Control de Calidad de Ensayos Medicos y Clinicos de Salud

4.
CONTROL DE CALIDAD DE ENSAYOS

Controles de tercer Nivel
➢ Son supervisados por Responsable de Calidad
Pruebas interlaboratorio:
➢ Organización, realización y evaluación de ensayos sobre el mismo
item o items similares por dos o más laboratorios de acuerdo con
condiciones predeterminadas.
51
4.CONTROL DE CALIDAD DE ENSAYOS
Controles de tercer Nivel
Ensayo de Aptitud:
➢ Evaluación del desempeño de los participantes con respecto a
criterios previamente establecidos mediante comparaciones
interlaboratorios. DA-acr-13D
52
5.-VERIFICACION DE MATERIAL ESTERIL
➢ Todo el material que paso por proceso de
esterilización se debe verificar la eficacia de la
esterilidad.
➢ Se prepara un caldo de cultivo y se enjuaga
los materiales con este caldo.
➢ Después de el enjuague se procede a incubar

con todo el material, por 24 horas a 35°C.
53
5.-VERIFICACION DE MATERIAL ESTERIL
➢ Pasado el tiempo de incubación se verifica

la turbidez
➢ Se considera un resultado aceptable

cuando no hay presencia de crecimiento.
➢ Los materiales estériles se guardaran en un
área seca y limpia por un periodo
determinado.
54
6.-CONTROL BIOLOGICO DE ESTERILIZACION
➢ Indicador Biológico: Consiste en preparaciones estandarizadas de

esporas de microorganismos muy resistentes, que son procesadas
en el esterilizador para comprobar si se han destruido o no y, por
tanto, si se ha llevado a cabo o no el proceso de esterilización.
55
Indicador Biológico
➢ Utilizan dos tipos de esporas:
➢ Bacillus stereotermophilus (para los procesos de esterilización con
vapor de agua o con vapores químicos)
➢ y Bacillus subtilis (para los procesos con óxido de etileno o con calor
seco), que se comercializan sobre tiras de papel o discos.
56
Indicador Biológico:
➢ Se incuban durante 24-48 horas, en el caso de que haya esporas
vivas éstas volverán a su forma vegetativa, y se reproducirán
teniendo lugar un crecimiento bacteriano ,lo que pondrá de
manifiesto un fallo en la esterilización.
57
Indicador Biológico:
➢ Este indicador se incuba con los controles respectivos indicados
por el proveedor a la temperatura y el tiempo indicado.
➢ Pasado el tiempo de incubación, revisar el cambio de viraje del

indicador:
-Viraje amarillo indica una mala esterilización
-No hay cambio de viraje (morado) indica una buena esterilización
58
7.-CONTROL QUIMICO DE ESTERILIZACION
➢ Los controles químicos se realizan comúnmente mediante

productos comerciales, consistentes en sustancias
químicas que cambian de color si se cumple uno o varios
elementos clave (temperatura, humedad, presión,
concentración del agente esterilizante) en el proceso de
esterilización.
60
➢ Se coloca una cinta indicadora de vapor o calor seco y cuando

sale del autoclave o estufa revisar el cambio de viraje de la
cinta.(franja color plomo oscuro ) este cambio de viraje indica
una esterilización del material.
62
8.-CONTROL DE CALIDAD DEL AGUA
➢ Atendiendo a su grado de impureza, el agua de

laboratorio se puede clasificar en tres grupos:
➢ Agua de Grado 1, de Grado 2 y de Grado 3, cuyas
características y usos se definen seguidamente
63
➢ Agua de Grado 1.- Exenta de partículas sólidas, sus impurezas

están constituidas principalmente por iones disueltos. Se emplea
en aquellos análisis que requieren máxima exactitud y precisión
y necesitan agua con características muy exigente en cuanto a
pureza.
64
➢ Agua de Grado 2.- Agua con presencia de partículas y coloides

