MANUAL

DE

INMUNOLOGÍA

-
INMUNOSERODIAGNÓSTIC
O
 INTRODUCCIÓN
En un intento de obtener resultados más rápidos se han desarrollado técnicas que
siendo específicas y sensibles, permiten una más rápida identificación del agente
etiológico del proceso infeccioso directamente a partir del producto patológico. Estos
métodos no deben sustituir a los clásicos del aislamiento e identificación, pero pueden
ser métodos adicionales valiosos. También pueden ser de un valor insustituible en los
casos de pacientes bajo tratamiento antibiótico en los que no se aísla el
microorganismo patógeno.
Se pueden clasificar en métodos inmunológicos que permiten detectar antígenos, y no
inmunológicos que ponen de manifiesto componentes microbianos o metabolitos
directamente en la muestra obtenida del enfermo.
Como contraposición al diagnóstico directo de una enfermedad infecciosa, cuyo
fundamento es el aislamiento de un agente causal o la detección de alguno de sus
componentes, el diagnóstico indirecto se basa en la detección de los anticuerpos
específicos que se forman como respuesta a la infección. Estos anticuerpos
reaccionarán solamente frente al antígeno (microorganismo) que los originó.
Basado en la especificidad de las reacciones antígeno-anticuerpo se ha desarrollado la
serología o estudio de las reacciones capaces de poner de manifiesto la unión
Antígeno-Anticuerpo, es decir, las interacciones antígeno-anticuerpo son la base de
muchas técnicas inmunológicas, en las que se utiliza la alta especificidad de una
anticuerpo para identificar, aislar o cuantificar un antígeno determinado.

UNIÓN ANTÍGENO- ANTICUERPO

La unión del Antígeno con el Anticuerpo, tiene lugar a través de la formación de
múltiples puentes entre el determinante antigénico o epítopo, y los aminoácidos del sitio
de combinación del fragmento Fc del Anticuerpo (paratope).

Ejemplos de las fuerzas débiles que mantienen la unión Antígeno-Anticuerpo

1. Atracción electrostática.
2. Puentes de hidrógeno.
3. Fuerzas de Van Der Waals.

Aunque las fuerzas son débiles si las consideramos aisladamente, la multiplicidad

de los enlaces conduce a una considerable energía de unión.

Atracción electrostática: También conocidas como uniones salinas, se establece

entre iones cuando estos se encuentran en disolución, si dos iones poseen cargas
opuestas se atraerán y tenderán a acercarse, mientras que si tienen carga igual se
repelen y, por tanto, tienden a alejarse. Entre grupos básicos con cargas positivas y
grupos ácidos con cargas negativas, se representará una fuerza de atracción
electrostática. Este tipo de interacción contribuye al mantenimiento de la estructura
espacial de las proteínas.

Fuerzas de Van Der Waals: Son fuerzas electrostáticas transitorias que se establecen
entre los electrones de la envoltura de unos de los átomos y los núcleos de los otros, lo
que provoca deformación momentánea de las nubes electrónicas y la aparición de un
dipolo de carácter transitorio. Estos dipolos originan fuerzas de atracción entre los
grupos o moléculas vecinas. Las fuerzas de Van Der Waals son importantes en el
mantenimiento de la estructura tridimensional de las proteínas.
Los átomos unidos por algún tipo de enlace estudiado, y en el caso de las
biomoléculas especialmente por el covalente, originan las cadenas hidrocarbonadas,
los distintos grupos funcionales y en general todas las agrupaciones atómicas que se
presentan en las diversas biomoléculas.

Los puentes de hidrógeno se establecen entre un átomo de hidrógeno que está

unido a un elemento muy electronegativa, con radio iónico pequeño (con el oxígeno y el
nitrógeno) y que es atraído por un segundo elemento con características similares, de
manera que el hidrógeno queda compartido entre los dos átomos electronegativos. En
estas condiciones el átomo de H se encuentra casi desposeído de su electrón y se
comporta como un H. El puente de hidrógeno puede formarse entre moléculas
diferentes y moléculas iguales.
El puente de hidrógeno puede alcanzar una energía alrededor de 10 kcal. Mol y es
una de las más fuertes entre las interacciones débiles; la formación de puentes de
hidrógeno entre moléculas de agua es un ejemplo. Esta interacción desempeña una
función fundamental en el mantenimiento de la estructura tridimensional de las
proteínas y de los ácidos nucleicos.

REQUISITOS QUE TIENE QUE CUMPLIR LA UNIÓN Ag-Ac.

1. COMPLEMENTARIEDAD: El epítope del Antígeno y su lugar de combinación en el
Anticuerpo (paratope), deben tener estructuras complementarias ( como una llave
en su cerradura) para que encajen uno con otro de manera que puedan formarse
varias uniones simultáneamente y almacenar suficiente energía de unión para
resistir la disrupción termodinámica.
2. AFINIDAD: Es la fuerza de una sola unión Antígeno- Anticuerpo individual. Viene
dada por la suma de las fuerzas de atracción y repulsión. Se le puede aplicar la
ecuación de la Ley de acción de masas. La afinidad de un Anticuerpo aumenta con
la duración de la inmunización, como si hubiera un perfeccionamiento de la
adaptación entre epítope y paratope. Por otra parte, frente a un mismo Antígeno,
todos los Anticuerpo circulantes no presentan la misma afinidad sino que en este
sentido son heterogéneos.
3. AVIDEZ: Cuando un Antígeno multivalente se combina con más de un Anticuerpo,
la energía de unión es considerablemente mayor que la suma de las energías de
cada una de las combinaciones ya que los lazos Antígeno-Anticuerpo deben
romperse simultáneamente para que el Antígeno y el Anticuerpo se disocien, por
 tanto, la avidez de un Anticuerpo por su Antígeno depende de la afinidad de cada
una de sus uniones pero es mayor que la suma de éstas.

4. ESPECIFICIDAD.

5. REACTIVIDAD CRUZADA: Se produce cuando algunos epítopes de un Antígeno

son compartidos por otro Antígeno, esto traería como consecuencia que los
Anticuerpos dirigidos contra el primer Antígeno reaccionan también con el otro
Antígeno.

Para poder evaluar la confiabilidad de un método dada en su poder de detección del

antígeno o del anticuerpo es importante comprender qué es la sensibilidad,
especificidad y eficiencia en relación al diagnóstico clínico de los pacientes, por lo que
a continuación daremos sus definiciones.

SENSIBILIDAD: Es la capacidad que tiene un método para detectar las

concentraciones del antígeno o del anticuerpo buscado. Da la proporción de resultados
positivos entre los pacientes de una enfermedad determinada. Por lo que:
Alta sensibilidad: Es la capacidad que tiene un método para detectar hasta las
más pequeñas concentraciones del elemento buscado que pueden estar en el orden de
los nanogramos o picogramos, por tanto esta característica hace que el método sea
más confiable.
Baja sensibilidad: Estos métodos no tienen la capacidad de detectar las pequeñas
concentraciones del elemento buscado, por tanto esta característica hace que el
método sea menos confiable ya que si el antígeno o el anticuerpo buscado está en la
muestra que se estudia en pequeñas cantidades al no lo poderlo detectar dará
negativo.

Especificidad: da la proporción de resultados negativos entre las personas sanas.

Eficiencia: Da la proporción de pacientes correctamente clasificados por una prueba.

Los métodos de diagnóstico inmunológicos se han clasificado de diversa formas, una

muy usada es la clasificación según la evidencia de los cambios
fisicoquímicos que ocurren al realizarse la reacción antígeno-
anticuerpo, la que los divide en métodos de evidencia primaria y secundaria.

MÉTODOS DE EVIDENCIA PRIMARIA:

Definición: Son aquellos métodos donde los cambios fisicoquímicos que ocurren al
realizarse la reacción antígeno-anticuerpo no son apreciables a simple vista sino con la
utilización de conjugados marcados con sustancias fluorescentes, isótopos radiactivos
y enzimas y equipos como el microscopio de fluorescencia, el contador de radiaciones
y el equipo SUMA o ELISA.
Como características de estos métodos están las mencionadas en la definición y su
alta sensibilidad, su menor especificidad, su mayor confiabilidad y su mayor
eficiencia.
Dentro de estos métodos se encuentran:
1. La inmunofluorescencia directa e indirecta.
2. Técnicas radioisotópicas como el radioinmunoanálisis.
3. Las técnicas inmunoenzimáticas como ELISA y SUMA.

En todos los casos la técnica base es la misma: el Antígeno se une a lo que se

denomina fase sólida (placa, tubo, lámina portaobjeto). En un paso posterior se añade
la muestra problema que tendrá o no el anticuerpo buscado y tras una incubación y
lavado para eliminar los anticuerpos no unidos al antígeno, se añade un anti-anticuerpo
humano marcado (con una sustancia fluorescente, o un isótopo radiactivo o una
enzima). La lectura de la reacción se realiza con un microscopio de fluorescencia, o un
contador de centelleos o un fotocolorímetro respectivamente.
En todos estos métodos la señal de unión del anticuerpo al anti-Anticuerpo marcado,
amplifica la señal original, por lo que estas reacciones son mucho más sensibles,
detectando RIA, ELISA o EIA cantidades de anticuerpos que se miden en nanogramos
o picogramos. Estos métodos también se pueden realizar para buscar en una muestra
el antígeno, siendo fijado a la fase sólida el anticuerpo específico, culminando la
reacción al agregar un anticuerpo marcado.

