5.
DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS
POLIMORFISMO
Definiciones:
Estricta: 2 o más variantes (alelos, fenotipos, variantes de secuencia o cromosómicas) en
frecuencias significantes en la población, que implican que no pueden ser mantenidas sólo por
una mutación recurrente.
Genética molecular:
a) Variante (alelo) en un locus que ocurre con frecuencia mayor de 0.01 (1 %)
b) Variación No patogénica
El polimorfismo desde el punto de vista de laboratorio debe tener dos condiciones:
❖ Que sea una variación no patogénica y
❖ Que al menos esté presente en el 1% de la población.
Pero desde el punto de vista estricto son variantes o secuencias en que la presencia de ellas no
puede ser explicada solamente por mutaciones recurrentes sino que son alteraciones que se
heredan de forma ancestral y están presentes en un gran número de individuos, por lo que no
tienen ninguna importancia desde el punto de vista de la patología.
Diferencias entre individuos
Nuestros polimorfismos, es decir las diferencias entre nosotros son inmensas, se dice que todos
somos iguales teniendo un 99,9% de homología, pero ese 0,1% son 3,4 millones de pares de bases.
Entonces, a pesar de que el porcentaje sea despreciable, el número de pares de bases es mucho y
por lo tanto nuestras diferencias son importantes, y esas diferencias pueden ser desde que no nos
produzcan ningún efecto en el sentido patogénico, hasta tener un cambio de base con una
mutación puntual dando una patología catastrófica. Y desde el “sin efecto” hasta la
“enfermedad” está todo lo que se les ocurra desde las diferencias anatómicas, reacciones adversas
a medicamentos, susceptibilidad a infecciones, a desarrollar cáncer, etc.
Aplicaciones en el Laboratorio Clínico
¿Cuáles son las aplicaciones en un laboratorio clínico de las metodologías moleculares?
Hay cientos de técnicas moleculares para hacer distintos tipos de diagnóstico, pero los que se
utilizan como rutina en el diagnóstico de enfermedades genéticas, son estos tres:
1. Southern blot, que es maravillosamente bueno pero es engorroso.
2. PCR
3. La secuenciación, que antes era una metodología muy lejana, pero que ahora se utiliza
de rutina en el laboratorio para el diagnóstico de este tipo de enfermedades:
Otros:
− RFLP
− ASO (Allele Specific Oligonucleotide)
− Hibridación in situ
− Uso de marcadores de linkeage, que en el fondo no tiene ninguna importancia en el
diagnóstico de enfermedades actualmente pero como se le encuentra en muchos
trabajos. Consiste en tratar de identificar las alteraciones en los genes cuando uno no es
capaz de estudiar el gen propiamente tal.
Por ejemplo: En el diagnóstico de Distrofia Muscular de Duchenne. Esta enfermedad se produce por
alteraciones en el llamado “gen de la distrofina”, el cual es un gen muy grande, tiene 79 exones en
total y está localizado además en el cromosoma X. La alteración más frecuente es que tiene
deleciones de una gran cantidad de exones. Entonces esta patología no está presente desde el
inicio de la vida, sino que se presenta más tardíamente. Como es una enfermedad ligada al X, los
niños la manifiestan y las mujeres son portadoras a pesar de que esto es variable. Es una
patología muy grave, en el sentido de que se empieza a hacer el diagnóstico como a los 5-6 años
cuando empiezan con debilidad muscular, a los 12 años están ya con silla de ruedas y mueren
muy jóvenes por falla muscular respiratoria. Todas las mujeres de una familia en que hay un
afectado con Distrofia Muscular de Duchenne quieren saber si son portadoras, porque tienen 50%
de probabilidades de tener un hijo afectado y eso es mucho.
Ejemplo distrofia muscular de Duchenne:
Una familia sin antecedentes previos, tiene 2 hijos: una mujer y un hombre, y el hombre presenta
