FUNCIONALISMO DE LA

GLÁNDULA ADRENAL

Química Clínica I
Dpto. de Bioquímica Clínica
2020

Bioq. Romina Geysels – romina.geysels@unc.edu.ar

Bioq. Fabián Ramos – fabian.ramos@unc.edu.ar
Temario General:

MÉDULA ADRENAL

• Conceptos básicos del funcionalismo normal y cuadros patológicos referidos a

la Médula Adrenal y el tejido cromafín.
• Preparación del paciente, obtención y conservación de las muestras
biológicas para la valoración de las catecolaminas (Dopamina, Noradrenalina,
Adrenalina) y sus metabolitos (Metanefrinas, Ácido vanilmandélico, Ácido
homovanílico). Métodos más utilizados.

CORTEZA ADRENAL

• Conceptos básicos del funcionalismo del eje hipotálamo-hipófiso-adrenal así

como de los cuadros patológicos de presentación más frecuente en la clínica
endocrinológica.
• Concepto, utilidad e interpretación de las distintas pruebas dinámicas
funcionales.
• Determinación de analitos que contribuyen al diagnóstico de las patologías de la
glándula suprarrenal.
 CRESTA NEURAL

SIMPATOGONIA

NEUROBLASTO FEOCROMOBLASTO

NEUROBLASTOMA
CEL. CROMAFÍN EXTRA-
CEL. CROMAFÍN
ADRENAL
ADRENAL
FEOCROMOCITOMA
CEL. GANGLIONAR EXTRA-ADRENAL O FEOCROMOCITOMA
SIMPÁTICA PARAGANGLIOMA ADRENAL

GANGLIONEUROMA • Hipertensión (sostenida/paroxística)

• Dolor de cabeza
• Palpitaciones Catecolaminas
• Transpiración excesiva
• Ataques de ansiedad
 ¿QUÉ ANÁLISIS PODEMOS REALIZAR EN EL
LABORATORIO CLÍNICO?

PLASMA ORINA

CATECOLAMINAS CATECOLAMINAS
Noradrenalina (NA) Noradrenalina (NA)
Adrenalina (A) Adrenalina (A)
Dopamina (DA) Dopamina (DA)

METANEFRINAS METANEFRINAS
Normetaadrenalina Normetaadrenalina
Metaadrenalina Metaadrenalina

ACIDO VANILMANDÉLICO (AVM)

ACIDO HOMOVANÍLICO (AHV)
 DETERMINACION ANALITICA DE CATECOLAMINAS
Y SUS METABOLITOS
PREPARACIÓN DEL PACIENTE
1- MEDICAMENTOS: suspender una semana antes medicamentos que
modifican los niveles de CA:
• Inhibidores de la monoamino-oxidasa (IMAO, disminuye la
degradación)
• α-metil DOPA (agonista α2, falso neurotransmisor)
• α-metil p-tirosina (AMPT, inhibe la tirosina hidroxilasa)
• Simpaticomiméticos (pseudoefedrina, salbutamol)
• Reserpina (produce depleción de los gránulos)
• Anfetaminas, antidepresivos tricíclicos, cocaína (inhiben la
recaptación de CA)
• Antibióticos (ampicilina, tetraciclina), vitaminas del complejo B
(fluorescencia)
Drogas que incrementan los niveles de catecolaminas

Neary y col., The New England Journal of Medicine, 2013

Drogas que incrementan los niveles de catecolaminas
 PREPARACIÓN DEL PACIENTE
2- DIETA PREVIA: suspender tres días antes:

• Chocolate, helado, frutas secas, cítricos, caramelos, vainillas, y

otros alimentos ricos en vainillina y ácidos fenólicos (dan
reacción similar al AVM)
• Banana, ananá (contienen CA conjugadas).
• Quesos fermentados, vinos tipo Chianti, arenque e hígado de
pollo (contienen tiramina: produce la liberación de CA de los
gránulos).
• Coca, café, té, mate, gaseosas (aumentan la fluorescencia).
 NO DEBE SER INDICADA EN:
• Ejercicio violento
• Hipoglucemia marcada
• Shock (hemorragia, endotoxinas)
• Posterior a cirugías o traumas
• Estados de marcada ansiedad
DESVENTAJAS
• Se encuentran en concentraciones muy bajas por lo que se realiza un
tratamiento previo:

NA: 170-300 pg/ml

A: 20-50 pg/ml

DA: 20-50 pg/ml

• Determina la actividad medular en un momento determinado.

• Presenta una vida media muy corta: 1-2 min.

• Fácilmente oxidables y fotosensibles.

• La recolección de la muestra es influenciada por stress, postura, niveles de

glucemia, ejercicio.
EFECTO DE LA HIPOGLUCEMIA SOBRE LAS CATECOLAMINAS PLASMÁTICAS

Prueba de Hipoglucemia

Niveles plasmáticos de catecolaminas (pg/ml)

insulínica
2000

ADRENALINA

1500

1000

500

NORADRENALINA

0 50 120 Tiempo
(min)
EFECTO DE LA POSTURA SOBRE NORADRENALINA PLASMÁTICA

600

Niveles plasmáticos de Noradrenalina (pg/ml)

NORADRENALINA
500

400

300

200

100

Supina Erguida Erguida

+
Torniquete
CATECOLAMINAS PLASMÁTICAS

ADRENALINA NORADRENALINA
 RECOLECCIÓN Y CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS
Las condiciones bajo las cuales se recolectan las muestras de sangre y orina son cruciales
para la confiabilidad e interpretación de los resultados

• Paciente sentado y • Tubos preenfriados • Transporte en hielo

relajado
• Anticoagulante: • Separación del plasma
• Cateterizar 30 min dentro de los 30 min
EDTA o Heparina
antes de tomar la
• Conservación:
muestra • Antioxidante:
-80ºC (8 meses)
tiosulfato de sodio,
metabisulfito o -20ºC pérdida de 5%/mes
glutatión
-temperatura ambiente
pérdida de 30%/h
 Catecolaminas en plasma Catecolaminas
(conjugadas con libres
sulfatos/glucurónidos)

1. Purificación con alúmina activada (dióxido de aluminio):

* adsorción de catecoles a pH 8.6
* elución de CA a pH ácido (Ác. Acético o Ác. Bórico)

2. Purificación con resinas de intercambio iónico (Amberlita CG-2, Dowex

CG-50)
 1- Agregar 1 ml de 2- Agregar 3- Agregar 5 mg de 4- Mezclar bien 20
plasma Tris EDTA Alúmina min

Tris EDTA
pH 8,6

Plasma

Alúmina

5- Centrifugar 6- Lavar la alúmina 7- Desorber catecoles en 8- Purificación o

con H2O ácido diluido Cuantificación

Catecoles se
desorben de la
Catecoles
alúmina con vortex a
adsorbidas a la
pH ácido
alúmina
 MÉTODOS PARA CATECOLAMINAS
PLASMÁTICAS

Doble purificación previa de Catecolaminas con alúmina y amberlita

CG-50 (intercambio catiónico)

Fluorométricos Radioinmunoanálisis Cromatografía líquida

técnicas de aislamiento de alta performance
altamente específicas (RIA) (HPLC)
Detección por

Radioenzimáticos (REA) -Fluorescencia

tediosos para la rutina -Electroquímica (HPLC/EC)

-- HPLC/MS/MS
 Radioinmunoanálisis (RIA)

Metanefrina
Ac (reconoce MN y sinefrina)
Ag Ag*

A MN
Metanefrina
COMT
(proviene de CA) NA NMN
SAM
PNMT
COMT
Ag
A MN
SAM

125 I - Sinefrina DAβOH PNMT

DA NA A
Tiramina Octopamina Sinefrina
Ag*
 Radioenzimoanálisis (REA)

• Método de referencia.
• No requiere tratamiento previo de la muestra.