suspendidos. Puede ser empleada en aquellos análisis que
necesitan unas cantidades mínimas de disolvente.
Recomendada para la mayoría de las pruebas analíticas y
generales de laboratorio, tales como los análisis hematológicos,
serológicos y microbiológicos.
65
➢ Agua de Grado 3.- Apropiada para la mayoría de los procesos

llevados a cabo en los laboratorios químicos y la preparación de
disoluciones de reactivos. No reúne unas características
específicas y solo requiere un grado mínimo de calidad, se
emplea también para enjuagues y lavados
66
67
Calidad del agua usado en ensayos microbiológicos
68 Referencia SMEWW- APHA-AWWA-WEF 9020B

➢ Conductividad: propiedad indicativa del contenido total en sales

disueltas en el agua (cationes y aniones) como Ca2+, Mg2+,
Na+, PO43-, HCO3- y Cl-. Altos valores de conductividad indican
la presencia de impurezas indeseables en el agua.
69
➢ Carbono orgánico total (COT): hace referencia a la

cantidad de materia orgánica presente en la muestra de
agua. Existen varios procedimientos para su medición, pero
todos tienen dos objetivos en común: Oxidar el carbono
orgánico a dióxido de carbono y Medir el dióxido de carbono
generado.
70
➢ Metales pesados : Los ejemplos de metales pesados incluyen el

mercurio (Hg), cadmio (Cd) el arsénico (As), el cromo (Cr), el
talio (Tl), y el plomo (Pb). La peligrosidad de los metales
pesados es mayor al no ser química ni biológicamente
degradables además y algunos de ellos con efectos de
bioacumulación.
71
➢ Cloro residual : El cloro residual libre en el agua se

encuentra como una combinación de hipoclorito y ácido
hipocloroso.El cloro residual combinado es el resultado
de la combinación del cloro con el amonio
(cloraminas).La suma de los dos constituye el cloro
residual total.
72
➢ Evaluación del cloro residual

La prueba más común es el indicador de DPD (dietil-para-fenil-
diamina) mediante un kit de comparación. En esta prueba, se
añade una tableta de reactivo a una muestra de agua, que la tiñe
de rojo.
73
➢ Conteo en placa de heterótrofos:

Las Bacterias Heterotróficas están presentes
en todos los cuerpos de agua, éstas son
indicadoras de la eficacia de los procesos de
tratamiento, principalmente de la
desinfección (descontaminación).
74
9.-EFICACIA DE LUZ UV
➢ Esterilización ultravioleta: Proceso de

destrucción de toda vida microbiana por
medio de radiación ultravioleta. Hay 3
clasificaciones para la luz ultravioleta, A, B
y C.
75
➢ UV-C: Se sitúa en un intervalo de longitudes de onda de

220 a 290 nanómetros. La radiación UV-C es la longitud de
onda ultravioleta más corta. Las personas estamos muy
poco o nada expuestas a ella de manera natural, lo que
sería altamente peligroso.
➢ Tiene propiedades germicidas significativas. La luz UV-C es
casi totalmente filtrada por la atmósfera de la Tierra
77
➢ UV-C: Esta radiación tiene una alta energía que cae tan pronto
incide contra cualquier superficie y en la industria se usa .Se usa
ampliamente en aplicaciones germicidas eliminando eficazmente
virus y bacterias.
78
¿Cómo desinfecta una luz UV-C?
Cuando la luz UV se encuentra con

un microorganismo penetra en su
ADN, destruyendo los enlaces
adenina y timina inactivando
eficazmente bacterias, virus,
esporas y mohos, evitando que se
multipliquen y causen infecciones
➢ Las lámparas UV en laboratorio se debe limpiar con etanol al 70%.

➢ Realizar la medición de la intensidad UV de las
lámparas(radiometro), reemplazar si la medición es menor del
70% de la original.
➢ Alternativamente realizar exposición de placas para evaluar la
eficacia de la luz UV.
80
➢ Cultivar la cepa de Escherichia Coli por 24 horas.

