica RAPD-PCR 5.8.5. Análisis estadístico VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1. Patogenicidad en huevos de B. tabaci 6.2. Patogenicidad en ninfas de B. tabaci 6.2.1. Tiempo letal medio (TL50) 6.2.2. Concentración letal media (CL50) 6.3. Caracterización fisiológica 6.3.1. Crecimiento diametral 6.3.2. Esporulación 6.3.3. Tasa de germinación 6.4 Caracterización molecular 6.4.1. Extracción y cuantificación del ADN 6.4.2. Selección de iniciadores RAPD 6.4.3. Análisis RAPD-PCR VII. CONCLUSIONES VIII. LITERATURA CITADA IX. APÉNDICE 5.8. 33 33 34 34 35 36 37 38 38 40 42 43 45 45 46 47 49 49 50 51 56 58 67

4 ÍNDICE DE CUADROS Página Cuadro 1. Nomenclatura de los aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus. Tiempo letal medio en ninfas de B. tabaci por efecto del hongo P. fumosoroseus al aplicar una suspensión de 1x107 esporas ml-1. Concentración letal media (CL50) de los aislamientos de P. fumosoroseus. Medias  error estándar del desarrollo in vitro de los aislamientos P. fumosoroseus. Secuencia y número de fragmentos amplificados por los iniciadores evaluados. Matriz de similaridad genética construida a partir de los perfiles RAPD a través del coeficiente Jaccard. 27

Cuadro 2.

43

Cuadro 3.

45

Cuadro 4

48

Cuadro 5

50

Cuadro 6

54

I

5 ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Mortalidad en huevos de Bemisia tabaci por efecto de la aplicación de una suspensión de 1x107 esporas ml-1 del hongo Paecilomyces fumosoroseus (24 ± 3 °C, 72 ± 5% HR, 16L: 8O). Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05). Mortalidad en ninfas del 1er instar de Bemisia tabaci por efecto de la aplicación de una suspensión de 1x10 7 esporas ml-1 de Paecilomyces fumosoroseus (24 ± 3 °C, 72 ± 5% HR, 16L: 8O). Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05). Cuantificación de ADN genómico de aislamientos polispóricos de Paecilomyces fumosoroseus. Carriles 1) Marcador de peso molecular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Selección de iniciadores empleando el aislamiento Pf-Tim (Monospórico M1) de Paecilomyces fumosoroseus. 1) Marcador de peso molecular 1 kb, 2) OPB 01, 3) OPB 02, 4) OPB 03, 5) OPB 04, 6) OPB 05 7) OPB 06, 8) OPB 07, 9) OPB 08, 10) OPB 09, 11) OPB 10. Perfil RAPD de cinco aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus obtenido con el primer OPB 10. 1) Marcador de peso molécular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Dendrograma obtenido a partir de los perfiles RAPD de cinco aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus y dos de Beauveria bassiana. 39

Figura 2.

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Figura 3.

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Figura 4.

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Figura 5

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Figura 6

55

II

6 ÍNDICE DE CUADROS DEL APÉNDICE Página Cuadro 1A. Análisis de varianza de la mortalidad acumulada en huevos de B. tabaci a los 7 días después de la inoculación de una suspensión de de 1x10 -7 esporas ml-1 de P. fumosoroseus. Análisis de varianza de la mortalidad acumulada en ninfas del primer instar de B. tabaci a los 12 días después de la inoculación de una suspensión de 1x10 7 esporas ml-1 de P. fumosoroseus. Análisis de varianza de la tasa de crecimiento diario de la colonia de los aislamientos de P. fumosoroseus. Análisis de varianza de la esporulación de los aislamientos de P. fumosoroseus Análisis de varianza del porcentaje de germinación por hora de los aislamientos de P. fumosoroseus. 67

Cuadro 2A.

67

Cuadro 3A.

67

Cuadro 4A.

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Cuadro 5A.

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III

7 ÍNDICE DE FIGURAS DEL APÉNDICE Página Figura 1A. Perfil RAPD de los aislamientos polispóricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 02. 1) Marcador de peso molécular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal, 6) Paesin, 7) HBb5 y 8) HBb22. Perfil RAPD de los aislamientos polispóricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 06. 1) Marcador de peso molécular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Perfil RAPD de los aislamientos polispóricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 07. 1) Marcador de peso molécular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. Perfil RAPD de los aislamientos polispóricos de P. fumosoroseus con el iniciador OPB 09. 1) Marcador de peso molécular 1 kb, 2) Pf-Tiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin. 68

Figura 2A.

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Figura 3A.

69

Figura 4A.

70

IV

8 RESUMEN

El uso de insecticidas químicos en el manejo de Bemisia tabaci ocasiona serios daños al ambiente y la selección de poblaciones resistentes. Una alternativa promisoria es el biocontrol mediante hongos entomopatógenos. En el presente estudio se evaluó la patogenicidad de Paecilomyces fumosoroseus en huevos y ninfas del 1er instar de Bemisia tabaci y se caracterizaron fisiológica y molecularmente los aislamientos evaluados. La patogenicidad se evaluó por inmersión de hojas que contenían inmaduros de B. tabaci en soluciones de 1x104 a 1x107 esporas ml-1. La caracterización fisiológica se evaluó mediante la tasa de crecimiento diario del diámetro de la colonia (TCD), esporulación y la tasa de germinación de esporas (TGE). La caracterización molecular se realizó mediante el uso de marcadores moleculares RAPDs. La mortalidad en huevos por efecto del hongo osciló entre 21.2 y 61.9%. Los aislamientos más patogénicos en ninfas con menor concentración letal media (CL50) fueron Paesin y Pf-Tim con 2.6x104 y 5.5x104 E. ml-1. El Tiempo letal medio (TL50) más bajo lo obtuvo Paesin con 3.7 días. El aislamiento Pf-Rg mostró la mayor TCD con 0.25 cm día-1, Paesin presentó la esporulación más alta con 4.5x10 6 E. ml-1. La TGE fue mayor en Pf-Tiz con 33.1% hora-1. Las huellas genéticas y el árbol filogenético evidenciaron la agrupación de los aislamientos de P. fumosoroseus en un solo grupo, fuera del grupo de los empleado (Beauveria bassiana) con un promedio se similaridad interna de 68.2%, lo que demuestra una baja variabilidad genética entre los aislamientos evaluados.

9 SUMARY

The use of chemical insecticides for the control of Bemisia tabaci has caused several damage at environmental and selection of resistant populations. A promising alternative is the biocontrol by entomopathogenic fungi. In the present study was evaluated the pathogenicity of Paecilomyces fumosoroseus on eggs and first ínstar nymphs of Bemisia tabaci and the physiology and molecular characterization of the isolates tested. The bioassay of pathogenicity was realized by leaves immersion that contained the inmature´s whiteflies inside of four solutions of spores (1x104-1x107 spores per ml). The physiology characterization was tested by means the rate of daily grow of colony diameter (RGCD), sporulation and the rate of spore germination (RSG). The molecular characterization was realized using molecular markers RAPDs. The mortality eggs by fungi’s effect oscillated between 21.2 to 61.9 percent. The isolates highest pathogenic in nymphs with less lethal concentration (LC50) were Paesin and Pf-Tim with 2.6x104 y 5.5x104 spores per ml. Paesin obtained the less lethal time (LT50) with 3.7 days. In the physiology characterization, Pf-Rg showed the highest RGCD with 0.25 centimeters per day, Paesin presented the highest sporulation with 4.5x106 spores per ml. The RSG was highest in Pf-Tiz with 33.1% per hour. The fingerprinting and the phylogenetic tree showed to grouping of P. fumosoroseus isolates outside of control group used (Beauveria bassiana) with an internal similarity average of 68.2 percent, this study showed a low genetic variability between the isolates tested.

10 I. INTRODUCCIÓN

La mosquita blanca Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) es una plaga polífaga que afecta el desarrollo de numerosos cultivos en regiones tropicales y subtropicales del mundo (Gómez et al., 2007). En México es la especie más común e importante en términos económicos que limita la producción de cultivos hortícolas y ornamentales (Sotero et al., 2007), debido a los daños que ocasiona de manera directa con la extracción de savia y debilitamiento de las plantas e indirectas como las fumaginas, alteraciones fitotóxicas y transmisión de enfermedades de etiología viral (Brown, 1994; Perring, 1996; Marcano, 2001).

Actualmente los insecticidas químicos son el método de control más utilizado en el combate de esta plaga, cuyo costo varía de acuerdo al nivel de toxicidad, siendo los más baratos los más utilizados por los agricultores. Esta actividad ejerce efectos adversos en la salud del hombre, el medio ambiente y genera poblaciones de insectos altamente resistentes a estos insecticidas (Palumbo et al., 2001). Por lo tanto, en la última década se ha incrementado el interés por el uso de métodos alternativos de control compatibles con el hombre y el ambiente.

El uso de hongos entomopatógenos para el control biológico de Bemisia tabaci constituye una alternativa promisoria debido a que estos microorganismos causan epizootias que juegan un papel importante en la regulación de poblaciones de insectos y no son nocivos hacia organismos benéficos (Torres et al., 1993; Vargas, 2003).

11 Al menos 20 especies de hongos entomopatógenos parasitan a mosquitas blancas, entre ellos destacan los géneros Beauveria, Verticillium, Aschersonia y Paecilomyces. Sin embargo, Paecilomyces sp. es el genero de mayor importancia de estudio para insectos homópteros como lo es Bemisia tabaci, destacando dentro de este genero la especie Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown and Smith (Dos Santos y Pozo, 2003; Pucheta et al., 2006).

Debido a su diversidad genética el hongo Paecilomyces fumosoroseus (Deuteromycotina: Hyphomycetes) esta ampliamente distribuido por todo el mundo, puede encontrarse en el suelo e infectando a diversos insectos de numerosos ordenes (Smith, 1993). Se han reportado variaciones entre los diferentes aislamientos de P. fumosoroseus ya que algunos presentan mayor especificidad y eficiencia a ciertas especies de insectos por lo que es importante evaluar los diferentes aislamientos basándose en criterios moleculares (Tigano-Milani et al., 1995; Azevedo et al., 2000; Oborník et al., 2000; Fargues et al., 2002; Delleau-Cloudet et al., 2005; Gauthier et al., 2007).

Por lo que el objetivo de este trabajo fue evaluar la patogenicidad de aislamientos del hongo entomopatógeno Paecilomyces fumosoroseus sobre estados inmaduros de Bemisia tabaci, así como caracterizar fisiológica y molecularmente los aislamientos con la perspectiva a largo plazo de establecer una alternativa más para el control biológico de esta plaga en regiones tropicales.

