Tema 1: Fundamentos de espectroscopía

1. Biofísica

La biofísica es un área interdisciplinar de la ciencia que estudia la organización, la dinámica y la función de los seres
vivos y sus partes desde una perspectiva fisicoquímica con el propósito de entender los principios fundamentales
que los gobiernan. Así, los biofísicos estudian la vida en todos sus niveles, desde átomos y moléculas, hasta células y
organismos, con el objetivo de conocer en profundidad cómo funcionan los sistemas biológicos y cuáles son las
bases moleculares que los sustentan.

Para ello, aplican las leyes y principios generales de la Físico-Química y las Matemáticas, utilizando herramientas
teóricas, computacionales y experimentales (técnicas fisicoquímicas).

1.1 Técnicas biofísicas

Son técnicas que permiten estudiar la estructura, propiedades y funciones de biomoléculas, células y procesos
biológicos. Son empleadas por especialistas de tanto Biología Estructural como de Biología Celular:

 Permiten entender macromoléculas biológicas, especialmente proteínas y ácidos nucleicos, adquieren sus
estructuras y como éstas determinan sus funciones (Biología Estructural).
 Permiten evaluar cómo las alteraciones de dicha estructura afectan a las funciones bioquímicas y celulares
de estas macromoléculas.
 Permiten identificar y caracterizar interacciones biológicas.
 Proporcionan imágenes de células y estructuras e incluso de las moléculas individuales.
 Permiten evaluar viabilidad celular, diferenciación celular, y procesos celulares específicos (Biología Celular).

2. La Radiación electromagnética

La luz se define clásicamente como el conjunto de radiaciones electromagnéticas cuya longitud de onda es capaz de
captar al ojo humano. Aunque técnicamente, todas las radiaciones electromagnéticas (ultravioleta, ondas de radio,
microondas), también son luz, solo que resultan invisibles a nuestros ojos (pues su longitud de onda queda fuera del
rango que podemos detectar con los ojos). No obstante, estas radiaciones electromagnéticas se pueden detectar
mediante instrumentos específicos.

La espectroscopía es el estudio del espectro electromagnético de cualquier objeto o compuesto, para obtener
mucha información acerca de sus propiedades fisicoquímicas y de su entorno, ya sea por la luz emitida o absorbida
por él. También se define como el estudio de la interacción entre la materia y la radiación electromagnética. El
efecto de la materia dependerá de la energía de la radiación, de modo que se puede obtener información estructural
de la materia a diferentes niveles, dependiendo del tipo de radiación empleada, por ejemplo:

 Los rayos X generan una ionización de las moléculas.

 La radiación UV-Visible provoca transiciones electrónicas entre orbitales (atómicos y moleculares).
 La radiación infrarroja produce vibración y deformación de los enlaces químicos.
 Las microondas producen rotaciones en torno a los enlaces químicos.
 La ondas de radio producen transiciones de spin (electrónicas o atómicas)

Un cromóforo es cualquier grupo de átomos que absorbe luz, independientemente de que produzca color o no.
Todas las moléculas absorben luz en algún rango de longitud de onda determinado, pero a ciertas longitudes de
onda son ciertos grupos químicos los que dominan el espectro.
2.1 La naturaleza dual de la radiación electromagnética

La radiación electromagnética es una combinación de campos eléctrico y magnéticos oscilantes y perpendiculares

entre sí, que se propagan en el espacio y en el tiempo como una serie de ondas que transportan energía. La
velocidad de propagación de esta radiación electromagnética en el vacío, c, es 299,792 Km/s, y su dirección de
propagación es perpendicular a las oscilaciones de los dos campos (eléctrico y magnético).

Por otro lado, la radiación electromagnética se puede considerar también como un ‘’chorro’’ de partículas que
‘’viajan’’ dentro de la onda, y esas partículas son los fotones. Esta dualidad onda-corpúsculo hace queda cada fotón
tenga una energía proporcional a la frecuencia de la onda asociada:

E es energía del fotón, h es la Constante de Planck (6.6.10

-27 erg.s; 6.6.10 -34J.s; ), y  es la frecuencia de la onda

2.2 Propiedades y características de las ondas

 Longitud de onda, λ: Distancia entre dos puntos que

ocupan la misma posición.
 Frecuencia, : Número de veces que un punto pasa por
una determinada posición en un lapso de 1 segundo.
 Amplitud: Es la mitad del desplazamiento máximo, y
representa la cantidad de energía que transporta la onda.

La longitud de onda y la frecuencia de oscilación están

relacionadas por una constante, que es la velocidad de la luz en el
medio, V (c si es en el vacío). De este modo, si aumenta la
frecuencia, la longitud de onda debe disminuir.

3. El espectro electromagnético

Es el rango de todas las radiaciones electromagnéticas posibles, por tanto abarca radiaciones con una longitud de
onda muy grande (y frecuencia baja) o muy pequeña (frecuencia muy alta). Las radiaciones de longitud de onda
pequeña (y por tanto, alta frecuencia) son las más energéticas (por la fórmula E=h), por eso son peligrosas
(radiación X, Gamma, UV…), pueden causar mutaciones en el genoma.

En realidad, como vemos en la imagen, el visible constituye solo una pequeña parte del espectro (aquella región
detectada por el ojo humano).

Existen fuentes naturales que generan ondas de todas estas longitudas de onda (pensar por ejemplo en las estrellas),
pero también se han inventado aparatos, instrumentos que pueden generar estas radiaciones, por ejemplo: el ser
humano inventó la bombilla para generar luz visible, y los equipos de espectroscopía pueden emplear diferentes
‘’bombillas’’ que generen ondas de determinadas longitudes de onda.
3.1 Técnicas espetroscoópicas

Según la forma del analito en el momento en que sufre el proceso espectroscópico (ionización, vibración,
transición…) se emplean diferentes técnicas. Atendiendo a la imagen, podemos apreciar que un mismo tipo de
radiación electromagnética puede emplearse en técnicas diferentes (UV-Visible se emplea en la espectroscopía del
mismo nombre, en la dicroísmo circular y en la espectroscopía de fluorescencia UV-Vis). El paso limitante en la
creación de estas técnicas ha sido el generar las radiaciones de esas longitudes de onda tan dispares en un aparato
de forma segura, y también la detección y el análisis (obtención e interpretación) de los datos obtenidos con el
aparato.

4. Fuentes de radiación

Su misión es la generación de un haz de radiación con suficiente potencia de salida y estabilidad para que se detecte
y se mida con facilidad. Pueden ser:

 Continuas: si emiten radiación que varía en su intensidad en un amplio rango de longitudes de onda (Δλ)
 Discontinuas o de líneas: si emiten un número limitado de bandas de radiación, cada una de las cuales
abarca un rango limitado de longitudes de onda
 Tema 2: Espectroscopía de absorción UV-VIS
1. Región Ultravioleta-Visible

La espectroscopia ultravioleta-visible o (UV-VIS) utiliza radiación electromagnética (luz) de las regiones visible,
ultravioleta cercana (UV) e infrarroja cercana (NIR) del espectro electromagnético (190nm y 780-800nm). La
radiación absorbida por las moléculas desde esta región del espectro provoca transiciones electrónicas que pueden
ser cuantificadas. Recuerda que el espectro es continuo, de modo que cada aparato puede trabajar en valores de
longitud de onda un poco diferentes (la Luz UV puede detectarse en 185/190/195 nm).

 La luz visible es lo que conocemos como luz blanca, y es la que dan las
lámparas que utilizamos en el día a día. En realidad, no es luz blanca,
pues abarca radiaciones de longitudes de onda desde los 380 a los 800
nm, lo que ocurre es que a nuestro ojo llega el conjunto de todas ellas y
eso hace que la veamos blanca. Ya sabemos que si un haz de luz blanca
atraviesa un prisma óptico (con un índice de refracción diferente al del

aire), cada onda con una longitud de onda diferente se comporta I'll see you on the dark side of
distinto, refracta con un ángulo distinto, y así la luz blanca se separan the moon
en diferentes radiaciones, cada una con una longitud de onda en
concreto.
 La luz UV abarca longitudes de onda desde 190-380 nm. Su nombre proviene de que su rango empieza desde
longitudes de onda más cortas de lo que los humanos identificamos como el color violeta, pero dicha luz o
longitud de onda, es invisible al ojo humano al estar por encima del espectro visible.

1.1 Transición electrónica entre orbitales moleculares

La materia absorbe luz, absorbe luz blanca de todos los colores menos la que refleja que es el color que vemos en la
materia. Por ejemplo: A gran escala, mi jersey azul absorbe luz blanca, o conjunto de radiaciones electromagnéticas
de todas las longitudes de onda (del visible), menos la radiación correspondiente al azul (longitud de onda 420-
440nm). A pequeña escala, en los espectrofotómetros, los detectores podrán captar cuanta radiación es absorbida
por las moléculas (ya veremos cómo lo hacen) para poder obtener información sobre ellas.

Sigamos a pequeña escala: cuando un átomo absorbe un fotón UV o un fotón de luz visible, la energía de ese fotón
puede excitar uno de los electrones del átomo de tal forma que alcance un nivel de energía mayor. Este movimiento
del electrón, de un menor nivel de energía a uno mayor, o de regreso de un nivel mayor de energía a uno menor, se
conoce como transición. Para que ocurra una transición, la energía del fotón absorbido debe ser mayor o igual que la
diferencia de energía entre los 2 niveles. Sin embargo, una vez que el electrón es excitado y alcanza un mayor nivel
de energía, está en una posición más inestable que en la que estaba cuando se hallaba relajado en su estado base.
Así, el electrón rápidamente caerá al estado de menor energía y, al hacerlo, emitirá un fotón con la misma energía
que la diferencia entre los niveles energéticos.

Esto no ocurre solo en los átomos, sino también en las

moléculas. Vimos en el tema anterior que la absorción de luz
UV-VIS por parte de una molécula promueve la transición
electrónica, es decir, el paso de un electrón desde un orbital
fundamental a un orbital excitado (hablamos ahora de
orbitales moleculares porque estamos hablando de los
orbitales que se forman cuando se generan las moléculas,
cuyos átomos comparten electrones).
Existen diferentes tipos de transiciones electrónicas (de orbitales enlazantes, a los no enlazantes, o antienlazantes),
no obstante, lo que siempre se va a cumplir es que para se produzca el salto de un orbital molecular enlazante a uno
no enlazante o antienlazante, la radiación electrónica que debe incidir sobre ese electrón debe ser la misma que la
diferencia de energía entre ambos orbitales (ΔE). En ese caso, el electrón absorbe la energía y salta al orbital
excitado. El valor de ΔE necesario para exccitar va a depender de la molécula que se ha formado.

¿Por qué el espectro de absorción de una molécula no es un pico discreto,

sino una banda?

La gran mayoría de compuestos químicos absorben en el UV, y para cada

molécula se pueden producir diferentes transiciones entre diferentes
orbitales moleculares. Además, los enlaces moleculares son dinámicos, las
moléculas son flexibles y tienen grados de libertad vibracional y rotacional, y
eso son diferencias de energía pequeñas pero suficientes para que el estado
basal y el excitado tienen diferentes subniveles de energía, en lugar de uno
único (las bandas de absorción UV/Vis son anchas, debido a que los niveles
vibracionales y rotacionales de la molécula se encuentran superimpuestos
sobre los niveles electrónicos). De este modo, se puede excitar un electrón
que se encuentre en cualquiera de los diferentes subniveles del estado basal
para que pase a cualquiera de los subniveles del estadoexcitado, y por eso en

los espectros se obtienen bandas en lugar de picos. No

obstante, esas bandas presentan un valor máximo de
absorción, al que nos referimos habitualmente, que es la
longitud de onda máxima de absorción (λmax).

Obviamente, esto ocurre no solo en un átomo, sino en todos los que conforman una molécula. Normalmente, el
espectro de absorción de una molécula no es la suma de los espectros de los grupos que la constituyen, esto
genera:

 Efecto hipercrómico: Desplazamiento (del máximo de

absorción) que provoca un aumento de la Absorbancia de la
sustancia (Destaca el caso de la desnaturalización del DNA)
 Efecto hipocrómico: Desplazamiento que provoca que se
disminuya la absorbancia de la sustancia.

Además, una molécula no está aislada en el vacío, sino que tiene un

entorno, un solvente, y ese entorno puede ejercer influencia

sobre el espectro de absorción de la molécula. En un entorno
polar, se estabilizan todos los estados, pero aún se estabilizan
más si hay separación de cargas, distinguimos:

 Desplazamiento Batocrómico: Desolazamiento al rojo,

es el desplazamiento del máximo de absorción hacia
 longitudes de onda mayores, es decir, ‘’hacia la dcha’’. En este caso, nos desplazamos hacia longitudes de
onda mayores porque la diferencia de energía es menor.
 Desplazamiento hipsocrómico: Desplazamiento de la longitud de onda al azul visible, es decir, ‘’hacia la
izda’’ Nos desplazamos hacia longitudes de onda más pequeñas porque la diferencia de energía es mayor.

Que se produzcan estos desplazamientos implica, como estamos viendo, que para producir una misma transición,
dependiendo del entorno y de la propia molécula necesitaré más o menos energía, y por tanto, longitudes de onda
diferentes para excitar a los electrones de una molécula, y esto es lo que nos puede dar información sobre ella,
sobre su entorno de la molécula, si está purificada, etc.

2. Espectroscopía UV/VIS

En un espectroscopio, la intensidad de la luz absorbida se mide por el porcentaje de luz incidente que atraviesa la
muestra.

En realidad, un espectrofotómetro no mide directamente la intensidad de la luz absorbida por la muestra, si no la

intensidad de la luz que ha sido capaz de atravesar la muestra y que es la que llega al detector. Lo que ocurre es que
la luz que no ha atravesado la muestra se asume que es la absorbida. El detector capta la intensidad de la onda
emergente, y el aparato da datos de porcentaje de transmitancia, que puede transformar luego en datos de
absorbancia.

2.1 Ley de Lambert-Beer (oh no)

La transmitancia no se puede relacionar con la concentración, pero la absorción sí, a través de la Ley de Beer-
Lambert, que dice que la absorción de esa luz es función del número de moléculas que absorben (es decir, de la
concentración de la sustancia) y de la capacidad de absorción de cada molécula (ε)

Donde:

 ε es el coeficiente de extinción molar (unidades M-1∙cm-1) o absortividad molar.

Representa a cada longitud de onda la capacidad que tiene una sustancia de absorber la radiación

electromagnética. Sería la forma correcta de dar un espectro. ES DIFERENTE PARA CADA λ.

 c es la concentración molar del soluto. A mayor concentración mayor absorción.
 l es la longitud de la cubeta (habitualmente 1 cm)

Esta ley permite corregir la dependencia de la concentración y otros factores operacionales al comparar distintos
compuestos. La Abs es adimensional.
Consideraciones a tener en cuenta:

 En sistemas biológicos, la concentración suele estar en micromolar o milimolar, asi que épsilon se puede dar
en esas unidades (a la menos uno y por cm-1, claro).
 El coeficiente de extinción molar (ε) es un parámetro que no depende de nada, por eso sería la forma
correcta de dar un espectro.
 Hay que tener cuidado con la cubeta a utilizar, pues hay materiales que en el UV absorben, por eso el
material de la cubeta es diferente en ese caso (cuarzo). En el visible se puede utilizar vidrio o plástico. Por
otro lado, las cubetas libres de radiales hidróxilo se emplean para UV/Vis/IR cercano.
 Normalmente el espectro se toma en disoluciones diluidas (1 mg/ 100 ml solvente, aunque puede depender
del ε de la muestra). La Ley LB solo se cumple hasta valores de Abs=1 normalmente (en equipos muy buenos
se puede aceptar una Abs=2).
 El espectro se toma normalmente como log(I0/I) vs. λ (nm). Sin embargo se convierte normalmente en Abs o
en ε frente a λ.
 No son fiables ni valores de Abs muy bajos (< 0.1) ni muy altos (> 1.5-2).

3. Tipos de espectrofotómetros

3.1 Espectrofotómetro de doble haz

Se compone de una lámpara de UV y otra de visible, y el haz generado se divide en dos con un juego de espejos. Se
requieren dos cubetas, una con la muestra y otra con la referencia (el blanco), de modo que la muestra siempre se
enfrenta a un cero., y así se obtienen simultáneamente la I0 y la I.

3.2 Espectrofotómetro de haz individual

En los de haz simple se ilumina en primer lugar la cubeta de referencia antes y luego el valor se va restando
electrónicamente.

En ambos tipos de espectrofotómetro, el haz pasa por un filtro o monocromador para que la luz que pasa a la
muestra tenga una longitud de onda diferente cada vez (se va haciendo un barrido), por eso se tarde un poco en
obtener el espectro. Una reacción no se puede estudiar con este equipo (solo se podría hacer en longitudes de onda
fijas, sin barrido).

3.3 Espectrofotómetro con detector de diodos

En este caso se ilumina la muestra con todas las longitudes de onda, y luego es la luz emergente la que se hace pasar
por el prisma, que las separa y finalmente hay un detector (regleta de diodos, un chip de silicio que contiene más de
mil fotodiodos), que colocados en el plano focal del monocromador pueden medir de forma simultánea múltiples
longitudes de onda. El chip contiene un condensador y un interruptor electrónico por cada diodo. Proporcionan
espectros que van variando a lo largo del tiempo, es decir, que permite medir la evolución con el tiempo en todo el
rango espectral.
3.4 Nanodrop

Permiten detectar concentraciones altas porque la l (longitud de cubeta) es muy pequeña (volúmenes muy
pequeños), se emplea para cuantificar DNA y RNA.

