Unidad de Trabajo nº2.

- Métodos Ópticos de Análisis

UNIDAD DE TRABAJO Nº 2.- MÉTODOS ÓPTICOS DE ANÁLISIS (I)

1. INTRODUCCIÓN. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS ÓPTICOS
Los métodos ópticos son aquellos que miden la radiación electromagnética que emana de la
materia o interacciona con ella.
Los métodos ópticos se dividen en:
a) Métodos ópticos no espectroscópicos: se basan en una interacción entre radiación
electromagnética y la materia que produce como resultado un cambio en la dirección o en las
propiedades físicas de la radiación electromagnética. No se miden espectros, ya que no se dan
transiciones entre niveles energéticos.
En estos métodos los mecanismos de interacción son la reflexión, refracción, difracción,
dispersión, interferencias, polarización o la dispersión refractiva.
b) Métodos ópticos espectroscópicos: se basan en la medida de la intensidad y longitud de
onda de la energía radiante. La característica común a todos ellos es que se basan en la medida
de espectros. Éstos son debidos a transiciones entre estados de energía característicos. Como
consecuencia de la interacción materia-radiación electromagnética se da un intercambio de
energía originando transiciones entre los distintos niveles energéticos que pueden tener lugar
a nivel atómico o molecular. Se basa en fenómenos de Absorción y Emisión.
Métodos de Absorción:
Se basan en procesos en los que la radiación se transfiere a los átomos, iones o moléculas de
una muestra y promueve a estas partículas desde su estado fundamental a un estado excitado.
Las partículas excitadas tienden a volver a su estado fundamental desprendiendo la energía
absorbida en forma de calor: proceso de relajación no radiante.
• A nivel Molecular: Las moléculas de la muestra se excitan por la radiación, dando espectros
menos definidos que los atómicos. Las transiciones se producen entre niveles electrónicos,
vibracionales y rotacionales, por absorción de radiación ultravioleta visible, infrarroja y de
microondas.
• A Nivel Atómico: La muestra es sometida a una disgregación molecular o atomización
siendo los átomos los que se excitan por la radiación, dando espectros bien definidos. Las
transiciones se producen entre niveles extremos o entre niveles internos de los átomos, según
que la radiación absorbida sea ultravioleta-visible y de rayos X respectivamente.
Métodos de Emisión:
Basados en procesos de relajación radiante, en los que las partículas excitadas pasan a niveles
de menor energía cediendo su exceso de energía en forma de fotones.
• A Nivel Molecular: Una especie molecular que ha adquirido un estado electrónico y
vibracional excitado mediante una radiación externa (Fluorimetría y Fosforometría) o como
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consecuencia de una reacción química (Quimioluminiscencia), pierde el exceso de energía

vibracional mediante colisiones y a continuación vuelve al estado fundamental, emitiendo
radiación ultravioleta o visible.
• A Nivel Atómico: La excitación de la muestra se lleva a cabo mediante un arco o una chispa
eléctrica, una llama o un plasma. Generalmente la energía necesaria para la excitación es tan
alta que las especies moleculares se disocian, con lo que se emiten espectros atómicos o
iónicos característicos.
2. PROPIEDADES DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA
Radiación electromagnética: propagación de la energía en el espacio, adoptando diversas
formas (luz visible, calor, rayos X, luz UV, …) por medio de ondas transversales. La radiación
electromagnética puede tratarse como un campo eléctrico en el espacio, asociado a otro
magnético perpendicular al anterior. Se puede representar físicamente como vectores
eléctricos y magnéticos.

Representación de la radiación electromagnética

Para explicar sus propiedades debe suponerse que, simultáneamente, esta radiación posee
un comportamiento ondulatorio y un comportamiento corpuscular. Clásicamente el
comportamiento de la luz se ha atribuido a su naturaleza ondulatoria, pero hay fenómenos
(absorción o emisión) que no pueden explicarse con la teoría ondulatoria y que requieren que
la radiación se comporte como pequeños haces de energía, es decir, como partículas llamadas
fotones.
Los parámetros ondulatorios que definen a cualquier tipo de radiación electromagnética
son:
a) Amplitud de una onda sinusoide (A): longitud del vector eléctrico en el máximo de la onda.
b) Periodo de la radiación (P): tiempo en segundos necesario para el paso de dos máximos o
mínimos consecutivos por un punto fijo del espacio.
c) Longitud de onda (): longitud de un ciclo o distancia entre dos máximos o mínimos

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consecutivos de la onda. Se expresa en unidades de longitud: metro, centímetro, angstrom

(Ǻ=10-10m), nanómetro (nm=10-9m) y micrómetro (μm=10-6m).
d) Número de onda (  ): se define como el inverso de la longitud de onda. Su unidad más
empleada es cm-1
e) Frecuencia (  ): número de ciclos que pasan por segundo por un punto fijo. Número de
oscilaciones por segundo. Su unidad es el Hertzio (Hz) que es la inversa del segundo (s -1)
1
=
P
La longitud de onda y la frecuencia se relacionan mediante la expresión:

V Velocidad de propagación de medio

=


Si es en el vacío, la velocidad en el medio sería igual a la velocidad de la luz (c = 3·108 m/s):

c
=

La velocidad de propagación y la longitud de onda, dependen de la naturaleza del medio
de propagación. Sin embargo, en el vacío la velocidad de la radiación electromagnética es
independiente de la longitud de onda, y alcanza su valor máximo. La radiación
electromagnética se mueve en el vacío con una velocidad de 3·1010 cm/s.
Hasta ahora hemos comentado la naturaleza ondulatoria de la radiación electromagnética.
Sin embargo, existen ciertos fenómenos como el efecto fotoeléctrico, el efecto Compton ó la
distribución espectral del cuerpo negro, que requieren que la radiación sea considerada como
un flujo de partículas o corpúsculos. Esta teoría fue establecida finalmente por Newton, y la
controversia entre defensores de ambas teorías se prolongó hasta principios del siglo XX. El
dilema fue resuelto por Max Planck que en 1.900 unificó ambas teorías. Para ello Planck
consideró que la energía de las partículas en movimiento térmicamente excitadas, está
cuantizada, es decir, que únicamente están permitidas ciertas energías. Dos postulados
importantes de la teoría cuántica son:
1. Los átomos, iones o moléculas sólo pueden existir en ciertos estados discretos,
caracterizados por cantidades definidas de energía. Cuando una especie cambia su estado,
absorbe o emite una cantidad de energía exactamente igual a la diferencia de energía entre
los estados.
2. Cuando los átomos, iones o moléculas absorben o emiten radiación al realizar la transición
de un estado de energía a otro, la frecuencia o la longitud de onda de la relación se relaciona
con la diferencia de energía entre los estados por la ecuación

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hc E1 → Energía del estado superior.