12 II. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Generalidades de Bemisia tabaci

Las mosquitas blancas son insectos diminutos, raramente de más de 2-3 mm de longitud, los adultos de ambos sexos son alados, pertenecen a la familia Aleyrodidae, que se divide en 2 subfamilias: Aleurodicinae y Aleyrodinae (Alean, 2003). La subfamilia Aleurodicinae es considerada la más primitiva, sus individuos se caracterizan por la presencia de secreciones de cera en forma de filamentos dorsales o algodonosas. La subfamilia Aleyrodinae es la más evolucionada, sus ninfas se caracterizan por presentar secreciones largas y dorsales; de color transparente, amarillo o negro y se alimentan principalmente de plantas herbáceas, comprende más de 1,000 especies descritas y es la más ampliamente distribuida con diecisiete géneros destacando los siguientes tres: Bemisia, Aleurocanthus y Aleurotrachelus (Caballero, 1992; Castillo 1996).

El genero Bemisia comprende 37 especies reconocidas entre las cuales la más destacada es Bemisia tabaci por ser cosmopolita y polífaga, capas de atacar a más de 500 especies y variedades de cultivos (Callejas y Ochando, 2005). Su distribución mundial parece estar relacionada con la implementación de los monocultivos, sus diferentes prácticas agrícolas y por tener una amplia plasticidad en diferentes hospedantes (Horowitz et al., 2003). Se conocen aproximadamente 24 biotipos relacionadas principalmente con hospedantes y regiones geográficas especificas, los cuales se han identificado y caracterizado de diferente manera (Zhang et al., 2005), por lo que muchos autores coinciden en que Bemisia tabaci representa un complejo de biotipos dentro del genero Bemisia (Muñiz, 2000; Perring, 2001).

13 2.1.1 Clasificación taxonómica

La clasificación de la familia Aleyrodidae está basada en la estructura de la exuvia pupal del cuarto ínstar ninfal y no de las estructuras morfológicas de los adultos (Mound y Halsey, 1978; Byrne y Bellows, 1991; Arcos, 2005).

Reino: Animal División: Exopterygota Clase: Insecta Orden: Hemíptera Suborden: Homóptera Familia: Aleyrodidae Género: Bemisia Especie: tabaci (Gennadius)

Sinonimias: Aleurodes tabaci (Gennadius), Bemisia goldingi (Corbertt), Bemisia gossypiperda (Masra Lamba), B. longispina (Priesner Hosny); B. nigeriensis (Corbertt) (Arcos, 2005)

2.1.2 Distribución geográfica

El Oriente y la India se han considerado como el centro de origen de Bemisia tabaci, de donde fue dispersada por el hombre hacia al continente Americano y Africano. Actualmente se encuentra afectando diversos cultivos en todas las regiones tropicales y subtropicales del mundo. No obstante en las últimas dos

14 décadas, Bemisia tabaci ha invadido todos los continentes con excepción de la Antártica (Naranjo et al., 2002). En México se ha reportado como plaga de importancia económica en Guanajuato, Veracruz, Baja California Sur, Sonora, Michoacán, Chiapas, Durango, Coahuila, Oaxaca, Sinaloa, San Luís Potosí, Tamaulipas y Yucatán, (Díaz y Ramírez, 1993; Soria et al., 1996).

2.1.3 Ciclo de vida

Es un insecto chupador que se localizan en el envés de las hojas de sus hospedantes, presentan metamorfosis incompleta; es decir su ciclo biológico incluye una etapa de huevo, cuatro estados ninfales y el adulto (Bautista et al., 2002; Bautista, 2006). Según Saunders et al., (1998) los huevos de B. tabaci comprenden un periodo de 5 a 10 días para pasar al estado ninfal y son depositados en forma individual o en grupos. El número máximo de huevos que puede ovipositar una hembra varía de 48 a 500 según la especie, las condiciones ambientales y la planta hospedante.

El estado ninfal presenta cuatro instares de los cuales solo el primero es móvil gracias a la presencia de patas bien desarrolladas, el cual es conocido como “gateador” (Carabali, 2004). Posteriormente pasa por otras tres instares de desarrollo, en cada caso de mayor tamaño, hasta transformarse en adulto o mosquita este periodo comprende de 12 a 28 días, dependiendo de las condiciones y planta hospedera en donde se desarrolle (Saunders et al., 1998; Bautista, 2006). El adulto, recién emergido, es de color amarillo pálido y sus alas son ligeramente transparentes, aunque luego adquieren un color blanco debido al polvo ceroso que las cubre. Diez horas después de la emergencia, los machos adultos están aptos para iniciar el cortejo. Copulan varias veces y las hembras presentan mayor longevidad que los machos (Bautista et al., 2002).

15 2.1.4 Daños ocasionados

El tipo de daño varia según la raza o biotipo, cuando el número de ninfas y adultos son altos causan daño directo, por su alimentación mediante la extracción de savia provocando el debilitamiento de las plantas, a su vez causan daños indirectos secretando sustancias azucaradas que favorecen el desarrollo de hongos como Capnodium spp. causantes de fumaginas, los cuales tienen un efecto adverso en la fotosíntesis, al impedir la llegada de luz a la superficie foliar (CIAT, 1986; Marcano, 2001). Otro de los daños poco conocidos de Bemisia tabaci son las alteraciones fitotóxicas o síndromes en cucurbitáceas, como el tomate, brócoli y lechuga (Perring, 1996).

Sin embargo, en la actualidad el mayor daño indirecto de Bemisia tabaci es ser el vector transmisor de por lo menos 100 virus de tipo geminivirus carlavirus, luteovirus, nepovirus, potyvirus y closterovirus (Brown, 1994). Por la vasta gama de cultivos hortícolas que afecta y al daño que ocasiona de forma directa como indirecta, siendo la causante de grandes perdidas económicas es considerando como unas de las principales plagas del siglo XXI (Antonio et al., 2001).

2.1.5 Métodos de control

Un buen control de las poblaciones de Bemisia tabaci se logra con un programa adecuado de manejo integrado, que implica la aplicación oportuna de diversos métodos de control, entre las tácticas más empleadas se encuentran la resistencia vegetal, control cultural, control químico, control biológico y el control microbiano.

16 2.1.5.1 Resistencia vegetal. Es un método que puede ser explotado por presentar un gran potencial como estrategia de manejo en un programa integrado (McAuslane, 1996). La resistencia de las plantas a insectos puede utilizarse en diversos cultivos. Varias características de las plantas pueden conferirle resistencia, tales como composición nutrimental del follaje, forma de las hojas, el número y distribución espacial de tricomas, pH, concentración de taninos y fenoles (Castro, 2006).

Uno de los casos mas exitosos de resistencia vegetal a moscas blancas son los estudios realizados por el CIAT en el cultivo de yuca evaluando por más de dos décadas la resistencia a la mosquita blanca Aleurotrachelus socialis Bondar en más de 6,000 variedades de Yuca. Demostrado que los clones MECU 72, MECU 64, MPER 335 y MPER 317 han manifestado de manera consistente un alto nivel de resistencia (Vargas et al., 2002).

Con respecto a B. tabaci se ha encontrado resistencia vegetal en cultivares de algodón como el BRS Aroeira, BRS Verde, BRS Ita 90-2 y BRS Ipe (Castro, 2006). En otro trabajo de resistencia vegetal Toscano et al., (2002) evaluaron genotipos silvestres de Lycopersicon spp encontrando un alto nivel de antibiosis en los genotipos L y c o p e r s i c o n pennellii (LA 716) y Lycopersicon

hirsutum f. glabratum (PI 134417). Sin embargo para llegar a obtener resultados como estos es necesario de una estricta disciplina y un largo periodo de estudios científicos para obtener resultados similares para cada cultivo susceptible.

2.1.5.2 Control cultural. El uso de plantas o cultivos secundarios asociados a uno o más cultivos primarios como barrera o trampa y las coberturas vivas para el combate de una plaga en del marco del manejo integrado de plagas (MIP) se ubican dentro del combate ejercido como prácticas culturales (Salas, 2004). El

17 cual consiste en la manipulación deliberada del ambiente para hacerlo menos favorable a las plagas, con el fin de interrumpir sus ciclos reproductivos, reducir la disponibilidad de alimentos y favorecer la multiplicación de sus enemigos naturales (Metcalf y Luckmann 1975).

El uso de plantas o cultivos en varias modalidades (asociado, barrera, intercalado y trampa, entre otros) como prácticas agrícolas para combatir diferentes plagas ha sido informado por varios investigadores (Gutiérrez 1999, Smith y McSorley 2000). Sin embargo, hasta ahora las evaluadas han incluido fechas de siembra y veda, eliminación de malezas, destrucción de residuos de cultivos, semilleros protegidos, cubiertas flotantes, alta densidad de siembra, barreras vivas, coberturas al suelo, cultivos asociados y riego por aspersión (Hilje 2000, Hilje et al. 2001).

2.1.5.3 Control químico. Durante las dos últimas décadas nuevos insecticidas químicos han sido introducidos ofreciendo una diversidad de modos de acción y rutas de actividad. Entre estos productos los más empleados son los nicotinoides como el imidacloprid, tiamethoxan, thiacloprid y pymetrozine. En lo que se refiere a las reguladores de crecimiento los más concurridos son el pyriproxyfen y buprofezin (Gutiérrez et al., 2007; Sotero et al., 2007). Aunque los nuevos atributos bioquímicos y las actividades biológicas de estos insecticidas los han hecho efectivos, su uso intensivo ha ocasionado pérdida de la susceptibilidad sobre este insecto (Palumbo et al., 2001), como la ha documentado Erdogan et al. (2008) quienes encontraron altos niveles de resistencia en B. tabaci a insecticidas Piretroides, organoclorados y reguladores de crecimiento.

18 2.1.5.4 Control biológico. Se han identificado diversas especies de parasitoides, depredadores y hongos entomopatógenos para B. tabaci. Los parasitoides están representados por dos géneros de la familia Aphelinidae (Encarsia y Eretmocerus) y uno de la familia Platygasteridae (Amitus) (Vázquez, 2002). Aunque la mayoria de las referencias sobre la actividad de los parasitoides no atribuyen la capacidad de regular satisfactoriamente las poblaciones de B. tabaci, varios informes reflejan su potencial en programas donde se combinen la conservación y otras tácticas de manejo. Así, Serrano et al. (1996) observaron en áreas de policultivos en el salvador tasas de reducción poblacional de B. tabaci de hasta el 80% en fríjol y el 60% en tomate, básicamente por Encarsia y Eretmocerus.

Los depredadores son más diversos, ubicados básicamente en los órdenes Neuroptera, Coleoptera, Hemiptera y Diptera de la clase insecta (Vázquez, 2002). Los cuatro agentes mas comunes y comercialmente producidos para el control biológico de moscas blancas son Macrolophus caliginosus Wagner (Hemiptera: Miridae), Dicyphus tamaninii Wagner (Hemiptera: Miridae), Delphastus pusillus (LeConde) (Coleoptera: Coccinellidae) y Delphastus hesperus (Coleoptera: Coccinellidae) (Coollen, 2005) Los adultos y ninfas de M. caliginosus son efectivos para suprimir las poblaciones de B. tabaci (Jakobsen et al., 2002).