4. Estudio de proteínas

Las proteínas son unas de las biomoléculas de las que más información se puede obtener mediante técnicas
espectrofotométricas. Las proteínas y las enzimas son herramientas moleculares muy eficientes y sofisticadas que
emplean su conformación y el reconocimiento molecular (de otras proteínas o moléculas) para regular procesos
celulares. Recuerda: la estructura determina la función (y también la interacción).

Las proteínas y las enzimas son dianas muy interesantes en biotecnología, pues prácticamente todos los procesos
biológicos dependen de su actividad, y muchas enfermedades se producen porque las proteínas funcionan mal, ya
sea por mutaciones en su gen, por cambios en la estructura, mala interacción con otras…

4.1 Principales cromóforos en proteínas

Los cromóforos típicos de las proteínas (enlace peptídico y aa de las cadenas laterales) no absorben en el visible,
únicamente absorben luz por debajo de 300 nm. La absorción en la región del UV contiene información de la
composición de estas moléculas y de su estructura o conformación en solución.

La limitación la encontramos en los solventes biológicos empleados (tampones, agua…) Es necesario trabajar en un
solvente, normalmente una solución acuosa a pH cercano a 7 para simular las condiciones in vivo. Pero el agua
absorbe mucho por debajo de 170 nm e impone un rango de temperaturas de trabajo. Lo mismo ocurre con muchos
tampones y electrolitos biológicos, que absorben por debajo de 200 nm.

Recuerda que las proteínas son cadenas de momómeros, los aminoácidos, de modo que para comprender sus
espectros de UV debemos examinar varias contribuciones al espectro:

 Los monómeros individuales.

 La cadena de polímero.
 Las estructuras secundarias y terciarias
 Los puentes de hidrogeno y los efectos del solvente.
 La importancia de la conjugación: los aa aromáticos tiene orbitales moleculares en los que los electrones
quedan deslocalizados, lo que hace que su espectro se vaya hacia el visible (la transición electrónica es más
fácil, requiere radiaciones menos energéticas y por tanto de mayor longitud de onda, por eso se va al
visible), y eso nos va a dar más información. También ocurre con los grupos prostéticos o cofactores. Algunas
proteínas contienen metales o compuestos orgánicos (cofactores) que absorben luz por encima de los 300
nm, y desplazarán los espectros.

El espectro de absorción de una proteína tiene esta pinta:

  Por debajo de 250 nm hay una banda de absorbancia con un valor muy elevado, en torno a los 220 nm(λ),
que se corresponde con la absorción del enlace peptídico (como en una proteína hay muchos enlaces
peptídicos, la banda es muy intensa), esta banda no se usa mucho (en dicroísmo circular sí).
 En torno a 270-280 nm absorben las cadenas laterales de los aa aromáticos (Phe, Tyr, Trp). Este dato es el
que se utiliza para cuantificar las proteínas.
 Algunas proteínas con grupos prostéticos que absorben en el visible tendrán un espectro característico en el
visible

Veamos cada apartado por separado:

Ultravioleta lejano de proteínas: El enlace peptídico

La absorción del enlace peptídico se corresponde con la

transición más alta (220 nm, con coeficientes de extinción
molar muy altos, del orden de 100-7000 M-1 cm-1). La banda
más intensa de absorción en realidad estaría en 190 nm, pero
como todo lo que haya en la solución puede absorber, el
espectro se desplaza y eso hace que aparezca la banda (no
pico) a 220 nm. La transición es de un orbital π a uno π *
(enlazante a antienlazante).

Ultravioleta cercano de proteínas

Ofrece más información, se trata de bandas que aparecen en torno de 230-300 nm (en teoría se supone que el
máximo de absorción está a 280 nm) Y en esa región los cromóforos que tenemos son las cadenas laterales de los aa
(Phe, Tyr y Trp), y las cistinas (Cys-Cys unidas por SS) también se encuentran en esta región (250 nm). Esta banda se
utiliza en la purificación de proteínas (se confirma que tenemos proteínas en una muestra cuando aparece esta
banda, por ejemplo, al hacer una HPLC unida a un detector que en realidad es un espectrofotómetro).

Según la proporción de aa aromáticos que tengamos, el máximo de absorción de las proteínas se irá desplazando. Y
con el entorno también observaremos cambios en el espectro. Como vemos en la tabla de abajo, el coeficiente de
extinción molar es mucho mayor para Trp que para Tyr y que para Phe:
De este modo, el cromóforo fundamental que va a determinar el espectro de absorción de una proteína será el Trp
(a menos que la proteína no tenga este aa). Y recuerda: el entorno de cada Trp también desplazará el espectro
(recuerda los efectos hiper e hipocrómicos y los desplazamientos hipso y batocrómico), es decir, que el espectro de
absorción no es la suma de los espectros de los componentes . En definitiva, que por estas cosas se consigue que el
espectro de cada proteína sea diferente (y así podemos identificarlas).

Grupos prostéticos. Su estado redox determina su espectro de Abs UV/Vis

Muchas moléculas unidas a la proteína de forma transitoria o permanente van a modificar el espectro en la zona del
visible, como metales o coenzimas (ambos cofactores). Por supuesto el espectro de cada cofactor va a ser diferente
en solución que en el interior de una proteína (por estar más o menos expuestos al solvente), y esta información se
puede emplear para detectar interacciones e incluso afinidades de las mismas. Ejemplos:

 Centros sulfoférricos: contienen varios grupos sulfuro unidos a entre

dos y cuatro átomos de hierro en estados de oxidación variables. Este
hecho hace que las proteínas con estos centros se encuentren en
cadenas de transferencia de electrones donde irán transfiriendo esos
electrones en función del potencial redox que haya en esos centros.
Cada centro tienen un espectro de absorción característico y estos
también van a variar en función de la proteína en la que se encuentra
(por eso aparecen ‘’hombritos’’ en los espectros). Además, dos
proteínas con el mismo centro sulfoférrico no tendrán el mismo
espectro si son proteínas diferentes. Vemos en la segunda
imagen que conforme se va reduciendo la proteína (las
líneas intermedias son mezcla de proteína oxidadaa y
reducida, y la discontinua todo reducida) el espectro se va
desplazano. Esto es interesante para estudiar cinéticas,
saber si la proteína pueden captar electrones de otra, etc.

 Grupos Hemo: Se trata de un anillo de porfirina con un

átomo de hierro (Fe) en el centro, y en función de los
diferentes sustituyentes del anillo de porfirina tendremos
diferentes grupo Hemo. En general, en su estado reducido
hay un desplazamiento del espectro hacia arriba (efecto
hipercómico) y hacia la derecha (desplazamiento
batocrómico) respecto del espectro de ese mismo grupo
hemo en el estado oxidado. Obviamente, el espectro de un
grupo hemo libre en solución será diferente al de un grupo
hemo enterrado en el interior de una proteína. Los grupos
hemo se emplean para seguir reacciones en los citocromos
que los continen. A 550 nm en el estado reducido el
espectro se desdobla en dos pequeñas bandas llamadas α y β que se distinguen muy bien en algunos
citocromos (la banda ϒ es la del máximo de absorbancia en torno a los 450 nm).
 Flavinas y flavoproteínas: Las moléculas FMN (flavín adenín dinucleótido) y
FAD (flavín adenín dinucleótido) no poseen metales (son moléculas orgánicas)
con triples anillos aromáticos cuya conjugación hace que presenten absorción
en el visible, muy característica. Además la molécula FAD se puede plegar sobre
sí misma y en ese caso sus anillos interaccionan y desplazan el espectro a la
derecha (aun más hacia el visible) si se encuentran libres, en proteínas la
 situación puede ser diferente al estar enterrados en cavidades interiore. La
presencia de dos bandas en torno a 390 y 450 nm indica presencia de
flavoproteínas, el otro pico a 260 nm es el de los aa aromáticos.

(PREGUNTA DE EXAMEN: LOS ESPECTROS DE CADA COSA).

Como acabamos de decir, el espectro de un FMN se desplaza hacia abajo y hacia la

derecha y le aparece un hombro cuando FMN se une a proteína, porque acaba
oculto y por tanto con poca parte accesible al solvente. El espectro de FAD libre
también se desplaza así cuando se encuentra dentro de una proteína, ya sea de Anabaena o de R. capsulatus

Si se cambia un átomo del FMN por un cloro (en uno de los tres anillos), el espectro también cambia, pero de
la misma manera (hacia abajo y hacia la derecha si estamos en una flavoproteína como la flavodoxina).

Las flavinas son centros redox más complejos porque al poder intercambiar 2 electrones presentan
diferentes estados de oxidación (pueden intercambiar los e- de uno en uno o los dos a la vez). Libres en
disolución los intercambian de 2 en 2 pero en un entorno proteico los saltos de e- se pueden separar y por
tanto los pueden ceder de uno en uno, de modo que las flavinas presentarán un estado radicalario llamado
semiquinonas en esos casos. Si el e- de la semiquinona va acompañado de un protón hablaremos de
semiquinona sin carga (neutral), y si no hay protón y solo hay un electrón hablaremos de semiquinona
aniónica. En resumen, que van aumentando los estados de oxidación en función de la protonación de la
flvina (lo cual depende del entorno proteico). Veamos los espectros para cada caso:

o Estado oxidado (FAD): dos banditas de color negro entre

450-500 nm.
o Estado semirreducido sin protón, semiquinona aniónica:
aumenta la banda a 390 nm, color azul.
o Semiquinona neutra: aparece una banda de absorción en
torno a los 600 nm que no aparece para ningún otro
estado (color verde).
o La flavina reducida del todo (hidroquinona): en este caso
se pierde la conjugación del anillo y en el visible la
absorción disminuye mucho, por eso la banda en torno a 450 nm desaparece.

 Clorofila: anillo de porfirina con Mg en el centro en lugar de hierro y que

puede tener diferentes sustituyentes en el anillo, lo que hace que se
distingan diferentes tipos de clorofilas. Tenemos clorofila a y b, que absorben
en regiones características del espectro (espectros diferentes para cada tipo).
 Rodopsina (de los fotorreceptores): es una proteína transmembranal que contiene una molécula que se excita
con la luz llamada 11-cis-retinol (o retinal). Esta molécula absorbe en el visible, y tiene un espectro de absorción
muy estrecho (cuando está libre), lo que en teoría nos permitiría ver tan solo en blanco y negro (escala de
grises). Lo que ocurre es que el ser humano tiene hasta 3 proteínas con pequeñas variaciones en los aminoácidos
que justo están en contacto o en las proximidades de la molécula de retinal, y eso hace que el espectro se vaya
desplazando y podamos ver en más colores (“en color”).

5. Estudio de los nucleótidos

Los nucleótidos absorben sólo en el UV, no en el visible y los cromóforos que absorben en realidad son las bases
púricas y primidínicas. Prácticamente todas ellas tienen una absorción en torno a 260 nm, debido a su carácter
aromático, a pH=7. Aunque, como siempre, el espectro de un ácido nucleico siempre va a ser diferente al de una
única base en solución.

Recuerda, podemos saber cuando estamos purificando una proteína si hay contaminación con ácidos nucleicos
viendo si en la gráfica aparecen dos bandas a 260 y 280 nm en lugar de una única banda a 280 nm (característica de
proteínas). También se puede tener el objetivo contrario, y en ese caso se emplea la siguiente razón de pureza para
detectar si una disolución de ácido nucleico está contaminada con proteínas:

5.1 Efectos hipocrómico e hipercrómico

El efecto hipocrómico es muy notable en ácidos nucleicos. La absorbancia de un mol de ADN es un 35-40 % menor al
valor calculado de la absorbancia de las bases que lo componen (piénsalo, las bases estaban ocultas en el interior de
la estructura de doble hélice).

Pero además, también destaca el efecto hipercrómico cuando se desanturaliza la doble hélice de DNA. Cuando se
aplica calor la doble hebra de DNA se va desnaturalizando, se exponen las bases nitrogenadas y aumenta la
absorción. Con esto podemos saber si tenemos el DNA en hebra sencilla o doble, o calcular la Tm (Temperatura de
fusión, la temperatura a la que se ha desnaturalizado la mitad de las moléculas de DNA). Estos experimentos de
desnaturalización también pueden dar información sobre el contenido en bases del DNA (%GC, pues a mayor
contenido en GC aumentará la estabilidad térmica del DNA y tardará más en desnaturalizarse y tendrá una Tm
mayor). Se ha visto que los genomas más grandes presentan mayor estabilidad térmica. Estos experimentos también
permiten conocer por ejemplo temperaturas para hibridar cebadores, o analizar cinéticas de reasociación de las
hebras de DNA cuando baja la temperatura.

En definitiva, que estas técnicas permiten evaluar la estabilidad, pureza o composición de los ácidos nucleicos.

6. Moléculas individuales: Coenzimas, Cofactores, Lípidos

Son el CoenzimaA, el fosfato de piridoxal, NADPH y NADH, carotenos, riboflavinas…. Tal y como veíamos con los
grupos hemo, la molécula de NADH también tiene dos espectros que difieren según si la molécula está oxidada o
reducida.
 Tema 3: Espectroscopia de dicroísmo circular
1. Utilidad

La espectroscopía de Dicroísmo Circular (DC) permite estudiar la conformación de las proteínas, por ejemplo, si no
sabemos si una proteína de estudio está plegada o no. Permiten hacer una caracterización conformacional y
dinámica:

 Observar, analizar y cuantificar pequeños cambios en la estructura secundaria o terciaria (por ejemplo,
debido a mutaciones), en interacciones y/o cambios de solvente debido a las actuaciones sobre las
biomoléculas sin necesidad de determinar la estructura tridimensional de las mismas.
 Cuantificar el contenido de estructura secundaria (en teoría).
 Determinación de pureza y estabilidad (controles de calidad).

En realidad, para determinar todo esto se utilizan una variedad de técnicas entre las que el dicroísmo circular es
particularmente útil, pese a ser más cara.

2. Fundamento

En este caso la luz que incide sobre la muestra

es una luz polarizada, es decir, un haz de luz
que solo avanza en una dirección (en un plano
vertical u horizontal, o una onda que avanzaría
en un plano de 45 grados si las superponemos y
están en fase, es decir, que alcanzan sus
máximos a la vez). Esto se consigue con filtros
específicos, y si añadimos un monocromador
conseguiremos luz polarizada en un plano con
una longitud de onda concreta.

Si las dos radiaciones están desfasadas, si se

componen, en lugar de dar un haz de luz en un
plano, lo que se obtiene es luz circularmente
polarizada, a la izquierda o a la derecha (si
están en fase, el máximo se alcanza a la vez, si están desfasadas no).

Por su parte, si luz circularmente polarizada hacia la derecha y hacia la izquierda están en fase, su sumatorio da luz
polarizada en el plano. Si no están en fase, obtendremos luz elípticamente polarizada. (La luz polarizada en un
plano es la suma de luz polarizada circularmente a derecha e izquierda)

Así, en DC lo que se hace es iluminar la muestra con luz circularmente polarizada a dcha. e izda. en fase. Si la
muestra no absorbe, veremos el haz de luz polarizada en el plano. Si la muestra absorbe, la luz se convierte en luz
elípticamente polarizada. Algo que también ocurriría si las dos ondas del principio no estaban en fase. Si absorbe,
también disminuye la intensidad.

La emisión de luz elípticamente polarizada no ocurre en todas las muestras, solo en aquellas que tengan moléculas
que sean capaces de absorber de forma diferencial la luz circularmente polarizada a dcha e izda. Se dice que cuando
la luz polarizada en un plano atraviesa una muestra ópticamente activa, sus componentes de luz circularmente
polarizada suelen ser absorbidos en distinta cantidad

Pista para examen: para saber si una molécula se puede estudiar con DC, debe absorber en el UV (sólo en UV) y ser
una molécula ópticamente activa.
 En la figura podemos ver lo
que pasa cuando haces de luz
circularmente polarizada hacia
la derecha y hacia la izquierda
atraviesan una muestra (de lo
que sea), vemos que como
consecuencia de la absorción
lo que se emite es luz
elípticamente polarizada. En la
parte de debajo de la figura
podemos ver cómo se
diferencian un haz de luz
polarizada y un haz de luz
elípticamente polarizada.

Un aparato empleado en espectroscopía DC mide o da el dato del ángulo ϴ o elipticidad, cuyo valor depende de lo
que nos alejemos del circulo inicial conforme se va formando la elipse.

Si los aparatos miden ese ángulo es porque la técnica se basa en otra llamada dispersión óptica rotatoria (que en
este caso se emplea para medir diferentes Índices de refracción). En el caso de la dispersión óptica rotatoria cuando
la luz atraviesa la muestra se pueden comprimir más las ondas en la luz circularmente polarizada en una dirección
que en la otra (aquí la luz no se absorbe, solo cambia su dirección al atravesar la muestra) y eso hace que el plano del
haz de luz polarizada se incline o desvíe. Los aparatos de dispersión óptica rotatoria medían el ángulo de cambio, y
por eso ahora los aparatos de DC miden el ángulo ϴ (vamos, que se hace por razones históricas).

2.1 Moléculas ópticamente activas

Las moléculas que absorben son aquellas ópticamente activas, que son aquellas que no disponen de un plano de
simetría o centro de inversión, y que además no son superponibles con su imagen especular (es decir, los
enantiómeros). La mayor parte de las moléculas sintetizadas por los organismos vivos son ópticamente activas (por
ejemplo, recuerda: los L-aminoácidos predominan sobre D-)

En los polímeros (proteínas o ácidos nucleicos), que también presentan comportamiento rotatorio, lo que ocurre es:

 La estructura primaria de estos polímeros es intrínsecamente asimétrica.