COMT
A Metanefrina (MN)
SAM

COMT
NA Normetanefrina (NMN)
SAM

COMT
DA 3-Metoxitiramina
SAM

• Cromatografía en capa fina

• Cuantificación directa o conversión de vainilla

 METANEFRINAS PLASMÁTICAS

• Son menos susceptibles a incremento por influencias externas tales como

cambio en la postura o el stress.

• Su determinación tiene una sensibilidad diagnóstica superior a las de las

catecolaminas plasmáticas para el diagnóstico de feocromocitoma.

MÉTODOS PARA METANEFRINAS PLASMÁTICAS

Radioenzimáticos HPLC
tediosos para la rutina Detección electroquímica –
MS/MS
Purificación previa de metanefrinas por resinas de intercambio iónico débiles y
fuertes.
Metanefrinas: HPLC
 ORINA
La recolección de la muestra depende de la presentación clínica:

Hipertensión sostenida Hipertensión paroxística

Orina de 24 hs

normotensión pico hipertensivo

Orina de 3-4 hs
• Frasco oscuro sobre medio ácido (15 ml HCl 6N/L orina).
• Conservar en heladera durante todo el período de recolección.
• Conservación: 4°C (6 meses), -20°C (2 años).
CA LIBRES MNs TOTALES
CA TOTALES ÁCIDO VANIL MANDÉLICO
 CATECOLAMINAS URINARIAS
• El orden de magnitud en que las catecolaminas se eliminan por orina
es de g/24 hs

NA: 31-59 g/24 hs

A: 7-14 g/24 hs

DA: 120-278 g/24 hs

• Las catecolaminas se eliminan por orina como libres y conjugadas.

• En orina es conveniente dosar la forma libre ya que:

- en la hidrólisis (ebullición 20 min a 100ºC a pH:1,5) se forman

pigmentos amarillos interferentes.

- las catecolaminas conjugadas representan principalmente las

catecolaminas de la dieta.
 CA LIBRES CA TOTALES

1. Si se dosan totales: hidrólisis previa (ebullición en medio ácido).

2. Purificación con alúmina activada o geles de borato:

* adsorción de catecoles a pH 8.6 (orina alcalinizada).
* elución de CA a pH ácido (Ác. Acético o Ác. Bórico).
 MÉTODOS PARA CATECOLAMINAS URINARIAS

Fluorométricos Radioenzimáticos HPLC

Derivados de tediosos para Detección
tri-hidroxi-indol la rutina electroquímica /
MS/MS

Purificación previa de catecolaminas basada en la interacción del grupo

catecol con alúmina o con resinas de intercambio iónico, excepto REA.
 METANEFRINAS URINARIAS

• El orden de magnitud en que las metanefrinas se eliminan por orina es

de ug/24 hs (74-297 ug/24h). Las metanefrinas se eliminan por orina
tanto como aminas libres como conjugadas con sulfato y glucurónido.

• La NMA y MA urinarias derivan fundamentalmente del metabolismo

de las catecolaminas circulantes por vías extraneuronales y no son
influenciadas por la dieta.

• Solo el 3% de las metanefrinas totales que se eliminan por orina

corresponden a metanefrinas libres.

• Se realiza un paso previo de Hidrólisis ácida o desconjugación

enzimática con sulfatasa para la liberación de los metabolitos
conjugados.
 METANEFRINAS TOTALES

1. Hidrólisis: ebullición en medio ácido.

2. Purificación por adsorción a resinas de intercambio catiónico

(Amberlita):
* adsorción a pH ligeramente ácido.
* elución de MNs a pH alcalino (NH4OH).
 MÉTODOS PARA METANEFRINAS URINARIAS

Espectrofotométricos RIA o REA HPLC

Método de Pisano tediosos para la rutina Detección electroquímica
o fluorescencia /
MS/MS

HPLC: pueden utilizarse condiciones uniformes para catecolaminas y

metanefrinas urinarias

Purificación previa con Amberlita CG-50.