E1 - E0 = ⎯⎯⎯ = h  E0 → Energía del estado inferior.
  → Frecuencia de la radiación.
 → Longitud de onda de la radiación.
h → Cte. de Planck = 6’624·10-34Js

Para átomos o iones en estado elemental, la energía de cualquier estado dado proviene del
movimiento de los electrones alrededor del núcleo cargado positivamente.
Consecuentemente, los distintos estados de energía se denominan estados electrónicos.
Además de los estados electrónicos, las moléculas también tienen cuantizados los estados
vibracionales, que están asociados a la energía de las vibraciones interatómicas, y los estados
rotacionales, que provienen de la rotación de las moléculas alrededor de sus centros de
gravedad.
El estado de energía más bajo de un átomo o molécula es su estado fundamental. Los estados
de energía superiores se denominan estados excitados. Generalmente, a temperatura
ambiente, las especies químicas se encuentran en su estado fundamental.
Espectro electromagnético
El espectro electromagnético abarca un intervalo enorme de longitudes de onda y frecuencias,
dividiéndose en regiones que abarcan intervalos de longitudes de onda más estrechos.

Banda Longitud de onda (m) Frecuencia (Hz) Energía (J)

Rayos gamma < 10 pm > 30,0 EHz > 20·10−15 J

Rayos X < 10 nm > 30,0 PHz > 20·10−18 J

Ultravioletaextremo < 200 nm > 1,5 PHz > 993·10−21 J

Ultravioletacercano < 380 nm > 789 THz > 523·10−21 J

Luz Visible < 780 nm > 384 THz > 255·10−21 J

Infrarrojocercano < 2,5 µm > 120 THz > 79·10−21 J

Infrarrojomedio < 50 µm > 6,00 THz > 4·10−21 J

Infrarrojolejano/submilimétrico < 1 mm > 300 GHz > 200·10−24 J

Microondas < 30 cm > 1 GHz > 2·10−24 J

Ultra Alta Frecuencia- Radio <1m > 300 MHz > 19.8·10−26 J

Muy Alta Frecuencia- Radio < 10 m > 30 MHz > 19.8·10−28 J

Onda Corta- Radio < 180 m > 1,7 MHz > 11.22·10−28 J

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Onda Media- Radio < 650 m > 650 kHz > 42.9·10−29 J

Onda Larga -Radio < 10 km > 30 kHz > 19.8·10−30 J

Muy Baja Frecuencia- Radio > 10 km < 30 kHz < 19.8·10−30 J

Las divisiones son función de los métodos que se precisan para generar y detectar los distintos
tipos de radiación, siendo la región visible del espectro (percibida por el ojo humano) muy
pequeña en comparación con otras regiones espectrales.

Color Longitud de onda

violeta 380–450 nm

azul 450–495 nm

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verde 495–570 nm

amarillo 570–590 nm

naranja 590–620 nm

rojo 620–750 nm

3. MÉTODOS NO ESPECTROSCÓPICOS: DISPERSIÓN

3.1.- PRINCIPIOS
Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión, sufre una serie de fenómenos,
de manera que parte de la luz es dispersada, parte es reflejada, parte es absorbida, y parte es
transmitida.
La dispersión de la luz depende, entre otros, de varios factores: tamaño y peso molecular de
la partícula, longitud de onda de la luz incidente, distancia del detector a la cubeta y
concentración de partículas.
Todos estos factores se relacionan mediante complejas fórmulas matemáticas (Ley de
Rayleigh), pero en conjunto, deberemos tener en cuenta:
a) El modelo de dispersión de la luz, es decir, la forma en que la luz es dispersada por la
partícula, depende de la relación entre el tamaño de ésta y la longitud de onda de la luz
incidente. Cuando el tamaño de la partícula es aproximadamente igual a la longitud de onda
del haz de luz incidente (una partícula de tamaño intermedio), la luz aparece dispersada hacia
delante en distintos ángulos, lo que favorece las medidas nefelométricas.
b) La intensidad de la luz dispersada es inversamente proporcional a la cuarta potencia de la
longitud de onda; lo que quiere decir que, a menor longitud de onda de excitación,
obtendremos mayor sensibilidad en las medidas.
c) La intensidad de la luz dispersada es directamente proporcional al peso molecular de las
partículas y a su concentración en la solución.
d) La intensidad de la luz dispersada es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia
del detector; por lo que cuanto más cerca esté el detector de la cubeta, mayor sensibilidad
obtendremos.
Para que las medidas de la luz dispersada por estas partículas en suspensión sean
reproducibles, es fundamental fijar unas condiciones de trabajo según las cuales se
mantengan constantes y bajo control todos los factores anteriormente expuestos, de manera
que se puedan obtener suspensiones reproducibles y con suficiente estabilidad. Esto se suele
conseguir mediante la adición de coloides protectores y respetando al máximo las condiciones
de trabajo.