Duchenne, entonces las hijas probablemente querrán tener hijos y querrán saber si son portadoras
o no de la patología. Si estamos en un laboratorio en que no puedo estudiar el gen propiamente
tal pero tengo como antecedente que la mamá es portadora obligada debo averiguar si ella
heredó el X de la mamá con alteración o sin alteración, sin saber cuál es la deleción. Para poder
hacer eso lo que se trata de estudiar son regiones que estén muy cercanas al gen debido a que
nosotros sufrimos recombinación genética en meiosis, por lo que existe la posibilidad de que haya
recombinado y sea el otro X el que tiene la alteración. Entonces tiene que ser idealmente en
regiones intragénicas.
Para ello lo que hago es buscar cualquier marcador, por ejemplo busqué el marcador A, que
algunos son A1 o A2 o las dos cosas si es que son heterocigotos, luego identifico los dos
marcadores de la familia y en este caso digo que el cromosoma X que tiene la alteración, que no
sé cuál es pero la tiene, es el A1B1 con esos marcadores los identifiqué. Luego veo la otra
hermana y tiene A1B1.
Entonces defino con este marcador el que tiene el X con la alteración, entonces voy a estudiar el
resto de la familia y esta hija de este matrimonio es A1B2 y A2B1 que vendrían siendo sanos (ella
vendría siendo sana, ella portadora y el, afectado).
Esta es entonces una forma indirecta para decir al menos si por aquí viene o aquí no viene (la
alteración). Es posible equivocarse (si este método fuera perfecto ocuparíamos este y no haríamos
técnicas moleculares). No identifica la etiología de la
alteración genética pero si sirve para establecer cuál
es el que viene dando vuelta de los cromosomas.
P: ¿Eso se hace en Chile o no?
R: En clínica no se puede informar ninguna patología con esta
metodología indirecta, pero la puedes usar en investigación.
P: Y si yo quisiera hacerme un estudio para saber si yo soy
portadora, ¿a qué tengo que recurrir entonces?
R: Hay estudios para gente que puede ser portadora en este
caso, lo que pasa es que hay otros genes que no están
identificados, esto es un ejemplo antiguo del Duchenne.
SOUTHERN BLOT
❖ Análisis del DNA a groso modo
❖ Estructura de DNA, cortado con enzimas
de restricción (miles de fragmentos)
❖ Sonda: segmento DNA clonado y
marcado
En el Southern Blot, uno analiza el DNA
groseramente, no hay amplificación de por medio,
solo mirarlo en gran cantidad. Entonces el primer
gran inconveniente que tiene el Southern Blot es que necesita gran cantidad de DNA, porque no
lo amplifico y eso significa que en muchos casos por ejemplo recién nacidos, cuando uno tiene
muestras de cadáveres y cosas así no es posible hacer esta metodología, esta es la principal
desventaja que tiene y además es complicado en el sentido que tiene muchas etapas, se demora
varios días. Si sale mal tienes que hacer todo de nuevo.
La otra gran desventaja es que en casi todas partes se utilizan las sondas marcadas con
radioactividad, P32, que tiene un montón de complicaciones en el laboratorio; nosotros en
laboratorio hacemos Southern blot en síndrome de X frágil, lo marcamos con
quimioluminiscencia así que tenemos la ventaja de que eso lo obviamos.
colita como un poco cortada y es justo ahí donde está la mutación completa pero la sensibilidad
de la citogenética es poca.
Estas expansiones ocurren sólo en la meiosis (embarazo), por eso es súper importante hacer el
diagnóstico. En el laboratorio si llega un paciente a hacerse estudios de X frágil nosotros además
le entregamos el n° de repeticiones, decíamos que hasta 45 es normal, después hay una zona libre
entre 45 - 55, sobre 55 es una pre mutación, de 55 para arriba la probabilidad de que esa región
expanda en los nuevos gametos es muy alta.
Se supone que hay números establecidos, pero no son tan certeros, por ejemplo:

¿Para qué usamos el Southern blot? ❖ 55 - 65 repeticiones→expande un 85%

Para lo único que lo usamos en este momento es el síndrome de X frágil que es una enfermedad
ligada al X que se localiza en esta región Xq27.3 de un gen que tiene 17 exones y es la forma más
frecuente de retraso mental hereditario, o sea, en una familia en que haya retraso mental en varias
personas, ésta es la primera causa. En un gen como este uno podría tener cualquier mutación
distinta pero especialmente, asociada a este fenotipo, lo que pasa es que hay una expansión de
unos tripletes que están localizados entre la región promotora y el codón de inicio de este gen.
❖ Hasta 45 repeticiones→ Normal
❖ 45 – 200 repeticiones→ Pre mutación
❖ Sobre 200 repeticiones→ Mutación completa (cuando esto sucede lo que pasaba era una
metilación del DNA y la proteína no se expresaba y el fenotipo está asociado a una no
expresión de esta proteína).
❖ Si son de 90 repeticiones hacia arriba→ 100% probabilidad de expansión.
Entonces si viene una mujer portadora nosotros le estudiamos las repeticiones y le decimos
“usted tiene 90 repeticiones, es absolutamente seguro que tiene 50% de probabilidad de tener un
hijo con X frágil, porque ese número de repeticiones es inestable y tiende a expandir y producir
sobre 200 repeticiones en el nuevo óvulo”.
P: ¿Por qué se produce esa fragilidad in vitro?
R: En la replicación (en la mitosis), estas regiones son débiles por decirlo así, no sé la razón molecular, se supone que es
la metilación, porque cuando tu ya estás en esta etapa ya está metilado, entonces esa metilación hace que frente a estos
medios deficitarios en algunos tipos de nutrientes, se expresen estos sitios frágiles y tú los puedas ver. En el fondo el
único objetivo es hacer diagnóstico, porque eso no es la realidad del paciente. Entonces los sitios frágiles no significan que
“los cromosomas son frágiles”, se generan en el laboratorio para tratar de hacer el diagnóstico. Eso es súper antiguo de
hecho nosotros no hacemos la metodología.

Los hombres son afectados y las mujeres portadoras, pero las mujeres
con mutación completa en uno de sus X, hasta 33% pueden tener
clínica, y esto es por la inactivación del X. Alguien pudo tener la mala
suerte que quedó con muchos más X inactivados que su X normal y esa
distribución hace que de las mujeres con mutación completa: 1/3 sean
afectadas, 1/3 tengan alteraciones cognitivas de distinto tipo y 1/3
sean sanas. Los hombres son todos afectados.

Fenotipo: tienen la cara alargada, las orejas grandes, la boca abierta,

tienen un retraso mental bastante severo, hacen movimientos
repetitivos y estos pacientes tienen además hidrocele, que es el escroto
con edema. El diagnóstico se realiza por PCR y Southern-Blot.

La citogenética antes se utilizaba para el diagnóstico, porque yo les decía que se generan sitios
frágiles artificialmente en laboratorio, uno si somete a estos cromosomas a medios deficientes de
ácido fólico que es necesario para la replicación (mitosis) se genera eso, ven ustedes que tiene la
 Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) Electroforesis en gel de agarosa
Enfermedades en que se utiliza esta metodología:
Fibrosis quística: enfermedad autosómica recesiva en que lo que uno hace es buscar (en este caso,
porque también podría secuenciar el gen completo, de hecho hay laboratorios de USA que
secuencian el gen completo CFTR, de 27 exones) 32 mutaciones, dentro de las cuales hay 25 de
ellas que son las mínimas standard del American College que dice cuáles con las mutaciones más
frecuentes en toda la población y con esas 32 mutaciones la sensibilidad es de alrededor de un
66%, lo que querría decir que si se tiene un test negativo no se descarta la enfermedad pues puede
tener otra mutación. Si encuentro 2 mutaciones confirmo la enfermedad, estudio a los padres y les
doy consejo genético, por lo tanto el diagnóstico es muy necesario.

❖ El objetivo de la PCR es amplificar una región del DNA que yo quiero estudiar.
❖ La miro en un gel de agarosa mirando el tamaño que obtuve de ese producto PCR.
❖ Hago una detección por un método muy sensible, como un ELISA o por un partidor
fluorescente cosa de establecer con detalle el número de repeticiones.
❖ La secuencio.

Métodos de detección de producto amplificado:

DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE: este gen es gigantesco y hay varios fenotipos asociados a
este gen, como la distrofia muscular de Becker, que también es una distrofia muscular pero
mucho menos severa y hay otros fenotipos indeterminados también asociados a las mutaciones,
pero en Duchenne un 60 a 65% de los casos son deleciones de exones, de estos 79 exones se
deletan individualmente.