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA E INDIRECTA

Sustancia fluorescente: Es una sustancia que emite luz en una longitud de onda
distinta a la luz recibida. Ejemplo: isotiocianato de fluoresceína, isotiocianato de
rodamina, etc.
Principio: Evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo con la utilización de un
conjugado marcado con una sustancia fluorescente.
Ventajas:
1. Permite localizar de forma exacta el lugar donde ocurre la reacción (citoplasma,
núcleo, superficie celular) en dependencia de la ubicación del Ag.
2. Esta técnica combina la especificidad de la inmunología, con la sensibilidad de la
histoquímica y la precisión de la microscopía.
3. Los métodos indirectos son 5-10 veces más sensibles que los directos.
4. La especificidad es elevada.
Inconvenientes:
1. Necesita personal entrenado.
1. Subjetividad de la interpretación.
2. Necesita un microscopio de fluorescencia para su lectura.
3. No es aplicable a un gran número de muestras.
4. La fluorescencia se agota.

Causas de error
1. Autofluorescencia: debida a las células del tejido, suele ser blanca o azul violeta,
facilmente diferenciable de la específica.
2. Fuorescencia inespecífica, se origina en el fluorocromo.
3. Cuando se pretenden detectar anticuerpos IgM, puede haber falsos positivos por la
presencia de factor reumatoide y falsos negativos por el exceso de IgG al competir
con la IgM por los sitios de unión al antígeno.

Aplicaciones de la inmunofluorescencia:
1. Se usa ampliamente para localizar e identificar antígenos en tejidos, células y
fluidos (diagnóstico rápido de virus, bacterias, Rickettsias, etc)
2. Puede detectar anticuerpos unidos a antígenos depositados en superficies celulares
y anticuerpos circulantes o libres en sangre y fluidos corporales.
3. En el diagnóstico de:
 Bacterias como: Treponema pallidum, Escherichia coli, Haemophilus influenzae,
Neisseria gonorrhoeae y meningitidis, Neumococos, Estreptococos piógenes,
Salmonellas spp, Chlamidias trachomatis, Legionella spp, Bordetella pertusis y
parapertussi.
 Protozoos como: Toxoplasma gondii, Giardia lamblia.
 Hongos como: Histoplasma capsulatum y Cryptococcus neoformans
 Para detectar virus que crecen con dificultad o lentamente en los cultivos celulares
como son los virus respiratorios, virus de la Parotiditis, del Sarampión y de la
Varicela-Zoster.
4. En la cuantificación de las subpoblaciones linfoides T CD4 y T CD8 con anticuerpos
monoclonales.
5. En la caracterización de Leucemias y Linfomas con anticuerpos monoclonales.

RADIOINMUNOANÁLISIS
Principio: Evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo con la utilización de un
conjugado marcado con un isótopo radiactivo.
Es decir el RIA se basa en la fina especificidad de los anticuerpos y la sensibilidad de
los detectores radioactivos y consiste en desplazar de un anticuerpo de alta afinidad
una inmunoglobulina marcada con la inmunoglobulina sin marcar presente en el fluido
que se quiere analizar. Es necesario utilizar alguna técnica de separación de los
inmunocomplejos y del antígeno libre cuya elección suele ser el punto crítico de esta
técnica.
Se utiliza como marcador el I 125 por su adecuada vida media, la mínima radioactividad
que emite y su facilidad para unirse a proteínas sin alterar su estructura.
La reacción puede llevarse a cabo en medio líquido o unido a una fase sólida.
La lectura se realiza en un contador de centelleos.
Ventajas:
1. Mayor sensibilidad: detecta concentraciones mínimas.
2. Lectura automatizada.
Desventajas:
1. Utilización y manipulación de material radiactivo, que si no se toman las medidas
pertinentes, puede afectar al manipulador de esta técnica y al medio ambiente.
2. Rápido deterioro del material marcado.
3. Necesidad de un equipo sofisticado y caro.

Utilidad:
1. En el diagnóstico de:
 Bacterias como Clostridium perfringens, tetani y botulinum (en la identificación de
las toxinas), Escherichia coli, Micobacterium tuberculosis, Estafilococos aureus
(enterotoxina A, B, C y C2) y Vibrio cholerae (toxina).

 Virus como Epstein Barr, Hepatitis A, los AgS, AgC y AgE de la Hepatitis B y los
Anticuerpos para estos Antígenos, virus del Herpes simples y de la Rabia y los
Rotavirus.

 Hongos como: Histoplasma capsulatum y Cryptococcus neoformans.

2 En la cuantificación de las subpoblaciones linfoides T CD4 y T CD8 con Anticuerpos
monoclonales.
3. En la caracterización de Leucemias y Linfomas con Anticuerpos monoclonales.
4. En la cuantificación de las IgG, IgA, IgM, IgE.

Radiometría: Es una reacción competitiva con antígeno o anticuerpo marcado. En el

primer caso se detecta anticuerpo y en el segundo antígeno. En ambos casos se puede
realizar la reacción en fase sólida o líquida. También puede marcarse una antiglobulina
que se unirá a la unión antígeno anticuerpo realizada en un tiempo previo.

TÉCNICAS INMUNOENZIMÁTICAS.
Principio: Evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo con la utilización de un
conjugado marcado con una enzima que da color al ser rebelada por su
substrato específico.
La base del desarrollo de estas técnicas se encuentra en el hecho que una enzima
puede unirse a un antígeno o a un anticuerpo manteniendo el conjunto las actividades
antigénicas y enzimáticas de cada uno de los componentes por separado.

Las enzimas más utilizadas son la fosfatasa alcalina y la peroxidasa de rábano cuyos
substratos son p-nitrofenilfosfato para la primera y ortofeniléndiamina (OPD) para la
segunda.
En estas técnicas la cantidad de substrato degradado da una idea de la cantidad de
anticuerpo fijado.
Ventajas:
1. Estabilidad de sus reactivos, venciendo así la desventaja de las técnicas anteriores
donde la fluorescencia y la radiactividad se agotaban.
2. Posibilidad de automatización.
3. Lectura objetiva de sus resultados.
4. Aplicable a un gran número de muestras.
5. Brinda mayor protección para el que utiliza esta técnica y para el medio ambiente al
no utilizar material radioactivo.
6. Alta sensibilidad parecida a la del RIA.

Tipos de ELISA o ensayos inmunoenzimáticos.

Tipo 1: El antígeno que se une a la fase sólida o soporte, se deja reaccionar con el
suero y la presencia de anticuerpos se pone de manifiesto con una antigammaglobulina
humana marcada con una enzima.
Tipo 2: Es una prueba competitiva en la que al antígeno que se une a la fase sólida se
le añade simultáneamente anticuerpo marcado con enzima y suero problema. Se mide
la coloración añadiendo el substrato y la inhibición de anticuerpo marcado es
proporcional a la cantidad de antígeno presente en el suero que compite con él por el
antígeno.
Tipo 3: Se denomina también de captura de anticuerpos. La fase sólida en este caso
se recubre de una anti-inmunoglobulina humana (anti-IgG o IgM). Se añade suero
problema cuyos anticuerpos no son específicos para el antígeno pero sí para la clase
de anticuerpo (IgG o IgM), se unirán a ellos. Añadiendo una preparación de antígeno,
se unirá a los anticuerpos capturados que posean especificidad para él, revelándose
esta unión por la adición de un anticuerpo, monoclonal o no, marcado dirigido frente al
antígeno.
Algunas técnicas introducen el sistema biotina-estreptavidina o avidina, aprovechando
la gran afinidad que tienen estas dos sustancias entre sí. El anticuerpo revelador se
marca con biotina eficientemente y sin perder su capacidad de unirse con el antígeno.
A este anticuerpo se le une la estreptavidina que lleva unido la enzima y el resultado es
una molécula de anticuerpo marcada indirectamente con más moléculas de enzima que
las que habría adquirido por métodos directos convencionales. Así la reacción
cromogénica es más fuerte con lo que aumenta la sensibilidad de la prueba.

Utilidad:
1. Para detectar antígenos de:
 Bacterias como por ejemplo: Escherichia coli, Salmonella Typhi, Estafilococos
aureus, Yersinia enterocolítica y Brucella abortus.
 Virus como Epstein Barr, Hepatitis A, los AgS, AgC y AgE de la Hepatitis B y los
anticuerpos para estos antígenos, virus del Herpes simples y los Rotavirus.
 Hongos como Candida albicans y Aspergillus.
 Protozoos como Toxoplasma gondii.
2. En la cuantificación de las subpoblaciones linfoides T CD4, Helper 1 ó 2 y T CD8
con anticuerpos monoclonales.
3. En la caracterización de Leucemias y Linfomas con anticuerpos monoclonales.
4. En la cuantificación de las IgG, IgA, IgM, IgE.

MÉTODOS DE EVIDENCIA SECUNDARIA:

Son aquellos métodos donde los cambios fisicoquímicos que ocurren al realizarse la
reacción antígeno-anticuerpo son apreciables a simple vista. Las características de
estos métodos son su menor sensibilidad, su mayor especificidad, generalmente no
utilizan conjugados marcados ni equipos para visualizar la reacción y la mencionada
en la definición.
Como ejemplos de estos métodos están:
1. La aglutinación y sus variantes: la hemaglutinación y la aglutinación con látex y
otras partículas.
2. La precipitación y sus variantes como por ejemplo: la contrainmunoelectroforesis, la
inmunodifusión radial simple y doble, la inmunoelectroforesis. La fijación del
complemento.
3. La neutralización.
4. Reacción de inmovilización.

ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS
Principio: Separar las proteínas que conforman una muestra gracias a la migración
que realizan estas partículas cargadas cuando son sometidas a un campo eléctrico.
Factores de que depende electroforesis de proteínas
1. Del tamaño de la proteína y de su carga eléctrica.
2. La viscosidad del medio.
3. El voltaje empleado.
Desventaja de este método
Al existir una disminución de los anticuerpos por exceso o defecto no se conoce qué
clase de inmunoglobulina es la afectada,
Utilidad de la electroforesis de proteínas.
Este método dentro de sus múltiples usos, se ha utilizado para:
Hacer el estudio de los anticuerpos conociéndose con este método cómo se
encuentran las concentraciones de anticuerpos: normales, disminuidos o
aumentados. ya que ellos migran en la electroforesis hacia la zona de las
gammaglobulinas fundamentalmente aunque también en menores cantidades pueden
migrar hacia la zona de las bettaglobulinas,
Es un método muy utilizado cuando se quiere hacer el diagnóstico de:
1. Hipogammaglobulinemia o agammaglobulinemia (disminución o ausencia de
anticuerpos)
2. Hipergammaglobulinemia monoclonal (aumento de anticuerpos como ocurre en los
trastornos por paraproteínas humanas como el Mieloma Múltiple y la
Macroglobulinemia de Waldenstrom) o policlonal y no se poseen los antisueros
necesarios para el estudio de cada una de las clases de inmunoglobulinas o cuando
se quieren ahorrar los mismos.
3. La proteinuria de Bence Jones del Mieloma ya que con este método, se pueden
identificar con facilidad las cadenas ligeras libres en orina cuando se encuentran
aumentadas.
4. Enfermedades del SNC con alteraciones del LCR, donde ha sido útil la
electroforesis de zona en gel de agarosa
5. Las anormalidades en las proteínas del suero diferentes de las inmunoglobulinas
como por ejemplo:
 La hipoproteinemia que involucra a todas las fracciones del suero que ocurre
durante la pérdida excesiva de proteínas, habitualmente en el aparato digestivo.
 La reducción de albúmina constituye una anormalidad común que ocurre en
muchas enfermedades del hígado, riñones, aparato digestivo o quemaduras
graves.
 La disminución de la alfa 1 globulina, puede indicar una deficiencia de alfa 1
antitripsina y un aumento refleja las reacciones de fase aguda que ocurren en
muchos padecimientos inflamatorios y neoplásicos.
 El aumento de las alfa 2 globulinas refleja habitualmente la presencia de síndrome
nefrótico o hemólisis con mayor hemoglobina-haptoglobina en el suero.

REACCIONES DE PRECIPITACIÓN
Junto con la aglutinación, forma lo que se denomina reacciones de agregación.
En esta reacción cuando el antígeno está en solución formando un coloide, la unión
antígeno-anticuerpo, dará lugar a la formación de un retículo que puede exteriorizarse
por la precipitación del inmunocomplejo, si éste llega a tener tamaño suficiente. Es
decir, las reacciones de precipitación se basan en la llamada teoría de la red, donde la
interacción de un antígeno soluble multivalente con anticuerpos bivalentes forman una
red en la que las moléculas de anticuerpo fijan 2 moléculas de antígeno que a su vez
se fijan por otro determinante a otra molécula de anticuerpo y así sucesivamente,
formando agregados que se hacen insolubles y precipitan espontáneamente.

Principio: Evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo con la aparición de un

precipitado cuando se combinan en proporciones iguales o próximas al punto de
equivalencia.
Las reacciones de precipitación se ponen de manifiesto cuando los dos elementos de la
reacción están presentes en una cierta porción, inhibiéndose por un exceso de
anticuerpo o, más frecuentemente, por un exceso de antígeno, a esto se le denomina
FENÓMENO DE ZONA y se produce en la mayoría de las reacciones inmunológicas
de las siguientes formas:
1. En la inhibición de la reacción por EXCESO DE ANTÍGENO, uno solo de los
determinantes antigénicos está combinado con el anticuerpo estando los dos sitios
del anticuerpo saturado; en estas condiciones, la disposición en retículo del
inmunocomplejo es imposible.
2. La inhibición por EXCESO DE ANTICUERPO puede ser el resultado de mecanismo
inverso.
3. Cuando la concentración de ambos es la adecuada, en función de la valencia del
antígeno, todos los sitios del antígeno y anticuerpo están utilizados y el retículo
alcanza sus dimensiones máximas y la reacción visible adquiere su máxima
intensidad.

Por eso, al añadir cantidades crecientes de antígeno a una cantidad fija de anticuerpo
se obtiene una curva similar a una campana de Gauss con la que se observa este
fenómeno de zona y explica que, en los tubos de máxima precipitación no se observan
ni antígeno ni anticuerpos libres (zona de equivalencia) mientras que en las otras se
observa uno de estos dos elementos libres.
CARACTERÍSTICAS DE LAS REACCIONES DE PRECIPITACIÓN
1. El antígeno es soluble y multivalente.
2. Los anticuerpos que participan en estas reacciones son clasificados como
precipitininas y son bivalentes.
3. Son menos sensibles que las reacciones de aglutinación, pero similares a ellas
en el resto de propiedades
La precipitación puede realizarse en medio líquido y sólido:

Precipitación en medio líquido:

Estas reacciones deben visualizarse con ayuda de una lupa o microcopio óptico con
pequeño aumento. Las más utilizadas son las que tienen por afinidad poner de
manifiesto la presencia de reaginas o anticuerpos inespecíficos de la sífilis, VDRL.
Precipitación en medio sólido:
La utilización de medios sólidos, como el agar, evita el fenómeno de zona ya que los
componentes difunden en distinta proporción, formándose la línea de precipitación en
aquella zona donde se encuentran ambos componentes en proporciones óptimas.
Dentro de estos métodos tenemos los siguientes:
1. MÉTODO DE DOBLE DIFUSIÓN EN GEL DE OUCHTERLONY.
Principio: Evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo mediante la aparición de una
línea de precipitación después haberse unido los dos reactantes que difundieron por el
agar y precipitar el inmunocomplejo formado en la zona de equivalencia.
El antígeno y el anticuerpo se depositan en pocillos cortados en el agar, difunden el
uno hacia el otro y forman una línea de precipitación al cabo de varias horas o días, en
la zona donde se encuentran en proporciones óptimas, formando complejos
inmunitarios estables que pueden ser analizados visualmente.
El número de líneas de precipitación indica el número mínimo de los distintos antígenos
presentes en la solución de antígeno.

Aplicaciones.
Para la detección de:
1. Antígenos de la hepatitis y herpes como el virus de la varicela- zoster.
2. Anticuerpos frente a Brucella, Bacteroides fragilis, Candida albicans y Hepatitis B.

2. INMUNODIFUSION RADIAL SIMPLE DE MANCINI.

Principio: Evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo mediante la aparición de un
anillo de precipitación después de haber difundido por el gel uno de los dos reactantes,
haberse unido con el que está mezclado en el agar y precipitar el inmunocomplejo
formado en la zona de equivalencia.
El método de precitación en gel es mucho más sensible mezclando el antisuero con el
agar y permitiendo que difunda el antígeno en la mezcla. El antígeno difundirá
radialmente, disminuyendo su concentración hasta alcanzar las proporciones óptimas
con el antisuero y formar un anillo o halo de precipitación cuyo diámetro será
proporcional a la concentración del antígeno, por lo que se mide para conocer la
cantidad del elemento buscado.
Los puntos críticos de esta técnica son:
1. La uniformidad y profundidad del agar.
2. El corte de los pocillos en fresco para evitar distorsiones.
3. Las condiciones de llenado de los pocillos.
Sensibilidad: Tanto esta técnica como la inmunoelectroforesis detectan
concentraciones de antígenos o anticuerpos de 20 microgramo/ mililitros.
Se emplea para la cuantificación de:
 Antígenos, ya que el diámetro del anillo está en proporción directa a la
concentración del antígeno utilizado.
 Las concentraciones de proteínas, por ejemplo, es un método cuantitativo que
permite conocer cómo se encuentran las concentraciones de las inmunoglobulinas
del paciente: IgG, IgM e IgA, si un antisuero monoespecífico dirigido sólo a los
determinantes Fc o de la cadena H de la molécula de Inmunoglobulina, se
incorpora en el agar.
Observación: Por este método no se puede cuantificar IgE ni IgD porque estas
inmunoglobulinas se encuentran en concentraciones tan pequeñas que no son
detectadas por este método debido a su baja sensibilidad.
Limitación.
Utiliza antígenos de potencia conocida pues es un método de baja sensibilidad.

3. INMUNOELECTROFORESIS.
Principio: Evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo mediante la aparición de una
línea de precipitación después de haber separado los antígenos según su carga
eléctrica y haber difundido ambos reactantes.
Como algunas mezclas de antígenos son demasiados complejas para ser analizadas
mediante difusión y precipitación simples, fue necesario desarrollar los métodos de
inmunoelectroforesis que combinan la separación mediante electroforesis con una
reacción de precipitación por doble difusión en gel.
Estas técnicas en gel sólo permiten analizar los antígenos y los anticuerpos de forma
cualitativa.
Es muy útil para la detección e identificación de mezclas en antígenos o anticuerpos
demasiados complejos para que puedan ser resueltos por la técnica de Ouchterlony.
Los componentes del suero se separan mediante electroforesis en agar en una serie de
bandas o manchas. Paralelamente a la línea de difusión se realiza un corte en el agar y
se rellena de antisuero frente a uno o varios componentes del suero. Los anticuerpos
difunden perpendicularmente desde el corte realizado y las diversas proteínas lo hacen
radialmente a partir de los puntos en que fueron dejadas por la electroforesis.
Sensibilidad: Tanto esta técnica como la inmunodifusión radial detectan
concentraciones de antígenos o anticuerpos de 20 microgramo/ mililitros.
Los resultados de la electroforesis deben ser combinados la inmunoelectroforesis para
poder observar la clase de inmunoglobulina ausente o identificar la paraproteína.
Utilidad: Para realizar el estudio de los anticuerpos ya que al utilizar un antisuero
antitotal (contra todas las proteínas de la muestra) o un anti-IgG o anti-IgM o anti-IgA,
permite conocer cómo se encuentran estas 3 clases de inmunoglobulinas: es
decir, si están todas, si falta alguna o todas o si existen inmunoglobulinas
anormales, por lo que permite diagnosticar pacientes con:
 Inmunodeficiencia humoral: agammaglobulinemia o hipogammaglobulinemia.
 Paraproteínemias por ejemplo: la hipergammaglobulinemia monoclonal (Mieloma
Múltiple y la Macroglobulinemia de Waldenstróm) o policlonal.
 Cadenas ligeras en la orina en las discrasias de células plasmáticas o trastornos
autoinmunitarios, identificar la proteína de Bence Jones en el Mieloma.
 Cantidades elevadas de proteínas en el LCR en diversas enfermedades
neurológicas.