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Las técnicas empleadas para medir la dispersión de la luz son:

a) Turbidimetría
Es la medida de la disminución de la intensidad de un haz de luz incidente (causada por
dispersión, reflexión y absorción de la luz) cuando pasa a través de una suspensión de
partículas.
La turbidimetría se mide a 0º del haz incidente, es decir, en su misma dirección. La disminución
de intensidad se puede medir como %T o como Absorbancia, en cualquier espectrofotómetro
o autoanalizador de química clínica. La sensibilidad de esta técnica dependerá principalmente
de la exactitud fotométrica y de la sensibilidad del instrumento.

b) Nefelometría
Es la medida de la luz dispersada en ángulos distintos al de incidencia (normalmente de 15 a
90°). La medida se realiza en aparatos diseñados con el sistema de detección situado a ángulos
predeterminados. La sensibilidad de este método depende del blanco, o dispersión basal de
la muestra, ya que idealmente la luz detectada en el ángulo de dispersión θ, en ausencia de
las partículas a estudiar, debería ser nula, con un fondo negro.
La nefelometría, a diferencia de la turbidimetría, precisa aparatos diseñados exclusivamente
para esta técnica. Generalmente, tienen un ángulo fijo de lectura, aunque alguno más
sofisticado puede cambiarlo.

3.2.- INSTRUMENTAL (Fig. 20.5)

El sistema genérico consta de:
1. Fuente de energía radiante.
2. Colimador.
3. Selector de longitud de onda.
4. Cubeta.
5. Sistema de detección.

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Figura 20.5.
Fuente de energía radiante
Se emplean diferentes tipos de lámparas: de halógeno, xenón, filamento de tungsteno, y láser.
La ventaja del láser es que produce haces de luz estables, de intensidad adecuada a la técnica
y bien colimados (paralelos).
Colimador
Su función es conseguir que el haz de luz que incide en la muestra sea paralelo, no divergente.
Es necesario cuando la fuente de luz no es láser.
Selector de longitud de onda.
Pueden ser filtros o monocromadores. No son necesarios cuando la fuente de luz es láser.
Cubeta
Se emplean las mismas que en espectrofotometría.
Sistema de detección
Se encuentra colocado normalmente a un ángulo fijo, de 0 a 90º. Ello define la técnica
empleada:
θº = 0º → Turbidimetría
θº = 90° → Nefelometría
El sistema óptico es similar al de los espectrofotómetros. La longitud de onda de detección es
la misma que la del haz de luz incidente, tanto en nefelometría como en turbidimetría.
3.3.- ASPECTOS PRÁCTICOS:
➢ Sensibilidad
En los nefelómetros, la sensibilidad depende de la lectura del blanco; cuanto menor sea la
lectura del blanco de reacción, mayor será la sensibilidad de la técnica.
En los turbidímetros, la sensibilidad depende de las características fotométricas del
espectrofotómetro empleado; cuanta más capacidad tenga el aparato para detectar
pequeños cambios en la absorción de la solución, más sensibilidad proporcionará a la técnica.
➢ Efectos de la matriz
Tanto en los reactivos como en el suero pueden existir partículas que produzcan una
dispersión de luz no deseada. También las partículas de suciedad pueden producir estos
efectos, tanto en las cubetas como en los reactivos. El manejo cuidadoso del material y los
reactivos controlará estas interferencias.
➢ Longitud de onda

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Según la Ley de Rayleigh, la intensidad de la luz dispersada aumenta cuando disminuye la

longitud de onda.
➢ Tipos de análisis
Estudiando la cinética de una reacción puede existir una primera etapa en la que la formación
de la reacción es lenta, casi sin variación en la dispersión de luz, seguida de otra rápida, con
un aumento grande en la dispersión, y al final otra fase en la que la dispersión se hace lenta,
casi constante. Podemos representar esta cinética de dos formas:

Figura 20.6

Existen dos tipos básicos de medición de la dispersión luminosa causada por esta reacción:
a) Análisis a punto final. Requiere la determinación del blanco y debe transcurrir un tiempo
razonable para la medición final.
b) Análisis de velocidad o cinético. Estudia el cambio de velocidad de la reacción, y no
requiere blanco.
Ejecución de las técnicas
Hay que tener muy en cuenta que se trabaja con suspensiones, que se pretende que sean lo
más homogéneas posible. Todos aquellos factores que puedan alterar la homogeneidad de la
suspensión podrán alterar las medidas. El problema fundamental es la preparación de
suspensiones reproducibles y con suficiente estabilidad. En algunos casos se consigue
solucionar este problema mediante la adición al sistema de coloides protectores.
Deben ser controladas cuidadosamente todas las variables posibles: reconstitución de
reactivos, temperatura, tiempo, estabilidad, etc.
3.4.- APLICACIONES
• Análisis de la calidad química del agua (claridad y control de los procesos de tratamiento.
• Ensayos cuantitativos que usan complejos antígeno-anticuerpo
• Medir la cantidad de proteínas en fluidos.
• Determinación de inmunoglobulinas, proteínas del complemento, proteínas de fase aguda,
proteínas de coagulación… (laboratorios clínicos)
4. MÉTODOS ESPECTROSCÓPICOS:
4.1.- ABSORCIÓN
4.1.1 INTRODUCCIÓN

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Cuando una partícula, que se encuentra en «estado de reposo» o «estado fundamental»,

interacciona con un haz de luz, absorbe energía, y pasa a lo que se denomina «estado
excitado».
En la partícula se producen cambios que dependen de las características de la propia partícula
(tipo de enlaces, etc.) y de la energía (longitud de onda) de la luz que interacciona.
La partícula en estado excitado tiende a regresar espontáneamente a su estado fundamental,
desprendiendo la energía absorbida en forma de calor:

A0 + h   →A * → A0 + calor

Siendo: A0 = absorbente en estado fundamental. A* = absorbente en estado excitado. h   =

energía del fotón absorbido. h = constante de Planck.  = frecuencia de la radiación.

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Cada especie absorbente (cromógeno) tiene lo que se llama un «espectro de absorción

característico». Este espectro representa la relación entre la longitud de onda incidente y la
absorbancia que presenta una solución de la especie, en condiciones definidas de trabajo. Al
gráfico que resulta de representar en un eje de coordenadas absorbancia (ordenadas) frente
a longitud de onda (abscisas), es a lo que llamamos espectro de absorción.