Ahí hay un ejemplo de un PCR múltiple que nosotros hacemos en el laboratorio para estudiar 26
exones que son los más frecuentemente deletados. Es un protocolo que está diseñado hace mucho
años por un doctor que fue el que descubrió el gen, la gracia además de encontrar cuáles exones
son los que están deletados es que según los exones que están deletados uno puede hacer una
predicción de la severidad del cuadro porque algunas deleciones lo que hacen es generar pérdida
del marco de lectura y las que generan pérdida del marco de lectura se supone que son más
severas que las que no (a pesar que ha habido controversia sobre esto). Nosotros tenemos unos
diagramas en el laboratorio donde miramos el tamaño de las deleciones y podemos saber si es
Duchenne, si es Becker, etc. La interpretación del test negativo no descarta pues hay mutaciones
puntuales en el gen, hay deleciones y hay duplicaciones además que nosotros con esta
metodología no la podemos ver.
 Detección de variación en el número de copias
❖ MPLA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification).
Esta es una metodología más sensibles. Si tenemos un niñito con diagnóstico de Duchenne (según
el médico) y los test nos salen negativos, se llama al médico y si el médico dice “no puede ser que
no tenga, porque encuentro que es un Duchenne clásico” le hacemos este test.
El MLPA tiene la gran ventaja que estudia los 79 exones individualmente y además serviría para
hacer estudios de portadoras, porque son PCR que son semicuantitativos, se utiliza además un
DNA control que viene en el kit, y se comparan las mujeres para establecer disminución de
copias. Ese el problema de las mujeres, que no le podemos hacer el otro PCR porque nos va a dar
siempre normal porque es uno de los X el que tiene la deleción, por lo tanto hay que usar algo
más sensible, que en este caso pareciera que nos pudiera resultar esta metodología.
PCR en tiempo real
Es una variante del PCR que tiene la ventaja de que es amplificación y detección simultánea. En el
mix se coloca una sonda que puede ser una sonda Taqman o cualquier otro tipo de sonda y a
medida que se va generando el producto amplificado, esta sonda se va hibridando con ese
producto amplificado y la sonda tiene una marca fluorescente que nos va a dar una señal,
entonces con eso mejoramos la sensibilidad y además la especificidad del test, porque la sonda
sólo se puede ligar si hay calce perfecto con el producto amplificado. Uno pudiese tener falsos
positivos (por su alta sensibilidad).
Con esta metodología se hace diagnóstico de Hemocromatosis que es una enfermedad
autosómica recesiva, hay 2 mutaciones que están más frecuentemente asociadas a esta
enfermedad que son la c282y y la h63d y para cada una de ellas tenemos una sonda, o sea, se
hacen 2 PCR’s independientes con la sonda dirigida al alelo normal y al alelo mutado y uno es
capaz de identificar las mutaciones de los pacientes.
PCR fluorescente cuantitativo (QF-PCR)
❖ Amplificación con partidores fluorescentes
❖ Separación del producto de PCR por tamaño
❖ Regiones altamente polimórficas (STR) con 15 a 20 alelos en cada locus.
❖ Cuantificación relativa del área bajo la curva
❖ Aplicación: diagnóstico de aneuploidías (13,18,21, X e Y)
La otra variante del PCR que nosotros utilizamos para las aneuploidías en la búsqueda de las
alteraciones de los cromosomas 13, 18, 21, X e Y, son PCR semicuantitativos y fluorescentes, que
tienen la ventaja de que permiten utilizar pequeñas cantidades de muestra. Están dirigidos a
regiones de STR (esas que son altamente polimórficas) de entre 15 a 20 alelos en cada locus.