Los hongos entomopatógenos son considerados como los patógenos más promisorios contra B. tabaci, ya que pueden infectar a los insectos directamente a través de la penetración de su cutícula. Así como sus múltiples mecanismos de acción que les confiere una alta capacidad para evitar que el hospedero desarrolle resistencia (Alean, 2003). Las especies más comunes como controladores de las mosquitas blancas son los hongos Deureromycetes: Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown & Smith, Verticillium lecanii (Zímm.)

19 Viegas, Aschersonia aleyrodis Webber y Beauveria bassiana (Bálsamo) Vuillemin (Fransen, 1990; Lacey et al., 1999; Ayhan y Kubilay, 2005).

Por ejemplo en Dominicana McGuirre (1995) informó de un hongo que controla a la mosquita blanca B. tabaci durante la estación de lluvia. Mendoza et al. (1995) refirieron que en la zona central del litoral ecuatoriano colectaron dos especies de hongos entomopatógenos y se han registrado hasta un 95% de mortalidad en adultos de B. tabaci por efecto de estos microorganismos. Igualmente Serrano et al., (1995) hallaron en el Salvador una epizootia intensa de Paecilomyces spp., que consideraron muy agresiva sobre poblaciones de B. tabaci, especialmente en adultos. Serra et al. (1996) evaluó la eficacia de aislamientos importantes y nativos de hongos entomopatógenos en

ornamentales y cultivos hortícolas severamente afectados por B. tabaci, encontrando porcentajes de control superiores al 50% con el hongo P. fumosoroseus.

2.2 Mecanismo de acción de los hongos entomopatógenos.

Los hongos entomopatógenos inician su proceso infectivo en los insectos hospederos cuando las esporas viables son retenidas por contacto en la superficie cuticular del insecto, mientras encuentran un espacio propicio para establecer la asociación patógeno-hospedero y formar los túmulos germinales y el apresorio, que facilitarán la invasión del hongo. Se ha sugerido que iones divalentes como el Ca+2 y el Mg+2 reducen las fuerzas de repulsión electrostática de la superficie cuticular del insecto, por lo que pueden afectar su hidrofobicidad y promover la adhesión pared celular fúngica-cutícula, creando condiciones favorables para el establecimiento de la espora y la subsecuente invasión del hospedero (Tanada y Kaya, 1993; Pucheta et al., 2006).

20 La germinación de la espora se inicia con el hinchamiento de la misma, que es favorecido por una humedad alta alrededor del 70% durante aproximadamente 14 horas. La germinación es disparada por mensajeros que generalmente son carbohidratos presentes en las proteínas cuticulares del insecto. La hidratación de la espora es favorecida por la acción antidesecante de su cubierta mucilaginosa, que además funciona como protector ante la presencia de polifenoles tóxicos y enzimas, secretadas por sistema inmune del insecto (Pucheta et al., 2006).

Al germinar la espora da lugar a la formación de un tubo germinativo mediante el proceso de polarización típico del crecimiento apical de los hongos produciendo un apresorio (Tanada y Kaya 1993). El tubo germinativo rastrea y reconoce la superficie del insecto para la localización de sitios receptores, habilitando a la hifa para la penetración de la cutícula (Wessels, 1999). El apresorio sirve para el anclaje de la espora y ejerce una presión hacia el interior del insecto. Paralelamente, el hongo excreta una gran cantidad de enzimas entre las que se incluyen proteasas, quitinasas, quitobiasas, lipasas, lipooxigenasas y otras enzimas hidrolíticas, que van degradando la cutícula y proporcionan a su vez nutrientes al hongo (Monzón, 2001).

Una vez dentro del insecto, el hongo prolifera formando cuerpos hifales secundarios, que se ramifican en la procutícula conformada principalmente de fibrillas lameladas. Posteriormente, los cuerpos hifales se encuentran con la capa epidérmica y con su respectiva membrana basal y se diseminan a través del hemocele (Deshpande, 1999). Así invaden diversas estructuras como tejidos musculares, cuerpos grasos, tubos de Malpighi, mitocondrias, retículo endoplásmico y membrana nuclear agotando los nutrientes debido al crecimiento del hongo de tal modo que el hospedero muere por inanición, destrucción de órganos internos y liberación de toxinas. Finalmente la hifas

21 penetran de adentro hacia fuera y emergen a la superficie iniciando la formación de esporas cuando las condiciones ambientales son adecuadas (Gillespie y Claydon, 1989; Pucheta et al., 2006).

2.2.1 Características de Paecilomyces fumosoroseus

El género Paecilomyces spp presenta hifas hialinas a amarillosas, septadas, de paredes delgadas. La mayoría presenta ramificaciones verticiladas o

irregularmente ramificadas, llevan en su parte terminal en cada rama grupos de fiálides, las cuales pueden ser solitarias. Las fiálides constan de una porción basal cilíndrica o hinchada, adelgazándose abruptamente a menudo para formar un cuello muy notorio. Los conidióforos llevan cadenas de conidias; éstas son hialinas, unicelulares y de forma ovoide (Bustillo, 2001).

Este género tiene dos subdivisiones Paecilomyces e Isarioidea. La primera división se caracterizan por no ser entomopatógenos y telómórficos, mientras que la división Isarioidea se caracterizada por ser entomopatógenos y telómórficos. Dentro de la división Isarioidea existen cinco especies con potencial biocontrolador de plagas, estas son: P. fumosoroseus, P. lilacinus, P. farinosus, P. amoenoroseus y P. javanicus. (Humber, 1998). El hongo Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown y Smith es un entomopatógeno de un amplio rango de hospederos y distribución geográfica, ha sido aislado del suelo y de insectos de diversas familias (Dos santos y Poso, 2003). Crece con micelio blanco, las conidias son menores a 3.5 μm, el color de la colonia puede ser rosado-gris, rosado-oscuro, gris y el reverso de la colonia cultivada in vitro es amarilla (Humber, 1998). Las infecciones causadas por P. fumosoroseus se reconocen por el color rosado pálido (Bustillo, 2001).

22 2.2.2 Antecedentes del uso de P. fumosoroseus contra B. tabaci

En la selección de aislamientos con mayor actividad biocontroladora de Bemisia tabaci el CATIE (2003) realizo evaluaciones en Colombia y Costa Rica de diversos hongos entomopatógenos. Las evaluaciones a los 6 días después de la inoculación arrojaron porcentajes bajos de control (<25%) para la mayoría de los aislamientos evaluados, con excepción del aislamiento Pc015c1 de Paecilomyces fumosoroseus que alcanzó 46.3 %. Los porcentaje de mortalidad fueron mucho mayores a los 13 días alcanzando hasta un 90 % de control con el aislamiento Pc007 de Paecilomyces fumosoroseus en Colombia y porcentajes de 80.6 a 87.7% para los aislamientos 485 y 486 ambos de P. fumosoroseus de Costa Rica.

Skrobek (2001) evalúo el potencial biocontrolador de 10 aislamientos de los hongos entomopatógenos sobre larvas del primer ínstar de Bemisia tabaci biotipo B. Los resultados mostraron diferencias significativas en la virulencia de los aislamientos sobre la mortalidad total a los 6 días después de la aplicación de una suspensión de 1x107 esporas ml-1. El rango de mortalidad oscilo entre el 15 y 80%. Los aislamientos P1 y P2 de P. fumosoroseus causaron la mortalidad más alta con un 80%. En un estudio comparativo sobre la capacidad patogénica de aislamientos nativos de los hongos entomopatógenos y productos comerciales formulados como el Preferred® (P. fumosoroseus), BotaniGard® (B. bassiana) y Mycotal® (V. lecanii) sobre Bemisia tabaci biotipo B Saito y Sugiyama (2005) encontraron la mortalidad más alta para el aislamientos nativo PF3110 de P. fumosoroseus (98%) pero no encontraron diferencia estadística significativa con los productos comerciales Preferred ® y BotanicGard® con 90.6 y 97.2% de mortalidad respectivamente.

23 En trabajos realizados por Osborne et al., (1990) encontraron un porcentaje alto de mortalidad entre el 70 y 90% en ninfas del cuarto instar de Bemisia tabaci al aplicar la cepa Apopka 97® de Paecilomyces fumosoroseus a una concentración de 1.0 x 106 esporas ml-1. En cultivos ornamentales como la Gerbera sp. en la Republica Dominica el hongo P. fumosoroseus ha mostrado una eficiencia de control mayor al 50% sobre ninfas Bemisia tabaci (Serra et al., 1996). También se ha observado el efecto biocida de P. fumosoroseus sobre otras especies de mosquitas blancas como lo demostró Alean (2003) quien evalúo aislamientos nativos de Colombia de hongos entomopatógenos sobre huevos y ninfas de la mosquita blanca de la Yuca Aleurotrachelus socialis Bondar (Homóptera: Aleyrodidae). De los aislamientos evaluados el CIAT 212 de P. fumosoroseus obtuvo un porcentaje de mortalidad de 48.5%.

En otro estudio de patogenicidad en la mosca blanca del invernadero Trialeurodes vaporariorum Westood (Homoptera: Aleyrodidae) Avery et al., (2004) encontraron el porcentaje de emergencia de adultos mas bajo para la cepa Trinidad de P. fumosoroseus al aplicar una suspensión de 1.2x106 esporas ml-1 en ninfas del cuarto ínstar bajo un régimen de luz constante y 100% de humedad, en la cual encontraron el 29.20% de eclosión o sobrevivencia (70% mortalidad). Al evaluar la cantidad de proteasas producidas por el hongo P. fumosoroseus en el proceso infecto sobre T. vaporariorumr Castellanos et al., (2007) encontraron porcentajes elevados de mortalidad en ninfas del primer y segundo instar por arriba del 90%.

Dos Santos y Pozo (2003) aislaron y evaluaron la patogenicidad de P. fumosoroseus y otras especies de hongos entomopatógenos como alternativa para el manejo de T. vaporariorum en Uruguay. Los aislamientos mostraron un marcado efecto patogénico sobre los estados inmaduros de T. vaporariorum, con un porcentaje de mortalidad mayor al 78%. La mayor mortalidad se obtuvo

24 con los aislamientos de P. fumosoroseus en un rango de 88.7 a 91.9%. Otros resultados similares fueron encontrados por Ayhan y Kubilay (2005) al evaluaron la patogenicidad in vitro de nueve aislamientos de P. fumosoroseus en ninfas de T. vaporariorum a los seis días después de la inoculación de una suspensión de 1 x 107 esporas ml-1, encontrando siete aislamientos con una mortalidad acumulada significativa por arriba del 70%.

2.3 Antecedentes de la caracterización molecular de P. fumosoroseus

El hongo entomopatógeno

Paecilomyces fumosoroseus es de amplia

distribución geográfica y rango de hospederos, capaz de infectar insectos de diversos ordenes y de todos los estados de desarrollo. Por lo que algunos aislamientos de P. fumosoroseus son producidos comercialmente en algunos países, principalmente para el manejo de la mosquitas blancas como Bemisia tabaci y Trialeurodes vaporariorum en invernadero y campo abierto (Osborne y Landa, 1992; Wraigth et al., 2000). Por lo tanto la correcta caracterización genotípica y fenotípica de este microorganismo antes de su liberación en programas de biocontrol es de suma importancia (Azevedo et al., 2000; Fargues et al., 2002; Gauthier et al., 2007).