Figura 1. Espectro de absorción

Los espectros de absorción son de utilidad tanto para seleccionar la longitud de onda más
adecuada para una medida cuantitativa (longitud de onda a la que la absorción es máxima),
como para fines de identificación cualitativa.
La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución de una especie absorbente, es el
fundamento en que se basan las técnicas de Espectrofotometría de absorción.
4.1.2 LEYES DE ABSORCIÓN
Cuando un haz de luz de intensidad Io incide sobre una cubeta cuadrada que contiene una
solución coloreada que absorbe luz a una determinada longitud de onda, se produce en la
solución un proceso de absorción, y el haz de luz que sale después de atravesar la cubeta tiene
una intensidad menor, Is:

Se define como transmitancia la relación entre la luz incidente y la luz transmitida:

Is
T=
I0

Is
En la práctica, se define el porcentaje de transmitancia: %T =  100
I0

Para evitar interacciones por parte del solvente o de la cubeta, y considerar así sólo la
absorción del compuesto de interés, hay que hacer una primera medida con una «solución de
referencia» o «blanco», que contiene todos los posibles compuestos que participan en la
lectura, menos el compuesto a medir.

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Todas las medidas que se hagan con posterioridad serán referidas a esta medida inicial, y se
deben hacer en la misma cubeta que se utilizó para la medida del blanco.
El valor experimental de la transmitancia, o %T, es de escaso empleo hoy en día, pero conviene
no olvidar que lo único que se puede medir es la luz transmitida.
En la práctica se emplea, en lugar del valor de transmitancia, el de Absorbancia (A), ya que la
relación entre la concentración de una solución y su transmitancia es inversa y logarítmica,
mientras que la relación entre la absorbancia y concentración es directamente proporcional:
Is 1 100
A = − log = − log T = log = log = log 100 − log T
I0 T %T

A = 2 − log %T

De esta relación matemática se deduce que la relación logarítmica entre A y %T se traduce en

dos escalas:
%T → va de 0 a 100 → Si %T = 100 → A = 2 -log 100 = 0
A→ va de ∞ a 0 → Si %T = 0 → A = 2 -log 0 = ∞
En los aparatos que se usan hoy en día, las lecturas de %T son transformadas en absorbancias
y presentadas así al operador, pero conviene no olvidar que la absorbancia no es en sí misma
una cantidad medible, sino que se obtiene por cálculo matemático a partir de los datos de
transmitancia que mide el sistema fotométrico.
Si representamos gráficamente en un eje de coordenadas la relación entre la absorbancia y
concentración, obtenemos una línea recta, y la proporción es directa; la gráfica resultante de
representar %T frente a concentración es una curva, y la proporción es inversa; si empleamos
papel semilogarítmico, la gráfica de %T frente a concentración se convierte en una recta.

Figura 3. Representación gráfica de absorbancia y porcentaje en transmitancia frente a concentración. a) %T

+ concentración. Escala lineal. b) %T + concentración. Escala logarítmica. c) A + concentración. Escala lineal.

Como hemos dicho, al aumentar la concentración del compuesto absorbente en solución, más
luz es absorbida y menos transmitida, lo que se observa en las gráficas.
La relación entre las cantidades de absorbente en una solución y el grado en que esta solución
absorbe la luz, se encuentra regida por las Leyes de absorción.

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La Ley de Beer establece la relación entre el grado de absorbancia de una solución y otras dos
variables: la concentración del absorbente y la longitud del trayecto que el haz de luz recorre
a través de la solución. Según esta ley, la absorbancia de una solución es directamente
proporcional a la concentración y a la longitud del paso de luz:

A=a·b·c
Siendo: A = absorbancia. a = coeficiente de absorción, o absortividad. b = longitud del paso de
luz en centímetros. c = concentración de absorbente.
Esta ecuación constituye la base del análisis cuantitativo de las determinaciones
espectrofotométricas.
Los valores de absorbancia no tienen unidades. El coeficiente de absorción es una constante,
relacionada con la naturaleza química del soluto.
El coeficiente de absorción a se denomina coeficiente de extinción molar, representado con
el símbolo ε cuando las unidades de b son centímetros y las de c son moles/litro. El coeficiente
de extinción molar es constante para un compuesto dado cuando se fijan condiciones de
longitud de onda, pH, solvente, temperatura, y otros factores. Sus unidades son 1/mol·cm.
En la práctica, el significado del coeficiente de extinción molar es el siguiente: cuanto mayor
sea ε en una sustancia (cromóforo) para unas condiciones de trabajo determinadas, mayor
será la absorbancia de ese compuesto en esas condiciones de trabajo y, por tanto, mayor será
la sensibilidad del método que lo emplea. (Para una misma concentración de cromógeno, si ε
aumenta, A aumenta.)
La Ley de Beer tiene una aplicación práctica: determina los métodos experimentales para
averiguar la concentración de una sustancia de interés en una solución. Basándonos en la
relación lineal entre absorbancia y concentración, podemos conocer la concentración de una
solución problema de dos maneras:
a) Por comparación con una solución conocida: Si tenemos dos soluciones, p (problema) y S
(estándar de concentración conocida), podemos establecer la siguiente relación matemática
entre ellas:

As C s Ap
= → C p = Cs
Ap C p As

Siendo: As = absorbancia de la solución estándar.

Ap = absorbancia de la solución problema.
Cs = concentración de la solución estándar.
Cp = concentración de la solución problema.