Consideraciones para la
elección de
Metanefrinas urinarias y
plasmáticas

Pacak y col.,
Nature Clinical Practice
Endocrinology &
Metaboilsm, 2007
 ÁCIDO VANILMANDÉLICO
• El orden de magnitud en que ácido vanilmandélico es eliminado por orina es de
1.8 a 7.1 mg/24 hs.

MÉTODOS PARA AVM

Espectrofotométricos HPLC
Detección electroquímica
Método de Pisano Electroforesis
o fluorescencia /
Método de Sunderman capilar
MS/MS
 DETERMINACION DE ÁCIDO VANIL MANDÉLICO EN ORINA
Método de Pisano (Clin. Chem. Acta 7:285, 1962)

ORINA (acidificada y saturada con NaCl)

EXTRACCION DEL AVM (acetato de etilo)

RE-EXTRACCION DEL AVM (K2CO3 1M, pH 11)

OXIDACION DEL AVM (NaIO4, 50°C)

EXTRACCION DE VAINILLINA (tolueno, pH 7.5)

RE-EXTRACCION DE VAINILLINA (K2CO3 1M, pH 11) LECTURA A 360 nm

DETERMINACION DE ÁCIDO VANIL MANDÉLICO EN ORINA TRABAJO PRÁCTICO
Método de Pisano

• BLANCO
• TESTIGO
- MUESTRA PROBLEMA
• - BLANCO DE PROBLEMA NO OXIDADO

Valores de Referencia: 1.8-7.1 mg/24hs

Ó 1.5-7.0 ug/mg creatinina
10-20 mg/24hs: SOSPECHOSO
> 20 mg/24hs: DIAGNÓSTICO
DETERMINACIÓN DE ÁCIDO VANIL MANDÉLICO EN ORINA
Método colorimétrico de Sunderman
PURIFICACIÓN DE LA ORINA CON SILICATO DE MAGNESIO ACTIVADO (FLORISIL)

EXTRACCIÓN DEL AVM (acetato de etilo)

RE-EXTRACCIÓN DEL AVM (K2CO3 1M, pH 11)

OXIDACIÓN DEL AVM (ferricianuro de potasio/ZnCl2, pH 11, oscuridad)

EXTRACCIÓN DE VAINILLINA (tolueno, pH 7.5)

RE-EXTRACCIÓN DE VAINILLINA (K2CO3 1M, pH 11)

ACIDIFICACIÓN (H2SO4)

VAINILLINA + INDOL+ H3PO4 COMPLEJO SALMÓN

(490 nm-495 nm)
SCREENING DIAGNÓSTICO PARA FEOCROMOCITOMA
DETERMINACIÓN DE MNs URINARIAS
SENSIBLE PARA EL DIAGNÓSTICO
(Bajo número de falsos negativos)

DETERMINACIÓN DE AVM
ESPECÍFICA PARA EL DIAGNÓSTICO
(Bajo número de falsos positivos)

COMBINACIÓN DE AMBAS DETERMINACIONES

MEJORA LA PESQUIZA

DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL (FEO. ADR./EXTRA-ADR.)

➢ CA URINARIAS
➢ CA PLASMÁTICAS
 CRESTA NEURAL

SIMPATOGONIA

NEUROBLASTO FEOCROMOBLASTO

NEUROBLASTOMA
 NA, AVM, CEL. CROMAFÍN EXTRA-
CEL. CROMAFÍN
ADRENAL
  DA y AHV ADRENAL
FEOCROMOCITOMA
EXTRA-ADRENAL O FEOCROMOCITOMA
CEL. GANGLIONAR ADRENAL
PARAGANGLIOMA
SIMPÁTICA
  NA, AVM  NA,   A y AVM
GANGLIONEUROMA

 NA, AVM
 BIBLIOGRAFÍA GENERAL

•Benowitz NL. (1990). Pheochromocytoma. Adv. Intern. Med. 35: 195-220.