4. CONTRAINMUNOELECTROFORESIS (CIE)
Principio: Es la electroforesis del antígeno y del anticuerpo en agar o agarosa a partir
de pozos separados y en direcciones opuestas con la precipitación resultante en un
punto intermedio a sus orígenes. La aparición de la línea de precipitación evidencia el
encuentro del antígeno con su anticuerpo específico y depende de la concentración de
cada uno de ellos.
Por ejemplo, cuando la línea de precipitación aparece en el medio existe la misma
concentración de los dos reactantes, cuando aparece más cerca del antígeno existe
mayor cantidad de anticuerpo y cuando aparece más cerca del anticuerpo habrá una
mayor concentración de antígeno. Por tanto si se conoce la concentración de uno de
los dos reactantes se tendría cierta idea de la concentración del otro reactante.
La contrainmunoelectroforesis es la aplicación combinada de la electroforesis y la
inmunoprecipitación a una muestra química (por ejemplo, LCR, suero, orina.) para la
detección de antígenos o anticuerpos, es decir, si se aplica una diferencia de potencial
(corriente) a través de un gel de tal forma que los antígenos y los anticuerpos se
desplacen simultáneamente, la técnica de inmunodifusión se convierte en una
contrainmunoelectroforesis
VENTAJAS de la contrainmunoelectroforesis sobre la inmunodifusión doble.
1.Mayor rapidez.
2.Mayor sensibilidad, permite detectar concentraciones de antígeno o anticuerpo
comprendidas entre 20 microgramos por mililitro y 2 mg por mililitro.
3.Cuantifica los componentes de la reacción.
Utilidad de la contrainmunoelectroforesis.
Para la detección de antígenos en diversas muestras clínicas, como por ejemplo:
1.-Antígenos virales.
 AgS de la Hepatitis B (HBsAg) en suero, lágrimas, saliva, orina, LCR.
 Rotavirus en heces fecales.
2.-Antígenos bacterianos.
 Estreptococos pneumoniae en esputo, suero, orina, LCR y líquidos pleural, peritoneal
y articular.
 Neisseria meningitidis A, B, C, D, X, Y, Z, W135, 29E en LCR, suero y líquido
articular.
 Haemophillus influenzae tipo B en suero, orina, líquido pericárdico, LCR.
 Pseudomona aeruginosa en suero.
 Escherichia coli K-1 en LCR y suero.
 Estafilococo aureus (ácido teicoico) en LCR, líquido pericárdico, suero.
 Estreptococos del grupo B en LCR y peritoneal.
 Estreptococo del grupo D en orina.
3.-Protozoos
 Toxoplasma gondii y Pneumocystis carinii en suero.
 Entamoeba hystolítica en pus.

4.-Hongo.
 Cryptococo neoformans en LCR, líquidos orgánicos.
PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS contra:
Virus: Hepatitis B, Influenza A, Citomegalovirus.
Bacterias: Estafilococos aureus, Mycoplasma pneumoniae, Serratia marcescens,
Brucella mellitensis, Rickettsia quintana.
Hongos: Candida sp, Histoplasma capsulatum, Aspergillus fumigates.
Protozoos: Entamoeba histolytica, Trypanosoma cruzii, Leishmania tropica,
Trichinella spiralis.

REACIONES DE AGLUTINACIÓN.
Principio: Evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo a través de la aparición de un
aglutinado.
CARACTERÍSTICAS DE LAS REACCIONES DE AGLUTINACIÓN
1. En el tamaño del antígeno que es particulado.
2. Los anticuerpos que participan en estas reacciones son clasificados como
aglutininas. Las inmunoglobulinas que más eficientes aglutinan son las IgM.
3. La formación de inmunocomplejos es visible a simple vista.
4. Son mucho más sensibles que las reacciones de precipitación, pero similares a
ellas en el resto de propiedades.
VENTAJAS DE LAS REACCIONES DE AGLUTINACIÓN
1. Son técnicas simples, rápidas de realizar y fáciles de interpretar.
2. Tienen buena sensibilidad y especificidad.
3. No necesitan equipos sofisticados.
Utilidad: Para detectar anticuerpos frente antígenos de la superficie bacteriana
(antígeno O y H de Salmonella typhi) y parásitos (Toxoplasma)
Aglutinación sobre partículas: Debido a las ventajas que la aglutinación
presenta sobre la precipitación se ha intentado convertir antígenos solubles en
particulados para poder aumentar las posibilidades diagnósticas de este tipo de
reacciones.
Se han utilizado diversos tipos de partículas portadoras, como hematíes, látex,
partículas pigmentadas, carbón, gelatina, etc, dando lugar a diversas reacciones como
la hemoaglutinación y la aglutinación con látex.

HEMAGLUTINACIÓN
Principio: Evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo a través de la aparición de un
aglutinado que se ve mejor por la utilización de hematíes. Está basada en la capacidad
de los anticuerpos para entrelazar los eritrocitos mediante su unión a antígenos
presentes en su superficie.
VENTAJAS FUNDAMENTALES DE LA HEMAGLUTINACIÓN
1. No necesita antígenos obtenido totalmente puro.
2. Es una prueba sensible, permite detectar y cuantificar anticuerpos a
concentraciones de 1 microgramo por mililitro o menos, más bajas que las que
son necesarias para las técnicas de contrainmunoelectroforesis y electroforesis
en cohetes.

DESVENTAJAS O INCONVENIENTES DE LA HEMAGLUTINACIÓN

1. El antígeno se fija de forma poco homogénea a la superficie del hematíe.
2. La vida media de los hematíes es corta (3- 21 días).
3. Los hematíes son productos biológicos que hay que obtener, utilizar y conservar
con mucho cuidado pues se destruyen con facilidad.
Estos inconvenientes se han obviado estabilizando los hematíes con ácido tánico,
glutaraldehido o formalina. Así se consigue mantener la integridad de la membrana,
para preservarlos de la lisis y aumentar las características de absorción de la
superficie.
La técnica puede realizarse como aglutinación en portaobjetos o en microplacas. En el
primer caso se observa en pocos minutos y el segundo en unas horas (2-3).
Utilidad: Para detectar Anticuerpos frente al Treponema pallidum, Toxoplasma
gondii, Virus de la Rubéola, Fasciola hepática, etc.
Puede dar reacciones cruzadas y falsos positivos con Anticuerpos heterófilos.
AGLUTINACIÓN CON LÁTEX.
Principio: Evidenciar la reacción antígeno-anticuerpo a través de la aparición de un
aglutinado que se ve mejor por la utilización de las partículas de látex.
La prueba se basa en el hecho de que las partículas de látex recubiertas de un Ag,
adquieren las propiedades de éste y forman coloides lipofílicos. Las partículas que
permanecen en suspensión, se aglutinan al mezclarse con suero homólogo.
Las soluciones de partículas sensibilizadas pueden ser estables hasta 6 meses a 4 oC y
la reacción se realiza en portaobjetos.

VENTAJAS DE LA AGLUTINACIÓN CON LÁTEX SOBRE LA HEMAGLUTINACIÓN

1. El tamaño y la forma de las partículas es constante.
2. Las partículas de látex son biológicamente inactivas.
3. La estabilidad de la unión látex-antígeno es total.
4. La sensibilidad de la reacción está relacionada con el tamaño y densidad de la
partícula.
5. La claridad y reproducibilidad depende del color o visibilidad de los agregados.
6. La estabilidad del complejo partícula-molécula se aumenta por aumento de los
puntos de unión de la superficie del látex (unos 50.000).

UTILIDAD DE LA AGLUTINACIÓN CON LÁTEX:

Para la detección de Ag en suero o LCR, como ejemplos se citan los siguientes:
1. Se ha usado en LCR para el diagnóstico de la meningitis producida por
Neisseria meningitidis (grupos A y C), neumococos, Haemophillus influenzae y
Criptococo neoformans.
2. Para la realización de la prueba de la coagulasa en la identificación de
Estafilococo aureus.
3. En la clasificación serológica de los Estreptococos.
Como modalidad de esta técnica se ha descrito un método de unión de Antígeno a
estas partículas de látex basándose en la afinidad de la avidita por la biotina. Se une la
primera a la partícula de látex y la biotina al Antígeno, dejando que reaccionen. Se ha
utilizado para detectar Anticuerpo frente a citomegalovirus, virus del Sarampión y los
herpes virus.
Se ha desarrollado otro látex para detectar Anticuerpo contra VIH. Se utiliza como
Antígeno, partículas de Látex recubiertas con un Antígeno de la envoltura viral 8CBre
3) obtenido por recombinación en Escherichia coli. La sensibilidad de esta prueba es
comparable con el Western Blot.
REACCIONES DE INHIBICIÓN DE UNA ACTIVIDAD BIOLÓGICA.
Todas ellas están basadas en que al añadir un anticuerpo a un sistema, el antígeno se
une a él y no es capaz de expresar alguna de sus propiedades biológicas (aglutinar
hematíes, lisar células, multiplicarse). Un ejemplo de ellas es:
REACCIÓN DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN.
Se basa en la propiedad biológica de determinados virus de aglutinar eritrocitos de
diferentes especies, mediante una reacción enzimática de grupos bioquímicos de la
superficie vírica con receptores glucoproteicos de los hematíes, produciéndose la
hemaglutinación, que se inhibe por la presencia de anticuerpos específicos.
Se utiliza para el diagnóstico del Sarampión, Rubéola, Gripe, etc.