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Conocemos el valor de Cs, y para la serie de análisis determinamos experimentalmente el valor

de As y el de Ap; con estos datos, calculamos el cociente Cs/As, estableciendo así el valor de un
factor, que es constante, y que multiplicado por las absorbencias de sucesivos problemas que
se ensayen en la misma serie, nos dará el valor de las concentraciones de estas soluciones
problema.
Ap
C p = Cs = F  Ap siendo: F = factor
As

b) Curva de Calibración: Es la representación gráfica en un eje de coordenadas de absorbancia

(ordenadas) frente a concentración (abscisas).
El método de trabajo con curva de calibración consiste en ensayar varías soluciones de
concentraciones conocidas, y determinar sus absorbancias; a continuación, se construye la
curva de calibración (que debe ser una recta), representando las concentraciones frente a sus
absorbancias gráficamente. Una vez ensayadas las soluciones problema, su concentración se
averigua por interpolación de las absorbancias de las soluciones problema en la recta de
calibración.
Estas dos formas de trabajo sólo son válidas si el cromógeno obedece la ley de Beer, y tanto
las soluciones estándar como los problemas son leídas en idénticas condiciones.
En las determinaciones fotométricas se deben conocer la linealidad que es el intervalo de
concentraciones del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre concentración
y absorbancia, es decir, se cumple la Ley de Beer. Cuando la concentración de cromógeno en
la solución sobrepasa los límites de linealidad, la Ley de Beer deja de cumplirse, convirtiéndose
la recta de la gráfica en una curva a partir se ese punto de concentración. La lectura de una
absorbancia fuera de los límites de linealidad, se traduce en una concentración falsamente
baja de cromógeno; ante esta situación, hay que diluir la muestra, para que su concentración
entre dentro de los límites de linealidad.
La Ley de Lambert-Beer sólo es aplicable para luz monocromática. Otras posibles fuentes de
error que originan desviaciones en la curva de calibrado y por ello en la Ley de Lambert-Beer
son:
• Las altas concentraciones de la muestra.
• Que los lados de las cubetas estén rayados o con algo de suciedad.
• Si la muestra se disocia, asocia o reacciona con la solución.
• Incertidumbre o ruido asociado al instrumento.

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Intervalo x-y: límites de linealiaridad. Intervalo de concentraciones entre las cuales es lineal la relación entre
absorción y concentración (se cumple la Ley de Beer)
Figura 4: Representación gráfica de la linearidad.

5.- ABSORCIÓN MOLECULAR

5.1.- INSTRUMENTACIÓN
En base al sistema selector de longitud de onda, los aparatos se clasifican en dos tipos:
▪ Fotómetros: Emplean filtros, obteniendo luz monocromática a longitudes de onda
discretas.
▪ Espectrofotómetros: Emplean monocromadores, del tipo de prismas o redes de difracción,
obteniendo luz monocromática en un intervalo continuo de longitudes de onda.
Según la disposición de los componentes fotométricos, se pueden clasificar en
espectrofotómetros de haz simple o de doble haz.
Todos los fotómetros y espectrofotómetros constan esencialmente de:
a) Fuente estable de energía radiante.
b) Rendijas de entrada y salida.
c) Selector de longitud de onda.
d) Cubeta destinada a contener la muestra.
e) Detector de energía radiante.
f) Presentación de datos.
Constan esquemáticamente de los componentes antes mencionados: la luz emitida pasa a
través de un monocromador que seleccionará la longitud de onda deseada; unas rendijas de
entrada y salida consiguen que el haz de luz sea estrecho, y evitan la luz difusa; la luz pasa a
través de la cubeta, donde se produce el proceso de absorción; la luz no absorbida es
transmitida al detector, que convierte la energía radiante en energía eléctrica, que es
registrada en un lector (fig. 5).

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Figura 5
Al trabajar con estos aparatos, es necesario un ajuste inicial a 0 por 100 de transmitancia, que
se consigue sustituyendo la cubeta por un sistema que no deje pasar la luz hasta el detector.
A continuación, se hace un blanco colocando una cubeta con todos los componentes de la
solución de trabajo exceptuando el cromógeno, y haciendo un ajuste a 100 por 100 de
transmitancia (o de absorbancia). Se hacen lecturas de estándares (soluciones de
concentración conocida), y a continuación las de las soluciones problema (concentración
desconocida), y se averigua la concentración de las disoluciones problemas por comparación
con los estándares.
Espectrofotómetro de doble haz
Se clasifican como tales en el espacio y en el tiempo.
a) Espectrofotómetros de doble haz en el espacio: Todos los componentes están duplicados
menos la lámpara. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo a través de los diferentes
componentes separados en el espacio. Esta disposición compensa las variaciones de
intensidad de la fuente de energía radiante y también las variaciones de absorbancia a medida
que se varía la longitud de onda de lectura en una operación de barrido (fig. 6).

Figura 6.

b) Espectrofotómetros de doble haz en el tiempo: Normalmente utilizan los mismos

componentes que un instrumento de haz simple. Dos haces de luz pasan a través de los
mismos componentes, pero no en el tiempo. Emplean un «chopper», consistente en un
interruptor rotativo del haz luminoso (es una rueda giratoria con secciones plateadas y
rendijas alternas) colocado a continuación de la rendija de salida. Un sistema de espejos dirige
la porción de luz reflejada por el chopper a través de una cubeta de referencia y de ahí al
detector común. El detector ve alternativamente el haz de luz procedente de la muestra y el

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de referencia. Esta disposición compensa la variación de la fuente de energía radiante, así

como las variaciones de sensibilidad del detector (fig. 7).

Figura 7

➢ Componentes
a) Fuente de energía radiante:
La misión de la fuente de energía es proporcionar energía radiante en forma de luz visible o
no visible. Existen distintas lámparas que emiten en distintas zonas del espectro visible UV.
▪ Lámparas de filamento de tungsteno: Se utilizan habitualmente como fuentes de radiación
para longitudes de onda del espectro visible y UV próximo son fuente de un espectro continuo
de energía radiante entre 360 y 950 nm.