•Bishop ML, Duben-Engelkirk JL, Fody EP. (2000). Clinical Chemistry. 4th edition. Lippincott Williams and Wilkins.

•Bravo EL, Tagle R. (2003). Pheochromocytoma: state-of-the-art and future prospects. Endocrine Reviews 24:539-
553.

•Burtis CA, Ashwood ER. (1999) Tietz Textbook of Clinical Chemistry. 3rd edition. W. B. Saunders Company.

•Felig PH, Baxter JD, Frohman L. (1995). Endocrinology and Metabolism 3rd edition. McGraw-Hill, INC.

•Krakoff LR, Garboiut D. (1991). Adreno-medullary hypertension: A review of syndrome, pathophysiology, diagnosis
and treatment. Clin. Chem. 37: 1849-1853.

•Kuchel O. (1994). Clinical implications of genetic and acquired defects in catecholamine synthesis and
metabolism. Review. Clin. Invest. Med. 17: 354-373.

•Shimada H. (1992). Neuroblastoma. Pathology and Biology. Review. Acta Pathol. Japonica 42: 229-241.

•Wilson JD, Foster DW. (1998). Williams Textbook of Endocrinology. 9th Edition. WB Saunders Company.

•Williams Textbook of Endocrinology. 11th Ed. 2008. Chapter 15: ENDOCRINE HYPERTENSION (505).

•Williams Textbook of Endocrinology. 11a Edición. 2009. Capítulo 15: HIPERTENSIÓN DE ORIGEN ENDÓCRINO (513).

•Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. 6th Edition, 2007.

• Felig Endocrinology & Metabolism. 4th Edition, 2001. Chapter 12 : DISEASES OF THE SYMPATHOCHROMAFFIN
SYSTEM.
 BIBLIOGRAFÍA METODOLÓGICA
•Burtis CA, Ashwood ER. Eds. (1990) Tietz Clinical Guide to Laboratory Tests. 2nd edition. Philadelphia, W. B.
Saunders Company.

•Crout R. (1962). Determinación de Catecolaminas Urinarias. Métodos seleccionados de Análisis Clínicos. Vol.
III.

•Eisenhofer G et al. (1986). Simultaneous liquid-chromatographic determination of 3,4-dihydroxyphenylglycol,

catecholamines, and 3,4-dihydroxiphenilalanine in plasma and their responses to inhibition of monoamine
oxidase. Clin. Chem. 32: 2030-2033

•Parker NC et al. (1986). Uniform chromatographic conditions for quantifying urinary catecholamines,
metanephrines, vanillylmandelic acid, 5-hydroxyindolacetic acid by liquid chromatography with
electrochemical detection. Clin. Chem. 32: 1473-1476.

•Pisano, Crout, Abrahan. (1962). Clin. Chem. 7:285.

•Rosano TG et al. (1991). Advances in catecholamine and metabolite measurements for diagnosis of
pheochromocytoma. Clin. Chem. 37: 1854-1867.

•Sawka AM, Jaeschke R, Singh RJ, Young WF. (2003). A comparison of biochemical testes for
pheochromocytoma: measurement of fractionated plasma metanephrines compared with the combination of
24-hour urinary mtanephrines and catecholamines. The Journal of Clin. Endocrinol. Metabolism 88:553-558.

•Wassell J et al. (2000). Freedom from drug interference in new immunoassays for urinary catecholamines and
metanephrines. Clin. Chem. 45: 2216-2223.

•Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana Vol 38 Nº2, 2004. Determinación de catecolaminas y sus
metabolitos.