Sistemas no precipitantes
La presencia de antígenos hapténicos monovalentes impide la formación de
inmunocomplejos. Por otro lado hay anticuerpos que no precipitan después de
combinarse con su antígeno, se denominan anticuerpos incompletos o bloqueantes. La
existencia de uno y otro puede ser puesta en evidencia mediante la reacción de
Coombs.
Se conoce que los anticuerpos contra el antígeno d son de la clase IgG, anticuerpos
que atraviesan con facilidad la barrera placentaria.
Prueba de Coombs
Los antígenos d (Rh) están en la superficie de los eritrocitos, los anticuerpos para el
antígeno d son no aglutinantes o subaglutinantes, por lo que no forman la malla
necesaria para producir la aglutinación, por lo tanto, para producir una marcada
aglutinación se debe de agregar un anticuerpo anti inmunoglobulina humana
Prueba de Coombs Directa
Identifica gammaglobulinas que se han adherido a los eritrocitos provenientes de un
paciente sensibilizado al producirse la aglutinación al agregar un anticuerpo anti
inmunoglobulina humana.
Muestra: eritrocitos provenientes de un paciente.
Interpretación: Al ser la muestra positiva los eritrocitos del paciente están recubiertos
con IgG anti d.
Prueba de Coombs Indirecta
Es una reacción en 2 etapas que permite identificar anticuerpos incompletos en el
suero de algún paciente (por ejemplo, anticuerpos contra el antígeno d). El suero se
incuba primero con los eritrocitos de prueba y luego los eritrocitos recubiertos por el
supuesto anticuerpo son aglutinados por un anticuerpo anti inmunoglobulina humana o
suero antiglobulínico de Coombs.
Muestra: suero de la paciente.
Interpretación: En el suero de esta paciente existe IgG anti d.
Aplicaciones de la prueba de Coombs: Tipificación de los eritrocitos en los bancos
de sangre, en la evaluación de la Enfermedad Hemolítica del recién nacido y el
diagnóstico de la anemia hemolítica autoinmunitaria.

REACCIÓN DE FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO

Principio: Esta técnica se basa en la capacidad de determinados complejos inmunes
(Antígeno-Anticuerpo) de fijar o unir el complemento por la vía clásica, fenómeno que
puede ser aprovechado para cuantificar la cantidad de antígeno o anticuerpo presente.
Utilizando una cantidad conocida de complemento y después del primer paso de la
reacción, donde ocurre la unión del antígeno al anticuerpo, se utiliza un segundo
sistema indicador de la presencia o ausencia de complemento libre de la reacción.
Este sistema indicador está constituido por hematíes de carnero y hemolisina (su
Anticuerpo específico).
Es positivo cuando hay ausencia de hemólisis, esto indica la fijación del complemento
por el primer sistema, es decir, por el inmunocomplejo.
Es negativo cuando hay hemólisis ya que al no producirse el inmunocomplejo por no
existir el elemento buscado (Anticuerpo o Antígeno), el complemento se fija a la
hemolisina unida a los hematíes, lisándolos.
La Ig que más eficientemente fija el complemento es la IgM aunque cantidades
elevadas de IgG2 e IgG3 también son capaces de fijarlo.
Sensibilidad: Detecta Anticuerpos a concentraciones inferiores a 1 microgramo por
mililitro.
Utilidad: En el diagnóstico de infecciones por:
 Virus como: Citomegalovirus, Herpes simplex, Varicela, Influenza, Parainfluenza,
Sincitial respiratorio, virus de la coriomeningitis linfocitaria.
 También se ha empleado en la Enfermedad de Chagas, y esquistosomiasis aguda,
Fiebre Q, Micoplasma pneumoniae, Clamidias, etc.

REACCIÓN DE NEUTRALIZACIÓN VÍRICA.

Se basa en la capacidad del Ac de neutralizar específicamente la infectividad de un
virus que no producirá así el efecto citopático característico. Se realiza normalmente en
cultivos celulares y embrión de pollo.
Se emplea para la identificación de virus aislados del paciente así como para detectar
la respuesta de Anticuerpo frente a Polio, Coxsackie y Echo.
REACCIÓN DE INMOVILIZACIÓN
Se basa en la capacidad que poseen ciertos Ac de inmovilizar bacterias móviles.
La prueba de inmovilización de Treponema pallidum ha resultado especialmente útil en
el diagnóstico de la Sífilis por su gran especificidad.
 PRUEBAS CUTÁNEAS
Como su nombre lo dice son aquellas pruebas que se realizan en la zona de la piel no
expuesta a roce (ejemplo: cara interna del antebrazo o en la parte superior de la
espalda) para descubrir la hipersensibilidad que tiene el paciente estudiado a distintos
alergenos.
No en todos los pacientes las pruebas cutáneas son de valor pues sus resultados van a
depender del tipo de piel que posean, por eso es importante clasificar la piel de los
pacientes que se van a realizar estas pruebas, para ello se utilizan 2 controles que son
los siguientes:
 Control positivo: Histamina sustancia que aumenta la permeabilidad vascular
considerada como una amina vasoactiva. Los pacientes con piel reactiva
responden a esta sustancia.
 Control negativo: Buffer sustancia inerte donde se disuelven los extractos
alergénicos que se van a utilizar en estas pruebas.

CLASIFICACIÓN DE LA PIEL SEGÚN LOS CONTROLES POSITIVO Y NEGATIVO

NORMORREACTIVA: No responde al control negativo (buffer) y sí al control positivo
(histamina). Es la única piel donde los resultados de las pruebas cutáneas son de valor.
HIPERREACTIVA: Responde al Buffer (control negativo) y exageradamente a la
histamina (control positivo).
HIPORREACTIVA: No responde a ninguno de los 2 controles.

PRUEBAS CUTÁNEAS INMEDIATAS

Son aquellas cuya reacción máxima se observa a los 30 minutos. Es la reacción
inmediata de hinchazón y eritema, en la que el alergeno introducido en la piel induce la
liberación de los mediadores almacenados; estos mediadores provocan un aumento de
la permeabilidad vascular, edema local y prurito.
El hecho de que los pacientes con diversas enfermedades atópicas muestren la
reacción clásica de hinchazón y eritema después de las pruebas cutáneas demuestra
que existe IgE unida a los mastocitos de la piel, aunque sus síntomas sean nasales y
bronquiales.
Ejemplos de Extractos alergénicos utilizados en estas pruebas
1. Antígenos inhalantes como polvo, ácaros, polen, pelos y caspas de animales,
hongos ambientales.
2. Antígenos ingestantes como leche de vaca, huevo, frijoles, pescados, mariscos.
3. Antígenos contactantes como la lana.
Se leen a los 30 minutos.
Se toma como positivo el habón o la induración que aparece en la piel, esto se mide y
se informa por cruces, mientras más grande sea más cruces se informará.

Interpretación: Identifica en el paciente los alergenos que causan una

hipersensibilidad tipo 1 mediada por la IgE.
Permite la aplicación en el paciente de vacunas de desensibilización y su educación
para disminuir sus síntomas al enseñarlo a realizar medidas de control ambiental que
eviten o disminuyan la exposición a estos alergenos.

PRUEBAS CUTÁNEAS RETARDADAS

Son aquellas cuya reacción aparece a las 24, 48 y 72 horas de haberse expuesto el
paciente al alergeno, denotando la hipersensibilidad tipo IV o retardada que posee ante
este.
Ejemplos de Extractos alergénicos utilizados en estas pruebas
1. Candidina: Alergeno extraído de Candida albicans.
2. Histoplasmina: Alergeno extraído de Histoplasma capsulatum.
3. Trichophitina: Alergeno extraído de Trichophyton, un Dermatofito.
4. Toxoplasmina: Alergeno extraído de Toxoplasma gondii.
5. Tuberculina: Alergeno extraído de Micobacterium tuberculosis.
6. Lepromina: Alergeno extraído de Micobacterium leprae

Se leen a los 30 minutos, a las 24, 48 y 72 horas.

Interpretación: A los 30 minutos se conoce si el paciente ha estado expuesto o no con
anterioridad, el resto de las medidas evidencia la existencia de una subpoblación de
linfocitos TCD4 de la hipersensibilidad retardada sensibilizada para ese alergeno,
células responsables de la activación del macrófago para que pueda destruir a estos
patógenos intracelulares.

Reacción en Cadena de la Polimerasa.

(PCR)
Proporciona un medio eficaz para obtener millones de copias de una secuencia corta
de DNA.
Los ciclos de calentamiento y enfriamiento se emplean para desnaturalizar el DNA y
producir nuevas copias de una secuencia específica unida a un cebador. Debido a la
velocidad y a su fácil manejo, esta técnica se utiliza actualmente de forma extensa para
valorar la variabilidad genética, diagnosticar la enfermedad genética y en medicina
legal.
Pasos básicos del proceso de RCP.
1. Desnaturalización del DNA a temperatura elevada.
2. Hibridación de los cebadores a bajas temperaturas.
3. Extensión de los cebadores a una temperatura intermedia.
Resultado de este proceso: Una secuencia definida de DNA.

