Departamento de Ciencias y Técnicas Fisicoquímicas Grado en Químicas

Técnicas y Métodos en Bioquímica

Tema 5. Espectroscopía UV-Vis: aplicaciones y ejemplos

ESPECTROSCOPÍA: PRINCIPIOS BÁSICOS

La espectroscopía es una parte de la ciencia que estudia cualquier tipo de interacción

de la radiación electromagnética con la materia. A continuación revisaremos
brevemente la naturaleza de la radiación electromagnética para presentar los distintos
tipos de interacción que pueden tener lugar y, por extensión, los distintos tipos de
espectroscopía.

La radiación electromagnética: longitud de onda, frecuencia, energía e

intensidad
Podemos considerar a la radiación electromagnética como una forma de propagación
de energía a través del espacio. Desde el punto de vista de las leyes de la mecánica
clásica, la luz se considera una onda, con dos componentes, una eléctrica y otra
magnética. Precisamente la espectroscopía dio las primeras evidencias experimentales
para considerar que, además de comportarse como una onda, a la luz se le podía
asociar un comportamiento corpuscular, comportamiento que está en la base de los
orígenes de la mecánica cuántica.
Considerando la luz como una onda electromagnética que se propaga en el espacio,
podemos caracterizarla, por la siguiente función seno:

I= I0 sen(2x/) (Ecuación 1)

donde I es el campo eléctrico o magnético, I0 es el valor máximo del campo eléctrico o

magnético, x (cm) es la distancia a lo largo del eje de propagación y  es la longitud de
onda (distancia recorrida en un ciclo completo). La periodicidad en el tiempo nos
permite establecer las siguientes correspondencias:

I= I0 sen(2x/)= I0 sen2t = I0 sent (Ecuación 2)

donde  es la frecuencia (ciclos por segundo, s-1 o Hertzios, Hz),  es la velocidad

angular en rad s-1, y t es el tiempo (s). La velocidad de propagación de esta onda será
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, que en el caso de la radiación electromagnética es la velocidad de la luz. De esta

forma, de acuerdo con su naturaleza ondulatoria, podemos caracterizar la radiación
electromagnética por parámetros como frecuencia,  (Hz), longitud de onda,  (cm), o
su inverso, el número de ondas, (cm-1). El tratamiento como onda es de gran utilidad
para comprender algunos de los métodos experimentales utilizados en espectroscopía.
La naturaleza corpuscular de la luz nos permite hablar de ella como flujo de partículas
denominados fotones, caracterizados por diferente energía. La energía de cada fotón
es proporcional a la frecuencia o longitud de onda de la radiación, de acuerdo con la
conocida ecuación de Planck (Ecuación 3).

(Ecuación 3)
E= h = hc/

donde c es la velocidad de la luz y h es la constante de Planck.

Por último, en nuestro trabajo con la radiación electromagnética es necesario definir
otro parámetro: la intensidad de la radiación, I, que es el número de fotones por
unidad de tiempo que atraviesa la unidad de área, perpendicular a la dirección de
propagación. Es decir, pueden existir dos radiaciones electromagnéticas con la misma
energía y diferente intensidad

El continuo de longitudes de onda, frecuencias o energías que constituyen todo el

espectro de la radiación electromagnética podemos dividirlo, de forma arbitraria, en
diferentes regiones, que se establecen en función del tipo de efecto que los distintos
tipos de radiación ejercen sobre la materia. De esta forma, las distintas zonas en las
que dividimos el espectro electromagnético están relacionadas con las distintas
técnicas espectroscópicas, tal y como se muestra en la Figura 1.
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Figura 1. Regiones del espectro electromagnético.