 Las estructuras secundarias de muchos biopolímeros son helicoidales, las hélices alfa de las proteínas, por
ejemplo, no son superponibles con sus imágenes especulares (giran en una dirección diferente).
 La estructura terciaria de la macromolécula tampoco es superponible con su imagen especular.

Entonces, cuando un haz de luz polarizada atraviesa una especie ópticamente activa, ésta absorbe de manera
diferencial la luz polarizada circularmente a izda y a dcha. La diferencia entre Aderecha y Aizquierda es la señal de
dicroísmo circular. CD mide la capacidad de moléculas ópticamente activas de absorber diferencialmente la luz
polarizada circularmente a izda y dcha (lo repito porque parece importante). Obviamente, para que haya
absorbancias diferentes necesitamos coeficientes de extinción molar diferentes.
Por convenio, siempre es la diferencia de Aizquierda - Aderecha. Si l y c son iguales, podemos hablar de Δε. El aparato va a
dar datos de elipticidad, recuerda, no de absorbancia, de modo que hay que saber la relación entre ambas.

Cosas a tener en cuenta:

 En los espectros de DC tendremos bandas positivas o negativas (novedad, si Adcha > Aizda)
 Ahora trabajamos con Δε, por tanto serán valores mucho más pequeños que los valores de ε empleados en
absorción en UV-VIS.
 No obstante, también hay que trabajar en muestras diluidas (para no saturar el fotomultiplicador).
 Algunas bandas que veíamos intensas en absorción UV-Vis son ahora débiles en DC y viceversa.

3. Dicrógrafo

Es el aparato con el que se realizan las mediciones, es como un espectrofotómetro pero con una lámpara muy
potente (pro tanto muy caro). La lámpara tiene que estar en ausencia de oxígeno y requiere consumo de nitrógeno
(trabajar bajo atmosfera de nitrógeno). Se requieren cubetas de cuarzo (por trabajar en el UV) y las que se emplean
son cubetas con una longitud de paso mucho menor que 1. Los tampones también tienen absorción en DC de modo
que hay que trabajar con tampones muy diluidos.

Consideraciones a tener en cuenta:

 Preparación de la muestra: Se debe trabajar con concentraciones pequeñas de proteína (porque pueden
absorber mucho y si nos pasamos se satura el fotomultiplicador y la medición deja de ser fiable), y deben
emplearse tampones de baja Fuerza Iónica. En el UV lejano además molestan algunas sales de los tampones
así como el oxígeno (es necesario degasear), hay que utilizar tampones específicos en concentraciones bajar
(Tris, percloratos o boratos), KF en lugar de NaCl y no se puede emplear imidazol. Hay que evitar otros
posibles aditivos y tener la proteína lo más pura posible (tendremos que eliminar también las proteínas no
plegadas, los péptidos o las partículas contaminantes previamente por filtrado).
 Condiciones de medida: Hay que asegurar la buena estabilidad del espectropolarímetro y la ausencia de
oxígeno en el equipo para mantener la estabilidad de la lámpara (mediante purga con nitrógeno). La
temperatura también tiene que ser controlada.
4. Principales cromóforos en proteínas

Los cromóforos potenciales son los mismos que teníamos en Abs UV-VIS (enlace
peptídico, cadenas laterales de los aa aromáticos y los grupos prostéticos y coenzimas).

4.1 CD en el UV-lejano: el enlace peptídico

El enlace peptídico es el cromóforo más importante en DC, en concreto, el grupo amida

del enlace. La absorción se produce en torno a los 190-220 nm (dos transiciones
diferentes?) pero la intensidad y la energía de estas transiciones depende de los ángulos
φ y ψ (son los ángulos que se generan entre las moléculas unidas en torno al enlace
peptídico, y que pueden ir variando sus valores en función de las estructuras secundarias
que se vayan adquiriendo, así, gracias a esos valores diferenciales, las transiciones
requerirán diferentes energías y los espectros serán característicos).

De este modo, las estructuras secundarias formadas por enlaces peptídicos son asimétricas y tienen espectros de DC
característico en la región UV lejano. Serán diferentes espectros para las alfa-hélices que para las hojas-beta, por
ejemplo. En cuanto a los giros, como los ángulos φ y ψ son muy variados, los espectros también lo serán.

Aunque en la figura superior se comience el barrido a 190 nm, entre 190 y 210 nm absorben muchas sustancias
(sales, tampones), de modo que los espectros suelen darse desde a partir de los 210 nm. Características de cada
estructura secundaria:

 Hélice alfa: Banda negativa a 222 nm, otra negativa-postiiva a 208 nm y en 190 también (positiva)
 Hoja beta: Banda negativa a 215-218 nm y banda positiva antes, a 196-198 nm.
 Giros o regiones desordenadas: Banda positiva a 212 nm y negativa ants, a 195 nm (al revés que hoja beta)

ENTONCES: PISTA; si en un espectro salen bandas negativas, se trata de un espectro de DC

El espectro DC de una proteína nativa va a depender de la cantidad de proteína 1qe se encuentre en alfa hélice, hoja
beta, etc (es decir, que depende de la fracción de sus componentes de estructura secundaria).
Los cambios en las conformaciones de péptidos y proteínas debidos a calentamiento, a cambio de solvente u otra
variación pueden seguirse fácilmente por DC. Veamos un par de ejemplos de estudio de estabilidad conformacional
y control de calidad:

1) En este experimento (DC en el UV lejano), se compara el

espectro de absorción (o la elipticidad molar) de una proteína
recombinante frente a una proteína natural, con el objeto de
verificar si la proteína recombinante se consigue en su
conformación nativa (por efecto del pH, sales, solventes,
temperatura, recuerda que el propio sistema de expresión podía
presentar problemas a la hora de plegar una proteína, por
ejemplo, si tratábamos de sobreexpresar una proteína eucariota
en E. coli).

2) En este estudio se estudia la variación de la elipticidad a 220 nm

con la temperatura, empleando una misma concentración de
proteína pero en tampones a distintos pH (6, 7’4 y 8’5). Si la
elipticidad disminuye quiere decir que la proteína está cambiando
de hélice alfa a una conformación desordenada, es decir, que la
proteína se está desplegando, desnaturalizando. Y no es igual de
estable con diferentes pH, es más estable a los cambios en la T en la
condición de pH 8’5, necesita más temperatura a ese pH para
desnaturalizarse.

Nota: en el experimento 1 se habla de elipticidad molar en lugar de

elipticidad a secas. En el UV, la elipticidad molar se consigue
dividiendo el valor de elpiticidad por el número de enlaces peptídicos o de aa. (¿?)

Otra aplicación de esto estaría en el ajuste al contenido de estructura secundaria, pero usar esta técnica en el UV
lejano para esto no es muy fiable para algunas proteínas. Se hizo una primera aproximación que consideraba la
combinación lineal de los espectros de DC de cada una de las estructuras secundarias presentes en la proteína para
detectar el % de contenido en esas estructuras secundarias en la proteína (ver fórmulas abajo). Muchos programas
informáticos siguen esta primera aproximación, y la información es muy confiable para proteínas con elevado
porcentaje en alfa hélices (comparable a la fiabilidad de la información obtenida por difracción por RX o RMN). Los
algoritmos de estos programas se basan en bases de datos de espectros de proteínas.

Limitaciones:

 Dependencia de la señal DC de la longitud de las hélices α

 Modelos no son buenos para la estructura de hoja β.
 Giros β mezclados con las estructuras de hoja β.
 No hay buenos modelos para la conformación de ovillo desordenado en solución.
 Distorsiones inducidas por las cadenas laterales que tienen propiedades como cromóforos.

Por eso se han diseñado otros métodos para esto (SVD, Singular value decomposition, o Variable selection, un
método estadístico).
4.2 CD en el UV-cercano: cadenas laterales de aminoácidos aromáticos y sulfuros

Algunos aa aromáticos libres en disolución no generan espectros de DC, pero si en proteínas, de modo que el DC de
los cromóforos en proteínas puede indicar interacciones con las moléculas en la vecindad inmediata. En este caso el
Trp también domina pero tiene que estar oculto (enterrado) para que haya espectro de CD, por eso esta parte del
espectro DC da información de estructura terciaria (hasta ahora obteníamos información de estructura secundaria).
Este fenómeno es lo que se llama CD inducido: Si una molécula simétrica que absorbe se disuelve en un solvente
quiral (entorno asimétrico), se observa CD en la región de absorción del soluto no quiral.

Es el caso de las cadenas laterales de los aminoácidos aromáticos y los puentes disulfuros
al formar parte de la estructura tridimensional (terciaria) de la proteína. Un criterio muy
sensible al estado nativo de la proteína.

En la gráfica de la derecha se aprecia bien: a pH 7 los Trp sufren CD inducido y dan señal en
CD UV cercano, mientra que a pH ácido o desnaturalización con urea, la cadena
polipeptídica se despliega, los Trp quedan accesibles al solvente y NO dan señal en el CD
UV-cercano.

AL igual que CD en el UV lejano, esta espectroscopía se puede emplear para estudiar estabilidad conformacional y
control de calidad (por ejemplo, para comprobar que dos lotes de producción distintos de un anticuerpo monoclonal
son iguales, que es lo que se busca).

4.3 CD visible: cofactores y coenzimas

Muchas proteínas contienen o interaccionan con cofactores o coenzimas que son cromóforos y presentan CD
inducido, como los grupos hemo (hemoglobina, mioglobina, citocromos), retinol (rodopsina), centros sulfoférricos
(ferredoxina), metales, flavinas, nucleótidos, etc... L a espectroscopía en CD visible da información sobre la
interacción metal-proteína, coenzima-proteína, cofactor-proteína, etc.

Fijarse en que en CD se analizan UV y visible por separado, en Absorción UV/VIS lo analizábamos a la vez.

5. Principales cromóforos en ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos también presentan espectro de DC. Tendremos diferentes espectros de DC en función del
estado del DNA (nativo, desnaturalizado…) y todos ellos serán diferentes al de la mera suma de los dNTPs
correspondientes.

Recuerda además que el DNA presenta varias estructuras secundarias de doble hélice: A, B y C (o Z). Cada una de
ellas tendrá también un espectro característico (pues en cada una las bases nitrogenadas están más o menos
expuestas).
5.1 Aplicaciones de Espectroscopía DC

 Verificar el correcto apareamiento de bases (por ej. de una hebra modificada con su hebra complementaria).
 Cambios en estructura secundaria con temperatura, agentes desnaturalizantes (por ej. cálculo de Tm).
 Estudiar isomerizaciones conformacionales (helix-coil, B-A, B-Z)

6. Ventajas de la espectroscopía DC

 Uso de poco material: 200 μL de 0.5 mg/mL de solución. Es la principal ventaja.

 Método no destructivo.
 Permite el estudio de cambios de entorno: pH, agentes desnaturalizantes, T...
 Desempeña un papel importante en la determinación de los componentes estructurales de las proteínas.
 Es rápido y se puede utilizar para analizar un número de proteínas candidatas a posteriores estudios
estructurales más detallados como RMN y Rayos-X.
 Capacidad de detectar cambios estructurales en una proteína que ha sufrido alguna perturbación o se ha
unido a un sustrato o cofactor. Control de Calidad.
 Comparación de estructuras manipuladas por ingeniería de proteínas frente a la especie nativa.

7. Inconvenientes de la espectroscopía DC

 La absorbancia del solvente interfiere en la región de UV. Hay que trabajar con tampones muy diluidos y que
no absorban a < 200 nm.
 Medidas sujetas a errores experimentales. Se trabaja en concentraciones muy pequeñas, de modo que es
fácil cometer errores
 La determinación de los porcentajes de elementos de estructura secundaria no es realista en muchos casos.
 Poca información de estructura terciaria o cuaternaria. Más como Control de Calidad
 Tema 4: Espectroscopia de Infrarrojo
1. Absorción de infrarrojos

La espectroscopia de IR permite identificar estructuras a nivel de grupos funcionales. Veamos su fundamento:

Cada átomo tiene tres grados de libertad relacionados con su movimiento (translación). Cuando se forma una
molécula esos grados de libertad se mantienen, así, la molécula tiene tres grados de libertad traslacional, y si no es
lineal, tendrá tres grados de libertad rotacional.

Los restantes grados de libertad para una molécula no lineal de n atomos son 3n-6 o 3n-5 si la molécula es lineal, y
son modos vibracionales del estado fundamental (se quitan los grados de libertad rotacional y traslacional). Estas
vibraciones son grados internos de libertad, y se expresan en término de las coordenadas del centro de masas.

Modos de vibración de los enlaces: Hay diferentes modos normales de vibración en las moléculas, cada uno lleva
asociado un movimiento característico de los átomos. Los principales son:

 Deformaciones de enlace.
 Ángulos de valencia.
 Ángulos diedros.
 Deformaciones fuera del plano.

Estos modos presentan ligeras diferencias en energía y eran lo que hacía que en los espectros de abs UV/Vis
apareciesen bandas en lugar de picos.

Las energías de estas transiciones vibracionales se encuentran en la región del IR del espectro electromagnético, es
decir, que cunado una molécula absorbe IR lo que hace es pasar de un estado vibracional a otro. Estas transiciones
entre modos vibracionales se estudian no solo por espectroscopia IR sino también por espectroscopia RAMAN . En el
primer caso (el que nos atañe) se emplea radiación electromagnética cuya longitud de onda está comprendida entre
los 800-400.000 nm (rango muy amplio). Es la técnica de Espectroscopia de Absorción empleada principalmente en
la elucidación de estructuras moleculares (de moléculas pequeñas).

Ojo cuidao: Aquí no estamos excitando electrones, sino más bien la distancia entre 2 átomos o el ángulo formado
entre los átomos que forman una molécula.

1.1 Los espectros de infrarrojos

Los espectros se miden en %T (oAbs) vs frecuencia. Las frecuencias van desde 5000 cm-1 (2000 nm) a 200 cm-1
(50000 nm, vemos que cada frecuencia tiene su longitud de onda asociada). Sigue la ley de Beer-Lambert y reglas
similares a UV-Vis.

Cada absorción observable en el espectro corresponde a una vibración determinada de algún enlace dentro
de la molécula. Los picos observados indican la presencia de determinados grupos funcionales. Como una
molécula va a tener muchos enlaces, estos pueden sufrir muchas transiciones vibracionales, y por tanto, cada
molécula va a tener un espectro característico.

Ejemplo: la molécula de formaldehído (4 átomos) presenta un espectro de IR sencillo con 6 modos normales de
vibración, cada uno de ellos se da a una frecuencia características del espectro, lo cual permite identificar los grupos
funcionales que hay presentes en la molécula y cómo están unidos unos con otros (de modo que podemos
identificar la molécula). En definitiva, que lo que ha de quedar claro es que el efecto sobre la materia orgánica de la
radiación IR es producir deformaciones de los enlaces de la sustancia. La absorción de estas radiaciones de baja
energía produce excitaciones los niveles vibracionales y rotacionales de los grupos de átomos que componen la
molécula, permitiendo la identificación de los grupos funcionales.

Aunque una macromolécula que contiene un gran número de átomos va a tener un gran número de vibraciones,
normalmente la espectroscopia de IR se simplifica porque los grupos químicos muestran bandas de vibración
características. Y como ocurría en otras espectroscopias, normalmente el espectro de un polímero no es la suma de
los espectros de los monómeros, ya que pueden existir bandas de combinación y de diferencia, resultado de dos a
más vibraciones que son excitadas simultáneamente. También pueden acoplarse distintos grupos (puentes de
hidrógeno).

Ejemplo: El grupo carbonilo aparece en torno a los 1700 cm-1, pero

podrá aparecer desplazado en función del entorno, la presencia o
no en el interior de la proteína, la formación de puentes de
hidrógeno, etc.

El siguiente esquema muestra qué regiones vibracionales se recogen en un espectro de infrarrojo, vemos que
tenemos frecuencias de estiramiento (azul) y de torsión (verde). Consideraciones a tener en cuenta:

 Las frecuencias de estiramiento son más altas que las correspondientes de torsión (es más fácil doblar un
enlace que estirarlo o comprimirlo).
 Los enlaces a átomos de H tienen mayores frecuencias de estiramiento que los de átomos más pesados.
 Los enlaces triples tienen mayores frecuencias de estiramiento que los dobles y estos que los sencillos.
 La complejidad del espectro en la región 1450 -600 cm-1 hace difícil la asignación de todas las bandas. Sin
embargo, esta región se denomina región de huella dactilar ya que presenta señales únicas para cada
compuesto.

La región huella dactilar puede ser útil para un fármaco (molécula pequeña) o para detectar productos catalizados
por una enzima, por ejemplo, recuerda, los biotecnólogos no siempre trabajan con macromoléculas.

IR presenta como problema que las muestras biológicas se presentan en solventes acuosos cuyas moléculas de agua
van a dar mucha señal en la región en torno a los 3300-3600 cm-1, por eso se prefieren solventes orgánicos o hacer
el espectro en sólido (pastilla del compuesto en sólido), aunque eso se hace más en Química Analítica que en
Biotecnología o Bioquímica.
2. Inconvenientes de la IR (menos usada que la espectroscopia de absorción UV-Vis)

 Las bandas IR son menos intensas porque los coeficientes de extinción son mucho menores y por tanto se
requieren utilizar concentraciones mayores.
 El agua absorbe intensamente en muchas regiones de interés biológico, de modo que se debería usar agua
deuterada (D2O) o muestras desecadas en película.
 La intensidad de una banda vibracional depende de la magnitud del dipolo inducido, este dipolo transitorio
tiene un término electrónico y otro vibracional. Además, la dirección del dipolo inducido depende del tipo de
vibración.
 El sistema de detección de los instrumentos es menos sensitivo.