Con la finalidad de agrupar e identificar las especies y biotipos de hongos entomopatógenos, se aplican las técnicas moleculares como los estudios isoenzimáticos, análisis de polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP), análisis de polimorfismo en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) y análisis de polimorfismo de ADN amplificado al azar (RAPD) (Vargas, 2003).

25 Los marcadores moleculares del tipo RAPD´s son una poderosa herramienta para la identificación de especies o cepas, la estimación de la variabilidad genética entre aislamientos y la construcción de dendrogramas a partir de distancias calculadas (Welsh y McClelland 1990; Williams et al.1990). Este método por medio de la huella genética es considerado de una alta sensibilidad para la detección de la variabilidad entre individuos relacionados cercanamente y menos en especie polimórficas. Los marcadores RAPD han sido usados exitosamente para estimar la variabilidad genética intraspecifica e

interespecifica de los hongos entomopatógenos (Tigano-Milani et al. 1995).

De

los

numerosos

estudios

de

diversidad

genética

en

hongos

entomopatógenos, únicamente unos pocos ha sido reportados en lo que concierne a P. fumosoroseus. Tigano-Milani et al. (1995) Al estudiar la variabilidad genética de 15 aislamientos de P. fumosoroseus, uno de Paecilomyces lilacinus y un grupo de 9 Paecilomyces sp (sin especificación) por RAPD-PCR empleando primers arbitrarios, encontraron que la mayoría de los aislamientos de P. fumosoroseus y Paecilomyces spp. fueron agrupados en tres grupos genéticos con un porcentaje por arriba del 56 % de similaridad interna. Arbitrariamente dos de los tres grupos genéticos fueron estrechamente relacionados con el tercer grupo (76% de similaridad) y completamente diferentes del segundo grupo (únicamente 14% de similaridad), en conclusión los grupos genéticos no se relacionaron entre si a pesar de ser aislados del mismo hospedero y región geografía.

En otro estudio de variación molecular realizado con ADN ribosomal mediante RAPD-PCR de 7 aislamientos de P. fumosoroseus, 5 de P. tenuipes y 5 Paecilomyces spp. Azevedo et al., (2000) encontraron una extensa variabilidad en la huella digital para diferenciar todos los aislamientos amplificados. Los aislamientos fueron separados en dos grandes grupos genéticos, el primer

26 grupo estuvo formado por todos los aislamientos de P. fumosoroseus y los cinco aislamientos sin identificación (Paecilomyces spp), el segundo grupo incluyo todos los aislamientos de P. tenuipes. No obstante la alta divergencia genética obtenida fue de 0.75 usando un amplificador común para todos los aislamientos (primer OPAK-16). En consecuencia los aislamientos sin identificación (Paecilomyces spp.) obtuvieron un promedio de similaridad entre si de 92.5%. Esta alta similaridad genética se debió a que estos aislamientos fueron obtenidos de una misma zona epizoótica (Paraná, Brasil)

Oborník et al., (2000) usaron marcadores moleculares RAPD-PCR para la reconstrucción de la filogenia de los hongos entomopatógenos P.

fumosoroseus, P. lilacinus, P. farinosus y V. lecanii. Emplearon nueve primers que producierón 107 características binarias reproducibles (2 constantes 107 variables). Las distancias genéticas fueron variables entre los hongos. Sin embargo, todos los aislamientos de P. fumosoroseus evaluados pertenecieron al mismo grupo

27 III. HIPÓTESIS

Al menos uno de los cinco aislamientos polispóricos de Paecilomyces fumosoroseus o alguno de sus cultivos monospóricos ocasiona mortalidad mayor al 90% de los estados inmaduros de Bemisia tabaci bajo condiciones de laboratorio.

Las huellas genéticas y la caracterización fisiológica permiten observar diferencias entre los aislamientos polispóricos de Paecilomyces fumosoroseus.

28 IV. OBJETIVOS

4.1 General

Caracterizar fisiológica y molecularmente los aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus y evaluar su patogenicidad en inmaduros de Bemisia tabaci.

4.2 Específicos

1. Evaluar

la

patogenicidad

de

aislamientos

polispóricos

y

cultivos

monospóricos de Paecilomyces fumosoroseus en huevos y ninfas del primer instar de Bemisia tabaci bajo condiciones de laboratorio.

2. Caracterizar el desarrollo fisiológico in vitro de los aislamientos polispóricos y cultivos monospóricos de Paecilomyces fumosoroseus por medio del crecimiento diametral, esporulación y germinación de esporas.

3. Detectar polimorfismos entre los aislamientos polispóricos de Paecilomyces fumosoroseus empleando la técnica de Amplificación de Fragmentos Polimorficos al Azar por Reacción en Cadena de la Polimerasa (RAPDPCR).

29 V. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Localización

Los experimentos de patogenicidad y la caracterización fisiológica de los asilamientos se realizaron el laboratorio de entomología y fitopatología del Instituto Tecnológico de Conkal, ubicado en el Km 16.3 de la antigua carretera Mérida-Motul. La caracterización molecular de los aislamientos se realizó el laboratorio de biología molecular del Colegio de Postgraduados campus Campeche situado en la calle Nicaragua N° 91 tercer piso entre Tamaulipas y Circuito Baluartes col. Santa Ana.

5.2 Cría de Bemisia tabaci

Se estableció la colonia de cría de B. tabaci en jaulas entomológicas de aluminio y malla antiafidos de 1.2 x 1.2 x 1 m. Con un aspirador bucal se colectaron 200 adultos de B. tabaci en invernaderos cercanos a la zona de estudio, estos fueron liberados dentro de las jaulas entomológicas sobre plantas de Capsicum chinense como planta hospedera, dispuestas en macetas de plástico rellenadas de cosmopeet® (Cosmocel, Canadá) como sustrato de soporte, posteriormente a los dos días los insectos introducidos fueron retirados de nuevo, dejando desarrollar a la generación que habían ovipositado hasta generar adultos en la colonia de cría, los cuales fueron empleados para la obtener los estados inmaduros de B. tabaci para los ensayos de patogenicidad.

30 5.3 Plantas hospederas para bioensayos

El material vegetal utilizado para evaluar la patogenicidad de los aislamientos de P. fumosoroseus sobre huevos y ninfas de B. tabaci correspondió a plantas de Capsicum chinense de 45 a 50 días de edad de la variedad Seminis®, sembradas en vasos de unicel con sustrato comercial Cosmopeet® mantenidas con riego y una fertilización básica con Urea (1g/Lt de agua) y MAP (1g/Lt de agua), las cuales se mantuvieron en invernadero a una temperatura de 28 ± 2°C y una humedad relativa de 75 ± 5% hasta antes de la infestación de B. tabaci.

5.4 Reactivación de los aislamientos

Los hongos fueron sembrados en medio de cultivo Sabouraud Dextrosa Agar “SDA” (Merck®, Alemania). El medio de cultivo se realizó agregando 65 g de SDA en 1 litro de agua destilada estéril, se agitó durante 10 minutos hasta homogenizar la mezcla, posteriormente se esterilizó en una autoclave a 125 libras de presión durante 25 minutos. Al enfriarse el medio de cultivo se aplicó 2 ml de cloranfenicol como antibiótico para evitar el crecimiento de bacterias saprofitas que puedan contaminar el medio de cultivo.

Una vez preparado el medio de cultivo se vertió en cajas de Petri para la siembra del hongo, esto se realizó dentro de una cámara de flujo laminar por las condiciones asépticas necesarias. Una vez listas las cajas de Petri con medio de cultivo se inocularon por medio de una asa de platino esporas de los aislamientos iniciales para su reproducción, las cuales se utilizaron para obtener las soluciones conidiales para evaluar el efecto patogénico de los aislamientos.

31 Los aislamientos del hongo P. fumosoroseus, fueron provistos por el laboratorio de control biológico del Comité Estatal de Sanidad Vegetal del estado Yucatán. Estas cepas fueron aisladas de mosquitas blancas parasitadas que se encontraban en cultivos a cielo abierto con el clima tropical prevaleciente. También se incluyo dentro del experimento un producto comercial a base de esporas de P. fumosoroseus conocido como Paesin® distribuida por laboratorios Agrobiológicos del Sureste S.A de C.V. El cual fue reaislado en cajas de Petri como se describió con anterioridad.

Cuadro 1. Nomenclatura de los aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus. Aislamiento
Pf-Tim Pf-Tiz Pf-Hal Pf-Rg Paesin
®

Hongo
P. fumosoroseus P. fumosoroseus P. fumosoroseus P. fumosoroseus P. fumosoroseus

Hospedante
Bemisia tabaci Bemisia tabaci Bemisia tabaci Bemisia tabaci ---------

Origen
Timucuy (Yuc.-Mex.) Tizimin (Yuc.-Mex.) Halacho (Yuc.-Mex.) Zacapa (Guatemala) Sinaloa (Comercial)

5.5 Obtención de cultivos monospóricos

Los cultivos monospóricos, se realizaron de acuerdo a la metodología descrita por Ayala et al. (2005); se obtuvo una suspensión de esporas de cada aislamiento polispórico por medio de un raspado de la colonia, la suspensión obtenida se ajustó a una concentración de 100 esporas ml-1 empleando una cámara de Neubauer® (Marienfeld, Alemania). Se aplicaron 200 μL de esta suspensión en cajas de Petri con SDA vaciado en capa fina, al reverso de la caja Petri se trazaron cuadros de 0.5 cm2, las cajas se incubaron a temperatura ambiente (24 ± 3 °C, 72 ± 5% HR), se revisaron cada 24 horas, al microscopio óptico a 4 y 10x, para marcar con un punto el cuadrante donde se encontraba

32 una sola espora con tubo germinativo. Al cabo de 2 días se observaron las colonias en crecimiento provenientes de la espora localizada el cual se le considera un cultivo monospórico por lo que fueron transferidas a una caja de petri con medio SDA para su completo desarrollo.

5.6 Bioensayos de patogenicidad

Se evalúo la patogenicidad del hongo P. fumosoroseus en huevos y ninfas del primer instar de Bemisia tabaci bajo condiciones de laboratorio, fueron aplicados cuatro diferentes concentraciones de esporas para el calculo de la concentración letal media (CL50) y el tiempo letal medio (TL50) de los 15 aislamientos evaluados

5.6.1 Obtención de estados inmaduros de B. tabaci

Se tomaron diez insectos adultos de la colonia de cría con un aspirador bucal, se depositaron en una jaula clip y se sujetaron en una hoja de la planta hospedera, dejando a los insectos ovipositar durante un periodo de 24 horas. Posteriormente los adultos y la jaula clip fueron retirados y se contabilizaron el número de huevos por hoja. En el caso de ninfas, estos huevos se dejaron desarrollar en un periodo de 7 días hasta obtener ninfas en el primer instar. Únicamente se dejaron entre 30 huevos o ninfas por hoja como unidad experimental (Muñiz y Nombela, 2001).