VENTAJAS DE LA PCR.
1. Se pueden emplear cantidades de DNA muy pequeñas (nanogramos o
picogramos en contraposición con los microgramos que requiere la clonación). Por
ejemplo, la cantidad de DNA existente en extensiones de sangre realizadas varios
años antes e incluso un simple cabello o el envés de un sello lamido, suele ser
suficiente para el análisis.
2. El proceso es mucho más rápido que las técnicas más antiguas al no requerirse
clonación genética. Por ejemplo, procesos que se hacían en una semana o más
ahora con esta técnica se realizan en un solo día.
3. Produce grandes cantidades de DNA muy puro.
4. No es necesario utilizar sondas radioactivas para detectar secuencias específicas
de DNA o mutaciones, utilizándose sustancias más seguras como la biotina, para
marcar de forma no radioactiva.
DESVENTAJAS DE LA PCR
1. La síntesis de los cebadores requiere el conocimiento de la secuencia del DNA que
flaquea el DNA de interés, por tanto cuando no se dispone de esta información, hay
que utilizar otras técnicas.
2. La extrema sensibilidad de la RCP hace que sea susceptible a la contaminación en
el laboratorio, hay que tomar precauciones para que no ocurra esto.
3. Es difícil aplicar PCR a secuencias mayores de 1 o unas pocas kilobases. No puede
utilizarse para detectar delecciones mayores (es difícil o imposible amplificar las
secuencias normales que sean más largas).

Amplificación del DNA (PCR)

En los últimos años se ha desarrollado una nueva y revolucionaria tecnología que
facilita los estudios moleculares en el laboratorio y que abre nuevas perspectivas a la
investigación y al diagnóstico médico. Esta nueva tecnología se basa en la
amplificación de secuencias específicas del DNA. La tecnología que permite tal
amplificación se conoce como reacción en cadena de la polimerasa (PCR, del inglés,
polymerase chain reaction).
La PCR constituye un sencillo método para la clonación in vitro de cualquier segmento
de DNA, sin necesidad de recurrir a la metodología convencional.
La PCR permite disponer, de forma rápida y eficaz, de cantidades suficientes de una
secuencia de DNA determinada para su posterior estudio molecular.
La aplicación de la PCR a distintas áreas de la medicina y la biología ha crecido
considerablemente en los últimos años, simplificando y magnificando las posibilidades
diagnósticas de la tecnología del DNA recombinante.
La nueva tecnología permite el diagnóstico preciso de los trastornos genéticos
hereditarios o adquiridos y facilita la investigación sobre los defectos moleculares
todavía no definidos.
La aplicación de la PCR en la medicina forense y legal supone, sin duda, entrar en una
nueva era para esta disciplina. Finalmente, la PCR permite la detección de una amplia
variedad de patógenos responsables de enfermedades infecciosas.
La revolución que la PCR ha supuesto en el campo de la investigación genética y
molecular es comparable a la producida por el descubrimiento de las enzimas de
restricción, de los polimorfismos del DNA u otros mecanismos íntimos del funcionalismo
celular. El descubrimiento de la PCR le valió a MULLIS el premio Nobel de Química en
1993.
Principio de la PCR
El método de la PCR se basa en la utilización de secuencias cortas de nucleótidos
sintéticos (oligonucleótidos) o primers, que hibridan de forma específica con las dos
hebras complementarias de DNA, las cuales flanquean la región de interés. La
amplificación se consigue al realizar una serie de ciclos repetitivos que consisten en la
desnaturalización del DNA molde o templado, la hibridación de los primers con el
templado y la síntesis del DNA complementario mediante la acción de la enzima DNA-
polimerasa. Si se realizan 20-30 ciclos del proceso de PCR señalado anteriormente, se
pueden obtener varios millones de copias de la secuencia de interés, flanqueada por
los primers utilizados en la amplificación (fig. 9.21).
La reacción típica de PCR consta del DNA muestra, las secuencias cebadoras o
primers, el tampón de reacción, los desoxinucleótidos trifosfatos y la enzima DNA-
polimerasa del DNA. El DNA muestra puede consistir en 100 ng de DNA genómico, lo
cual puede suponer hasta 100.000 copias del DNA molde que se desea amplificar, o
incluso una única célula, en la que existen sólo 5 pg de DNA (sólo una o dos copias del
DNA templado).
Esquema del principio de la PCR. (página 1197). El DNA se somete a varios ciclos de
desnaturalización, hibridación y elongación, en presencia de nucleótidos libres, primers
y la enzima Taq DNA-polimerasa.
De los varios tipos de enzimas DNA-polimerasa existentes, las más utilizadas son las
procedentes de E. coli, concretamente el fragmento largo de la DNA-polimerasa I
(kleenow).
Sin embargo, la actividad de esta enzima desciende considerablemente por encima de
los 37 0C, y la exposición a altas temperaturas de desnaturalización necesarias para
separar las dos cadenas de DNA inactiva la enzima tras cada ciclo de amplificación.
La DNA-polimerasa del microrganismo Thermus aquaticus (Taq DNA-polimerasa)
permite la síntesis del DNA a temperaturas por encima de los 70 0C y resiste
perfectamente los 94-95 0C necesarios para separar las dos hebras de DNA. Con la
polimerasa Taq se consigue una mayor especificidad en la reacción, además de
permitir la automatización del proceso. La polimerasa Taq es la que se utiliza en la
actualidad en la mayoría de los experimentos de amplificación de DNA.
La reacción de amplificación puede realizarse mediante un aparato automático
programado para conseguir las temperaturas y los ciclos deseados. Un ciclo típico
consiste en la desnaturalización a 94 0C durante 20 seg, la hibridación de los primers
con el DNA molde a 50-60 0C durante 20 seg y la síntesis a 72 0C durante 30 seg. Los
aparatos que existen en el mercado permiten el proceso de amplificación en menos de
3 h.
Una de las extraordinarias particularidades y ventajas de la PCR, de especial
importancia en su aplicación diagnóstica, es que permite la amplificación de cualquier
secuencia de DNA, a pesar de que éste se encuentre degradado. Sin embargo, uno de
los principales problemas de la PCR es la posibilidad de contaminación con material
genético extraño.
Esto reviste especial importancia cuando se realiza amplificación de escaso material
genético, como puede ser una sola célula (ovocito o esperma) o un pelo, y tiene una
relevancia mayor cuando se trata de detectar secuencias como, por ejemplo, las del
virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) adquirida. La rigurosidad en los diversos
procedimientos del laboratorio consigue disminuir la posibilidad de contaminación en la
PCR.
Los productos obtenidos en la amplificación pueden analizarse mediante una amplia
variedad de técnicas, que incluyen la hibridación mediante dot-blot, la simple
visualización
del producto en geles de agarosa o poliacrilamida, el análisis de restricción o la
secuenciación directa del DNA. En el método de dot-blot se deposita en un filtro de
nilón una parte del producto de la amplificación, que queda fijado mediante irradiación
UV o por calor. El filtro se hibrida con el oligonucleótido específico de secuencia (SSO)
o específico de alelo (ASO), marcado radiactivamente o con biotina. Luego los filtros se
lavan a la temperatura óptima, exponiéndolos a una película de rayos X (en el caso del
marcado radiactivo) u obteniendo la conversión colorimétrica (en el caso del marcado
enzimático). También es posible realizar un dot-blot inverso, en el que son los
oligonucleótidos los que se depositan en el filtro y el DNA amplificado el que, marcado
radiactiva o enzimáticamente, actúa como sonda.
 Aplicaciones de la PCR
La PCR ha simplificado y magnificado las posibilidades diagnósticas del DNA en
medicina.

PCR en el diagnóstico de procesos infecciosos

En el campo de la microbiología la PCR ha aportado considerables avances, al permitir:
1. La detección rápida y específica de todo tipo de patógenos: virus, bacterias y
hongos.
2. Amplificar una secuencia de DNA de interés en cuestión de pocas horas, y
ocupará un papel fundamental en el diagnóstico, frente a los métodos clásicos
de cultivo, los cuales requieren días e incluso semanas, especialmente para
procesos en los que el cultivo es muy difícil o imposible.
3. Realizar el análisis a partir de escaso material genético, como el obtenido en una
biopsia, un lavado o una punción aspirativa.
Los anticuerpos monoclonales o policlonales se utilizan para la detección de gran
variedad de procesos infecciosos. Estos anticuerpos pueden reaccionar con otros
patógenos distintos y, por consiguiente, impedir el diagnóstico fiable o precisar una
amplia batería de anticuerpos para establecer el diagnóstico específico. Por otra parte,
los métodos inmunológicos no permiten detectar el proceso infectivo en el momento en
el que éste se produce, sino varias semanas después.
Por último, ciertos agentes infecciosos comprometen seriamente el sistema inmunitario,
o éste se encuentra ya muy afectado, como en el caso de las inmunodeficiencias
congénitas y adquiridas (como el SIDA), de los pacientes sometidos a tratamiento
antineoplásico o afectos de procesos cancerosos. En estas situaciones, la detección
serológica de los procesos infectivos es muy difícil.
Existen varios retrovirus humanos que han sido caracterizados, entre ellos los virus
HIV-1 y HIV-2, responsables del SIDA. Los cultivos del virus en individuos seropositivos
y en aquellos que padecen la infección tienen una amplia variedad y son altamente
laboriosos, largos y costosos.
4. La PCR se ha aplicado con éxito en la detección de individuos infectados por los
virus
HIV-1 y HIV-2, permitiendo el diagnóstico antes del desarrollo de anticuerpos.
a) El método permite establecer un diagnóstico preciso en aquellos casos en los que
los estudios inmunológicos son dudosos, así como demostrar la infección en individuos
seropositivos para los que los métodos de detección directa del virus son negativos.
b) El método ha mostrado gran utilidad para el análisis en recién nacidos, para análisis
pretransfusional y para determinar el tipo de virus presente en el individuo.
Uno de los principales problemas con los virus HIV-1 y 2 es la gran heterogeneidad
molecular de ciertas regiones del genoma de estos virus, por lo que es preciso emplear
secuencias que se encuentran altamente conservadas.
Los virus HTLV-I y II son retrovirus que infectan los linfocitos. El virus HTLV-I se asocia
a un tipo de leucemia muy grave, que se conoce como leucemia de células T del
adulto, así como a una mielopatía crónica progresiva. En muchos países, el análisis
serológico para el HTLV-I es obligatorio para los bancos de sangre.
c) La PCR es de gran utilidad clínica al permitir identificar a los individuos infectados
antes de que se produzca la seroconversión, confirmando además la presencia del
virus para los casos detectados mediante métodos serológicos.
d) Como el virus HTLV-II se encuentra de forma epidérmica en drogadictos; la
detección de este virus mediante PCR permitirá establecer su relación con procesos
específicos todavía no claros.