3. Instrumentación para IR

Normalmente se mide FTIR, es decir, infrarrojo pero con transformada de Fourier. Lo que se hace es medir a todas
las frecuencias (lo cual da mayor rapidez a la técnica) y luego se hace una segunda transformada de Fourier para
obtener el espectro. Así se mejora la relación señal/ruido, ya que la luz no debe pasar por un monocromador, como
sí ocurría en casos anteriores.

Para hacer esto, los espectros han de pasar necesariamente por un ordenador, lo que facilita el análisis y el manejo
espectral.

La resolución de esta técnica puede ser de menos de 0.01 cm-1.

4. IR de proteínas

4.1 El enlace peptídico

El cromóforo más importante va a ser el enlace peptídico, que se repite a lo largo de la estructura. El espectro es
complicado ya que los enlaces peptídicos están en distintos entornos y los puentes de hidrógeno de las amidas
formados cuando se generan las estructuras secundarias producen importantes desplazamientos de las
correspondientes bandas vibracionales (hay muchos modos normales de vibración del grupo amida).

La simetría de las estructuras secundarias (hélice α y hoja β), produce bandas considerablemente manejables que
ofrecen información sobre la conformación de estructura secundaria en que se encuentra el enlace peptídico.

Las principales bandas de absorción del enlace peptídico se deben a los siguientes modos vibracionales:

 Estiramiento del enlace N-H

 Estiramiento del enlace C=O (Amida I)
 Estiramiento del enlace C-N-H (Amida II)

Según la información de la tabla de abajo, podemos utilizar la vibración del estiramiento N-H para diferenciar
proteínas desnaturalizadas (sin puentes de hidrógeno) y no desnaturalizadas (puentes de hidrógeno intactos, se
forman estructuras secundarias). Pero si lo que queremos saber es si nuestra proteína tiene hélices alfa u hojas beta,
deberíamos observar la frecuencia de vibración del enlace C=O (valores diferentes para una hélice alfa que para una
hoja beta).
Nota: En proteínas el IR también puede darse en Abs, pero siempre se va a enfrentar con frecuencia, no con λ.

4.2 La banda amida I del enlace peptídico

Acabamos de decir que es la que da más información sobre el contenido en estructura secundaria.

 Para una estructura rica en hélices alfa, tendremos algo parecido a la banda roja, con un máximo en torno a
una frecuencia de 1650 cm-1.
 Para una lámina beta pueden aparecer dos hombros (en azul) con máximos de absorción en torno a 1620 y
1690 cm-1.
 Una región desordenada puede tener un máximo en torno a los 1670 cm-1.

Pero claro, a veces puede aparecernos una única banda experimental amida I pero que no da suficiente información.
En ese caso se puede hacer una deconvolución espectral mediante un sistema informático para calcular % de hélice
alfa y hoja beta que tenemos en nuestra proteína, pero no se suele poder deconvolucionar con buenos resultados la
gran mayoría de ocasiones, lo cual implica que no todas las hojas beta y hélices alfa son iguales (diferirán con el
entorno, la proteína, etc).

4.3 Aplicaciones de la IR de proteínas

 Un espectro IR puede servir para ver si la proteína está desnaturalizada o no, e

incluso estudiar la cinética de desnaturalización con la Temperatura (el
espectro es diferente en el estado plegado que en el desnaturalizado).
 También puede servir para estudiar modificaciones de estructura secundaria:
en la imagen de la derecha, vemos cómo el cambio de pH hace que se vaya
alcanzado la lámina beta antiparalela desde un estado desplegado (ovillo
estadístico).
 También para estudiar el efecto de la deuteración sobre las moléculas, por
ejemplo, sobre la posición de la banda amida I: al añadir D2O se alteran los
puentes de hidrógeno (se convierten en puentes de deuterios), y el espectro
cambia.
 Estudio de unión de ligandos: Para esto se hace un espectro diferencial,
primero se hace el espectro de la proteína sola, luego el de la proteína con un
determinado ligando, y luego se restan, para obtener información sobre cómo
ocurre la unión del ligando. Como restas espectros, se ven bandas negativas.
 Actualmente, se está empleando mucho la combinación de la espectroscopia IR
con la microscopía en Biomedicina, ejemplos:
o Microespectroscopia de IR con transformada de Fourier en el estudio
de tejidos y células.
o Microespectroscopia de IR con transformada de Fourier en el estudio
de sistemas biológicos.
 Tema 5: Espectroscopia de emisión de fluorescencia
1. Espectroscopia de Fluorescencia Molecular

La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual especies que han sido excitadas por la absorción de radiación
electromagnética se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones.

De nuevo estamos excitando orbitales moleculares (como en UV/VIS, pero no como en IR). Todas las moléculas
absorben pero no todas emiten fluorescencia, solo aquellas que eliminan energía y regresan al estado fundamental
mediante la emisión de fotones. Se excita en el UV (entonces, una molécula que absorba en el UV puede ser, o no,
fluorescente, condición necesaria pero no suficiente).

Una vez excitada, la molécula

pasa al modo vibracional de
menor energía del estado
excitado, y luego se regresará al
estado fundamental. En este
último paso del proceso, el fotón
emitido tiene menos energía
que el fotón absorbido, es decir,
que tiene una frecuencia menor
y emite a una mayor longitud de
onda, por eso el espectro de
fluorescencia aparece despla-
zado hacia la derecha (Recapitulando: se absorbe un fotón, se excita un e-, éste pasa al estado excitado vibracional
de menor energía, al ser el más estable, y a partir de ahí puede regresar a cualquiera de los subniveles de energía del
estado basal, solo entonces podemos hablar de fluorescencia).

La fluorescencia tiene una alta sensibilidad inherente, con frecuencia de 1-3 órdenes de magnitud mayor que en la
espectroscopia de absorción. Que sea tan sensible quiere decir que con poca muestra tendremos una señal
importante, pero claro, no todas las moléculas son fluorescentes, es decir, es una técnica sensible pero con
limitaciones.

1.1 Algunas definiciones importantes

Fluoróforo: Grupo que presenta fluorescencia. No todos los cromóforos son fluoróforos.

Desplazamiento de Stokes: La distancia entre el valor máximo de absorbancia y el valor máximo de emisión. Como
hemos dicho antes, la longitud de onda de emisión siempre es mayor que la de excitación. En algunas moléculas, los
espectros de absorción y de emisión de fluorescencia se solapan.

Rendimiento cuántico de fluorescencia: Relación entre el número de fotones emitidos y el número total de fotones
absorbidos. De su valor depende que una molécula sea fluorescente o no. Este parámetro indica cómo de
fluorescente es una muestra.

Uno de los problemas de la fluorescencia es que es menos general que la absorción UV/Vis debido al número
relativamente limitado de sistemas químicos que se pueden hacer fluorescer, ya que la fluorescencia compite con
otras formas de desexcitación. Esta competencia entre la emisión fluorescente y otras formas de desexcitación no
radiactivas (en lugar de liberarse un fotón, la energía se emplea para otra cosa, como una reacción fotoquímica,
energía cinética, calor, etc) es lo que decide si una molécula es fluorescente. Todos esos procesos compiten y al
final solo gana aquel que ocurra antes (el que sea más rápido).
Los procesos de retorno al estado fundamental que entran en competencia son la conversión interna, el cruce entre
sistemas y la fluorescencia. En caso de que tengamos cruce entre sistemas podemos pasar de tener fluorescencia a
fosforescencia (en fosforescencia se retiene durante mucho más tiempo la capacidad de emitir fotones que en
fluorescencia). Recapitulando:

Luminiscencia: emisión de luz desde un estado electrónicamente excitado.

 Si se alcanza el estado excitado por absorción de luz podemos hablar de:

o Fluorescencia
o Fosforescencia: ‘’transición prohibida’’
 Si se alcanza el estado excitado por una reacción química, hablaremos de quimioluminiscencia.

1.2 La escala de tiempo de los procesos

Estamos viendo que el que una molécula sea fluorescente o no va a depender del tiempo en que ocurren todos los
procesos que compiten: la relajación vibracional es el proceso que más rápido ocurre después de la absorción, y eso
hace que el electrón excitado se vaya al nivel vibracional de menor E del estado excitado. Luego podemos tener
fluorescencia, conversión interna, fluorescencia o fosforescencia por el cruce entre sistemas.

Las etapas de absorción y de emisión son extremadamente rápidas, tanto que los núcleos no llegan a moverse
(principio de Franck-Condon). La absorción sólo proporcionaba información del entorno inmediato a la molécula que
absorbe, pero el espectro de fluorescencia porporciona información de un entorno más amplio, por eso es de
interés.

Notas: La relajación vibracional por lo general es mucho más rápida que la fluorescencia, entonces la
molécula se relaja completamente y (en general) sólo vemos la emisión desde el estado S1. La escala de tiempo de
fluorescencia es la misma que la escala de tiempo de movimientos moleculares.

1.3 Rendimiento cuántico de fluorescencia

El Rendimiento Cuántico se define como la relación entre la intensidad de fluorescencia emitida por la muestra y la
Intensidad de radiación electromagnética que ha absorbido. Es la relación entre el número de fotos emitidos y el
número total de fotones absorbidos. En una situación ideal, el rendimiento cuántico de una molécula fluorescente
debería ser 1.

En definitiva, que una molécula será fluorescente o no, dependiendo de los valores relativos de las constantes
cinéticas de los procesos implicados. Las constantes pueden variar su valor dependiendo del entorno del fluoróforo
(el tampón), y la temperatura, un factor muy importante aquí en emisión (en abs UV-Vis no lo era). Si la
Temperatura es porque las constantes son constantes cinéticas, que como ya sabes, dependen de la Temperatura.

2. Decaimiento de la fluorescencia

La fluorescencia no es un fenómeno permanente, sino que decae con el tiempo si la molécula no se vuelve a excitar.

Se define el tiempo de vida media, τ, como el tiempo promedio de las

moléculas del fluoróforo en el estado excitado antes de volver al estado basal.

Se define el tiempo de vida natural o intrínseca, τn como el tiempo de vida si la

vuelta fuera solo por fluorescencia. Es el tiempo que tardan N moléculas del
instante inicial (N(0)) en perder su emisión hasta el momento t (N(t)). El tiempo
que se tarda en pasar de Imax a Imax/ e.

El tiempo de vida media y el de vida natural se relacionan por el rendimiento cuántico de fluorescencia:

El tiempo de vida media de fliorescencia es

característico de cada molécula fluorescente pero
puede verse influenciado por la composición química
de su entorno, por eso, los cambios en el decaimiento
pueden utilizarse para adquirir información sobre el
entorno local de la molécula o seguir mecanismos de
reacción.

3. Espectros

3.1 Espectros de emisión

La vuelta desde el modo vibracional de menor

energía al estado fundamental puede llevar a
distintos modos vibraciones de este último estado
fundamental, por tanto, los fotones emitidos
pueden tener distintas longitudes de onda de
emisión. Por eso, el espectro de emisión
fluorescente recuerda al de absorción (bandas en
lugar de picos), y en muchos casos es la imagen
especular de este último (no siempre).

Un espectro de emisión siempre mantendrá la

forma de uno de absorción independientemente de la longitud de onda de la radiación con que se irradió la muestra,
pues el electrón, salte al nivel de energía que salte, siempre caerá desde aquél de menor energía, por eso siempre
tendremos las mismas transiciones y las mismas bandas (la misma forma). Pero esas bandas aparecerán siempre
hacia la derecha (pues la radiación emitida es de menor energía) y la altura de los picos si que cambia, es decir, que
la intensidad de fluorescencia si cambia (En resumen, en el espectro de emisión tendremos la misma forma de
bandas, siempre en la misma región, pero a diferente altura, ver imagen de la página anterior).

La altura, es decir, la intensidad, va a depender del coeficiente de extinción molar (a mayor valor de coeficiente de
extinción molar, más intensidad de fluorescencia??).

Nota: si en una molécula hay dos cromóforos, uno puede emitir fluorescencia y el otro no, por eso pueden aparecer
dos picos en el espectro de absorción pero solo uno en el de emisión. Por eso a veces los espectros de absorción y
emisión no son imágenes especulares.

3.2 Espectros de excitación

En este caso se representa la fluorescencia frente a la longitud de onda de excitación, no la longitud de onda de
emisión.

Como pasaba en emisión, si una molécula posee un único fluoróforo el espectro de excitación coincide con el de
absorción, ya que el rendimiento cuántico no depende de la longitud de onda de la radiación absorbida.

El espectro de excitación de una molécula se consigue fijando una longitud de onda de emisión concreta y luego se
hace un barrido de longitudes de onda de excitación. Por eso en los aparatos que den estos espectros necesitaremos
dos monocromadores, uno a la entrada y otro a la salida.

3.3 El espectrofluorímetro

Parecido a un espectrofotómetro, solo que para evitar captar y medir la luz de la lámpara y solo medir la emisión de
fluorescencia, dentro del aparato el detector está en un ángulo de 90 grados respecto de la fuente de iluminación.
En este caso, las cubetas NO TIENEN LADOS BISELADOS, sino que han de tener todos los lados transparentes. Resto
de componentes:

 Fuente de luz: es una lámpara de Xe, Hg-Xe, Diodo (Laser, LED), Hg…
 Monocromadores
 Detector (tubo fotomultiplicador)
 Muestra: hay que tener en cuenta la geometría de iluminación de la muestra. La medida de la intensidad de
fluorescencia es relativa a la geometría del equipo.

3.4 Intensidad de fluorescencia

Con la disposición de los elementos de un espectrofluorímetro, aparecen ya los primeros problemas de la técnica:
una muestra fluorescente emite fluorescencia en todas direcciones, pero el detector no está en todas las
direcciones, solo a 90°, de modo que no se puede medir la intensidad de fluorescencia real de nuestra muestra.

Entonces, debido a las características del fenómeno de fluorescencia y a la forma en que se mide se pueden definir
tres tipos de intensidad de emisión: real, observada y corregida.

La intensidad real (IF(r)) sería el número de fotones emitidos por unidad de

tiempo, pero es algo imposible de cuantificar. Además, se dan los efectos de
filtro interno y externo.

Filtro interno: Solo una fracción de la intensidad real llega eficazmente al

fotomultiplicador y solo se mide la fluorescencia de una pequeña porción de
muestra, porque los fotones son filtrados por la propia muestra, y la intensidad de la luz incidente que llega al
elemento del volumen central será tanto me nor cuanto mayor sea la concentración de fluoróforo, y menor será la
emisión fluorescente (una moleculita del centro no recibe la misma intensidad de radiación que una moleculita que
está justo en el borde de la cubeta, porque las moléculas entre ambas pueden habrán absorbido radiación).

Filtro externo: La luz emitida pasa solo por parte de la muestra, teniendo en cuenta que parte de los espectros de
emisión y absorción se solapan, parte de los fotones emitidos pueden ser de nuevo absorbidos por la propia
muestra, todo esto hace que la intensidad real de fluorescencia sea imposible de cuantificar.

Para evitar estos fenómenos en la medida de lo posible, hay que diluir la muestra (pero no pasa nada por diluir
porque la técnica es sensible, con poca muestra obtendremos señal), así como aumentar la intensidad de la lámpara
para provocar el máximo de excitación.

Intensidad observada, IF(ob) es la intensidad de fluorescencia que es

detectada por el fotomultiplicador. Si la respresentamos frente a la
concentración de analito veremos una relación lineal a bajas
concentraciones y que pasa por el origen, pero a altas concentraciones
aumentan los efectos de filtro interno y externo y la relación deja de ser
lineal.

Nota: Las diferentes geometrías de las cubetas minimizan esos efectos

de filtro interno y filtro externo. La azul es la convencional.

Intensidad de fluorescencia corregida, IF(C)λ se introduce una corrección de estos efectos y hace referencia a cada
longitud de onda de emisión.

4. Fenómeno de Quenching, o desactivación de la fluorescencia

No confundir con decaimiento. En muestras biológicas el fluoróforo está normalmente en disolución y puede
interaccionar con otras moléculas, y como consecuencia de esta interacción se puede producir una pérdida de
emisión fluorescente en un proceso conocido como Quenching, un proceso de desexcitatción no radiactiva
provocado por una molécula ajena al fluoróforo, que recibe el nombre de desactivador o quenche.

Puede utilizarse para estudiar efectos de determinadas moléculas sobre el fluoróforo de interés. Exsiten dos tipos de
desactivación, la dinámica y la estática.
4.1 Desactivación dinámica

Consecuencia de la colisión entre las moléculas de desactivador y el fluoróforo. Si este se encuentra en el estado
excitado, pasa al fundamental sin emitir radiación, al disiparse la energía en forma de energía cinética de la molécula
del desactivador.

La probabilidad de choque depende de la concentración de ambas especies, de la temperatura y la viscosidad del

medio, y esto se rige por una constante cinética que llamamos constante de desactivación

4.2 Desactivación estática

En este caso, la molécula de desactivador forma un

complejo con el fluoróforo en equilibrio con las
especies separadas. En este caso la constante de
desactivación es, en concreto, una constante de
equilibrio. Estudiar este tipo de desactivación
permite determinar, por ejemplo, parámetros de
interacción entre una proteína y su ligando o su
cofactor, si ello produce esta desactivación. El
ejemplo típico es el de cuando la molécula de FMN
se entierra dentro de una flavoproteína y deja de
emitir.