Interacción radiación-materia: transiciones energéticas cuantizadas

La radiación electromagnética, cuando atraviesa la materia, puede interaccionar con
partículas que tengan carga eléctrica o momento magnético, produciéndose una
transferencia de energía entre la radiación y la materia. Esta interacción se puede
describir como el resultado del intercambio de fotones entre las partículas que
interactúan, produciendo unas transiciones características que se manifiesta en el
espectro que podemos observar. La energía, o longitudes de onda,
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absorbidas/emitidas, y la intensidad, relacionada con la eficiencia con se producen

esas absorciones/emisiones, son dos de las características medibles de estas
transiciones, que se nos manifiestan a través del espectro de una sustancia.
La característica fundamental de estas transiciones energéticas es que están
cuantizadas. Es decir, cada sistema concreto puede encontrarse en unos estados
energéticos concretos, pudiendo pasarse de uno a otro mediante la absorción o
emisión de una cantidad concreta de energía. En una molécula, la energía total es el
resultado de la suma de muchos tipos de energía: electrónica, por el movimiento
continuo de los electrones de cada átomo o enlace, vibracional, originada por el
movimiento periódico de sus átomos con respecto a sus posiciones de equilibrio,
rotacional, etc., y asociados a cada uno de estos tipos hay estados energéticos
posibles, característicos para cada sistema concreto (niveles energéticos rotacionales,
niveles energéticos vibracionales, electrónicos, etc.). Planck sugirió que la energía
absorbida o emitida por un sistema puede tomar la forma de radiación
electromagnética, y que la frecuencia de la radiación era proporcional a la energía,
siendo el factor de proporcionalidad lo que se denominó constante de Planck
(Ecuación 3). Desde un punto de vista descriptivo, podemos decir que si una radiación
electromagnética de amplio espectro incide sobre una sustancia, los átomos o
moléculas que la integran absorberán aquellos fotones cuya energía les permitan pasar
del nivel energético en el que se encuentren (la ocupación de los distintos niveles
energéticos, a una determinada temperatura, se ajunta a la ley de distribución de
Boltzmann) hacia otro de los posibles, de acuerdo con su naturaleza. Es decir, se
absorberán los fotones cuya energía coincida con las diferencias energéticas entre los
distintos niveles posibles. El resultado será el espectro de absorción de la sustancia.
También es posible que aquellas moléculas que se encuentren en estados energéticos
excitados (de más alta energía) emitan radiación para pasar a su estado de mínima
energía. En este caso, los fotones tendrán energía equivalente al tránsito producido, y
lo que podremos registrar es su espectro de emisión, complementario al anterior. En
principio, son igual de probables los tránsitos desde el nivel de menor energía al
superior y los inversos. El que suceda uno u otro sólo depende del grado de ocupación
de ambos. A temperatura ambiente, casi todas las moléculas se encontrarán en el nivel
menos energético.
Desde un punto de vista puramente descriptivo y práctico podemos establecer que no
es posible la captación de radiación por parte de una molécula (o esta no emitirá
fotones) cuya energía no se corresponde exactamente con la diferencia entre sus
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distintos niveles energéticos posibles. Como conclusión surge que en nuestros estudios
espectroscópicos tendremos que elegir la técnica que nos permita trabajar en la región
del espectro cuya energía se corresponda con el tipo de transición que queremos
provocar (Figura 1).
Antes de finalizar este apartado, tenemos que mencionar que si bien, en principio,
podríamos esperar que, al suministrar las cantidades de energía adecuadas a una
molécula, se efectúen transiciones energéticas entre dos niveles cualesquiera,
experimentalmente se puede comprobar que los espectros muestran muchas menos
líneas de las esperadas. Esto implica que sólo determinadas transiciones son
“permitidas”. Para definir las transiciones permitidas en cada espectroscopía hablamos
de “reglas de selección”, con lo que nos estamos refiriendo a las condiciones que se
tienen que satisfacer para que un sistema pase de un estado a otro a causa de su
interacción con la radiación electromagnética [1,2].