5. La PCR ha aumentado considerablemente la sensibilidad (más de 10.000 veces)

de la detección del virus de las hepatitis B y C, permitiendo detectar el virus en
pacientes seronegativos.

6. La infección por citomegalovirus (CMV) es de especial importancia para los

recién nacidos, al ser responsable de retraso mental y de sordera congénita no
hereditaria. En los individuos inmunodeprimidos el CMV es un agente patógeno
grave.

La detección temprana de la presencia del virus mediante PCR permite la rápida

instauración de una terapéutica eficaz, la cual no sería posible mediante el cultivo
del virus. Éste puede ser detectado en la orina de recién nacidos, de pacientes
afectos de SIDA y de enfermos sometidos a tratamiento inmunodepresor y
trasplantados, entre otros.

7. Se han identificado varios tipos de papilomavirus humanos que se encuentran

asociados a displasia de cuello uterino y a carcinoma (tipos 16 y 18) o a
condiloma benigno (tipos 6 y 11). La posibilidad de realizar la tipificación de
estos virus en las muestras genitales permite elucidar el papel que cumplen en
estos procesos, particularmente en el cáncer de cuello uterino. Por otra parte, la
presencia de los tipos de virus asociados con mayor frecuencia a la
transformación maligna permite monitorizar el seguimiento de las pacientes en
las que se demuestre la presencia de estos tipos virales.

PCR y genética.
La nueva tecnología permite el diagnóstico preciso de los trastornos hereditarios,
que
incluyen tanto los procesos en los que el defecto molecular es conocido en detalle,
como aquellos para los que sólo ha sido posible la localización cromosómica del
defecto en cuestión.
En las enfermedades genéticas adquiridas, como el cáncer y los procesos
autoinmunes, la PCR permite detectar con precisión los defectos moleculares que han
sido definidos
y facilita la exploración de su patología básica.
El estudio de la hipervariabilidad en el genoma supone la posibilidad de su empleo en
los estudios de susceptibilidad a ciertas enfermedades y la aplicación a la medicina
forense y legal. En este campo, el poder discriminativo de la nueva tecnología es
altamente superior al obtenido con la metodología clásica.
La detección de patógenos infecciosos y la identificación de variabilidad genética
asociada a enfermedad se han visto también revolucionadas con la utilización de la
tecnología del DNA recombinante.
La PCR en el campo de las enfermedades monogénicas tiene dos aplicaciones
principales:
a) el análisis indirecto de los procesos hereditarios mediante el estudio de
polimorfismos asociados a los genes responsables de los distintos procesos
b) la detección directa de mutaciones, mediante hibridación, digestión con enzimas de
restricción, secuenciación directa del DNA o simple visualización de fragmentos.
Además de la posibilidad de análisis de procesos genéticos, cáncer y susceptibilidad a
enfermedad, la nueva tecnología permite el análisis rápido de patógenos
infecciosos. El análisis de la presencia de estos patógenos y de mutaciones en
oncogenes en material médico de archivo, como bloques de tejidos en parafina, fijados
en formol, permite importantes trabajos retrospectivos.
A partir de escaso material genético, como pueden ser gotas de sangre seca, pelos,
semen, etc., la PCR es también un poderoso método para estudiar muestras de
archivo.
La PCR ha revolucionado la tecnología del DNA recombinante en el campo de la
investigación genética y molecular.
Los métodos de clonación de cDNA y DNA genómico, la manipulación de regiones
promotoras de los genes, la secuenciación del DNA, el análisis de la expresión génica,
la detección de mutaciones, los estudios evolutivos, el marcado radiactivo, la
mutagénesis in vitro, etc., se han visto sustituidos, complementados o altamente
facilitados con la PCR. La aplicación de la nueva tecnología en la investigación ha
permitido importantes contribuciones sobre la variabilidad, la expresión, la
recombinación y la evolución genética.
La PCR se ha aplicado con éxito al estudio de la variabilidad alélica de las subregiones
DP, DQ y DR del HLA. El método del dot-blot reverso permite aplicar cualquier muestra
a un filtro de nilón que contiene todas las variantes posibles de estos loci en forma de
oligonucleótidos. Este método constituye una forma rápida y precisa de analizar los
polimorfismos del HLA de clase II. La PCR permite además trabajar con escasa
muestra biológica, siendo el método más preciso, simple y rápido para realizar
tipificación de HLA, de aplicación para el trasplante de tejidos, la identificación de
individuos y los estudios de susceptibilidad a diversas enfermedades.
Otro ejemplo de la aplicación y ventajas que tiene la PCR es el siguiente, antes de
1987, el diagnóstico prenatal de enfermedades como la anemia de células falciformes,
la betatalasemia y las hemofilias se realizaba mediante tecnología de Southern blotting,
tardándose varias semanas en la obtención de los resultados de este tipo de análisis.
Desde finales de 1987 es posible establecer el diagnóstico de estos procesos en
menos de una semana mediante la amplificación proporcionada por la PCR. Esta
nueva tecnología no sólo ha aumentado la rapidez diagnóstica, sino que ha permitido
un considerable incremento en su fiabilidad.
En enfermedades para las que es conocido el gen, como la anemia de células
falciformes, la betatalasemia, la alfatalasemia, la distrofia muscular de Duchenne, la
hemofilia, el retinoblastoma o la fibrosis quística, es posible utilizar técnicas (SSCP –
single strand conformation polymorphism–, DGGE –denaturant gradient gel
electrophoresis–, heterodúplex, etc.) que permiten detectar las mutaciones
responsables de esa enfermedad (diagnóstico directo). En la mayoría de estas técnicas
se usa la amplificación por PCR.
El análisis de microsatélites se lleva a cabo mediante amplificación con PCR de la
región polimórfica y posterior separación de los fragmentos en un gel de acrilamida

PCR y Afecciones neoplásicas

En los últimos años, las investigaciones sobre las bases moleculares del cáncer se han
dirigido a la identificación de las alteraciones responsables del desarrollo de tumores y
a la caracterización de los genes que controlan el crecimiento y la diferenciación de las
células en la carcinogénesis. Se ha aislado un amplio número de genes relacionados
con el cáncer, los cuales contienen mutaciones específicas que pueden ser
identificadas a partir de material genético del tumor. Los reordenamientos
cromosómicos específicos asociados a ciertas leucemias son marcadores diagnósticos
de gran utilidad, los cuales pueden ser detectados mediante PCR.

PCR y Medicina legal y forense

La posibilidad de detectar polimorfismos del DNA en cualquier muestra biológica ha
constituido una revolución para la medicina legal y forense. El empleo de la PCR ha
mejorado considerablemente la utilización de la variabilidad alélica en los estudios de
identificación, sobre todo con el empleo de minisatélites y microsatélites. La PCR
permite realizar una tipificación a partir de un solo pelo, de una sola célula, un único
esperma o una gota de sangre seca, a pesar de que el material biológico se encuentre
degradado.
Los sistemas de marcadores para análisis mediante PCR, de utilidad en medicina
forense, deben ser altamente polimórficos y tener un elevado nivel de heterocigosidad
genética. La secuencia que se ha de estudiar debe ser amplificable con facilidad; del
mismo modo, la detección de la variación alélica debe ser reproducible. Es necesario
también disponer de las frecuencias genotípicas para estimar el poder de
discriminación de los marcadores. Si los marcadores empleados se heredan de forma
independiente (proceden de distintos cromosomas), las frecuencias derivadas de un
sistema de marcadores pueden multiplicarse por las obtenidas con otros sistemas,
aumentando el poder discriminativo del total del sistema.
Uno de los sistemas mejor desarrollados para el análisis forense mediante PCR es el
DQdel HLA. El segundo exón del gen DQes altamente variable. Una vez
amplificada esta región del DNA, es posible emplear un oligonucleótido específico de
sonda para la detección de cada una de las secuencias variantes o alelos (ASO). Los
genotipos que se obtienen muestran frecuencias que van de 0,005 a 0,15, teniendo un
poder de discriminación del 0,93; es decir, altamente superior al conseguido con los
grupos sanguíneos ABO, que es sólo del 0,60. El locus DPaumenta
considerablemente el poder de discriminación obtenido con el sistema DQ.
Otro sistema altamente polimórfico es el que se encuentra en la región D-loop del DNA
mitocondrial humano. La hipervariabilidad presente en el DNA mitocondrial tiene una
gran ventaja frente al DNA genómico, ya que existen entre 100 y 10.000 copias de una
secuencia determinada de DNA mitocondrial por célula, comparado con una sola copia
de DNA genómico, lo que representa una gran ventaja cuando se dispone de escasa
muestra biológica.
Los marcadores del DNA que detectan regiones hipervariables VNTR y los
microsatélites permiten distinguir a dos individuos entre millones de individuos. Los
microsatélites tienen además la ventaja de que pueden analizarse mediante PCR al
nivel de la secuencia del DNA. Estos marcadores son los de mayor utilidad en estudios
de paternidad.
Cualquier muestra biológica puede ser analizada mediante PCR, sin importar sus
características o su tamaño. De este modo, manchas de esperma, gotas de sangre,
pelos, células epiteliales bucales, muestras de autopsia conservadas en formol, etc.,
pueden ser estudiadas con estos sistemas hipervariables y PCR. El estado de
degradación del DNA en la muestra biológica no representa un gran problema para la
PCR, ya que muchos de los fragmentos que se desea analizar son de alrededor de 100
pb. Mediante esta metodología ha sido posible estudiar muestras de restos humanos
de hace más de 7.000 años.
Uno de los principales problemas en la PCR es la posibilidad de contaminación con muestras
de otros individuos, incluido el que las manipula. En cada estudio deben realizarse controles
positivos y negativos que permitan monitorizar la tecnología y la posibilidad de contaminación.
HIBRIDACIÓN
La hibridación es el proceso por el que dos cadenas únicas de ácido nucleico se
unen para formar una molécula estable de doble cadena (híbrido). Cuanto mayor sea la
complementariedad de las dos cadenas unidas mayor será la estabilidad de la
molécula.
Componentes que intervienen en la reacción de hibridación:
1. La sonda.
2. La muestra patológica.
3. El sistema revelador.
4. El método de hibridación empleado.