4.3 El efecto del entorno

El solvente también puede ejercer desactivación

dinámica por los choques con las moléculas de
tampón. El entorno puede producir quenching y
cambiar el espectro de emisión de fluorescencia.
En función de cómo el solvente estabiliza aquellos
orbitales moleculares enlazantes o antienlazantes
desplaza los espectros.
5. Fluoróforos en Bioquímica y Biología

No todas las moléculas biológicas son fluorescentes, las que lo son se consideran que tienen fluorescencia intrínseca,
natural, propia de un sistema (no se puede controlar su rendimiento cuántico). Por otro lado, nosotros podemos
introducir agentes fluoróforos con buenos rendimientos cuánticos y que hacen que un sistema que antes no tenía
fluorescencia ahora sí lo tenga. Es lo que se conoce como fluorescencia extrínseca (se agrega a la muestra un
fluoróforo externo, una sonda fluorescente, que se pueden unir a las moléculas de estudio de forma covalente o no
covalente)

 En proteínas, la fluorescencia intrínseca se debe a la de los aa aromáticos (Trp) y poco más. Sí es cierto que
existen proteínas fluorescentes como la GFP y sus derivados, que son fluorescentes per se pero son
excepciones. Lo que ocurre normalmente es que proteínas no fluorescentes pueden tener cofactores que sí
lo sean. Pero lo normal es que tengamos que marcarlas con sondas fluorescentes (FITC, DNS).
 Los ácidos nucleicos no tienen fluorescencia intrínseca, de modo que se agregan sondas fluorescentes
catiónicas (EtBr, DAPI).
 Las membranas tampoco son fluorescentes. Se agregan sondas liposolubles con baja fluorescencia en agua
(DPH, ANS) o fosfolípidos marcados.
 Esas biomoléculas de pequeño tamaño que sí son fluorescentes y que pueden funcionar como cofactores
son: NAD(P)H, FAD, FMN, Piridoxal fosfato (PLP), clorofilas….

5.1 Fluorescencia de proteínas

Sólo aquellos cromóforos de las cadenas peptídicas que

absorben en el UV-cercano tienen unos rendimientos cuánticos
apreciables. Los aa Tyr, Trp y Phe, constituyen los fluoróforos
intrínsecos de las proteínas, de hecho, el espectro de emisión
fluorescente de una proteína esta normalmente dominado por
laemisión de Tyr y, sobre todo, de Trp. Tal y como vemos en la
gráfica, domina la señal del Trp, que de hecho se ha añadido
menos concentrado porque es el que más fluorescencia relativa
tiene. Sin embargo, si nos fijamos en la tabla inferior, el Trp no
tiene un rendimiento cuántico mucho mayor al de sus otros
compañeros. Lo que sí tiene más elevado con diferencia es el
parámetro de sensiblidad (εmax∙Rdto cuántico)

Nota: La espectroscopía de emisión se podría utilizar para hacer análisis de componentes (por deconvolución del
espectro de una proteína teniendo el espectro individual de cada componentes, y luego haciendo determinadas
correciones).
Recuerda: son muchos los factores que modifican los espectros de absorción y también los de emisión. En el interior
de una proteína el entorno de estos aa cambia y eso influye (efecto de plegamiento) en fluorescencia intrínseca.

En el caso de una proteína que no tenga Trp, el máximo de emisión estará en torno a 307 nm, (por las Tyr), pero
también se puede desplazar. Ejemplo: espectros de Tyr libre, y Tyr unida a calmodulina con y sin calcio (tu querido
complejo Ca2+/Calmodulina).

Los factores que disminuyen el rendimiento cuántico de la fluorescencia de la Tyr en proteínas son:

 El enlace peptídico.
 La transferencia de la excitación a residuos de Trp (Trp ‘’desactivaría’’ a Tyr)
 Los grupos carboxilo y amino de otros aa pueden también actuar como desactivadores.

Recuerda: Grupos prostéticos, coenzimas y cofactores presentarán dos espectros de emisión distintos en función de
su estado redox. Algunos pueden incluso no emitir en determinados estados redox (NADH emite, pero NAD+ no, por
ejemplo, ambos absorben). Esto permitiría estudiar el seguimiento de reacciones redox.

Ejercicio: Aquí tenemos el espectro de emisión de la flavodoxina de Anabaena cuyo cofactor es el FMN, no
fluorescente en el UV, si no en el visible.

 Verde oscuro: Flavodoxina con FMN. Lo

usaremos como espectro de referencia.
 Rojo: Flavodoxina sin FMN, emite
mucho más y el máximo se desplaza a
335 nm. El FMN lo que hace (en la
gráfica verde) es ‘’desactivar’’ al TRP,
porque se produce una transferencia de
energía de uno a otro, es un quenching.
Por eso ahora que no hay FMN, el Trp
emite tanto. Esto puede dar información de la unión de FMN a la proteína (podríamos calcular la KD). Que el
aumento sea tan brusco implica que probablemente estaremos afectando un Trp importante para esa
interacción (¿?).
 Naranja: el pico aumenta (respecto del espectro de referencia, el verde oscuro) y se desplaza, lo que
significa que la proteína se ha desnaturalizado y los residuos Trp se han expuesto. Los Trp se exponen y el
espectro se convierte prácticamente en el de un Trp libre.
 Verde clarito: se ha producido de nuevo una desactivación dinámica por choque de moléculas de FMN con
la proteína (Ahora probablemente porque estarán chocando en el estado desnaturalizado), por eso la
emisión aumenta ligeramente respecto del espectro de referencia.

Todo esto ocurre porque se va alternando el entorno del cromóforo (Trp).

6.Sondas fluorescentes para proteínas

Se pueden elegir sus propiedades (ε y φF ), y se caracterizan por su:

 Fotoestabilidad
 Alto rendimiento cuántico
 Coeficiente de extinción alto
 Pocas fluctuaciones en intensidad
 Absorción y emisión en el visible.
 Pequeño tamaño.
 Ser más estables a variaciones en el entorno.

En proteínas se pueden unir de forma covalente o no a las mismas, siendo la unión covalente una unión específica,
mientras que la no covalente no es específica. Ejemplos:

 Unión covalente: las yodacetamidas pueden unirse formando enlaces covalentes con las Cys. Si una proteína
no tiene Cys en una determinada posición pero aun así queremos añadir esta sonda, pues hacemos una
proteína mutante (mutagénesis dirigida).
 Unión no covalente: se produce un cambio en la emisión por un cambio del entorno, por ejemplo, el
fluoróforo ANS no ofrece fluorescencia hasta que no se mezcla con una disolución de albúmina humana.

Ejemplos: Fluoresceína y rodaminas que absorben y emiten en el visible, el dansilo (sensible a la polaridad del
entorno, fluorescencia polarizada) y los compuestos de B (BODIPY) que absorben y emiten en el visible. Otro ejemplo
es el de la Tioflavina (ThT), un marcador fluorescente de agregados amiloides de proteínas (en enfermedades
neurodegenerativas). En disolución su rendimiento cuántico es pequeño y el coeficiente de extinción molar también
pero cuando se internaliza entre las fibras amiloides aumenta su absorción a 450 nm y eso implica un aumento de
fluorescencia (a 482 nm). Así se pueden detectar estas fibras amiloides.

7. Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos no tienen fluorescencia intrínseca, pero se pueden n intercalar entres sus bases moléculas
fluorescentes llamadas agentes intercalantes para detectarlos, por ejemplo Bromuro de Etidio o Naranja de Acridina.
También se pueden modificar las bases para que sean fluorescentes.

(Los seminarios entran para el examen).

8. Aplicaciones de la fluorescencia

Son numerosas las aplicaciones de la fluorescencia y la microscopía de fluorescencia:

 Marcaje de moléculas en células y tejidos para su caracterización e identificación.

 Estudio de células normales y patológicas.
 Recuento y clasificación de células (Citometría de Flujo).
 Estudios inmunológicos.

9. La GFP y sus derivados

Es una proteína que emite fluorescencia en el visible (luz en la zona verde del visible) por formación espontánea del
fluoróforo al plegarse. Cuando esta proteína se pliega la proteína se produce una desprotonación y una
deshidrogenación (¿) en el interior de su estructura y las cadenas laterales de los aa quedan orientadas en la
dirección correcta para que ocurra esa reacción y se genera ese compuesto fluorescente que emite en el visible. La
presentan algunos animales y amebas.
La GFP fue clonada e introducida en el gusano transparente C. elegans en 1988, iniciando así la era de la GFP como
marcador celular y de organismo: iluminando el organismo con la longitud de onda adecuada se observa
fluorescencia allá donde se encuentre la GFP, sirve por tanto para hacer estudios in vivo.

La modificación de la estructura de la proteína ha permitido

producir proteínas que emiten luz a distintas longitudes de onda
(proteínas fluorescentes azulees y amarillas). Se han conseguido
modificando los aa que se encuentran en la región cromófora
generada cuando la proteína se pliega, se cambia el entorno del
cromóforo y por tanto absorben a longitudes de onda distintas y
emiten también a longitud de onda distinta. El rendimiento
cuántico de estas moléculas es elevado.

Son muy versátiles y se utilizan en diversos campos, como la microbiología, la ingeniería genética, la fisiología y la
ingeniería ambiental. Permiten ver procesos antes invisibles, como puede ser el desarrollo de neuronas o cómo se
diseminan las células cancerosas, o el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer, el crecimiento de bacterias
patógenas, o la proliferación del virus del SIDA, entre otros.

Ejemplos:

 Células cancerosas que expresan DsRED pueden implantarse en ratones

salvajes, o transgénicos con expresión de GFP en todas las células. Cuando los
ratones son iluminados con luz azul las células cancerosas pueden ser
fácilmente detectadas y seguidas permitiendo la localización de las metástasis
y el fenómeno de angiogénesis en tumores en proliferación. Por otro lado, el
modelo permite seguir la evolución comparativa de las metástasis en
presencia o ausencia de distintos fármacos.
 Cultivo de neuronas corticales de embrión de rata transfectadas con un plásmido
que codifica para la GFP. La tinción en azul corresponde con el marcador de
ácidos nucleicos DAPI que detecta el núcleo de las células presentes en el
campo. Solo una de ellas expresa GFP
 Se emplean en doble hibrido (se divide d forma estratégica la GFP y cuando las dos mitades se acoplan se
emite fluorescencia, y eso sólo ocurre cuando se produce una interacción entre las dos proteínas de estudio,
cada una de ellas unida a una mitad de la GFP).
 Micrografias de células en división, tomadas con un microscopio de
fluorescencia. Se emplearon tres fluorocromos: DAPI (emite luz azul) para
marcar cromosomas, GFP (proteína verde fluorescente intracelular que emite luz
verde) y rodamina (luz roja) para marcar microtúbulos. Cada fluorocromo
necesita el uso de filtros específicos, dependiendo de la longitud de onda
necesaria para su excitación. En realidad, el color se añade de manera artificial
(los aparatos miden la fluorescencia emitida, el color lo ponemos nosotros
sabiendo la longitud de onda de emisión de las sondas empleadas). Recuerda que
lo normal es tomar las fotografías por separado para cada sonda y luego
combinar las imágenes obtenidas.

10. Polarización de fluorescencia y anisotropía

En este caso empleamos luz polarizada en un plano para excitar la muestra. En solución, el fluoróforo puede estar
en cualquier orientación debido a su dipolo (si no hay un campo eléctrico o magnético, los dipolos no están
orientados). De este modo, al emplear luz polarizada, sólo se podrán excitar aquellas moléculas cuyo dipolo se
encuentre en el mismo plano de polarización que la luz que incide, esas serán las únicas moléculas que absorberán
y que por tanto emitirán radiación electromagnética.

En el tiempo entre que las moléculas absorben y emiten, se pueden mover, pero si una molécula es grande no se va
a mover mucho, de modo que el detector recogerá luz polarizada. Pero lo normal es que en una disolución de
muestra las moléculas difundan, se muevan y roten, de modo que cuando emiten fluorescencia los dipolos pueden
estar orientados de forma totalmente distinta a cuando la molécula absorbió, de modo que veremos mucha menos
intensidad de fluorescencia, en un haz de luz no polarizada, entonces, cuando la luz emitida por un fluoróforo posee
diferentes intensidades en diferentes ejes de polarización hablamos de Anisotropía.

La polarización de fluorescencia proporciona información sobre la forma y tamaño de las macromoléculas o sobre la
rigidez de varios entornos moleculares. Se emplea para estudiar los cambios conformaciones en macromoléculas,
asociaciones proteína-proteína, fluidez de membranas….

También tenemos anisotropía en fenómenos de FRET (que básicamente es excitar un cromóforo pero para recoger
luego la emisión de otro).

La polarización puede calcularse con una fórmula matemática que relaciona la intensidad paralela y la perpendicular,
y la anisotropía también (es r(t)). Se calcula así porque el aparato mide precisamente sólo la intensidad, bien en el
mismo plano de polarización que la luz incidente (que disminuirá si las moléculas han rotado) y la intensidad en el
plano perpendicular (que aumentará cuanto mayor haya sido el movimiento de las moléculas). Todo esto se mide en
el tiempo en que se desarrolla el experimento. Esta técnica permite por tanto analizar lo rápido o lento que se
mueve una determinada molécula (lo cual depende de la temperatura, la viscosidad del medio y del tamaño de la
propia molécula). Ejemplo: una molécula que puede formar tanto mono como tetrámeros, el monómero se moverá
más rápido que el tetrámero, así que podemos ver si la proteína se ha oligomerizado o se ha desnaturalizado.

Nota: De los dos parámetros, el que se utiliza es en realidad la anisotropía. Las intensidades son siempre relativas
(ninguna de las dos, ni la del plano paralelo ni la dle perpendicular es real, recuerda).

10.1 Aplicaciones

 Investigaciones sobre la fluidez y rigidez de membrana.

 Microviscosidad local en líquidos y polímeros.
 Interacciones proteína-proteína
 Unión Ligando-Receptor
 Monitorizar procesos de FRET entre moléculas idénticas.
  Alineamiento de moléculas en varias matrices.

11. Photobleaching o blanqueamiento

Más que el blanqueamiento, se emplea el fenómeno de recuperación de la fluorescencia después del

Photobleaching.

Se define fotoblanqueamiento como a la pérdida de capacidad para producir fluorescencia de una molécula debido
a la destrucción fotoquímica de los fluoróforos cuando la molécula es expuesta a una luz de excitación demasiado
potente. Se emplea una luz tan potente que el fluoróforo se acaba estropeando, se desactiva o se convierte en una
molécula no fluorescente. Lo que ocurrirá normalmente, no obstante, es que los fluoróforos que estén en otra
región (por ejemplo, en una célula analizada) podrán acudir a la zona blanqueada y por eso se recupera la emisión
(que será menos intensa).

11.1 Aplicaciones

 Estudiar difusión de moléculas

 Analizar el movimiento activo de los componentes celulares.
 Evaluar cómo de móvil es una molécula fluroescente (¿es libre para moverse por el citosol o está anclada a
lago que no se mueve? ¿tal vez está en un compartimento intracelular?)

12. Microscopía confocal

Empela un microscopio de fluorescencia normal pero que permite estudiar sólo un plano de la célula. La muestra se
ilumina de forma secuencial en un elemento de volumen cada vez. Se pueden iluminar zonas hasta 250 nm y 500 nm
de profundidad. En un microscopio de fluorescencia común se emite y se capta toda la fluorescencia de golpe, y en
el confocal se seleccionan las capas del espécimen que se excitan, por lo que la imagen es más nítida (tímida ha
dicho jajajajaajjajaj) porque solo estudiamos un plano. Entonces, las características son:

 Uso de la fluorescencia (epi-fluorescencia).

 Enfoca un solo plano del espécimen.
 Elimina la información proveniente de otros planos no enfocados del espécimen.
 Obtención de cortes ópticos seriados a partir de muestras con cierto grosor o cuyo corte fino se dificulta.
 Gracias a programas de computación, se combinan los cortes ópticos seriados y a partir de ellos se
reconstruye en tres dimensiones la estructura observada.

Comparación entre dos micrografías de una célula en

mitosis, contrastada con un doble marcaje fluorescente,
tanto para los cromosomas (verde) y la actina (rojo). A la
izquierda se aprecia una imagen donde la profundidad de
campo abarca prácticamente todo el espesor de la célula y
en consecuencia la imagen se ve un tanto borrosa a pesar
de estar enfocada. A la derecha se observa una imagen
obtenida con el principio confocal, que consiste en un
corte óptico de la célula donde se captura la fluorescencia
que proviene exclusivamente de las estructuras que están en el plano de enfoque, obteniéndose una imagen más
nítida.
 Tema 6: Espectroscopia resuelta en el tiempo
1. Cinética en reacciones biológicas

Con las técnicas vistas hasta ahora lo que veíamos era el espectro de equilibrio en las condiciones de estudio,
información de la proteína en un estado fijo. Era algo estático, como si hubiésemos hecho una fotografía. Pero en
muchos procesos biológicos lo que interesa es ver el tiempo en que tarda en alcanzarse dicho equilibrio, es decir, la
cinética de los procesos.