▪ Lámparas de filamentos de haluros de tungsteno: Son de mayor duración, producen más

luz a longitudes de onda cortas, y emiten energía radiante de mayor intensidad que las de
filamento de tungsteno. Se emplean frecuentemente las de yoduro de tungsteno.
▪ Lámparas de hidrógeno y deuterio: Están constituidas por un par de electrodos colocados
dentro de una ampolla de vidrio con una ventana óptica de cuarzo. En su interior contienen
hidrógeno o deuterio a baja presión. Al aplicar un alto voltaje entre los electrodos se provoca
una descarga electrónica que excita los electrones de las moléculas del gas a estados de mayor
energía. Al volver esos electrones a su estado fundamental emiten radiación continua entre

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180 y 350 nm. Se emplean para medidas en la región UV del espectro, siendo más usada la de
deuterio, de mayor intensidad que la de hidrógeno.

▪ Lámparas de vapores de mercurio: Emiten un espectro discontinuo «espectro de líneas»

(313, 365, 405, 436 y 546 nm). Son muy útiles para propósitos de calibración de longitudes de
onda, pero no son utilizadas en muchos espectrofotómetros. Se emplean en
espectrofotómetros para cromatografía HPLC.
Es importante tener en cuenta que la cantidad de luz emitida por una lámpara no es constante
en un intervalo continuo de longitudes de onda, presentando máximos y mínimos, propiedad
que varía en los diferentes tipos de lámparas, e incluso con los diferentes fabricantes; esto
nos llevará a buscar siempre el tipo de lámpara que resulte más adecuado en la práctica para
los análisis que queremos realizar.
Conviene tener también en cuenta que las lámparas sufren con las subidas y bajadas bruscas
de tensión, que se traducen en cambios en las lecturas de absorbancias. Y que la lámpara tiene
una vida limitada, haciéndose necesaria su vigilancia para el buen funcionamiento del
instrumento.
b) Rendijas
La función de las rendijas de entrada es reducir al máximo la luz difusa y evitar que la luz
dispersa entre en el sistema de selección de longitud de onda.
Las rendijas de salida tienen como función impedir que la luz difusa atraviese la cubeta, lo que
generaría desviaciones a la Ley de Beer.
c) Sistemas de selección de longitud de onda
Su finalidad es seleccionar la longitud de onda o intervalos de longitud de onda deseados para
el análisis. Se clasifican en filtros y monocromadores.
c.1) Filtros: Seleccionan una única banda (bastante ancha) de , luego con ellos no es posible
variar la  en forma continua (cosa que requieren los espectrofotómetros). Los montan en
instrumentos sencillos (colorímetros o fotómetros). Tipos: lentes coloreadas intercambiables
o redes de difracción.

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Región λ (nm) Color filtro Color disolución

380–435 Azul Amarillo
480–490 Verde azuloso Rojo
500–560 Verde amarillento Violeta
580–595 Anaranjado Azul verdoso
595–650 Rojo Verde azuloso

c.2) Monocromadores
Los monocromadores son dispositivos ópticos que descomponen la radiación policromática
incidente en sus diferentes radiaciones monocromáticas y permiten transmitir anchos de
banda muy angostos, que varían entre 2 y 0,1 milimicras. Todo monocromador consta de:
Rendija de entrada
Lente colimadora
Dispersor de la radiación
Lente de enfoque
Rendija desplazable de salida

El elemento básico del monocromador es el dispersor de la radiación y puede ser:

Prisma de dispersión.
Red de difracción por reflexión.
▪ Prismas. Son fragmentos con forma de cuña, de vidrio, cuarzo, cloruro sódico o cualquier
otro material que permita la transmisión de la luz. En el campo visible e infrarrojo cercano se
utilizan de vidrio al plomo. Debido a la variación del índice de refracción en función de la
longitud de onda, la luz que penetra en el prisma se dispersa en mayor o menor medida según
la longitud de onda de la luz. La dispersión de la luz no es lineal, es decir, se hace cada vez
menor a medida que se acortan las longitudes de onda. Cuando se pretende trabajar en la
zona visible del espectro y en la UV próxima, se pueden utilizar prismas de vidrio, pero para
trabajar en el UV lejano, han de ser de cuarzo.

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▪ Redes de difracción por reflexión. Consisten en placas de aluminio altamente pulido en

una de cuyas caras se tallan una serie de ranuras paralelas de la misma anchura. Las rejillas
normales para la región UV-VIS tienen 1180 o 1770 ranuras por mm.
Cuando incide la luz blanca sobre ella, cada hendidura se comporta como un pequeño
prisma; la luz se refleja o atraviesa la red de manera que la luz blanca se descompone en varios
colores.

d) Cubetas
Es el recipiente donde se coloca la muestra para la medición espectrofotométrica.
▪ Formas
Pueden ser redondas, cuadradas, o rectangulares, y de tamaño menor o mayor.
Habitualmente tienen 1 cm de paso de luz. Se obtienen mejores resultados trabajando con las
cubetas de lados paralelos, a ser posible fundidas en lugar de cementadas. Las de forma
redonda se deben marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posición.
▪ Materiales

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La mayoría están fabricadas en vidrio, lo cual permite trabajar satisfactoriamente entre

longitudes de onda que van de 320 a 950 nm. También existen cubetas de plástico. Para
medidas por debajo de 320 nm (UV) es necesario emplear cubetas de cuarzo, que también se
podrían emplear para mediciones a longitudes de onda superiores, pero su costo lo
desaconseja.

e) Sistemas de detección
Los detectores son aparatos que sirven para detectar la radiación transmitida por la muestra
generando una corriente eléctrica proporcional que puede ser amplificada y medida.
Deben tener una respuesta lineal en la zona del espectro en la que trabajan y poseer suficiente
sensibilidad para el trabajo que van a desarrollar.
Existen dos tipos de detectores empleados tanto en las regiones del visible como del UV:
Células fotovoltaicas
Fototubos.
La elección de uno u otro sistema depende fundamentalmente de la energía radiante de que
se disponga. Si se han empleado como selectores filtros o monocromadores de baja
dispersión, éstos proporcionarán un haz de luz de suficiente energía como para emplear
células fotovoltaicas. Si se emplean monocromadores de elevado poder resolutivo, hay que
recurrir a fotomultiplicadores para la detección.
e.1) Fotocélulas o células fotovoltaicas semiconductoras, o células con capa de barrera
Consisten en una lámina de cobre sobre la que se ha depositado una capa de material
semiconductor, como selenio u óxido cuproso. Esta capa está cubierta por una capa de metal
transparente que sirve como electrodo colector. Al iluminarse a través del electrodo
transparente, se produce un flujo de electrones que puede ser medido con un amperímetro.
Estos detectores son resistentes, relativamente económicos, y sensibles desde el UV hasta los
1000 nm. No se requiere ningún aporte externo de energía, y la corriente producida es
directamente proporcional a la energía que llega.
Las fotocélulas muestran el llamado «efecto de fatiga», consistente en que presentan una
subida inicial de corriente que luego decrece gradualmente hasta el equilibrio. Por ello,
conviene esperar unos 30-60 segundos entre lecturas.