Las sondas de ADN son fragmentos de ADN marcados con algún sistema
revelador, que pueden buscar y unirse a cadenas de ADN o ARN que posean
secuencias complementarias, presentes en la muestra.

Ejemplos de sondas usadas en el diagnóstico de las enfermedades

infecciosas.
1. ADN completo celular.
2. ADN o ARN vírico.
3. ARN ribosómico.
4. Genes completos o secuencias que codifiquen una proteína bacteriana.
5. Secuencias altamente redundantes presentes en células eucarióticas.
Elementos de que depende la sensibilidad y la especificidad de la
sonda.
1. Tamaño de la sonda.
2. Condiciones en que se realiza la reacción de hibridación (concentración de sales y
temperatura).
3. Método empleado.
Principio de los métodos de hibridación
Todos los procedimientos de hibridación dependen de las propiedades específicas del
apareamiento de bases de las tiras complementarias de los ácidos nucleicos.
TIPOS DE MÉTODOS DE HIBRIDACIÓN.
1.- HIBRIDACIÓN POR FILTRACIÓN: La muestra se deposita por filtración en un
soporte sólido y el ADN presente es lisado y desnaturalizado. Una variación de este
método es la adhesión de la sonda al fondo de un pocillo de una placa de microtiter o
un en tubo.
2.- HIBRIDACIÓN EN SOLUCIÓN: La sonda y la muestra se encuentran en solución lo
que incrementa la probabilidad de que se encuentren y se unan las cadenas
complementarias y se acorte la velocidad de reacción.
3.- HIBRIDACIÓN IN SITU: La sonda se aplica a cortes tisulares parafinados o tejidos
fijados en formol, donde tendrá lugar la reacción de hibridación. Al mismo tiempo
permite apreciar las alteraciones histológicas del tejido infectado.
4.- HIBRIDACIÓN EN GEL POR EL MÉTODO SOUTHERN: El ADN presente en la
muestra es purificado, fragmentado por endonucleasas de restricción y separados los
fragmentos por electroforesis en gel de agarosa. Posteriormente son transferidos y
fijados a filtros de nylon o nitrocelulosa, en los que se aplicará la sonda.
Los sistemas de detección de los híbridos formados son variados y pueden emplear:
radioisótopos incorporados en la sonda durante su obtención, sistemas enzimáticos
(biotina-avidina), los nucleótidos incorporados a la sonda están marcados con biotina.
Un ejemplo de los explicado anteriormente es la hibridación en colonia o placa es el
método por el que se identifican y purifican clonas determinadas. Las bacterias se
cultivan en colonias sobre una placa de agar y se cubren con un papel de filtro de
nitrocelulosa. Las células de cada colonia se adhieren al filtro y además son fijadas de
manera permanente por medio del calor, el que con un tratamiento con NaOH también
lisa las células y desnaturaliza al DNA de modo que se hibridará con el sondeador.
Un sondeador radiactivo se agrega al filtro y después se lava, el complejo híbrido es
localizado por exposición del filtro a una placa de rayos X. Apareando la mancha en la
autorradiografía con una colonia, esta última puede ser recogida de la placa.
Una estrategia semejante se emplea para identificar fragmentos en colecciones de
fagos. Rondas sucesivas del procedimiento conducen a un aislado clonal (colonia
bacteriana) o a una placa individual de fagos. Las parejas perfectas se hibridizan con
facilidad y se conservan a temperaturas altas en las reacciones de hibridación y lavado.
Los complejos se forman también en presencia de concentraciones salinas bajas.
Limitaciones del uso de las técnicas de hibridación con sondas de ácidos
nucleicos en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas.
1. Tienen gran especificidad, lo que hace que sólo detecten secuencias únicas de los
genomas de los agentes biológicos.
2. Hay que tener una alta sospecha de la presencia del patógeno que se trata de
detectar en la muestra patológica.
3. Se debe poseer una gran batería de sondas.
4. No permite el aislamiento del agente causal.
5. No se pueden realizar pruebas de sensibilidad.
6. No se pueden realizar serotipages con fines epidemiológicos.
7. Gran variabilidad en la rapidez de estas técnicas, por ejemplo, los métodos más
rápidos se realizan entre 60-120 minutos en cambio, la mayoría de los restantes
demoran hasta 28-32 horas.
8. Necesita una preparación especializada del personal.
9. Requiere procesos largos y complicados.
Ejemplos de sondas comerciales utilizadas para el diagnóstico de las
enfermedades infecciosas.
Para bacterias: Mycobacterium tuberculosis, Escherichia coli enterotixigénico y
enteroinvasivo, Haemophilus spp, Neisseria gonorrhoeae, Salmonella typhi, Shigella
ssp, Chlamydia trachomatis, Bacteroides ssp, Campylobacter jejuni, Legionella ssp,
Mycoplasma pneumoniae.
Para virus: Virus de la Hepatitis A y B, Virus Epstein-Barr, Papilomavirus, Herpes
simplex, VIH, Adenovirus, Citomegalovirus, Coronavirus, Parvovirus, Rotavirus, Virus
sincitial respiratorio, Arbovirus.
Para parásitos: Plasmodium falciparum, Leishmania, Trypanosoma cruzi,
Trypanosoma gambiense.
Utilidad de las técnicas de hibridación con sondas de ácidos nucleicos.
Pueden ser muy útiles en la detección agentes microbianos muy difíciles de cultivar,
siendo empleadas como métodos rápidos para el diagnóstico e identificación de
diferentes patógenos en muestras clínicas, como por ejemplos:
1. En la detección de patógenos causantes de diarreas.
2. Detección de patógenos respiratorios.
3. Diagnóstico de enfermedades de transmisión sexual.
4. Diagnóstico de las infecciones víricas del SNC y de las infecciones por Arbovirus.
Usos en Genética:
1. Identificación de familias de genes en las que hay cierto grado de homología.
2. Para hacer comparaciones de un gen dado en especies cruzadas.
VALORACIÓN DE LA RESPUESTA DE ANTICUERPOS.
Las posibilidades de encontrar alterado este parámetro son grandes, siendo las más
frecuentes los defectos o excesos en cualquiera de las 3 clases de inmunoglobulinas
(IgG, IgM, IgA) en ocasiones asociadas a complicaciones por inmunocomplejos o de
otra etiología. En todos estos casos la valoración de las inmunoglobulinas se utiliza
como sistema diagnóstico y pronóstico. En relación con las enfermedades infecciosas,
el valor más importante es el correspondiente a deficiencias selectivas en la respuesta
específica y la infección repetida por patógenos extracelulares. Todos los métodos
usados para el estudio de los anticuerpos se basan en observar el efecto de la unión de
anticuerpos específicos contra IgG, IgM e IgA y se pueden clasificar en 2 categorías:
Aquellos que se basan en los efectos físicos de la formación de inmunocomplejos entre
las inmunoglobulinas y los anticuerpos contra ellas (precipitación).
Aquellos que miden la cantidad de anticuerpo ligado al antígeno (con marcajes que
incluyen enzimas y radioisótopos.
MÉTODOS UTILIZADOS PARA REALIZAR EL ESTUDIO DE LOS ANTICUERPOS
1. Electroforesis de proteínas: Permite conocer cómo se encuentran las
concentraciones de anticuerpos (normales, aumentadas o disminuidas) sin precisar
las clases.
2. Inmunoelectroforesis: Informa cómo se encuentran las clases y subclases de las
inmunoglobulinas IgM, IgA, IgG (están todas, faltan todas, falta una o existen Ig
anormales).
3. Inmunodifusión radial simple: Permite saber cómo se encuentran las
concentraciones de IgM, IgA, IgG.
4. ELISA o SUMA: Con ellos se cuantifican las concentraciones de IgM, IgA, IgG, IgE.
5. RIA: Permite cuantificar las concentraciones de IgM, IgA, IgG, IgE.

MÉTODOS UTILIZADOS PARA REALIZAR EL ESTUDIO DE LOS LINFOCITOS T

1. Técnica de roseta espontánea.
2. Estudio de las subpoblaciones linfoides TCD4 helper 1 y helper 2 y TCD8, con
anticuerpos monoclonales por inmunofluorescencia indirecta, RIA, SUMA, ELISA.
3. Pruebas cutáneas retardadas.