En los procesos biológicos es muy importante conocer la velocidad a la que sucede ese proceso y también saber si
hay que pasar por intermediarios hasta llegar al producto final. En los estudios de estado estacionario, solo podemos
estudiar la proteína plegada y la desplegada, no proporcionan información del intermediario.

Si la cinética es adecuada significa que el metabolismo funciona correctamente. Queremos conocer la cinética de
procesos como las interacciones proteína-proteína, la unión de un ligando, la transferencia de electrones, FRET, el
plegamiento de proteínas, reacciones enzimáticas o reacciones químicas

La mayoría de estas reacciones ocurren a velocidades tan rápidas que no se pueden detectar con los aparatos
convencionales. Como los equilibrios se establecen en cuestión de mili o femtosegundos, se necesitan técnicas
adecuadas que permitan medir a tiempos mucho más cortos. Queremos identificar constantes individuales, las
especies que intervienen (intermediarios) y cuál es la velocidad de cada uno de estos procesos en los que se generan
y desaparecen. Para ello se emplean los métodos de estado pre-estacionario, para estudiar los procesos que tienen
lugar antes de que se alcanza el equilibrio.

1.1 Equilibrio rápido de formación: proteína plegada/desplegada

Al calentar una proteína vemos que pasa de una

conformación nativa a una desplegada. Las
técnicas vistas hasta ahora no dan información
sobre la velocidad a la que sucede el proceso. Si
queremos conocer la velocidad de proceso
tenemos que conocer la concentración de las
especies nativa y desplegada, y la proporción de
proteína plegada y desplegada que tengamos en
cada momento depende del equilibrio.

Hay que resolver un sistema de dos ecuaciones

diferenciales con dos incógnitas.

Las constantes k1 y k2 están normalmente en escalas de milisegundos por lo que no se pueden medir con una técnica
espectroscópica normal.

2. Cinética del estado pre-estacionario y del estado estacionario

En el estado estacionario la mayoría de enzimas parecen seguir una cinética que recibe el nombre de Michaelis-
Menten (MM). El mecanismo propuesto por MM es el que sigue:

El modelo asume ciertas cosas:

 Enzima y sustrato se unen de forma no covalente para formar el complejo ES

  Se trabaja en condiciones de cinética de pseudo-primer órden (un único sustrato se une a la enzima, la
concentración de enzima total (libre y en forma de complejo) es constante, y más pequeña que la cantidad
de sustrato, y estado estacionario):

 Se trabaja con las velocidades iniciales

 La segunda reacción es irreversible (k-2 = 0)
 No hay inhibición por producto.

En Michaelis-Menten, tenemos como parámetros a conocer la Km y la kcat (y a partir de ésta última se puede conocer
Vmax, recuerda, si la concentración de enzima es constante). Pero estas constantes dependen de todos los procesos
que ocurren en el mecanismo, son constantes macroscópicas que podrían no informar de todas las etapas del
proceso. Por eso se necesitan las cinéticas de estado pre-estacionario, para conocer la totalidad de las etapas.

La Vmax viene determinada por la cantidad de enzima total y por la habilidad química de la misma, lo que se refleja
en su constante catalítica (kcat) o número de recambio, que da idea del número máximo de moléculas de sustrato
transformadas por sitio activo por unidad de tiempo (velocidad a la cual la enzima transforma el sustrato en valores
de pH y T adecuados).

Por otro lado, la Km se define como la concentración de sustrato a la cual se alcanza la mitad de la velocidad máxima.
Se podría definir como la constante de disociación (KD) del complejo ES.Recuerda que la Km da una medida de la
afinidad, PERO no siempre es lo mismo que la KD. Sólo KD se aproxima a Km si k2 es mucho menor que k-1 (demostrar).

Y recuerda: el significado microscópico de Km y kcat va a depender de los detalles del mecanismo.

Se necesitan técnicas que nos permitan ver por separado todos los procesos, que nos permitan medir desde el
momento inicial y seguir el curso de la reacción conociendo los intermedios y demás. Estas técnicas se llaman
técnicas de estado pre-estacionario o técnicas de espectroscopia resuelta en el tiempo.

Hay dos posibilidades. Pero ambos se basan en la posibilidad de que cada especie intermedia tenga un cambio en el
espectro respecto de la proteína inicial:

 O somos capaces de diseñar sistemas que tecnológicamente permitan medir la reacción desde el tiempo
cero en que empieza la reacción (desde que se añaden los reactivos, desde t=0).
 O se tiene todo en la cubeta del equipo que se va a usar y se altera algo muy rápidamente de modo que ese
algo sea lo que inicie la reacción. Por ejemplo, tenemos todo mezclado en la cubeta y con un pulso de laser
excitamos una molécula y eso hace que se inicie la reacción. Puede hacerse con un láser que cambie el pH,
que cambie la temperatura o que excite alguna molécula.

Los métodos más empleados son Mezcla Rápida con flujo detenido (stopped-fow, rapid mixing), fotólisis por pulso
de láser, cambio brusco de pH o T (pH-Jumping, T-Jumping). Y los métodos de detección más habituales acoplados a
estos sistema son los que hemos ido viendo: espectrómetros UV-Vis, Fluorescencia y CD.

3. Mezcla rápida con flujo detenido

Se basa en una cubeta dentro del equipo con un reservorio de muestra muy pequeño
(120-140 microlitros, lo cual minimiza la cantidad de muestra a utilizar) y un haz de luz
que atraviesa la muestra. Posteriormente hay un detector que conecta con la cámara de
observación (sistemas de detección de CD, Fluorescencia o Absorción, normalmente
estos dos últimos).

El sistema tiene dos jeringas que vienen desde fuera y en ellas es donde cargamos un
sustrato diferente en cada una. Luego, un sistema (neumático a compresión) pulsa los
dos pistones de las jeringas simultáneamente para que llegue la misma cantidad o
volumen de cada uno de las jeringas a la cubeta, y en el momento en que llegan a la
cámara se mezclan los componentes y empieza el experimento. No obstante, como la
mezcla puede generar turbulencias y ruido los resultados, éstos solo son
fiables a partir de un milisegundo

Otro problema es la posible pérdida de muestra: como el sistema de jeringas

emplea presión, todo aquello que no quepa en la cámara de observación se
irá al conducto de desechos. Para evitar esto, el sistema tiene una tercera
jeringa que es de parada. Primero se empuja la jeringa de stop o parada y se
sacan del sistema unos 140 microlitros de líquido, lo que deja solo especio
para que entren 140 microlitros de la mezcla que se ha formado tras pulsar
las otras dos jeringas (si cada una es de 2 mL se puede hacer unas 18, 20
medidas).

Notas: Si quieres que la mezcla no sea homogénea, pones una de los

sustratos diluidos en jeringas más pequeñas. Las jeringas están dentro de
una cámara termostatizada.

El aparato proporciona el cambio de la señal espectroscopia con el tiempo (muy corto). Necesitamos por tanto que
la reacción ocurra en ese periodo de tiempo. Y recuerda: podemos considerar que el cambio es real después del
milisegundo (por aquello de la mezcla). Se obtienen graficas exponenciales, que se pueden ajustar a ecuaciones
exponenciales.
En la ecuación, Y es la absorción a una determinada longitud de onda, es igual a la absorción inicial más la amplitud
por e elevado a la kobs por el tiempo. An es amplitud del proceso (variación de absorbancia, fluorescencia o
elipticidad) que se relaciona con ese proceso y kobs es la constante de velocidad de la transformación entre especies
en las condiciones de ensayo, permite saber la velocidad del proceso.

Identificar el proceso es muy complicado. En el ejemplo, A es la mezcla de sustratos y B la mezcla de productos (no
sabemos que hay dentro). Es lo único que podemos decir con esta información. Podemos hacer un ajuste
monoexponencial y evaluar los residuals. Los residuals son la diferencia entre los datos experimentales y la línea
teórica de mi ajuste (los que deberían haber salido). Para que el ajuste fuera bueno tendría que estar la línea de
datos experimentales prácticamente en cero lo cual no sucede mucho. En el ejemplo vemos que no es así, así que
pasamos a proponer un mecanismo diferente, en el que en lugar de dos especies participan tres (una será el
intermediario), y vemos que el ajuste es mejor. Si continuásemos haciendo el ajuste a una exponencial triple sería
probablemente mejor pero siempre hay que quedarse con el más simple que sea más bueno.

Se puede medir cualquier cambio espectroscópico (CD, absorbancia, fluorescencia). También puede ocurrir que a
diferentes longitudes de onda se produzcan cambios diferentes (lo cual podría dificultar los análisis). Según lo que se
vaya a medir, unas técnicas serán mejores que otras (pensar: para reacciones redox en anaerobiosis podemos
trabajar en el UV-Vis, para ver unión ligando-prot, espectros absorción diferencial, para analizar un cambio de
estructura secundaria usaríamos CD, etc).

Problema: los parámetros que nos den

los espectros serán las constantes
macroscópicas, que habrá que rela-
cionarlas con las del proceso real. Por
ejemplo, en una proteína que lleve a
cabo un proceso redox, la kobs puede
englobar todas esas otras constantes.
Para determinar la Kd tendremos que
enfrentar los diferentes valores de
kobs a concentraciones crecientes de
sustrato, la relación entre ellas
recuerda a la ecuación de MM (porque la gráfica también es una hipérbola). Nota: krev es la constante del proceso
reverso.

Las incógnitas son kon, koff y ket.

Nota: Los programas hacen los ajustes no lineales iterando, dando valores teóricos a los parámetros hasta encontrar
la ecuación que más se ajusta a los datos experimentales. Hay que tener cuidado con los datos que salgan , deben
ser razonables, porque puede haber más de un resultado matemático posible.

De la misma forma se pueden estudiar los procesos de despegamiento y calcular las velocidades de estos procesos.

Lo importante de la técnica de stopped-flow es que la

detección sea muy rápida, si en lugar de un detector normal
empleamos uno de diodos, podemos ver como evoluciona el
espectro en función del tiempo y en el rango de diodos que
podamos medir, y así obtenemos la información en función de
la landa y del tiempo (3 variables, sistema tridimensional, se
transforma en uno bidimensional si fijo una variable,
normalmente, la longitud de onda).

Nota: A veces los procesos reversos y directos no siguen el mismo mecanismo (por ejemplo: reducción y oxidación
de flavinas).

3.1 Ejemplo: Reoxidación de DHODH por el fumarato

Es un proceso aparentemente bastante rápido porque solo han

conseguido coger dos o tres espectros antes de que la reacción esté
acabada. En el primer espectro vemos cómo se producen cambios en
el espectro de la proteína reducida conforme se va reoxidando. Si
ese gráfico se analiza y se hace una deconvolución espectral, se
predice que existen 3 especies, A, B y C, cuya concentración va
variando con el tiempo (grafiquita pequeña dentro del segundo espectro). Calculamos la kobs al enfrentar la
proteína con diferentes concentraciones de fumarato, y enfrentamos kobs frente a [fumarato], obteniendo una
gráfica de la que podemos estimar Ket = 30 s-1 y Kd= 250 μM. Ket es el valor límite o asintótico de Kobs, es algo así
como la Vmax de esta ecuación.

Podemos suponer que la especie A sea el complejo Proteína-Fumarato (recuerda, las mediciones empiezan justo
cuando mezclamos los sustratos, puede que la formación del complejo sea tan rápida que no podamos detectarla). B
posiblemente sea un intermediario y C será la proteína una vez ha liberado el producto. La etapa limitante del
proceso es la segunda, la transformación de B en C, es la etapa lenta.
3.2 Ejemplo: Organización molecular del dímero AIF:NAD(H) humano

Si durante una reacción entre las moléculas se apilan las nubes

electrónicas π, (por ejemplo: cuando interaccionan flavinas y
pirimidinucleotidos) aparecerá información en la región de visible.
Se forman lo que se conoce como complejos de transferencia de
carga (bandas de complejo de transferencia de carga, NO APARECEN
EXACTAMENTE EN LA MISMA REGIÓN EN LA QUE ABSORBEN NI LA
NICOTINAMIDA NI LA FLAVINA, en amarillo en la imagen de abajo)

El grupo hizo un mutante de esta proteína para que no fuera estable. Crearon una mutante triple que dimerizaba
cuando era reducida por NADH, y en la que se estabilizaba mucho menos complejo de transferencia de carga (lo
cual implica importancia de esos residuos en el papel de señalizador redox de la célula). El cambio en los residuos de
aminoácidos hace que haya menos apilamiento entre la flavina y el coenzima. Vieron que había una relación ente el
complejo de transferencia de carga y la no estabilización del mutante.

Apuntes de otros años:

Este estudio tenía un problema: casi todo ocurría en el tiempo muerto y no se observaba. ¿Qué podemos hacer?
Bajar la T ya que hablamos de constantes cinéticas relacionadas con la T. Al bajar la T éstas también bajan y sirve
para comparar. Con eso estudiaron otras proteínas con mutaciones y han complementado con estudios estructurales
experimentales y computacionales han sido capaces de determinar el mecanismo del enzima. La combinación de
diferentes técnicas biofísicas computacionales y experimentales les permitió describir que la tirosina es esencial para
que tenga lugar el funcionamiento del enzima de forma eficaz: ayuda a que los anillos se coloquen correctamente. Se
han podido simular estructuralmente ya que se conocen los complejos de transferencia de carga.

La transferencia de electrones entre estas dos proteínas son espectros muy parecidos: si las mezclas. Cuando una
proteína interacciona con otra su espectro puede cambiar.

Nota: Para saber si una proteína ha formado el dímero podría hacerse electroforesis nativa, cromatografía de
exclusión molecular, anisotropía de fluorescencia, resolver la estructura cristalográfica, microscopia de fuerzas
atómicas, termoforesis, etc.

4. Estudio de transferencia de hidruro entre FNR y NADP(H)

Los procesos de transferencia de hidruro ocurren entre el N5 del FM y el C4 del

NAD(P)+. (Ocurren en la fotosíntesis y el proceso reverso? en la fase oscura). Al analizar
los espectros determinaron que había dos intermediarios, y un complejo de
transferencia de carga, que se interconvierten entre sí. Así, ya solo con esto, podemos
asegurar por lo menos la existencia de apilamiento (transferencia de hidruro directa)
aunque no se haya visto cristalográficamente.
Recuerda que todo lo que se mide con stopped-flow va a depender mucho de la temperatura (porque las constantes
de los procesos dependen de la T). Si una reacción es tan rápida que no la podemos analizar, podemos enfriar el
sistema bajando la temperatura, bajan así las velocidades y los procesos se vuelven medibles.

Al analizar el mutante Y303S se observó que la reacción casi solo va en una dirección
y genera gran cantidad de complejo de transferencia de carga. Se propuso que el
residuo de serina en 303 es tan pequeño que el NADPH se queda encerrado dentro,
sin salir de la cavidad, lo que permitiría que la reacción solo se diese en un dirección.
Pero en el caso del WT Y303, se forma un complejo óptimo para la transferencia de
hidruro.

Notas: es interesante estudiar los estados de transición porque son dianas terapéuticas interesantes, pero claro, no
se tienen sus estructuras cristalográficas, por eso se hacen necesarias estas técnicas. Todo se puede complicar
mucho más (pensar en estados semiquinonas); ¿Verdaderamente estamos interpretando bien los espectros para dar
los procesos del mecanismo reales?
5. Unión de flavinas al sitio RFK de la FAD sintetasa

La FAD sintetasa se ha resuelto en dos conformaciones, abierta y cerrada. Querían estudiar el mecanismo de unión
de los ligandos, ver la cinética de su incorporación. Como la flavina es fluorescentes se empleó la fluorescencia para
el análisis (ventaja: alta sensiblidad de la técnica, recuerda, así hace falta menos proteína y el espectro cambia
bastante cuando el ligando está unido respecto a cuándo no lo está).

Analizaron dos ligando diferentes, la riboflavina (RF) y el FMN. Pero lo que

vieron es que la caída de fluorescencia era MUY LENTA (para lo que se había
vsito). Vieron que la fluorescencia era muy baja también al añadir RF sólo
con tampón (sin FAD sintetasa), de modo que lo que estaba sucediendo era
un fenómeno de photobleaching, la lámpara del stop-flow estropeaba la
flavina. O bien, que la flavina no cambia de entono, no se internaliza dentro
de la proteína.

Además, se vio que hacía falta un segundo sustrato, el ATP, para que RF se
uniera a la FAD Sintetasa. Hicieron todas las mezclas posibles, siempre en
presencia de magnesio y vieron que lo que faltaba para producir ese
aumento de la fluorescencia era ATP.

Determinaron que la Kobs1 era la constante de unión de la flavina a la proteína y la segunda constante correspondía
al cierre de la cavidad, que solo se produce cuando hay ATP (el otro sustrato, el ATP es el que desencadena el cierre
de la cavidad).

Al repetir los ensayos con la enzima de Streptococcus neumomie, el comportamiento era distinto. Había diferentes
velocidades y amplitudes en los espectros, los mecanismos de reacción debían ser por tanto diferentes (vieron que
lo que ocurría es que en ocasiones había inhibición por sustrato, se regulan de forma diferente).

La FAD Sintetasa del principio procedía de Corynebacterium y presentaba inhibición por sustrato, mientras que la de
Streptococcus no (Recuerda por qué es interesante el fenómeno de inhibición pro sustrato. En este caso es porque
estas FAD son las que se encargan de sintetizar el FMN de toda la célula). La de Corynebacterium además sufre un
cambio conformacional y la de Streptococcus no lo necesita.