33 5.6.2 Obtención de la suspensión de esporas

Una suspensión de esporas por cada aislamiento se obtuvo de los crecimientos en medio de cultivo Sabouraud Dextrosa Agar. De las colonias en cajas de Petri una vez esporuladas (15 días), se cosecharon las esporas de cada aislamiento agregando 10 ml de agua destilada estéril más 0.5 μl de Tween® al 30% como dispersante de esporas, posteriormente se le realizo un raspado a la colonia por medio de una espátula estéril, se extrajo el raspado y se filtro en un dial con gasas estériles evitando el paso de micelio e impurezas, obteniendo una suspensión stock el cual fue ajustada a las concentraciones a evaluar mediante una cámara de Neubauer® (Gindin et al., 2000).

5.6.3 Bioensayos de patogenicidad en inmaduros de B. tabaci

Se evalúo la patogenicidad de los cinco aislamientos polispóricos y dos aislamientos monospóricos de cada polispórico, haciendo un total de 15 aislamientos evaluados en huevos y ninfas de Bemisia tabaci. Para los bioensayos de patogenicidad, fueron tratados únicamente 30 huevos y 30 ninfas por hoja como unidad experimental. Cuatro suspensiones de esporas a concentraciones de 1x104, 1x105, 1x106, 1x107 esporas ml-1 se aplicaron a las hojas con huevos y/o ninfas por medio de inmersión de hoja durante 15 segundos, se dejaron secar y se incubaron bajo condiciones de laboratorio para su evaluación. Las evaluaciones fueron realizadas diariamente empleando un microscopio estereoscopio.

34 Para el caso de huevos se contabilizaron los huevos micosados, deformes, eclosionados y no eclosionados. Mientras que para las ninfas se contabilizaron las ninfas micosadas, ninfas muertas, ninfas deformes por deshidratación, cambios de coloración, destrucción de órganos internos visibles y ninfas eclosionadas. Además de estos parámetros patogénicos se midieron las variables ambientales de temperatura y humedad empleando un

higrotermometro digital (Serra et al., 1996; Gindin et al., 2000).

5.6.4 Diseño experimental y análisis estadístico

Este experimento se realizo bajo un diseño completamente al azar con 15 tratamientos y 4 repeticiones, la unidad experimental consintió en una hoja con 30 huevos y/o 30 ninfas de B. tabaci. Los resultados de mortalidad dado en porcentaje tanto en huevos como en ninfas fueron analizados mediante un análisis de varianza y una comparación de medias Tukey (P=0.05) por medio del programa estadístico GraphPad (San Diego, California). Para el cálculo de TL50 y CL50 se realizó un análisis Probit para la mortalidad diaria acumulada con el programa estadístico SAS Ver. 8.1 (SAS Inc. USA).

5.7 Caracterización fisiológica

La caracterización fisiológica de los aislamientos se realizó mediante la evaluación del desarrollo in vitro del hongo reflejado por el crecimiento diametral de la colonia, producción de esporas (esporulación) y porcentaje de germinación.

35 5.7.1 Crecimiento diametral

Se realizo depositando en el centro de una caja de Petri con medio de cultivo Sabouraud Dextrosa Agar 1 μL de una suspensión de 1 x 107 esporas ml-1. Las cajas de Petri se incubaron a una temperatura de 24 ± 3 ºC, humedad relativa de 72 ± 5% y fotoperíodo de 16h luz y 8h oscuridad, durante 15 días. Se realizaron mediciones diarias del diámetro de la colonia, calculando la tasa de crecimiento diario en cm día-1 (Skrobek, 2001).

5.7.2 Esporulación

La producción de esporas se determino empleando la metodología descrita por Gindin et al., (2000) para el conteo de esporas. Se agregó a las colonias en cajas de Petri 10 ml de agua destilada estéril más 0.5 μL de Tween® al 30%. Posteriormente se realizo el raspado de la colonia empleando un espátula estéril, seguido se extrajo el raspado y se filtro en un dial evitando el paso de impurezas y micelio mediante una gasa estéril, obteniendo una solución, de la cual se mido la concentración de esporas depositando 5 μL de la solución en una cámara de Neubauer®, contabilizando las esporas mL-1 bajo un microscopio compuesto con el ocular en 40x.

5.7.3 Porcentaje de germinación

Para cuantificar el porcentaje de germinación de esporas, se ajusto la suspensión stock a una concentración de 1x107 esporas ml1. Se tomaron 2 μL y se colocaron en un punto dentro de una caja Petri con medio SDA, se colocaron cinco puntos por caja Petri, una caja por cada aislamiento. Sobre estos puntos

36 se colocaron cubreobjetos, se observo la germinación de las esporas en intervalos de 1 hora hasta lograr un 100% de germinación para cada muestra. Se contabilizaron al azar 100 esporas empleando un contador manual, se diferenciaron las esporas germinadas y no germinadas obteniendo así de manera directa el porcentaje de germinación. Se considero a la espora germinada, cuando se observo la presencia del tubo germinativo con el doble de tamaño de la espora (Skrobek, 2001).

5.7.4 Diseño experimental y análisis estadístico

Para los experimentos de desarrollo in vitro se utilizó un diseño completamente al azar con 15 tratamientos y 5 repeticiones cada uno. Los datos se analizaron con un análisis de varianza y comparación de medias Tukey (P=0.05) empleando el programa estadístico GraphPad (San diego, California).

37 5.8 Caracterización molecular mediante RAPD-PCR

Para la caracterización genética del hongo se emplearon los 5 aislamientos polispóricos de P. fumosoroseus, previamente caracterizados fisiológicamente y evaluados patógenicamente sobre inmaduros de B. tabaci.

5.8.1 Producción de biomasa y extracción del ADN

5.8.1.1 Producción de biomasa. Los aislamientos de P. fumosoroseus fueron sembrados en Caldo Dextrosa Sabouraud (40 g de dextrosa, 5 g de peptona de carne y 5 g de peptona de caseína para un litro) adicionado con cloramfenicol 100 μg L-1 (Pharmacia) para evitar la contaminación bacteriana. Con una espátula esterilizada a calor se cortaron cuadros de 1 cm 2 de una colonia de 2 semanas de edad, estos fueron depositados en matraces de 250 ml conteniendo 50 ml de medio de cultivo líquido, los matraces se mantuvieron en agitación orbital a 22 °C durante 5 días. El micelio se recuperó por filtración por gravedad utilizando papel estéril Whatman No 2, lavándolo dos veces con agua ultrapura estéril y un buffer de lavado (100mM de Tris-HCL pH 8.5, 150 mM de NaCl, 5 mM EDTA). El micelio extraído se depositó en tubos Eppendorf de 1.5 mL y fue almacenado a -80 °C para su posterior extracción de ADN.

5.8.1.2 Extracción del ADN. La extracción del ADN se realizó de acuerdo al protocolo desarrollado Raeder y Broda (1985) con ligeras modificaciones. El micelio congelado se depositó en proporción aproximada de 200 mg por muestra en morteros estériles y fueron macerados con nitrógeno líquido hasta formar un polvo fino. El micelio pulverizado se colocó en un tubo Eppendorf adicionándole 500 uL del buffer de extracción (200 mM de Tris-HCl pH 8.5, 250 mM de NaCl, 25 mM de EDTA, 0.5% de SDS), se mezcló de manera

38 homogénea durante 10 minutos mediante un vortex. A la suspensión formada con el buffer y los restos celulares extraídos, se les adiciono un volumen de fenol-cloroformo. La suspensión se mantuvo 10 minutos en agitación constante, al término del tiempo, se realizó una remoción celular por centrifugación a 12,000 rpm durante 10 minutos.

La fase acuosa se recuperó en un tubo Eppendorf y se le agregó un volumen de cloroformo y eliminar los residuos de fenol. La solución se mezcló de manera homogénea en un vortex y se centrifugó a 12,000 rpm por cinco minutos. La fase acuosa se recuperó en otro tubo Eppendorf adicionándole un volumen de isopropanol frió, posteriormente la solución fue centrifugada por cinco minutos a 12,000 rpm para recuperar los ácidos nucleicos en forma de pastilla. La pastilla se lavó dos veces con etanol al 70% y fue suspendida en 100 uL de agua ultrapura estéril.

Para eliminar el ARN contaminante se agregó 3 μL de RNAsa (5 ng/uL), encubando la muestra por 30 minutos a 37 °C, al termino de la incubación se realizó una limpieza de la RNAsa con fenol-cloroformo y cloroformo con la misma metodología mencionada anteriormente, al final se precipitó con isopropanol hasta obtener la pastilla, la cual fue lavada dos veces con etanol al 70% y secada por centrifugación al vació. Finalmente la pastilla fue suspendida en 50 μL de agua ultrapura estéril.

5.8.1.3 Cuantificación del ADN

El estado físico del ADN se determinó por electroforesis en gel de agarosa al 1.2% corrido a 90 V por una hora, el gel se tiñó con bromuro de etidio observándose en un transluminador con luz ultravioleta. En todas las

39 electroforesis se empleó 1 μL de marcador de peso molecular de 1kb Leader (Gibco Lab). Una vez confirmado el estado físico aceptable del ADN cromosómico, se cuantificó por medio de un espectrofotómetro BeckmanCoulter modelo DU® 530 (USA), empleando el programa DNA de doble cadena (dsDNA).

5.8.2 Aplicación de la técnica RAPD-PCR

Se utilizó la técnica de ampliación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD) por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para detectar la variabilidad entre los aislamientos de P. fumosoroseus. Para ello se evaluaron 10 iniciadores al azar del Kit OPB de Operon Technologies (California, USA) utilizando un solo ADN para analizar el número de bandas obtenidas por cada iniciador y seleccionar aquellos que permitieran establecer un buen patrón de bandas en la huella genética particularmente de cada aislamiento (Tabla 2).

Tabla 2. Secuencias de los iniciadores evaluados. Iniciador universal OPB 01 OPB 02 OPB 03 OPB 04 OPB 05 OPB 06 OPB 07 OPB 08 OPB 09 OPB 10 Secuencia 5’-GTTTCGCTCC-3’ 5’-TGATCCCTGG-3’ 5’-CATCCCCCTG-3’ 5’-GGACTGGAGT-3’ 5’-TGCGCCCTTC-3’ 5’-TGCTCTGCCC-3’ 5’-GGTGACGCAG-3’ 5’-GTCCACACGG-3’ 5’-TGGGGGACTC-3’ 5’-CTGCTGGGAC-3’

40 Las reacciones se realizaron en un volumen total 25 μL, conteniendo lo indicado en la tabla 3. Se utilizó ADN de referencia de un hongo entomopatógeno previamente extraído (Beauveria bassiana). La amplificación se realizó en un termociclador Techgene modelo FTgene2D (Technege, USA) con el programa de amplificación desglosado en la tabla 4. Los productos de amplificaciones fueron separados en una cámara de electroforesis Thermo EC 340 (Thermo scientific, USA) en gel de agarosa al 1% utilizando 1X del buffer Tris-BoratoETDA (TBE) a 80 V durante 3 horas, los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se visualizaron en un transluminador con luz ultravioleta.