Tienen la gran ventaja que necesitan muy poca muestra, la principal razón por la que se utiliza
esta metodología es para mujeres embarazadas en donde el bebé está por ejemplo con restricción
del crecimiento uterino o con alguna cosa que hace tener que tomar la decisión si el bebé debe
sacarse o la dejo evolucionando. Para eso muchas veces necesito hacer un diagnóstico muy rápido
de esta aneuploidía, entonces en 1 cc de líquido amniótico nosotros podemos decirle al clínico si
tiene trisomía 13, 18, 21 o alteración del cromosoma sexual.
PCR fluorescente cuantitativo (QF--PCR)
Ventajas:
❖ Rapidez
❖ Automatización
❖ Menos operadores
❖ Sensibilidad→ menos muestra
❖ Exactitud
La ventaja del PCR cuantitativo es la rapidez, si uno quiere lo puede tener el diagnóstico en 5-6
hrs. Además está en formato automatizado porque esto se sube a esos analizadores genéticos que
además secuencian; tiene menos operadores que las metodologías convencionales que son el
FISH y el cariotipo, tiene una sensibilidad muy buena porque además requiere muy poca muestra
y además tiene muy buena exactitud.
Secuenciación Método Didesoxi
Lo otro que utilizamos muchísimo es el método de Sanger, donde
se generan todas las secuencias posibles de todos los tamaños
posibles, porque al incorporarse el nucleótido marcado se detiene
la replicación, por lo tanto cuando hago después la electroforesis,
todos estos distintos tamaños se ordenan por tamaño y empiezan
a aparecer delante del láser uno detrás de otro y yo soy capaz, a
través de eso, de replicar la secuencia que yo tenía en ese DNA.
Tenemos un montón de patologías que estudiamos por secuencia,
por ejemplo el más importante es el estudio del gen de la
Hemofilia que es un gen 26 exones, donde se secuencian todos
ellos para tratar de identificar los afectados y las portadoras.
ACONDROPLASIA/HIPOCONDROPLASIA
❖ Crecimiento óseo anormal/talla baja
❖ Autosómica Dominante
❖ Mutación de novo en gen FGFR3 (señal prendida) 19
exones
❖ 95%→ mutación puntual
❖ G1138A (Gly380Arg)
❖ Diagnóstico molecular: Secuenciación región de interés
Es una enfermedad autosómica dominante, y es en general 1 mutación puntual, que es una G por
una A en la región 1138 del gen FGFR3.
Hay dos mutaciones que nosotros estudiamos en esa región para Acondroplasia, que en realidad
si dan las dos negativas y el paciente venía con diagnóstico de Acondroplasia, le hacemos una
tercera, que en realidad no hemos encontrado nunca aquí en Chile, y además estudiamos otras
regiones que están asociadas a un fenotipo menos severo de esta enfermedad en este mismo gen
que es la Hipocondroplasia, que son otras mutaciones que provocan un daño mucho menor en la
proteína, por lo tanto el fenotipo es un poquito mejor. Nosotros hemos hecho más diagnóstico
prenatal de Acondroplasia, lo que es súper bueno porque prepara a las familias.
SORDERA CONGÉNITA SENSORIONEURAL
Gen GJB2:
Conexina 26
❖ Responsable de 50 - 80 % de las pérdidas auditivas no sindrómicas
❖ Más de 70 mutaciones descritas
Otra enfermedad que estudiamos por secuencias, es el gen GJB2 que codifica para una proteína
llamada Conexina 26 que es responsable de gran cantidad de las pérdidas auditivas no
sindrómicas, con patrón de herencia autosómica recesiva.
En general son padres normales que tienen un hijo con Sordera Congénita, que en general es
severa-profunda, o sea grave, a pesar de que podrían haber otros fenotipos asociados. Se estudia
a los pacientes para entregarles consejo genético a la familia, lo normal es que los padres sean
portadores de alguna mutación.