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e.2) Fototubos multiplicadores

Es un tubo que contiene en su interior un cátodo consistente en una placa de metal que emite
electrones de forma proporcional a la energía que incide sobre ella.
Contiene además un ánodo, que recoge los electrones y de 9 a 14 dínodos o niveles de energía
(electrodos del tubo fotomultiplicador) que originan hasta 100000 electrones por cada
fotoelectrón generado en el cátodo.
Los electrones producidos en el primer choque contra el cátodo pasan a chocar contra una
superficie secundaria, donde cada electrón produce entre 4 y 6 electrones adicionales que van
a otro nivel (dínodos), y así sucesivamente, multiplicándose de este modo el efecto del primer
choque de la luz contra el cátodo, hasta que los electrones llegan al ánodo, y la señal se
amplifica en cientos o miles de veces. Esta alta amplificación interna significa que pueden ser
detectadas potencias radiantes muy bajas sin necesidad de una amplia amplificación externa.
Los fototubos tienen un rápido tiempo de respuesta, no muestran efectos de fatiga tan altos
como otros detectores y son muy sensibles

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Actualmente los detectores más utilizados son los Diodos Array (formación ordenada de
fotodiodos).
Un diodo es un pequeño elemento semiconductor que sólo permite la circulación de corriente
en un sentido. Están formados por cristales de silicio o germanio dopados con algún elemento
como el antimonio o arsénico que le aporta exceso de electrones en la red de enlace, o de
aluminio, galio o boro que crean déficit de electrones en la red.
Los fotodiodos son elementos electrónicos sensibles a las radiaciones luminosas que inciden
sobre ellos, de modo que cuanto más grande es su intensidad mayor es la corriente que fluye
por el mismo.
Aplicando la salida del dispersor sobre el campo de diodos se puede trabajar con todas las
longitudes de onda emergentes, teniendo la posibilidad de obtener espectros
tridimensionales muy interesantes en análisis.
Los espectrofotómetros con estos detectores se denominan multicanales.

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f) Sistemas de presentación de datos

La energía eléctrica del detector se refleja en sistemas de lectura y presentación de datos.
Éstos pueden ser sistemas de lectura directa, que suelen ir aplicados a aparatos con
detectores del tipo fotocélulas, o bien pueden introducir amplificadores de señal, como ocurre
en los aparatos con fototubos.
Hoy en día todos los aparatos incorporan ya la lectura digital, la cual, unida también a la
introducción de microprocesadores, permite cálculos directos de concentración con arreglo a
factores de calibración prefijados, y lectura contra estándares, o curvas de calibración en
memoria.
A esta presentación digital de resultados se une también la posibilidad de conexión de
registradores, de gran utilidad en el estudio de reacciones cinéticas, y en la realización de
barridos a través de intervalos de longitudes de onda del espectro.

5.2.- ASPECTOS PRÁCTICOS

a) Empleo de blancos
Antes de efectuar una lectura, se debe hacer siempre un «blanco»: esta maniobra eliminará
las posibles interferencias de absorción o reflexión por parte de la propia cubeta o el solvente
del cromógeno.
Consiste en hacer una primera medida en la misma cubeta, sólo con el solvente; se establecerá
una intensidad inicial relativa a la cubeta y a la solución, que marcará las condiciones iniciales
de trabajo. La absorbancia del blanco se restará de las absorbancias que se midan para los
problemas.

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b) CURVA  – ABSORBANCIA

Sobre una muestra de una determinada concentración

(no muy alta) se va incidiendo radiaciones de distinta 
midiendo la absorbancia (A). Se representa las  frente a
las A obtenidas y se observa para cuál de ellas se ha
producido la máxima absorbancia. Esa será la radiación que
deberemos emplear para análisis cuantitativo de ese
analito (salvo problemas de interferencias o exceso de
señal). Las razones son:
• En las proximidades del máximo de absorción la
absorbancia es constante y también ε, luego se cumple
mejor la ley de Beer.
• La sensibilidad para el análisis será máxima.
Por otro lado, si se trata de un componente puro,
habremos obtenido su espectro característico para el
disolvente utilizado, como puede verse en las Figuras 14-4.
Este espectro es útil para para comprobar purezas y como
dato para su identificación en análisis cualitativo, aunque
no tiene por qué ser único.
c) Desviaciones de la Ley de Beer
En las condiciones habituales de trabajo esta ley se cumple casi siempre, sin embargo, hay
ocasiones en que dicha relación lineal entre la Absorbancia y la concentración deja de
cumplirse. Estas limitaciones suelen ser de dos tipos:
• Limitaciones Reales:
• Limitaciones Aparentes: Dentro de estas tendríamos:
- Químicas.
- Instrumentales.
c.1) Limitaciones reales:
Son aquellas que se presentan a concentraciones elevadas (> 0,01 M) y que originan que los
valores de las absortividades molares dejen de ser constantes y varíen con la concentración.
Ocurren tanto si la concentración de analito como la de los electrolitos de la disolución es
elevada y son debidas a que las interacciones entre las moléculas cercanas afectan a la
absorción de radiación. También pueden ser causadas por cambios en el índice de refracción
de la disolución.
c.2) Limitaciones químicas:
Se presentan desviaciones químicas de la ley de Beer cuando las especies absorbentes
participan en equilibrios que dependen de su concentración, como ocurre en relaciones de