Tabla 3. Componentes de las reacciones RAPD-PCR. Reactivo ADN Iniciador dNTP´s MgCl2 Buffer PCR Taq ADN polimerasa H20 Ultrapura estéril Total Cantidad 1.0 uL 2.0 uL 1.5 uL 2.0 uL 2.5 uL 0.5 uL 15.5 uL 25.0 uL Concentración 80 ng uL-1 20 pmol uL-1 50 mM c/u 50 mM 10X 2.5 U

Tabla 4. Programa de amplificación. Paso Desnaturalización inicial Desnaturalización Alineamiento Extensión Extensión final Ciclo 1 40 1 Temperatura 94 °C 94 °C 36 °C 72 °C 72 °C Tiempo 5 min 1 min 1 min 2 min 7 min

41 5.8.3 Análisis de la caracterización molecular

Para el establecimiento de las huellas genéticas derivadas de cada uno de los iniciadores evaluados, se construyó una matriz binaria asignando valores de 0, en caso de ausencia del fragmento y 1 cuando esta estuvo presente en cada uno de los aislamientos. A partir de la matriz binaria se elaboró una matriz de proximidad mediante el coeficiente Jaccard, que cuantificó el grado de similaridad entre cada par de objetos. Las agrupaciones para la elaboración del dendrograma se realizó mediante el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method using Aritmetic Averages) o promedios no ponderados, el cual se sometió a un análisis de reagrupamiento (Bootstrapping) con 1000 replicas mediante el programa FreeTree Ver. 0.9.1.50 (Pavlicek et al., 1999). El dendrograma se visualizó con el programa TreeView Ver. 4.1 (Page, 1996).

42 VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

6.1 Patogenicidad en huevos de B. tabaci

De los quince aislamientos evaluados sobre huevos de B. tabaci los aislamientos Pf-Hal M1 y Paesin presentaron los porcentajes de mortalidad más altos con 61.92% y 61.32% respectivamente. El efecto de estos aislamientos resultó significativamente superior (P<0.05) (Cuadro 1A) al efecto de los aislamientos Pf-Tiz, Pf-Hal, Pf-Rg M1 y Pf-Tiz M2, con 33.32, 21.25, 31.25 y 33.21%, respectivamente. El testigo obtuvo el porcentaje de mortalidad más bajo con el 9.79% (Figura 1).

En otros estudios se han encontrado valores inferiores a los obtenidos en el presente trabajo. Por ejemplo, Lacey et al., (1999) al evaluar la patogenicidad de P. fumosoroseus en huevos de B. tabaci encontraron valores de mortalidad menores al 20% al aplicar una solución conidial de 1x10 3 esporas/cm2. En otras especies de mosquitas blancas, P. fumosoroseus ha causado efectos similares a los encontrados en el presente estudio, Alean (2003) al evaluar el efecto ovicida de P. fumosoroseus sobre la mosquita blanca Aleurotrachelus socialis Bondar (Homóptera: Aleyrodidae) encontró porcentajes de mortalidad entre 40 y 60% similares a los encontrados en este experimento.

Para efectos de comparación es preciso mencionar la actividad ovicida de otras especies de hongos entomopatógenos en B. tabaci. Por ejemplo, Gindin et al. (2000) encontraron que Verticillium lecanii ocasionó entre el 14 y 26% de mortalidad en huevos de B. tabaci al aplicar una suspensión de 1x107 esporas ml-1. Skrobek (2001) reportó que Metarhizium anisopliae ocasionó mortalidades

43 entre 33 y 45% a los 6 días posteriores a la aplicación de una suspensión de 1x107 esporas ml-1. Estos trabajos previos resaltan los resultados encontrados en este trabajo y sugieren los aislamientos Paesin y Pf-Hal M1 son más patogénicos en huevos de B. tabaci que otros hongos evaluados.

100

80

Mortalidad (%)

60

ab c

a ab abc abc abc

a ab abc abc d ab c

40

bcd de

cde

bc d e

20

0
Pf-Tim Pf-Hal Pf-Tim M1 Pf-Tim M2 Pf-Rg M1 Pf-Hal M1 Pf-Rg M2 Paesin M1 Paesin M2 Pf-Hal M2 Pf-Rg Paesin Pf-Tiz M1 Pf-Tiz M2 Testigo Pf-Tiz

Aislamientos

Figura1. Mortalidad en huevos de Bemisia tabaci por efecto de la aplicación de una suspensión de 1x107 esporas ml-1 del hongo Paecilomyces fumosoroseus (24 ± 3 °C, 72 ± 5% HR, 16L: 8O). Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05).

6.2 Patogenicidad en ninfas de B. tabaci

El potencial de control de los quince aislamientos de P. fumosoroseus se evaluó en ninfas del primer instar de B. tabaci. Los resultados mostraron diferencia significativa (P<0.05) (Cuadro 2A) en el porcentaje de mortalidad a los 12 días

44 después de la aplicación. El aislamiento Pf-Rg causó el porcentaje de mortalidad más alto con 92.1%, con respecto a los aislamientos Pf-Tiz , Pf-Hal, Pf-Tim M1, Pf-Rg M1, Pf-Tiz M2, Pf-Tim M2, Pf-Rg M2 y Pf-Hal M2, que presentaron valores de 66.43, 54.09, 61.07, 56.48, 65.18, 60.75, 59.15 y 60.23%, respectivamente. El aislamiento Pf-Rg fue mucho más patogénico que sus dos aislamientos monospóricos evaluados. Sin embargo ocurrió lo contrario con los aislamientos Pf-Tiz y Pf-Hal, donde los aislamientos monospóricos fueron más patogénicos que sus respectivos polispórico. El testigo presentó el porcentaje de mortalidad más bajo con 9.52%

Los valores de mortalidad encontrados en este trabajo fueron mayores a los reportados por Scorsetti et al., (2008), quienes al evaluar en ninfas de B. tabaci la patogenicidad del hongo P. fumosoroseus aplicando una suspensión de 1x107 esporas ml-1, encontraron valores de mortalidad entre el 26.6 y 76.6% a los 7 días posteriores a la aplicación. Skrobek (2001) evaluó la patogenicidad de P. fumosoroseus sobre el primer instar ninfal de B. tabaci biotipo B, los valores de encontrados a los 6 días posteriores a la inoculación de una suspensión de 1x107 esporas ml-1, fueron aproximadamente del 80%.

En otros estudios de patogenicidad realizados por Osborne et al., (1990), encontraron un porcentaje mortalidad entre el 70 y 90% en ninfas del cuarto instar de Bemisia tabaci al aplicar la cepa Apopka 97® de P. fumosoroseus a una suspensión 1x106 esporas mL-1. Otros resultados indican que los aislamientos evaluados en este ensayo fueron más virulentos. Por ejemplo , Saito y Sugiyama (2005) al evaluar aislamientos nativos de Japón de P. fumosoroseus y aislamientos comerciales sobre estadios ninfales de B. tabaci (biotipo B) encontraron la mortalidad más alta en el aislamiento nativo PF3110 con 98%, al aplicar una suspensión de 6x107 esporas ml-1, seis veces mayor a la suspensión mas alta evaluadas en el presente trabajo.

45

100 abc bc

a abc ab abc bc c c abc abc bc bc bc bc

Mortalidad (%)

80

60

40

20

d

0
Pf-Tim Pf-Hal Pf-Tim M1 Pf-Tim M2 Pf-Rg M1 Pf-Hal M1 Pf-Rg M2 Paesin M1 Paesin M2 Pf-Hal M2 Pf-Rg Pf-Tiz M1 Pf-Tiz M2 Testigo Paesin Pf-Tiz

Aislamientos

| Figura 2. Mortalidad en ninfas del 1er instar de Bemisia tabaci por efecto de la aplicación de una suspensión de 1x107 esporas ml-1 de Paecilomyces fumosoroseus (24 ± 3 °C, 72 ± 5% HR, 16L: 8O). Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05).

6.2.1 Tiempo letal medio (TL50)

Con base en el análisis probit se calcularon los tiempos letales medios (TL50) de cada aislamiento empleando la suspensión más alta evaluada (1x107 esporas ml-1). Este valor indica el tiempo requerido para obtener el 50% de mortalidad de la población tratada. El asilamiento Paesin fue estadísticamente diferente al resto de los aislamientos evaluados con un valor de 3.7 días, los aislamientos Pf-Hal, Pf-Rg M2 y Pf-Tim M1 obtuvieron los valores más altos de TL 50 con 6.36, 6.71 y 6.08 días, respectivamente (Cuadro 2). Otros estudios sobre tiempos letales medios de P. fumosoroseus en B. tabaci, han encontrado resultados similares a los obtenidos en el presente estudio. Por ejemplo, Saito y Sugiyama (2005) al evaluar la patogenicidad de P. fumosoroseus sobre B. tabaci a una suspensión de 7.4x107 esporas ml-1, encontraron un valor de TL50

46 de 3.8 días. Lo mismo registraron Gindin et al., (2000) al encontrar un TL50 de 3.8 días, por lo que estos valores son muy cercano a los obtenidos por el aislamiento Paesin del presente ensayo.

Para efectos de comparación cabe mencionar que los tiempos letales de P. fumosoroseus en moscas blancas es variado como lo describen otros trabajos. Por ejemplo, en ninfas de Trialeurodes vaporariorum se ha encontrado tiempos letales (TL50) de 4.4 a 4.7 días al aplicar una suspensión de 1x108 esporas ml-1. (James, 2001). Valores entre 4.1 a 4.7 días de TL50 fueron encontrados por Coollen (2005) al aplicar una suspensión de 9x106 esporas ml-1 de P. fumosoroseus sobre T. vaporariorum. Por otro lado Dos santos y Pozo (2003) encontraron un valor menor de TL50 de 3.04 días en T. vaporariorum al aplicar una suspensión de 3.5x107 esporas ml-1. Por lo que se pone en manifiesto que existe diferencia en patogenicidad entre los diferentes aislamientos evaluados.

