Cultivo y tinción

selectiva de
bacterias
ALUMNO: Kevin Perdomo
GRUPO: 3ro BG Química Industrial
ASIGNATURA: Microbiologia
Objetivos:
Hacer un medio de cultivo específico para la bacteria E. Coli y realizar una tinción
selectiva para reconocer: esporas, capsulas y bacterias del tipo ácido-alcohol resistentes
en el microscopio.

Marco teórico:
Cultivos de bacterias:
En microbiología se utilizan dos grandes clases de medios de cultivo: los
definidos y los complejos. Los medios definidos se preparan añadiendo
cantidades precisas de productos orgánicos o inorgánicos puros a agua destilada.
Por tanto, en un medio definido se conoce la composición exacta (tanto en
sentido cualitativo como cuantitativo). En cualquier medio de cultivo es
fundamental la fuente de carbono, porque todas las células necesitan grandes
cantidades de este elemento para elaborar nuevo material celular (Figura 3.1). La
fuente concreta de carbono y su concentración dependen del organismo que se
va a cultivar. En la Tabla 3.2 se presentan las recetas para cuatro medios de
cultivo. Algunos medios , como el que se cita para Escherichia coli, se
consideran «simples» porque contienen una sola fuente de carbono. En este
medio, las células de E. coli sintetizan todas sus moléculas orgánicas a partir de
glucosa. Si se desea cultivar muchos microorganismos, no es esencial conocer la
composición exacta de un medio. En estos casos, es suficiente con un medio
complejo. (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, Stahl; 2015)
Que son y para qué sirven las tinciones en microbiología:
“En el microscopio óptico, la mejora del contraste favorece la imagen final. La tinción
es un método fácil y rápido de mejorar el contraste, pero hay muchas otras formas de
hacerlo” (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, Stahl; 2015).
Se pueden usar colorantes para teñir las células y mejorar el contraste, de modo
que sea más fácil observarlas al microscopio de campo claro. Los colorantes son
compuestos orgánicos, y cada clase de colorante tiene una afinidad por
materiales celulares concretos. Muchos de los usados en microbiología tienen
carga positiva, y por esta razón reciben el nombre de colorantes básicos.
Ejemplos de ellos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Los
colorantes básicos se unen fuertemente a los componentes celulares cargados
negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Como las
superficies celulares suelen estar cargadas negativamente, estos colorantes
también tienen gran afinidad por dichas superficies, de modo que son muy útiles
para un estudio general. (Madigan, Martinko, Bender, Buckley, Stahl; 2015)

Materiales:
 Microscopio
 Aceite de inmersión
 Alcohol etílico
 Agua destilada
  Cuentagotas
 Portaobjetos y cubreobjetos
 Papel de filtro
 Asa
 Mechero Bunsen
 HCl 3%
 Verde malaquita
 Safranina
 Tinta china
 Fuscina
 Azul de metileno

Procedimiento:
Preparación del cultivo para E.Coli:
Se masaron 15 gramos de glucosa y se trasvasaron a un matraz Erlenmeyer.
Se masaron 5 g de extracto de levadura y se pusieron en el mismo matraz Erlenmeyer.
Se masaron 5 g de caldo de carne y se trasvasó al matraz Erlenmeyer.

Se masaron 2 g de fosfato de potasio monobásico ( K H 2 P O4 ) y se trasvasó al matraz

Erlenmeyer.
Se agregaron 200 mL de agua destilada y se puso la mezcla en el agitador magnético
hasta que sea lo más homogénea posible. (Si es necesario calentar el matraz para que
sea más rápido)
Tinción de esporas:
1) Se preparó el frotis bacteriano.
2) Se tiñió con verde malaquita (previamente se diluyó 5 g en 100 mL. de agua
destilada). Se calentó la preparación durante 5 minutos para que el colorante humee,
pero sin que hierva.
3) Se lavó con agua destilada el resto del colorante.
4) Se tiñió con safranina 1 minuto.
5) Se lavó con agua el resto del colorante.
6) Se secó la preparación.
7) Se observó al microscopio con el objetivo de inmersión.
Tinción de cápsulas:
1) De un cultivo se tomó con el asa una pequeña cantidad y se depositó en un lado del
portaobjetos.
2) Se añadió una gota de tinta china y se mezcló bien con la suspensión de
microorganismos.
3) Con otro portaobjetos se realizó una extensión y se deja secar.
4) Se añadió safranina durante 1 minuto.
5) Se lavó con agua y dejar secar.
6) Se obsrevó al microscopio con el objetivo de inmersión.
Tinción de Ziehl-Neelsen o ácido-alcohol resistente:
1) Se preparó un frotis bacteriano.
2) Se colocó un trozo de papel de filtro del mismo tamaño que el portaobjetos sobre la
preparación.
3) Se cubrió la preparación con fuscina.
4) Se calento la preparación durante 5 minutos mediante pasadas sucesivas sobre la
llama del mechero. No debe hervir, sólo debe emitir vapores. Si se evapora se añade
más fuscina para que no se seque en ningún momento.
5) Se quitó el papel del filtro y se lavó con agua destilada.
6) Se decoloró con la mezcla ácido-alcohol (HCl al 3% en etanol 96°) hasta que no se
desprenda más colorante (20 segundos aproximadamente).
7) Se lavó con agua para que no prosiga la decoloración.
8) Se tiñió con azul de metileno 2 minutos.
9) Se lavó con agua el resto del colorante.
10) Se dejó secar la preparación.
11) Se observó al microscopio con el objetivo de inmersión.

Resultados y observaciones:
En nuestro medio de cultivo, el cual era específico para E.Coli se lograron ver esporas
de esta bacteria. Y como se esperaba en el ensayo de Ziehl-Neelsen no se logró
reconocer nada ya que esta bacteria no es del tipo ácido-alcohol resitente.

Bibliografia:
Brock. Biologia de los microorganismos. (Madigan, M; Martinko, J; Bender, K;
Buckley, D; Stahl, D; 2015) PEARSON (14th edición)