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asociación, disociación o reacción con el disolvente. Estas reacciones dan lugar a productos
con propiedades diferentes a las del propio analito.
Cr2O72- + H2O ↔ 2 HCrO4- ↔2 H+ + 2 CrO4-
Naranja Amarillo

c.3) Limitaciones instrumentales:

Se pueden presentar en dos situaciones:
- Cuando la radiación empleada no es monocromática. No obstante, en la práctica estas
desviaciones no son apreciables siempre que la radiación usada abarque un tramo espectral
dentro del cual el absorbente no presente grandes cambios en su absortividad molar respecto
a la λ. Por eso, conviene siempre medir en la zona de máxima absorción.
- Cuando la radiación empleada para medir la Absorbancia está contaminada con radiación
dispersa o parásita (radiación que llega al detector y no procede de la muestra) debido a
fenómenos de dispersión en las lentes, prismas, ventanas, etc.
d) Curvas de calibración
La curva de calibración relaciona las absorbancias con las concentraciones. Se construye
ensayando soluciones de distintas concentraciones, restableciendo para cada una de ellas su
absorbancia a una determinada longitud de onda.
Para construir una curva de calibración, se deben estudiar concentraciones que cubran el
rango que se va a encontrar en la práctica, siempre que sea posible.
Las unidades de concentración empleadas en la curva deben ser las mismas que se vayan a
utilizar luego para expresar los resultados.
En la construcción de la curva se emplean un mínimo de tres puntos, que se representan en
la gráfica, ya continuación se traza una línea recta que se aproxime a ellos lo más posible.
Generalmente, a una concentración de 0 corresponde una absorbancia de 0. La curva debe
abarcar un rango de concentraciones que se encuentren dentro del límite de linealidad, para
que se cumpla la Ley de Beer, y al mismo tiempo la interpolación de cualquier resultado en
esta gráfica ofrezca un resultado fiable.
d) Empleo de factores de calibración
Otra forma de trabajo consiste en utilizar lo que se llama factor de calibración; este factor es
el resultante de la aplicación de la ecuación básica de la espectrofotometría, y se halla por una
simple regla de tres, tras el ensayo de un estándar (comparando concentraciones y
absorbancias de estándar y problema).

As C s Ap
= → C p = Cs → C p = F  Ap
Ap C p As

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Para reactivos estables y sistemas fotométricos estables, este factor se puede mantener
constante, siendo sólo necesario ensayar las muestras problema, multiplicando la absorbancia
resultante por el factor, para conocer la concentración.
Cualquier cambio en las condiciones de trabajo (reactivos, ajustes de aparatos, etc.) requiere
el cálculo de un nuevo factor de calibración.
De igual manera, cuando se trabaje con una curva de calibración, cualquier ajuste en el
aparato, o cambio en los reactivos con que se fabricó, requieren la construcción de una nueva
curva.
5.3. MANTENIMIENTO PREVENTIVO
CUBETAS
- Las cubetas deben mantenerse en buen estado: perfectamente limpias, no ralladas y
exentas de huellas o adherencias en las paredes por las que ha de pasar la radiación.
- Las cubetas de vidrio y cuarzo pueden limpiarse con HNO3 o con Agua Regia en frío, pero
no con mezcla crómica.
- Una vez limpias deben enjuagarse con H2O destilada y secarse exteriormente con un papel
suave.
- Para guardarlas secas pueden enjuagarse con Acetona previamente.

EQUIPO
- Debe comprobarse periódicamente que las lámparas estén en buen estado,
fundamentalmente la de Deuterio, que es más delicada. (Anotando el número de horas de
utilización)
- El equipo debe mantenerse limpio y cubierto con una funda evitando el polvo y la
humedad, para que los espejos no se empañen.
- Deberá verificarse su funcionamiento periódicamente, comprobando Exactitud,
Reproducibilidad y correspondencia entre escalas de A y T.
- Deberá inspeccionarse, ajustarse y cambiarse, si fuera necesario el sistema óptico: espejos,
lentes, red de difracción, filtros, rendijas…
- Limpiar los filtros de ventilación del sistema electrónico.

5.4.- VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LAS ESPECTROFOTOMETRÍAS

A la hora de elegir trabajar con Espectrofotometría UV- Visible, debemos tener en cuenta
alguna de sus ventajas e inconvenientes:

VENTAJAS:
• Gran sensibilidad
• Pueden analizarse sustancias con concentraciones entre 10 - 4 y 10 – 5 M
• Es una técnica selectiva
• Se puede encontrar una banda de λ en la que sólo absorba el componente deseado

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• Buena precisión y facilidad de manejo

• Las especies no absorbentes pasan a serlo cuando reaccionan y dan productos
coloreados
INCONVENIENTES:
• Sólo es aplicable para concentraciones bajas de muestra
• Requiere mayor cantidad de muestra que otras técnicas instrumentales
• Normalmente la muestra requiere de un tratamiento previo para eliminar interferencias
ó para formar un compuesto que absorba en esta zona de UV- Visible.
• Deben controlarse varios factores a la hora de llevar a cabo la determinación, como: pH,
concentración de los reactivos, tiempo adecuado de la medida, Temperatura, orden de
adición de reactivos, eliminación de interferencias, concentración de sales (ya que pueden
desplazar el máximo de Absorbancia), etc.

5.5.- APLICACIONES
o Análisis Cualitativo: permite identificar especies a partir de las bandas de absorción de
mayor intensidad del espectro de absorción UV- Visible
o Para Análisis Cuantitativos: es una de las técnicas más útiles en análisis instrumental.
Muchas especies orgánicas e inorgánicas absorben selectivamente en esta zona.
o Estandarización de colores de diversos materiales como plásticos y pinturas.
o Detección de niveles de contaminación en aire y agua.
o Determinación de trazas de impurezas en alimentos y en reactivos.

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