Cuadro 2. Tiempo letal medio en ninfas de B. tabaci por efecto del hongo P. fumosoroseus al aplicar una suspensión de 1x107 esporas ml-1. Aislamientos TL50 (Días) IC (Días) Pendiente Pr>f Paesin 3.72 a 3.41 - 4.04 3.47 <0.0001 Paesin M1 4.94 b 4.65 - 5.28 4.50 <0.0001 Paesin M2 4.69 b 4.44 - 4.97 4.02 <0.0001 Pf-Tiz 4.66 b 4.22 - 5.22 2.93 <0.0001 Pf-Tiz M1 5.39 bc 5.03 - 5.84 4.00 <0.0001 Pf-Tiz M2 5.50 bc 5.23 - 5.97 3.91 <0.0001 Pf-Hal 6.36 c 5.76 - 7.22 2.53 <0.0001 Pf-Hal M1 5.08 b 4.63 - 5.66 3.26 <0.0001 Pf-Hal M2 6.13 bc 5.58 - 6.90 2.89 <0.0001 Pf-Rg 4.35 b 4.11 - 4.59 5.86 <0.0001 Pf-Rg M1 6.01 bc 5.54 - 6.66 3.86 <0.0001 Pf-Rg M2 6.71 c 6.21 - 7.42 4.03 <0.0001 Pf-Tim 5.04 b 4.70 - 5.45 3.70 <0.0001 Pf-Tim M1 6.08 c 5.67 - 6.64 4.46 <0.0001 Pf-Tim M2 5.53 bc 5.25 - 5.87 3.78 <0.0001 TL50=Tiempo letal medio, IC=intervalo de confianza. Valores con letras iguales son estadísticamente iguales según traslape de los intervalos de confianza.

47 6.2.2 Concentración letal media (CL50)

Al

analizar

los

resultados

obtenidos

después

de

aplicar las

cuatro

concentraciones de los aislamientos de P. fumosoroseus sobre ninfas de de B. tabaci, al cabo de los 12 días se encontró una mayor mortalidad a medida que se aumentó la concentración de esporas. Según el análisis Probit se encontraron cuatro grupos de los cuales los valores de CL50 más bajos fueron para el aislamiento Paesin y Pf-Tim con 2.6x104 y 5.5x104 esporas ml-1, respectivamente. Esto indica que estos aislamientos fueron más virulentos contra B. tabaci que el resto de los aislamientos evaluados. Las CL50 más alta obtenida fueron para los aislamientos Pf-Rg M2 y Pf-Rg M1 con 3.3 x106 esporas ml-1 y 7.2x106 esporas ml-1 respectivamente (Cuadro 3).

Respecto a los resultados obtenidos con la CL50, estos fueron inferiores al obtenido por el CATIE (2006), al evaluar el aislamiento Colombiano Pc 013 de P. fumosoroseus sobre B. tabaci con una CL50 de 2.4x105 esporas ml-1. En otro ensayo Coollen (2005) al evaluar cinco suspensiones de esporas de P. fumosoroseus encontró una CL50 de 1.33x105 esporas ml-1 siendo más alta que los del presente ensayo. Sin embargo, existen reportes de CL50 ligeramente inferiores a los obtenidos en este experimento, tales como los de Saito y Sugiyama (2005), quienes al evaluar aislamientos nativos y comerciales del Japón de P. fumosoroseus sobre B. tabaci, encontraron una CL50 de 1.1x104 esporas ml-1. En otro experimento similar con aislamientos Uruguayos, Dos santos y Pozo (2003) encontraron una CL50 de 1.31x104 esporas ml-1 del P. fumosoroseus sobre ninfas de B. tabaci. También Castellanos et al., (2007) encontraron valores de CL50 de 1.1x103 y 2.5x104 esporas ml-1 de los aislamientos EH-503/3 y EH-503/3 de P. fumosoroseus sobre B. tabaci.

48 Cuadro 3. Concentración letal media (CL50) de los aislamientos de P. fumosoroseus Aislamiento CL50 (Esporas ml-1) IC (Esporas ml-1) Pendiente Pr>f 4 4 4 Paesin 2.6 x 10 a 1.2x10 - 4.7x10 0.31 <0.0001 Paesin M1 1.4 x 105 b 9.4x104 - 2.1x105 0.36 <0.0001 5 5 5 Paesin M2 4.0 x 10 c 2.9x10 - 5.4x10 0.48 <0.0001 Pf-Tiz 3.5 x 105 c 2.0 x105 - 5.9x105 0.28 <0.0001 5 5 5 Pf-Tiz M1 3.2 x 10 c 2.3x10 - 4.3x10 0.48 <0.0001 Pf-Tiz M2 1.3 x 106 d 8.7x105 - 2.4x106 0.33 <0.0001 6 6 6 Pf-Hal 2.3 x 10 d 1.6x10 - 3.3x10 0.53 <0.0001 Pf-Hal M1 5.7 x 105 c 3.9x105 - 8.3x105 0.41 <0.0001 6 6 6 Pf-Hal M2 1.8 x 10 d 1.1x10 - 3.0x10 0.37 <0.0001 Pf-Rg 1.5 x 105 b 1.1x105 - 2.0x105 0.53 <0.0001 6 6 7 Pf-Rg M1 7.2 x 10 d 3.7x10 - 1.7x10 0.30 <0.0001 Pf-Rg M2 3.3 x 106 d 2.1x106 - 5.5x106 0.42 <0.0001 Pf-Tim 5.5 x 104 a 3.4x104 - 8.2x104 0.40 <0.0001 6 6 6 Pf-Tim M1 2.0 x 10 d 1.1x10 - 4.1x10 0.28 <0.0001 Pf-Tim M2 2.8 x 106 d 1.9x106 - 4.4x106 0.47 <0.0001 CL50=Concentración letal medio, IC=intervalo de confianza. Valores con letras iguales son estadísticamente iguales según el análisis Probit.

6.3 Caracterización fisiológica

6.3.1 Crecimiento diametral

Se observó diferencia estadística significativa (P<0.05) (Cuadro 5A) en la tasa diaria de crecimiento diametral de los aislamientos evaluados (Cuadro 4). El aislamiento Pf-Rg mostró el mayor crecimiento diametral con 0.25 cm día-1 en comparación a los aislamientos Pf-Tiz M2, Pf-Hal M1 y Pf-Rg M2 con 0.20 cm día-1 cada uno, al igual que al aislamiento Pf-Tiz con 0.21 cm día-1. Evaluaciones previas de crecimiento in vitro de P. fumosoroseus han mostrado valores similares de crecimiento diametral a los encontrados en este trabajo, por ejemplo, el CATIE (2006) reporta que el crecimiento diametral promedio de

49 diversas cepas nativas de P. fumosoroseus de Colombia y Costa Rica fueron del orden de 0.159 cm día-1.

Sin embargo, los resultados encontrados, difieren substancialmente de los reportados por Skrobek (2001), quien encontró un crecimiento de 0.36 cm día-1 en dos aislamientos de P. fumosoroseus sembrados en medio SDA. Aunque en tal experimento, la incubación se realizó a 26 ºC, esta tasa alta de crecimiento diametral de la colonia, pudo deberse a que la incubación se llevó a cabo bajo un régimen de oscuridad total. Se ha comprobado que la tasa de crecimiento diametral de la colonia está fuertemente influenciada por la temperatura, al respecto, Vidal et al., (1997) al evaluar la tasa de crecimiento radial de 37 aislamientos de P. fumosoroseus en medio sintético, encontraron un rango de crecimiento de 0 a 0.5 cm día-1 bajo condiciones de temperaturas de 20 a 30 ºC.

6.3.2 Esporulación

En cuanto a la esporulación sobre medio de cultivo SDA, se observó una diferencia estadística significativa (P<0.05) (Cuadro 6A) únicamente para el aislamiento Paesin con 4.55x106 esporas ml-1 en comparación a los aislamientos Pf-Rg M2 y Pf-Tim M2 con 1.58x106 y 1.38x106 esporas ml-1 respectivamente.

Estos resultados fueron similares a los encontrados por Skrobek (2001) al medir la esporulación del hongo P. fumosoroseus en medio de cultivo SDA encontrando valores que van de 2 a 3x10 6 esporas ml-1. Sin embargo la esporulación en medios de cultivo sintéticos es mucho menor que la obtenida con otros sustratos, comparado con la producción masiva del hongo al

50 empleando arroz donde se pueden obtener esporulaciones que en promedio de 1x109 esporas g-1 (CATIE, 2006). Por lo que la esporulación de un aislamiento, esta por los factores de crecimiento como la metodología de extracción de las esporas y sustratos empleados.

6.3.3 Tasa de germinación

Se encontró una diferencia estadística significativa para la tasa de germinación por hora (P<0.05) (Cuadro 7) para el aislamiento Pf-Tiz con 33.1% respecto a los aislamientos Pf-Hal M2 (26.83%) y Pf-Hal M1 (25.58%). El resto de los tratamientos fueron estadísticamente iguales entre si. La tasa de germinación de esporas de los aislamientos evaluados en este trabajo se considera alta. En otros trabajos, se ha documentado que se requieren hasta 24 horas para obtener 100% de germinación de esporas (Vidal et al., 1997), comparado con los resultados presentados en este trabajo, que requirieron máximo 9 horas para lograr la germinación total de las esporas.

La velocidad de crecimiento y germinación de los hongos entomopatógenos ha sido asociada a su capacidad patogénica (Heale et al., 1989; Estrada et al., 1997). Por lo que se esperaría entonces que el Pf Rg que presento 92.18% de mortalidad en ninfas de B. tabaci se ha el que presente mayor TCD y TGH. Sin embargo Pf-Rg presento un TCD de 0.24 cm día-1 y 32.33% de TGH, dichos valores fueron estadísticamente iguales a los más altos obtenidos por Pf-Rg M1 (0.25 cm días-1) en TCD y Pf-Tiz con la TGH más alta de 33.16%, lo que pone en manifiesto lo citado por dichos autores.

51 Cuadro 4. Medias  error estándar del desarrollo in vitro de los aislamientos P. fumosoroseus. Aislamiento TCD (cm día-1) Esporulación (106 E. ml-1) TGH (% hora-1) Paesin 0.22 ± 0.015 ab 4.55 ± 0.36 a 30.24 ± 3.08 abc Paesin M1 0.23 ± 0.007 ab 2.87 ± 0.40 abc 28.33 ± 1.01 abc Paesin M2 0.22 ± 0.006 ab 3.05 ± 0.59 abc 30.16 ± 1.54 abc Pf-Tiz 0.21 ± 0.011 b 2.15 ± 0.20 abc 33.16 ± 0.09 a Pf-Tiz M1 0.23 ± 0.006 ab 3.90 ± 0.71 ab 28.41 ± 0.55 abc Pf-Tiz M2 0.20 ± 0.004 b 2.87 ± 0.44 abc 29.83 ± 0.55 abc Pf-Hal 0.22 ± 0.015 ab 3.93 ± 0.67 ab 29.58 ± 0.34 abc Pf-Hal M1 0.20 ± 0.005 b 2.51 ± 0.26 abc 25.58 ± 1.21 c Pf-Hal M2 0.22 ± 0.000 ab 2.52 ± 0.56 abc 26.83 ± 1.69 bc Pf-Rg 0.24 ± 0.004 ab 3.96 ± 0.34 ab 32.33 ± 0.52 ab Pf-Rg M1 0.25 ± 0.004 a 3.26 ± 0.72 abc 28.91 ± 0.45 abc Pf-Rg M2 0.20 ± 0.000 b 1.58 ± 0.38 bc 30.41 ± 0.92 abc Pf-Tim 0.22 ± 0.007 ab 2.85 ± 0.21 abc 29.16 ± 0.95 abc Pf-Tim M1 0.23 ± 0.006 ab 3.03 ± 0.61 abc 30.33 ± 0.30 abc Pf-Tim M2 0.20 ± 0.009 b 1.38 ± 0.25 c 32.00 ± 0.36 ab Valores que no comparten una misma letra indican diferencias significativas Tukey (P=0.05). TCD=Tasa de Crecimiento diario, TGH=Tasa de germinación por hora.