Importancia de este descubrimiento: dos proteínas parecidas de especies diferentes pero con tantas diferencias en
su mecanismo permitirán describrir inhibidores que sólo afecten a la FAD sintetasa que nos interese (la de
Streptococcus).

6. Laser flash photolysis spectroscopy (espectroscopia inducida por pulso de láser)

En este caso, hay algo fotosensible en la muestra de

manera que cuando una longitud de onda lo excite se
iniciará una reacción.

Es un sistema que en un momento dado hace incidir

sobre la muestra un pulso de laser que produce
cambio temperatura, pH o de potencial redox. Se inicia
así el proceso, que se mide en un osciloscopio.

Tiene como ventaja que permite hacer mediciones

desde el momento cero prácticamente: el tiempo
muerto es menor y se puede medir casi por debajo
bajos milisegundo, y podemos hacer mediciones incluso antes de que incida el láser. Otras técnicas miden en
femtosegundos. Los gráficos se analizan y se ajustan a ecuaciones similares al de stopped-flow.
 Tema 7: Difracción de rayos X
1. Biología Estructural

En el Protein Data Bank están todas las estructuras de proteínas descritas hasta la fecha depositadas (145.700
aprox). Son estructuras de proteínas aisladas, o interaccionando con ligandos, DNA, carbohidratos (algunas por tanto
serán redundantes). Aproximadamente un 90 % de las estructuras depositadas en el PDB se han obtenido a partir de
cristalografía por difracción de rayos X (las otras dos técnicas de obtención de estructuras son la RMN y la
microscopía electrónica).

Las estructuras secundarias y terciarias de las marcomoléculas contienen información clave para determinar sus
funciones y estudiar procesos dinámicos. Por el tipo de plegamiento que presenta una proteína cristalizada podemos
dilucidar su función (comparando con otras proteínas de estructura de plegamiento similar y de función conocida).

La determinación de estructuras de proteínas resulta vital para estudiar el sitio activo. Es imprescindible conocer el
sitio activo tanto en 3D como en 2D para poder hacer estudios y modificaciones, desde el punto de vista atómico.

La determinación de estructuras de biomoléculas se realiza, como ya hemos dicho, con Rayos X (Cristalografía de
rayos X), RMN (Resonancia Magnética Nuclear, permite resolver estructuras en solución, ayudará por tanto a hacer
estudios dinámicos) y la Microscopía electrónica (que servirá para estudiar la estructura de complejos grandes). Las
estructuras así obtenidas se depositan en el Protein Data Bank y a cada una se le asigna un código PDB. Se pueden
descargar desde allí

2. Cristalografía de rayos X

En realidad la cristalografía de rayos X es una forma de microscopía de alta resolución (resolución atómica, entre 1-2
Å), que permite visualizar la estructura de proteínas por tanto a nivel atómico. Mejora nuestro entendimiento de la
función de las proteínas, de su interacción con otras, de su inhibición con drogas, etc. Es una técnica disponible en
muchos laboratorios y que abarca un rango amplio de tamaños moleculares.

La técnica de rayos X aplicada a proteínas proporciona información acerca de la estructura tridimensional y el

plegamiento, así como propiedades físico-químicas, como las distancias y los ángulos de enlace, el estado térmico
vibracional de los átomos (recuerda que solo a 0 K los átomos están quietos) y su empaquetamiento cristalino (lo
cual puede dar pista de cómo actúan in vivo, en forma de dímeros, trímeros, etc, aunque a veces se trata de
artefactos formados al cristalizar).

El tamaño molecular que abarca esta técnica es muy amplia: podemos analizar proteínas, virus, ácidos nucleicos,
complejos nucleoproteicos y complejos proteína-proteína. En definitiva, todo aquello que se pueda cristalizar.

2.1 Pasos clave

1. Preparación de la proteína: pura y a homogeneidad (pura y todas las moléculas con el mismo plegamiento).
2. Crecimiento de cristales: para que a partir de una disolución acuosa de proteína se obtenga la estructura
cristalina.
3. Recogida de datos: los cristales se introducen en un aparato (dicrógrafo) y se someten a Rayos X, se generan
una serie de puntos como consecuencia de la radiación que pasan a un detector.
4. Determinación de las fases: A partir de los datos se calcula y genera un mapa de densidad electrónica que se
debe correlacionar con la secuencia de aminoácidos de la proteína
5. Construcción del modelo y refinado: se enfrenta el modelo generado a los diagramas de Ramachandran y a
otras especificaciones para que podamos decir que es un modelo real de la estructura 3D de la proteína.
2.2 Radiación X

 La luz visible utilizada en microscopía tiene una λ= 300 nm, y permite ver células individuales y orgánulos.
 En la microscopía electrónica, la λ empleada es de 10 nm, podemos ver arquitectura celular, la forma de las
células o de sus componentes, y la forma de moléculas grandes de proteína.
 Los rayos X tienen una longitud de onda menor o igual a 0,1 nm o 1 Å, son por tanto radiaciones mucho más
energéticas, pero permiten estudiar el detalle atómico de la proteína.

El físico alemán Wilhelm Conrad Röntgen descubrió los rayos X en 1895, determinó que os rayos creaban una
radiación muy penetrante, pero invisible, que atravesaba grandes espesores de papel o de metales poco densos e
incluso realizó la primera radiografía humana, usando la mano de su mujer. Como desconocía la radiación con la que
estaba trabajando, lo llamó ‘Radiación X’

Poco después, Max von Loue demostró que la radiación X era una radiación con naturaleza ondulatoria, y vio que los
cristales que eran irradiados con ella generaban patrones de difracción característicos (le dieron el Premio Nobel de
Física en 1914).

Posteriormente padre e hijo Braggs vieron que esos patrones se podrían relacionar con la estructura interna de los
cristales. Les dieron el premio Nobel de Física un año después, en 1915.

Como toda radiación electromagnética, la radiación X tiene una componente eléctrica y otra magnética, con una λ
en torno a 1 Å. Los rayos X son los segundos rayos más energéticos (después de los gamma), y esta radiación cubre
un rango del espectro ligeramente amplio, desde 0,5 a 5 Å.

Según su longitud de onda y su energética (frecuencia) tenemos rayos X blandos y rayos X duros (λ menor,
frecuencia mayor, muy interesantes, pero no se consiguen en dicrógrafos, se requieren sincotrones, aceleradores de
partículas).

¿Cómo se generan los rayos X?

Difractómetro:

Es un tubo en el que se generan los rayos X. En el

tubo tenemos un polo positivo y otro negativo entre
los que se genera una diferencia de potencial enorme
con un generador de alta tensión (50 kev). En el polo
negativo hay un filamento especial del que se
desprenden electrones como consecuencia de la
aplicación de ese potencial, electrones que viajan
hasta el polo positivo para chocar con él. Este polo
positivo es lo que se conoce como ánodo o
anticátodo y está formado por un metal (Fe, Mo, Cu),
de modo que cuando los electrones impactan contra
él, se producen, como consecuencia de los impactos, transiciones entre diferentes niveles energéticos de los
electrones de los átomos que componen el polo positivo, y esas transiciones generan radiación con una λ
determinada (dependerá del metal que compone el anticátodo), radiación X

Los rayos generados pasan por un monocromador para seleccionar la λ concreta con la que se quiera irradiar la
muestra. El aparato cuenta también con unas ventanas de Berilio que absorben cierta cantidad de radiación (para
disminuir la peligrosidad), estas ventanas se convierten en material altamente radiactivo (por eso hay que tener
mucho cuidado cuando se desmantelan instalaciones que cuenten con estos equipos.

Todo el aparato está reforzado con Pb (plomo, que absorbe radiación X).
Los electrones frenados como consecuencia del choque con el anticátodo no solo producen rayos X (al generar
transiciones electrónicas en los átomos) sino que además también van a producir una disipación de energía en el
frenado en forma de calor, por lo que se deben emplear o bien ánodos giratorios (de modo que no serán siempre
bombardeados en el mismo sitio) o bien circuitos de refrigeración con agua.

Cuando un electrón choca con los átomos de metal del anticátodo, pueden pasar dos cosas:

 El electrón impacta cerca del núcleo, pero interacciona de algún modo con los electrones de la corteza y es
frenado, emitiendo un fotón con una λ igual o menor que la que tenía el electrón que ha impactado. Es lo
que se conoce como radiación de frenado o de Brehmstrahlung.
 El electrón al impactar no es frenado, sino que a su paso desplaza a un electrón de un nivel energético bajo,
al desplazarlo se genera un hueco en esa capa para que un electrón de un nivel superior descienda
(transición electrónica). En esa caída se emite un fotón que tendrá una λ característica para cada átomo. Es
por tanto la radiación característica (producción de rayos X característicos de un metal).

Para que se genere la radiación X es necesario que entre los electrodos se

genere un voltaje de un valor determinado. La generación de rayos X se inicia Radiación blanca
a un valor mínimo de voltaje, que dependerá del material del anticátodo (es o continua
decir, del metal empleado).

Si hiciésemos un espectro de rayos X en el que medimos la intensidad relativa

frente a la longitud de onda, obtendríamos lo que se llama espectro
continuo, que observa una variación concreta con el voltaje: al aumentar el
voltaje, la intensidad de todas las longitudes de onda aumenta, y el valor de
la longitud de onda mínima decrece (fijarse en la figura).

Cuando superamos un valor determinado de voltaje (ese que depende del

material del anticátodo), lo que aparece es el espectro característico, que
se superpone al espectro continuo.

Dependiendo del metal, en el espectro tendremos unos picos de

intensidad muy alta, que será la radiación característica de cada material,
debida a las transiciones electrónicas de las que hemos hablado.
Normalmente se generan dos picos: uno por el paso de la capa L a la capa
L (radiación Kα) y otro pico por el paso de la capa M a la K (radiación Kβ),
cada uno a una λ característica.

Grandes instalaciones de sincrotrón

Aquí se generan radiaciones electromagnéticas de gran energía, entre ellas, rayos X.

Un sincrotrón consta de un primer anillo donde se vierten los electrones

producidos por un acelerador lineal. En este primer anillo tenemos campos
eléctricos que aceleran los electrones vertidos, hasta casi alcanzar la
velocidad de la luz. De ahí, pasan a un anillo de almacenaje, donde se
mueven y giran gracias a unos poderosos imanes colocados a lo largo de
todo este segundo anillo. Al cambiar su trayectoria para poder girar en el
campo magnético, se disipa energía y los electrones generan radiación de
sincrotrón (“luz”), que se compone de radiación microondas, X, casi se
acerca a la λ propia de los gamma también).

3. La estructura cristalina (empieza lo bueno, jeje)

Hacemos incidir nuestra radiación X en un cristal que se define como un material sólido que presenta un orden
interno de las partículas que lo componen (no es un sólido al uso). Lo que nosotros llamamos vidrio no es crital en
realidad, sino que es algo amorfo.

A la derecha podemos ver una imagen de microscopia

electrónica con los electrones en blanco y las bolitas
negras son átomos. Se ve muy claro el ordenamiento.
Hay un conjunto de puntos idénticos, posiciones con
el mismo entorno, que se van repitiendo en las dos
dimensiones del espacio que permiten esta técnica de
microscopia. El conjunto de puntos idénticos es la
red, y cada punto dentro de ella es un punto de la
red o punto reticular.

Después de identificar los puntos de la red, podemos unir unos puntos con
otros para crear una figura (en la imagen, un cuadrilátero) a la que
llamaremos celda unidad. La celda unidad se define de tal forma que sea la
mínima parte de la estructura tal que al repetirse en las 2 o 3 dimensiones
describa toda la composición del cristal (al repetirla por traslación
obtenemos el cristal). Pueden ser de dos tipos:

 Primitivas: los puntos de la red están sólo en los vértices.

 No primitivas: presencia de puntos adicionales en lugares distintos a los vértices, por ejemplo, en el centro.

Veamos un ejemplo:
 Como se elige aquella red que trasladada en el espacio describa mejor la estructura, en el ejemplo de arriba
cogeríamos la red centrada de la derecha (remarcada en morado).

3.1 Grupos puntuales de simetría y clases cristalinas

Un objeto finito presenta diferentes elementos de simetría. Si volvemos al ejemplo de la pared de ladrillos, un
ladrillo sería un motivo que contaría con 2 elementos de simetría puntual (dos planos de simetría perpendiculares,
tal que si diésemos la vuelta a ese objeto sobre esos planos obtendríamos la misma figura, el mismo objeto). Se
define un grupo puntual de simetría como el conjunto de elementos de simetría de un objeto finito, que pasan por
un punto y que definen la simetría total del objeto.

De todos los grupos puntuales de simetría, solo hay 32 que sean compatibles con la repetición por traslación (es
decir, que repetidos a lo largo y ancho de las 2 dimensiones del espacio o las tres dimensiones permiten definir la
estructura completa del cristal), son lo que se denominan clases cristalinas.

3.2 Celda unidad y sistemas cristalinos

Volviendo al concepto de celda unidad, o celdilla elemental, es la mínima

parte de la estructura tal que al repetirse en las 2 o 3 dimensiones describa
toda la composición del cristal. Si por ejemplo, la celda unidad es un cubo,
podemos definir tres ejes a, b y c en las tres dimensiones del espacio, así
como tres ángulos interaxiales (α, β y ϒ). Podemos distinguir 4 tipos de
celdilla unidad:

 Primitiva (P) o simple, 1 átomo o punto reticular por celda.

 Centrada en el cuerpo (I), 2 átomos o puntos por celda.
 Centrada en las caras (F), 4 átomos por celda.
 Centrada en las bases (C), 2 átomos por celda.

Recapitulando: una estructura cristalina se

construye a partir de la repetición en el espa-
cio de una celda unitaria. En función de los
parámetros de red, es decir, de las longitudes
de los lados o ejes del paralelepípedo
elemental y de los ángulos que forman esa
celda (a, b, c, α, β y ϒ), se distinguen siete
sistemas cristalinos: cúbico, hexagonal, tetra-
gonal, trigonal, rómbico, monoclínico y
triclínico.

Con 4 tipos de celdilla unidad y 7 sistemas cristalinos, se pueden generar hasta 14 redes de traslación compatibles
con las clases cristalinas, es decir, 14 arreglos infinitos de puntos discretos con un ordenamiento y orientación, que
parece exactamente la misma, desde cualquier punto de observación (14 maneras de organizar esas celdillas unidad
de forma repetitiva en el espacio para que generen la estructura completa del cristal). Son las Redes de Bravais (se
prnuncia Bravé, en francés).

Entonces, recapitulando:

 Tenemos 32 clases cristalinas, esto es, 32 grupos puntuales de simetría compatibles con la repetición por
traslación.
 Tenemos 14 redes de Bravais: 14 redes de traslación compatibles con esas 32 clases cristalinas.

De manera general, existen unas 230 maneras diferentes en las que un cuerpo puede repetirse en el espacio (230
grupos espaciales), pero en proteínas el número se reduce a 65, debido a que en ellas muchos elementos o grupos
de simetría se eliminan (por ejemplo, debido a la estructura helicoidal de muchas de ellas).

Entonces, si aplicamos estas nociones básicas a redes cristalinas de proteínas, podemos decir que los cristales
contienen unidades repetidas llamadas CELDILLA UNIDAD, siendo una celdilla unidad la pieza básica de
construcción del cristal que contiene al menos una molécula de proteína.

3.3 Celda unidad y unidad asimétrica

Dentro de la celda unidad encontramos un motivo que se

repite (puede ser un conjunto de átomos si es el cristal de
una sal, o una molécula de proteína, o dos moléculas de
proteína, o las que sean, si estamos analizando el cristal de
una proteina). El motivo que se repite en el interior de
cada celda unidad es la unidad asimétrica, que en el caso
de proteínas, puede ser una única o varias moléculas de
una proteína. Esos motivos o unidades asimétricas pueden
estar unidos por elementos de simetría, y el conjunto (unidades asimétricas + elementos de simetría) constituye la
celda unidad, y la repetición de la celda unidad por traslación en el espacio genera el cristal completo.

Entonces, es muy importante saber distinguir los siguientes tres conceptos:

 El ensamblaje biológico o unidad biológica (biological assembly) es el ensamblaje macromolecular que se

cree que es, o ha sido demostrado como la forma funcional de la molécula.
  La unidad asimétrica (assymetric unit) es la porción más pequeña de una estructura cristalina a la cual se le
puede aplicar operaciones de simetría para generar una celda unidad completa.
 La celda unidad (unit cell) es la porción más pequeña de un cristal que, al ser duplicada y trasladada, puede
generar el cristal completo.

En la imagen podemos ver como en una celda unidad (en blanco) Celda unidad
cómo 6 moléculas de proteína se ordenan para formar una unidad
asimétrica (o motivo). Para generar esa unidad asimétrica, las Proteína
moléculas siguen el sistema cristalino P61 (se juntan 6 motivos y se
tuercen de una determinada manera para ordenarse en el espacio Unidad
así). asimétrica

3.4 Empaquetamiento cristalino y solvente Slowdive - Star Roving (Official Audio)

Los cristales de proteína contienen grandes canales de solvente, lo más normal es que el contenido en solvente de
un cristal sea del 40-60 %. Esto es interesante porque tales cantidades de solvente facilitan el mantenimiento de la
estructura y aseguran en cierta medida que la proteína está en un entorno parecido al fisiológico.

Este hecho se puede emplear en la llamada técnica de Soacking, que consiste en sumergir el cristal de la proteína en
una solvente nuevo en el que hay un ligando para ver si interacciona con algún sitio de la molécula, es una manera
de obtener estructuras de complejos Prot-Ligando.