Hay muchas mutaciones descritas, y lo que nosotros hacemos es estudiar toda la región
codificante de este gen, por ejemplo esta mutación que encontramos que es una deleción de la G
en uno de los dos alelos (que también puede darse en forma homocigótica, o conjunta con otra
mutación en otra región del gen), nos permite establecer el diagnóstico y además dar consejo
genético a los padres.
Detección de variación en el número de copias:
❖ CGH (Comparative Genomic Hibridization)
❖ Inserciones, deleciones, duplicaciones
La Hibridación Genómica Comparativa (CGH), es la metodología que ha mejorado la
sensibilidad del cariotipo, ninguna de las otras técnicas que hemos visto nos da el cariotipo, que
es la visión general de todo el genoma del paciente. La gracia que tiene el CGH es que hace una
comparación entre un genoma normal y el genoma del paciente de muchas regiones con una
sensibilidad bastante alta.
En principio cuando se desarrolló el CGH, se ponía la metafase de un paciente marcada con un
fluoróforo, y se marcaba un genoma normal y el del paciente, los hibridabas entre ellos y se hacía
una evaluación con un software entre las diferencias en esta hibridación, por ejemplo si había
más señal en el DNA normal, uno decía que había una deleción del paciente en esa región, y al
revés, si había más señal en el paciente, uno decía que había una duplicación de esa región. Es
decir en un principio era bastante rústico, cromosoma con cromosoma en metafase, y el problema
que tenía era la reproducibilidad, uno lo volvía a hacer con el paciente, y no daba exactamente lo
mismo, entonces se desechó, y se pasó al formato de array. Este formato tiene mucho mejor
reproducibilidad, y en realidad ya hace 5-6 años se usa en clínica.
❖ Incidencia 1:20.000
❖ Microdeleción 7q11.23 en 99% de los casos
❖ Compromete ELN y LIMK1 entre otros
❖ WSBCR: 1.5 Mb
❖ Esporádico
❖ Déficit cognitivo con perfil específico
− RM leve (75%) a severo
− Habilidades en área verbal más que visuoespacial
❖ Personalidad especial: Amistosos, ansiosos
❖ Facies característica
En esta enfermedad es posible hacer diagnóstico con otras metodologías como el FISH, pero en
algunos casos no da la sensibilidad y hay que hacer otras cosas, es el Síndrome de Williams que
también es una microdeleción como el Di George, la pérdida de un segmento de una región pero
del cromosoma 7.
Tiene una incidencia de 1:20.000, y son niñitos que son muy especiales porque son amorosos, y
tienen esta deleción que compromete muchos genes porque es una región grande que incluye el
gen de la Lactina, por ejemplo, y estos niños prácticamente todos tienen también malformación
cardiaca, tienen retraso mental que es leve pero que puede llegar a ser severo, tienen muchas
habilidades en el área verbal, y tienen esas facies características.
Los Williams se pueden diagnosticar por FISH, o sea una sonda que es dirigida a un gen, que es
el gen blanco, y otra sonda contra el mismo cromosoma, y uno lo que tiene que hacer es no
encontrarlo. Otra alternativa es el array, que uno ve que hay una región con una deleción. Lo que
tiene de gran ventaja el array es que todo lo que nosotros no vemos por los ojos, esto lo puede
ver, y además la diferencia con el FISH es que en el FISH tienes que pensar lo que tiene el
paciente, tienes que pedir dirigidamente para el 7, para el 22, para los distintos cromosomas, por
lo tanto tienes que hacerte la idea clínica, en cambio en el CGH no, porque veo todas las regiones
simultáneamente. En cuanto a la interpretación del cuadro, el CGH también es comparativo, por
lo que está mostrando que solamente el normal tiene esa región que en el paciente no se ve (la
indicada por la flecha), lo que el sistema interpreta como una deleción, esto se analiza por
software porque a veces este tipo de mutaciones no se puede ver en el gráfico a simple vista.
Hay muchas enfermedades genéticas que no tienen que ver con la edad, la que está más
claramente demostrada es el Síndrome de Down, ahí si existe relación, porque nuestra
prevalencia general de los Down es de 1:700, pero a los 40 años es 1:100, y a los 45 puede llegar a
ser 1:10. Todo esto porque se supone que la no disyunción se produce más por esto de que los
óvulos están viejos. Pero hay muchísimas otras enfermedades en que la edad no tiene nada que
ver en la aparición de estas.
DNA en sangre materna
Hitos históricos
❖ 1969 linfocitos fetales en sangre materna
❖ 1970’s ácidos nucleicos circulantes no celulares
❖ 1977 DNA en plasma de pacientes con cáncer vs normales
❖ 1989 determ. prenatal del sexo fetal en sangre materna
❖ 1996 DNA específico del tumor en plasma y suero de pacientes con cáncer pulmonar
❖ 1997 DNA fetal libre en suero y plasma maternos
La identificación de DNA fetal en sangre materna se refiere a hacer diagnósticos de enfermedades
genéticas en fetos a través del estudio de la sangre periférica de la madre. Lo que se trataba de
hacer en un principio es que células fetales siguen persistiendo en circulación materna durante el
embarazo y muchos años después (las células fetales circulan en concentración bajísima en la
sangre).
Células fetales en sangre materna versus DNA fetal en plasma o suero materno
En 1997 se estableció más claramente que además de haber células fetales circulando en sangre
materna, hay DNA fetal libre fragmentado, y eso es lo que se trata de identificar para poder hacer
diagnóstico no invasivo en los fetos.
Demostración de la presencia de DNA fetal en plasma y suero maternos
Hay algunas patologías en que, por ejemplo, identificar el sexo del feto precozmente es
fundamental para tratar de evitar consecuencias en ese feto, entonces mientras uno antes haga el
diagnóstico de sexo fetal, es mejor.
El problema de las células fetales es que:
❖ Son difíciles de separar de las células maternas
❖ Además hay un paper en el que se habla del hallazgo de células fetales con cromosoma Y en una
mujer, 27 años después del último parto.
Por lo tanto, hay persistencia de estas células, entonces no nos sirven para hacer diagnóstico pues
podría confundir el sexo del feto mirando células que en realidad son de un embarazo antiguo.
En nuestro laboratorio, desde 1999 hacemos identificación de regiones del cromosoma Y para
otras patologías como Turner (donde la presencia de secuencias Y en niñas es un factor
importante ya que hay que extirparle las gónadas) o Sexo ambiguo (saber si al menos
cromosómicamente el bebé es hombre o mujer).
 Hasta el momento llevamos 61 fetos estudiados, 58 correctamente identificados (por cariotipo
durante el embarazo o por el sexo de nacimiento) y 3 falsos negativos porque no pudimos
encontrar DNA fetal suficiente como para hacer el cariotipo y además no pudimos hacerle
seguimiento a esos bebés.