52 6.4 Caracterización molecular

6.4.1 Producción de biomasa

La siembra de los aislamientos en medio liquido Caldo Dextrosa Sabouraud permitió obtener entre 1 a 1.5 g de micelio filtrado, lo cual fue suficiente para la extracción del ADN cromosómico de los aislamientos de P. fumosoroseus.

6.4.2 Extracción y cuantificación del ADN

La metodología empleada permitió obtener ADN con el rendimiento y calidad suficiente para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Figura 3).

Figura 3. ADN cromosómico obtenido de los aislamientos de P. fumosoroseus. Carril 1) Marcador de peso molecular 1 kb Leader (Gibco, Lab), 2) PfTiz, 3) Pf-Tim, 4) Pf-Rg, 5) Pf-Hal y 6) Paesin.

53 6.4.3 Selección de iniciadores para la técnica RAPD-PCR

Las amplificaciones se realizaron con el ADN de uno de los aislamientos (PfTim). Tomando como parámetros la presencia de bandas más fuertes, más definidas y con mayor numero, fueron seleccionados los iniciadores OPB 02, OPB 06, OPB 07, OPB 09 y OPB 10 para la caracterización molecular de los aislamientos (Figura 4).

Figura 4. Selección de iniciadores carril 1) Marcador de peso molecular 1 kb Leader (Gibco, Lab), 2) OPB 01, 3) OPB 02, 4) OPB 03, 5) OPB 04, 6) OPB 05 7) OPB 06, 8) OPB 07, 9) OPB 08, 10) OPB 09, 11) OPB 10.

54 6.4.4 Caracterización molecular

Los fragmentos amplificados mediante PCR empleando cinco iniciadores del kit OPB de Operon Technologies permitieron observar la huella genética de los aislamientos evaluados, los cuales se muestran en las figuras #,#,#,#,#,#.

Figura #. Huella genética del aislamiento Paesin empleando cinco iniciadores diferentes.

55

Figura #. Huella genética del aislamiento Pf-Tiz empleando cinco iniciadores diferentes.

Figura #. Huella genética del aislamiento Pf-Tim empleando cinco iniciadores diferentes.

56

Figura #. Huella genética del aislamiento Pf-Rg empleando cinco iniciadores diferentes.

Figura #. Huella genética del aislamiento Pf-Hal empleando cinco iniciadores diferentes.

57 De acuerdo a la matriz de similitud y al dendrograma se evidenció la formación de dos grupos, el primero lo conforman todos los aislamientos de P. fumosoroseus con un promedio de similaridad interna de 68.2%. El promedio de similaridad es alto, lo que sugiere una baja variabilidad genética entre los aislamientos de P. fumosoroseus. El segundo grupo esta formado por los dos aislamientos de referencia (Beauveria bassiana). La matriz de similitud indica que existe una relación estrecha entre los aislamientos Pf-Tiz y Pf-Rg con un valor de 1.0, sin embargo, los aislamientos menos similares entre si fueron PfHal y Paesin con un valor de 0.38.

Cuadro 6. Matriz de similaridad genética construida a partir de los fragmentos amplificados. Pf-Tiz Pf-Tiz Pf-Tim Pf-Rg Pf-Hal Paesin HBb 5 HBb 22 0.92308 1.00000 0.57143 0.53846 0.46667 0.40000 Pf-Tim Pf-Rg 0.92308 1.00000 0.92308 0.92308 0.53333 0.57143 0.61538 0.53846 0.43750 0.46667 0.37500 0.40000 Pf-Hal Paesin HBb 5 HBb 22 0.57143 0.53846 0.46667 0.40000 0.53333 0.61538 0.43750 0.37500 0.57143 0.53846 4.46667 0.40000 0.38462 0.42857 0.18750 0.38462 0.20000 0.13333 0.42857 0.20000 0.58333 0.18750 0.13333 0.58333

Figura 6. Dendrograma obtenido a partir de las amplificaciones de los cinco aislamientos de P. fumosoroseus y dos de B. bassiana.

58 Tigano-Milani et al. (1995) emplearon la técnica de RAPD para analizar la variabilidad intra e interespecífica del género Paecilomyces, así como para realizar estudios epizootiológicos de P. fumosoroseus. Una gran

heterogeneidad fue detectada entre los aislamientos de este hongo. A pesar de baja homogeneidad observada entre los aislamientos aislados de Bemisia tabaci, diferentes genotipos fueron identificados entre los aislados de poblaciones epizoóticas de P. fumosoroseus en este insecto.

Azevedo et al. (2000) utilizaron RAPD para investigar la variabilidad molecular entre aislamientos de Paecilomyces y para identificar cinco aislamientos morfológicamente atípicos, obtenidos de Bemisia tabaci, que poseían alguna semejanza con P. fumosoroseus. La variabilidad observada en los productos de las amplificaciones fue suficiente para discriminar todos los aislamientos. La similaridad genética entre los aislamientos no identificados y los de P. fumosoroseus fue mayor que aquella observada entre los aislamientos de referencia de esta especie.

Debido al valor de los hongos entomopatógenos como agentes de control biológico, la caracterización molecular de estos microorganismos por medio de su huella genética es de suma importancia para el reconocimiento de la especie, cuando esta no esta bien definida, así como para la protección y patente de las cepas caracterizadas, en el momento que se han desarrollados como productos formulados (bioplaguicidas) y se han distribuidos para su uso en el manejo de plagas agrícolas.

59 VII. CONCLUSIONES

El uso de hongos entomopatógenos para el manejo integrado de plagas de importancia agrícola como la mosquita blanca ha evolucionado notablemente, hasta el punto de encontrar formulaciones comerciales ha base de estos microorganismos. Sin embargo, es indispensable la caracterización molecular, fisiológica y patogénica de estos microorganismos antes de ser empleados como una alternativa de manejo. De los resultados obtenidos del presente trabajo sobre “la caracterización fisiológica y molecular de Paecilomyces fumosoroseus y su actividad patogénica en estados inmaduros de Bemisia tabaci”, se concluye lo siguiente:

Los aislamientos evaluados presentaron efecto ovicida sobre huevos de B. tabaci, los aislamientos con mayor actividad fueron Paesin y el aislamiento monospórico M1 de Pf-Hal, estos aislamientos son promisorios para el control preemergente de las ninfas de B. tabaci.

Todos los aislamientos evaluados a una concentración de 1x107 esporas ml-1 fueron patogénicos en ninfas del primer instar de B. tabaci. De acuerdo al porcentaje de mortalidad acumulada los aislamientos más patogénicos fueron Pf-Rg, Pf-Tim y Paesin junto con sus dos cultivos monospóricos. Estos aislamientos se pueden considerar como posibles agentes biocontroladores de las poblaciones B. tabaci en cultivos agrícolas.

60  Los resultados obtenidos de acuerdo a los parámetros de tiempo letal medio (TL50) y concentración letal media (CL50) reafirmar la efectividad patogénica que tienen los aislamientos Paesin y Pf- Tim sobre ninfas de Bemisia tabaci.

La velocidad de crecimiento diametral fue estadísticamente igual entre los aislamientos evaluados, excepto para Pf-Tiz, Pf-Tiz M2, Pf-Hal M1, Pf-Rg M2 y Pf-Tim M2. La esporulación fue aceptable para todos los aislamientos con una producción mayor de 2x106 esporas ml-1, excepto para los aislamientos monospóricos M2 de Pf-Rg y Pf-Tim. La viabilidad de los aislamientos expresado en porcentaje de germinación por hora fue elevada con un promedio de 25.5%. La caracterización fisiológica de P. fumosoroseus permite identificar variabilidad entre estos aislamientos y seleccionar los aislamientos con características adaptativas que

favorezcan su supervivencia y eficacia como micoinsecticidas.

El uso de los iniciadores RAPD´s evaluados permitió diferenciar los cinco aislamientos de Paecilomyces fumosoroseus de los dos aislamientos de referencia (Beauveria bassiana). Sin embargo se observó una baja variabilidad genética entre los aislamientos de P. fumosoroseus.

Las huellas genéticas obtenidas con la técnica RAPD-PCR son una herramienta útil en la protección y patente de los aislamientos. Ya que estas cepas tienen la finalidad de que en un futuro se han desarrollados como bioplaguicida para el manejo integrado de B. tabaci en zonas agrícolas.

61  VIII. LITERATURA CITADA

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70 IX. APÉNDICE

Cuadro 1A. Análisis de varianza de la mortalidad acumulada en huevos de B. tabaci a los 7 días después de la inoculación de una suspensión de de 1x10-7 esporas ml-1 de P. fumosoroseus. F.V. Aislamientos Error Total DMS=4.5764 G.L. 15 48 63 S.C. 12792.00 3730.30 16523.00 C.M. 852.82 77.71 F.Cal. 10.97 Pr > F 0.0001

Cuadro 2A. Análisis de varianza de la mortalidad acumulada en ninfas del primer instar de B. tabaci a los 12 días después de la inoculación de una suspensión de 1x10-7 esporas ml-1 de P. fumosoroseus. F.V. Aislamientos Error Total DMS=4.6627 G.L. 15 48 63 S.C. 19029 3872.10 22901 C.M. 1268.2 80.668 F.Cal. 15.72 Pr > F 0.0001

Cuadro 3A. Análisis de varianza de la tasa de crecimiento diario de la colonia de los aislamientos de P. fumosoroseus. F.V. Aislamientos Error Total DMS=0.0085362 G.L. 14 45 59 S.C. 0.015093 0.012125 0.027218 C.M. 0.0010781 0.0002694 F.Cal. 4.00 Pr > F 0.0002

71 Cuadro 4A. Análisis de varianza de la esporulación de los aislamientos de P. fumosoroseus. F.V. Aislamientos Error Total DSM=0.504491 G.L. 14 45 59 S.C. 43.6649 42.3504 86.0153 C.M. 3.1189 0.9411 F.Cal. 3.31 Pr > F 0.0011

Cuadro 5A. Análisis de varianza del porcentaje de germinación por hora de los aislamientos de P. fumosoroseus. F.V. Aislamientos Error Total DMS=1.214377 G.L. 14 45 59 S.C. 221.133 245.387 466.520 C.M. 15.795 5.453 F.Cal. 2.90 Pr > F 0.0034

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