Intensidades en las transiciones

Ya mencionábamos antes que además de la energía de una transición, determinada
por la separación energética que existe entre los niveles de energía, hay otra
característica medible en las transiciones energéticas: la intensidad, que está
relacionada con la eficiencia con que se producen esas absorciones/emisiones. Una
muestra de moléculas no absorberá todos los fotones de una determinada energía que
lleguen en una irradiación. La intensidad de una transición a una determinada
frecuencia viene descrita por la absortividad de la Ley de Lambert-Beer, desde un
punto de vista empírico, y por los coeficientes de Einstein, relacionados con la
probabilidad estimada de que un fotón sea absorbido o emitido por una molécula de la
muestra. El espectro de una sustancia refleja, a través del área de las bandas de un
espectro, la intensidad (probabilidad) mecano-cuántica de una transición. En general,
podemos decir que “la intensidad de la línea de absorción es proporcional a la
población del estado inferior. Además, cuando se irradia una muestra habrá también
emisión inducida y espontánea y podemos esperar que estos efectos competitivos
disminuyan la intensidad de las líneas de absorción” [1,2].
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Espectrofotómetros
Los instrumentos que vamos a utilizar para la medida experimental de la
absorción/emisión de radiación por una muestra se denominan espectrofotómetros.
Los componentes básicos que, en general, necesitan son:
 fuentes de emisión de radiación electromagnética,
 sistemas que permitan separar o descomponer la radiación según su longitud
de onda y concentrar un pequeño rango de frecuencias sobre la muestra,
 conjunto de espejos y lentes que permitan dirigir la radiación por donde nos
interese,
 compartimentos, soportes, células, cubetas o tubos dónde colocar la muestra,
 sistemas de detección que nos permitan conocer las características de la
radiación después de atravesar la muestra
 sistemas para la lectura y tratamiento de las señales detectadas

Dispondremos de diferentes fuentes de emisión de radiación, que se utilizarán según

el rango del espectro en el que se trabaje. Entre los sistemas que nos permiten
descomponer la radiación policromática en monocromática están los denominados
monocromadores, que junto con estrechas rendijas, hacen que podamos focalizar
sobre la muestra sólo radiación dentro de un pequeño intervalo de frecuencias. Los
monocromadores han sido sustituidos en algunas técnicas espectroscópicas por los
interferómetros, que permiten no descomponer la radiación antes de hacerla pasar a
través de la muestra. El uso de interferómetros ha permitido que, en lugar de
determinar la intensidad de la radiación absorbida por una muestra a cada frecuencia,
de forma secuencial (espectroscopía convencional), se pueda irradiar con un pulso de
radiación que contenga fotones de un espectro amplio de energía proveniente de un
interferómetro , al interferograma resultante se le aplica la transformación de Fourier
que permite obtener la representación de las intensidades de la radiación en función
de las distintas frecuencias, es decir, el espectro de la sustancia. En cuanto a las
características principales de los recipientes en los que colocaremos la muestra son el
ser transparentes al rango de radiación con el que estemos trabajando, e inertes a las
muestras. Los elementos ópticos y los detectores variarán en función de la técnica y,
finalmente, en prácticamente todos los espectrofotómetros que nos encontramos
actualmente, la señal eléctrica que sale del detector se transformará en señal digital,
que podrá ser analizada y tratada en ordenadores.
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Referencias utilizadas

[1] Principios básicos de Espectroscopia, R. Chang (1977) Editorial AC. Traducción de I.

Katime. Capítulo 1.

[2] Physical Chemistry for the Chemical and Biological Sciences, R. Chang (2000),
3ª ed., University Science Books. Págs. 701-711.

[3] Principles of Physical Biochemistry . , K.E. Van Holde, W.C. Jonson y P.S. Ho (1ª ed.
1998, 2ª ed. 2006) Prentice Hall, Upper Saddle River, Nueva Jersey.

[4] Spectroscopy for the Biological Sciences, G.G. Hammes (2005), John Wiley & Sons, Inc.
Nueva Jersey.

[5] Fundamentals of Molecular Spectroscopy, C.N. Banwell (1994), 4ª ed. McGraw-Hill.

Traducida al castellano la 3ª ed. por O. de la Cruz : "Fundamentos de Espectroscopia
Molecular"; 3ª ed.; Ed. Castillo, Madrid (1977).