En general se le hace un seguimiento a la embarazada a las 7, 8 y 9 semanas y en esta última se

obtiene un 100% de sensibilidad en la técnica. La ecografía como diagnóstico del sexo, para la
patología que buscamos nosotros, no sirve.

❖ Técnica de extracción es fundamental b) Status RhD

❖ Análisis simultáneo de la fracción celular de la sangre
❖ Secuencia copia única en el cromosoma Y DYS14
❖ PCR convencional, electroforesis en agarosa y tinción con bromuro de etidio.

Aplicaciones en el Diagnóstico Prenatal

a) Determinación del sexo fetal: enfermedades ligadas al X, HSC
Exactitud
Unidad BM UC 1999
❖ 2do y 3er trimestre: 100%
Secuencias analizadas: ❖ 1er trimestre: 78%

❖ SRY sex-determining region Francia: 285 embarazadas 285/285 correctamente genotipificadas. Costa et al. 2002
❖ DYZ3 región pericentromérica
❖ TSPY testis specific protein Por esta metodología además se puede identificar el status Rh del paciente, con una sensibilidad
menor en el primer trimestre (78%) por la misma razón que lo anterior: el DNA fetal circulante es
Aplicaciones: sexo ambiguo, detección de secuencias Y ocultas (a la citogenética) en el síndrome menor. En el segundo y tercer trimestre se obtiene una sensibilidad del 100%. El futuro de esto es
de Turner (mosaicismo) ahora en plasma de mujeres embarazadas ??? finalmente diagnosticar enfermedades genéticas en la sangre materna.

Amplificación de secuencias de cromosoma Y en suero y plasma materno c) Enfermedades genéticas Ejemplo: Acondroplasia. Saito et. al 2000
 Hiperplasia suprarrenal congénita

En un futuro es probable que podamos buscar la mutación del padre en la circulación materna, lo
que significaría que el feto tiene mutación paterna. La mutación de la madre no podemos
La razón por la cual nosotros hacemos identificación de sexo fetal es por la Hiperplasia
identificarla porque la tiene la madre y también eso confirma un riesgo distinto porque si yo no
Suprarrenal Congénita (de herencia autosómica recesiva), donde la principal causa es la mutación
encuentro una mutación paterna, independientemente de que sea niñita, también podría
de un gen que codifica para la 21-hidroxilasa, donde ese shortcut provoca que haya una
suspender el tratamiento.
derivación hacia hormonas masculinas y mineralocorticoides.
El tamaño del DNA fetal es distinto al de la madre. Uno siempre tiene DNA libre circulante pero
Afectados por mutaciones severas, es decir, la forma de Hiperplasia clásica, si son mujeres tienen
está fragmentado de distinta forma el fetal y el de la madre. Esto podría ser una pista para en
una alta probabilidad de virilización. Ya incluso a las 15–16 semanas los ecografistas pueden
futuro separarlos y estudiar solamente el fetal.
tratar de ver el sexo del feto (si es hombre sólo hay que preocuparse cuando nazca) pero pueden
equivocarse pues puede haber una virilización muy temprana. Por todo esto, la interpretación del DNA mitocondrial
sexo hay que hacerla por otras metodologías no fenotípicas:

❖ Cariotipo
❖ Biopsia de vellosidades coriales o
❖ A través de la sangre materna

A las pacientes se les da corticoides para evitar la virilización, pero si se identifica que es hombre
hay que detener el tratamiento. Todo el medicamento (dexametasona) pasa al feto y tiene pocas
implicancias en la mujer, aunque las consecuencias son más para el feto por el uso de corticoides
igual que a cualquier individuo. Cada vez que yo trato a una embarazada con antecedentes en la
familia y parto de inmediato con corticoides estoy tratando además 7 de cada 8 fetos, porque ya
teniendo los papás una mutación recesiva tendré de cada 4 individuos, 1 afectado, los otros 2
portadores y 1 sano. Y además se hace sólo en las mujeres, no en los hombres, por lo tanto 7 de
cada 8 fetos se tratan demás si uno no hace el diagnóstico precozmente.
❖ 16 kb circular, doble hebra
Se debe tratar de establecer la presencia de una de estas regiones del Y a las 7–8 semanas y
❖ Múltiples copias por mitocondria
reanalizar entre las 9–11 en donde la sensibilidad es perfecta, porque si da mujer no se podrá
❖ Heteroplasmia y herencia materna
hacer nada, pero si sale hombre se suspende el tratamiento.
❖ Genes involucrados en metabolismo de la energía
Otra causa de patología en genética son las alteraciones en el DNA mitocondrial. Cada una de las Mutaciones puntuales
células tiene muchas mitocondrias, entonces se tienen cantidades enormes de DNA mitocondrial.

Tiene 16.6 kb de tamaño, 37 genes y en general están involucrados en el metabolismo de la

energía.

La genética mitocondrial es una genética distinta a la genética nuclear, tiene un código genético
que es distinto y tiene una característica que dificulta el diagnóstico en el laboratorio la
“heteroplasmia” que quiere decir que no todas las mitocondrias son iguales en su composición
genética en un mismo individuo, es como si fueran mosaicos.

En la imagen ustedes ven que puede haber un paciente con 100% de las mitocondrias normales,
otro con 40% de ellas mutadas, otro con 60%, donde ninguno de estos presenta aún el fenotipo.
Pero hay un umbral, donde la presencia mayoritaria de mitocondrias con DNA mutado
determina la aparición del fenotipo.

Son cientas. Nosotros en el laboratorio estamos estudiando las deleciones groseras que están
asociadas a 2 fenotipos especiales que son: Kearns-Sayre y el Peerson, ambos muy catastróficos.

Mutaciones puntuales MELAS

Vamos 6 de todas las mutaciones puntuales son las más frecuentes, producen las enfermedades:
MELAS, Diabetes y Sordera, MEERF, entre otras.

De todas estas la patología más frecuente es MELAS (Mitochondrial Encephalo-Myopathy Lactic

Heteroplasmia
Acidosis Stroke-like Episodes = Encefalopatía y Miopatía Mitocondrial con Acidosis Láctica y con
❖ Variantes de mtDNA en la misma célula episodios de Infarto Cerebral). Es la menos catastrófica.
❖ Segregación replicativa (distribución de la mitocondrias heteroplásmicas durante la
Hay 6 mutaciones asociadas a MELAS pero la A3243G es la más frecuente.
división celular es desigual)
❖ Efecto umbral (n mínimo de mitocondrias alteradas para que la célula muestre ❖ 80%: A → G gentRNA (Leu) en la base 3243
manifestación de la disfunción). ❖ 7.5% : T → C gentRNA (Leu) en la base 3271

→variabilidad manifestación clínica de las enfermedades mitocondriales

Diagrama de flujo para estudiar mutaciones genéticas:

❖ Si llega un paciente con un desorden familiar, el genetista debiese primero hacer el

pedigree del paciente (ver si hay más afectados, ver si la enfermedad tiene herencia
mendeliana, etc.) y si se observa un gen conocido, candidato para la patología que se
está presentando, debiera ofrecérsele al paciente el consejo genético pre-test y luego el
análisis mutacional.
❖ Si es un gen desconocido se puede tratar de hacer un análisis de ligamiento y tratar de
identificar el gen, pero todo eso en laboratorios de investigación relacionados a las
patologías.
❖ Si ubiqué al paciente por métodos de screening en pacientes sanos, el mismo protocolo.
❖ Después del análisis mutacional se realiza el consejo genético post-test y el tratamiento
de la patología si es que es posible.