3.5 Líneas y planos reticulares

Para poder entender la difracción de rayos X, es necesario definir

la red recíproca a partir de la red directa, y para ello primero hay
que definir las líneas y planos reticulares, que son líneas y planos
que pasan a través de los puntos o motivos de una red.

Si estamos en dos dimensiones, hablaremos de líneas reticulares

que atraviesan las celdas unidas. En el ejemplo de la derecha
vemos que pueden ser muchas las líneas paralelas que pueden
atravesar estas celdas, y entre líneas mantienen una distancia
concreta, llamada d. La nomenclatura de cada una hace
referencia al número de veces que cada línea corta al eje a y al eje
b de la celda unidad, respectivamente. No tenemos en cuenta lo
que ocurre en el eje c porque estamos en dos dimensiones.

En tres dimensiones si que podremos hablar de planos reticulares que

podrán atravesar una o varias veces los ejes de la celda unidad.
3.6 Red directa y red recíproca

En difracción de rayos X es necesario trabajar en un espacio nuevo llamado espacio recíproco. En ese espacio
tendremos una red recíproca respecto a la red directa. La red recíproca se compone de puntos recíprocos de una
red, que se generan de la siguiente manera:

Seleccionamos un origen de coordenadas (o), cogemos un plano b

(0,1,0) y todos sus paralelos y asignamos a cada plano un punto en la
llamada red recíproca. Para ello, creamos un vector perpendicular al
plano escogido y con una longitud que sea el inverso de la d que
separa ambos planos paralelos. Así, con un solo punto estaremos
representando a toda una familia de planos. Podemos hacer lo
mismo con varios planos diferentes hasta obtener una red de puntos
recíprocos, esto es, la red recíproca.

Podremos volver del espacio reciproco al directo (el real), a través de

la transformada de Fourier, gracias a que están relacionadas con
estas cuentas (no entran para examen):

4. Difracción de rayos X

Recuerda: dos ondas desfasadas se anulan, pero dos ondas en fase se suman y se amplifican. En difracción con rayos
X buscamos que los rayos X emitidos estén en fase, para lograr esa amplificación.

Cuando los rayos X inciden sobre un cristal, los electrones de los átomos de todo el cristal se transforman en
emisores de radiación X. Los rayos emitidos por esos electrones en determinadas direccionan se combinan y
refuerzan (amplifican), y para que esto ocurra es necesario que los átomos en los que están estos electrones se
encuentren perfectamente ordenados en el espacio. Así, la difracción solo ocurrirá en estructuras ordenadas, por
eso es necesario cristalizar las proteínas, para obtener ese tipo de estructuras tan concreto.

Para que haya dispersión cooperativa o difracción es necesario que se cumpla la Ley de Bragg. Una ley que se
cumple tanto aquí como en la reflexión de la luz.
Viene a decir que cuando la luz incidente y la dispersada guarden un ángulo ϴ característico tal que su seno por 2
veces la distancia d que separa a los planos paralelos (2dsinϴ) sea múltiplo de la λ incidente, las ondas emitidas
(dispersadas) estarán en fase, se amplificarán y tendremos difracción.

Por otro lado, en tres dimensiones es necesario definir la esfera de Ewald, que tiene en planos virtuales de Bragg en
el interior. Cuando el haz difractado pasa por el punto P en la superficie de la esfera, que es un punto recíprico (de
los calculados como hemos dicho anteriormente), se cumplirá la ley de Bragg y tendremos difracción de rayos X.

Es importante ir girando el cristal para favorecer que se cumpla la Ley de Bragg y haya difracción.

4.1 Recogida de los datos

Para el montaje de cristales, éstos se cargan en un loop o capilar muy fino, que se monta en una cabeza
goniométrica que hará girar la muestra durante el experimento. Los cristales van en una solución concreta que lleva
además cierta cantidad de anticongelante.

Para la exposición a los rayos X, se emplean fuentes de rayos X diferentes, las de sincrotrón necesitarán fuentes de
alta resolución y brillo, y otros de menor resolución (generadores de rayos X) en los laboratorios.
El tamaño típico de un cristal para la recogida de datos debe ser de unos 0.3 x 0.3 x
0.1 mm, estos cristales son bombardeados con rayos X que son dispersados desde los
planos de la red cristalina. Los rayos X dispersados en fase (difractados) llegan a un
detector donde producen un patrón de difracción característico. La simetría del
patrón indicará que la muestra es simétrica también (el cristal). Este patrón es el que
luego se utiliza para generar los mapas de densidad electrónica.

5. Resolución estructural

Hay que tomar unas 1000 imágenes de patrones de difracción. En el espacio recíproco
tenemos unos pequeños spots (puntos) que permiten identificar con un software la celdilla unidad recíproca. Esa
celda guarda simetría recíproca y dará los datos de factores de estructura: módulos y fases. Esos datos se trasladan
con una transformada de Fourier para obtener la densidad electrónica, y con ello, obtener la estructura a nivel
atómico de nuestra proteína.

La intensidad de cada spot se relaciona con el módulo

del factor de estructura. A su vez, un factor de
estructura se compone de un módulo multiplicado por
una exponencial en la que aparece la fase. Así que
también hay que conocer la fase en la que salen las
ondas difractadas, pero ese dato se pierde en el
experimento, aunque sea necesario para la realización
de la transformada de Fourier.

La relación entre el módulo de los factores de estructura

y la intensidad de los puntos del espectro de difracción
es:

por su parte, el factor de estructura se define como:

Donde la fase es el ángulo φ de reflexión de la onda.

Esto es lo que se conoce como el problema de las fases

5.1 El problema de las fases

El factor de estructura depende del tipo y situación de los átomos en la celdilla unidad. El factor de estructura
completa, F, para una reflexión, incluye la fase, que no se puede medir directamente, y que debe ser estimada.

Para determinar la fase podemos emplear métodos directos para moléculas pequeñas, pero en proteínas trabajamos
con macromoléculas de muchísimos átomos, por lo que se requieren otros métodos:

 Método de reemplazamiento isomorfo (MIR/SIR): se cambia algún átomo de la macromolécula por otro
que disperse la radiación de una forma muy característica (pe: proteínas que incorporan Se en sus residuos:
Selenio-metionina)
 Método de dispersión anómala (MAD/SAD): se añaden metales que hacen que la red cristalina o bien se
destruya o bien los incorpore en los huecos de solvente, de modo que esos metales difractarán de una
determinada manera y permitirán estimar las fases.
 Método de reemplazamiento molecular.

5.2 Reemplazamiento molecular

Cuando tenemos una proteína similar a la nuestra (identidad

de secuencia en un 30% o porque comparten dominios
similares), podemos estimar que su plegamiento será similar
al de la proteína de estudio, así, a partir de su estructura
podremos estimar las fases de nuestra proteína. Para ello se
calculan unas matrices de rotación y traslación para tomar la
estructura de la proteína modelo e ir rotándola y
trasladándola hasta superoponerla con la nuestra, la obtenido
experimentalmente. Si las conseguimos superponer, tomamos
las fases de la proteína similar para utilizarlas en nuestro caso,
y así solventar el problema de las fases. Se trata de encontrar
la solución a las funciones de rotación R y traslación T.

Conocidos los módulos y las fases, podemos proceder a calcular el primer mapa de densidad electrónica mediante
una primera transformada de Fourier, será nuestro primer modelo de densidad electrónica. En este modelo se
habrán asignado unas coordenadas X,Y,Z para cada átomo y con ellos podemos calcular un nuevo factor de
estructura. De nuevo, tomamos ese factor de estructura, junto con las fases observadas y volvemos a hacer una
segunda transformada de Fourier para obtener el segundo mapa de densidad electrónica, que será probablemente
mejor que el primero y así sucesivamente.
5.3 Refinamiento

El refinamiento es el proceso de convergencia entre el modelo estructural y las observaciones experimentales. Para
moléculas pequeñas podemos emplear la optimización por mínimos cuadrados. Pero para moléculas más grandes
como proteínas utilizamos:

 Refinamiento de cuerpo rígido: consiste en rotar y trasladar ligeramente la estructura para que encaje con el
mapa de densidad electrónica.
 Recocido simulado (Simulated Anneling).
 Método de máxima probabilidad: búsqueda del modelo estructural más probable que se relacione con los
datos experimentales.
 Método de Gradiente conjugado.

Durante el refinamiento, los programas informáticos empleados tienen en cuenta todas las restricciones
geométricas durante el refinamiento (longitudes y ángulos de enlace, contactos de Van der Waals, ángulos de
torsión permitidos…así disminuyen las incógnitas, porque aquí, en determinación de estructuras de proteínas, son
mucho más numerosas las incógnitas que los datos experimentales).

A mayor resolución de la densidad electrónica, más se parecerá la nube o

malla a la forma de un aminoácido (en nuestro caso). La resolución
depende del orden interno de cristal, del aparato empleado, la
temperatura de recogida de datos.

Vemos que se trabaja en forma de ciclo: El ciclo de la construcción del

modelo y refinado. Se repiten los pasos sucesivos hasta que ya no mejore
más el modelo (el ajuste entre el modelo propuesto y los datos
experimentales no mejora más).
Nota: En el caso de la temperatura, los mapas de densidad electrónica son más definidos (con mayor resolución)
porque los átomos están más quietos,vibran menos en torno a la posición de equilibrio.

En el ajuste final del modelo estructural, la fiabilidad se calcula con los factores R.

 Factor R: Desacuerdo entre los valores experimentales y los calculados. Debe ser lo más bajo posible.
 Factor Rfree: Da idea de la validez del refinamiento del modelo estructural. Se calcula dejando un pequeño %
de datos sin refinar. Siempre será mayor que R.

5.4 Validación del modelo estructural

El siguiente paso es la validación. Para ello se puede utilizar el gráfico de

Ramachandran: todos los residuos de nuestro modelo (o la mayoría,
pensar en que las glicinas son pequeñitas y pueden aparecer en regiones
no permitidas) deben tener unos valores de los ángulos de torsión del
enlace peptídico (phi y psi) que estén en las regiones permitidas del
diagrama de Ramachandran. Por ejemplo: el 99% de los residuos se
encuentran en regiones permitidas (se permite hasta un 2% en zonas no
permitidas).

5.5 Resultado final

El conjunto de información que describe un modelo cristalográfico final

es muy concreto:

 Datos sobre el experimento de difracción que nos condujo al modelo: longitud de onda de los rayos X y el
patrón de difracción obtenido (la intensidad e índices hkl de los miles, o hasta cientos de miles de las ondas
dispersadas por el cristal).
 Dimensiones de la celdilla elemental (calculadas a partir de la celdilla recíproca)
 Simetría del cristal (también deducida de la simetría del espacio recíproco), y….
 Un conjunto de datos que expresan la posición de cada átomo en la estructura, su estado de vibración
térmica y, en su caso el denominado factor de ocupación (o de población)

Todo eso se ve en el documento o archivo pdb: un documento de texto en el que aparece toda esa información.

Recuerda: los hidrógenos solo tienen un electrón y dispersan poco, por eso no se ven sus coordenadas (en sincrotrón
sí se verían). Aparecen, como ya hemos dicho, el factor de población (da idea de que en todas las moléculas del
cristal ese átomo está en esas mismas coordenadas, normalmente en los átomos de las cadenas laterales se
duplicaría la línea de coordenadas y en lugar de haber un 1 para ese factor habría un 0.5, o lo que sea o.2-0.8 etc) y
el factor térmico (estado vibracional de los átomos, a mayor valor de este factor, más movimiento en torno a la
posición de equilibrio).

6. Cristalización de proteínas

Las proteínas necesitan ser cristalizadas para determinar sus estructuras por difracción de rayos X porque la
dispersión de los rayos X de una sola molécula es demasiado débil para ser medida (incluso en sincrotrón).

Un cristal comprende un gran número de moléculas en la misma orientación, y las ondas dispersadas por él se
suman en fase y aumentan así la señal a un nivel que puede medirse. PERO la cristalización es a menudo el paso
limitante en la resolución de estructuras, especialmente las de las proteínas de membrana (son igualmente difíciles
de aislar de las membranas también, se emplean detergentes).
Los llamados diagramas de fase relacionan la
concentración de proteína con la de un agente
precipitante y permiten establecer las condiciones a
partir de las cuales se puede formar un cristal o un
agregado o precipitado amorfo de nuestra proteína. Hay
que llevar la concentración a niveles de zona labil-
nucleación: en esa zona se tiene un número discreto de
proteínas que forman los llamados núcleos a partir de los
cuales crecerán los cristales (región metaestable) hasta
que se llega a la línea de saturación (ahí ya el cristal deja
de crecer).

Si las proteínas cristalizan (tendiendo al orden) es

porque los factores entrópicos y entálpicos hacen que la
energía libre de Gibbs sea menor en el estado cristal que
en el estado solución. De modo que el proceso es
termodinámicamente favorable, pero no espontaneo.
Debe salvarse la Energía de activación que en este caso
se alcanza durante la formación de núcleos (recuerda,
un número discreto de moléculas de proteína
interaccionan, se unen y forman un núcleo). Se consigue
superar esta barrera mezclando proteínas en disolución
con los agentes precipitantes.

En las macromoléculas la cristalización es mucho más complicada debido a su mayor complejidad, labilidad y
propiedades dinámicas (por eso se trabaja en soluciones de agua, motivo por el cual siempre encontraremos
también en los mapas de densidad electrónica moléculas de agua), son muy sensibles al entorno y en el proceso
pueden sufrir desnaturalización y degradación, por eso se emplean técnicas más suaves y restrictivas.

Los cristales en realidad son muy frágiles (recuerda la presencia de canales aprox un 40-60% de la estructura son
huecos, canales).

6.1 Métodos de cristalización.

La elección de uno u otro se hace en base a ensayos de prueba y error:

 Batch.
 Diálisis.
 Difusión libre en la interfase.
 Difusión de vapor.

6.2 Método de cristalización en difusión de vapor.

Se emplean agentes precipitantes que retirarán agua de la solución de proteínas, de modo que éstas se quedarán
sin su capa de solvatación y se unirán entre ellas para no perder las interacciones electrostáticas. Se emplea como
agente precipitante todo aquello que disminuya la solubilidad de las moléculas:

 PEG: Polietilenglicol (también se pueden emplear otros polímeros). Los polímeros no distorsionan la fuerza
iónica del medio al no ser especies cargadas (¿?), pero en la gota ocupan mucho sitio, y eso hace que las
proteínas se concentren localmente en un punto de la gota, y así cristalizan. Se emplean por ejemplo para
precipitar complejos (si se altera la fuerza iónica muchos complejos se disocian).
  Sales: sulfato de amonio se emplea mucho, el cloruro de sodio también se usa. El problema es que las sales
también cristalizaran durante el proceso. Para distinguir entre un cristal de proteína y otro de sal, cogemos
el cristal con el loop de carga y apretamos, si el cristal difunde o se escapa era de proteína, y si se rompe era
sal. Pero como esto es un método destructivo de comprobación, lo que se hace es llevar el cristal al
difractrómetro y a ver qué sale.
 Alcoholes: sobre todo para precipitar ácidos nucleicos (recuerda que se empleaban en las etapas finales de
la extracción de los mismos): isopropanol o metilpentanediol (MPD).

Si usamos el método de la gota colgante (otra variedad sería el

método de la gota sentada): tenemos un gota con una
proporción 1:1 proteína-precipitante. Esta gota se pone en un
cubre que luego se coloca boca abajo sobre una solución de
precipitante, de modo que habrá más concentración de agente
precipitante en la gota que en la solución del fondo del pocillo.
De este modo, como las dos disoluciones no están en
equilibrio, se irán evaporando moléculas de agua de la gota y
pasarán a la solución del fondo, hasta que en la gota aumente
la concentración de precipitante hasta tal punto que se llegue a
una condición de nucleación.

El proceso se deja desarrollar durante varios días en varias condiciones (4 o 18 grados). Se suelen hacer con placas
formadas por cuatro receptáculos que permiten probar cuatro condiciones diferentes (con/sin ligando, diferentes
concentraciones de proteína, etc), pero todos ellos a la misma temperatura. Se cierran con celofán transparente
para luego poder visualizar bien los cristales.

Así, al observar las gotas al microscopio o a la lupa, tenemos que ver cristales, tridimensionales o bidimensionales
(hay algunos que crecen solo en 2 dimensiones, se conocen como agujas). No debemos ver agregados amorfos. A
veces los agregados o precipitados amorfos se redisuelven para generar cristales (por aquello de que ΔG es menor).

Lo importante es que los cristales sean reproducibles. Si no lo son, se procede a hacer siembra.

 Microsiembra: se repiten probalndo disoluciones diferentes de cada cristal.

 Macrosiembra: se toma un cristal grande, se lava, y se pone en una gota más grande para que crezca más.

7. La técnica del futuro: Criomicroscopía Electrónica

Para resolver complejos. Esta técnica toma fotografías de las moléculas en solución sin necesidad de cristalizarlas. Se
genera una monocapa de moléculas, se sumergen en un baño de etanol (así se alcanzan temperaturas criogénicas y
se evita la generación de artefactos), y se analizan con un microscopio electrónico. Éste da una fotografía de la
molécula en diferentes posiciones (aquellas en las que se quedaron congeladas), luego se cogen todas aquellas
fotografías de la proteína que quedaron en una misma orientación y se genera una estructura para esa orientación.
Se repite esto muchas veces (se requieren ordenadores con procesadores muy potentes) y al final se obtiene un
modelo.