➢ Preparar diluciones con recuentos de 200 a 300 colonias por
placa.
➢ Diseminar las placas de manera uniforme con la espátula en
placas con Agar Plate Count (APC).
➢ Retirar las tapas y exponer las placas de APC con luz blanca por
2 minutos y a placas APC con luz ultravioleta.
81
➢ Luego de las exposiciones a luz colocar la tapa sin sellarlas

fuertemente.
➢ Realizar la incubación de las placas de APC a 35 °C por 48 horas.

➢ Realizar el conteo de las colonias en las placas expuestas a luz
UV y luz blanca
➢ Para el cálculo de porcentaje de reducción se usa la siguiente

formula:
82
Criterio de Aceptación
➢ Es conforme cuando el porcentaje de reducción es mayor a 99%,
➢ NO es conforme cuando el recuento es menor a 99 %
➢ En caso que el porcentaje de reducción se menor al 99% se
reemplazará la lámpara UV .
83
10.-CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO
➢ Medios de cultivo: Son necesarios para el aislamiento,

mantenimiento, la reproducción y la identificación de los
microorganismos. Contienen sustancias nutritivas .pH
adecuado.Deben estar estériles.
➢ Incubación: Depende del metabolismo del microorganismo a
cultivar.La atmósfera empleada.Tiempo. Temperatura.
84
➢ Clasificación de medios de cultivo:

1. Según su estado físico: líquidos, semisólidos y sólidos.
2. Según su finalidad en microbiología:
➢ -No selectivos: contienen suficientes nutrientes como para
soportar el crecimiento de gran variedad de microorganismos.
➢ -Selectivos: permiten el crecimiento de sólo un tipo de
microorganismo.
85
-Enriquecido: son medios no selectivos que se

le agrega sustancias como ser sangre, suero,
albúmina, etc... Para microorganismos
exigentes.
-Diferenciales: son medios de cultivo que
permiten establecer diferencias entre diferentes
tipos microorganismos.
86
❑ Requisitos de los medio de cultivo provistos por el fabricante:

• Los lotes de medios deben estar debidamente identificados.
• Cada lote recibido debe ir acompañado de evidencias del
cumplimiento de las especificaciones de calidad.
• El fabricante debe proveer información acerca de las
especificaciones de calidad, como mínimo debe incluir lo
siguiente:
87
• Nombre del medio y lista de componentes, incluido cualquier

suplemento.
• Fecha de vencimiento del medio.

• Condiciones de almacenamiento.
• Control de esterilidad.
• Control del crecimiento de los microorganismos de interés (target) y de
los microorganismos no deseados (no target) y criterios de
aceptabilidad.
63
• Controles físicos y criterios de aceptabilidad aplicados.

• Fecha de emisión de las especificaciones
• Manejo de los medios de cultivo:
1. El laboratorio debe registrar la fecha
• de recepción
• de apertura del envase.
• de caducidad
89
2. El almacenamiento debe realizarse en las

condiciones apropiadas.
• Envases: deben estar herméticamente
cerrados.
• No deben utilizarse medios deshidratados
que presenten apelmazamiento o un
cambio de color.
90
En medios selectivos y/o diferenciales hay que evaluar:

▪ El crecimiento de las cepas target.
▪ Hay que prestar atención también a la apariencia, tamaño y
morfología de las colonias (especificidad) .
▪ El crecimiento de las cepas no-target debe estar en parte o
completamente inhibido.
91
➢ Para evaluar cada lote de medio de cultivo según Norma ISO/TS

11133 -2:2000
➢ Se puede emplear los siguientes métodos:

a) Pruebas cuantitativas
b) Pruebas semi-cuantitativas
c) Pruebas cualitativas
92
➢ Evaluación de la calidad de los medios de cultivo: La elección

del empleo de una u otra metodología será considerada en cada
caso en particular según el medio a evaluar, las capacidades y
necesidades del laboratorio .Norma ISO/TS 11133-2:2000.
➢ Medio de referencia: El uso de un medio de referencia específico
es obligatorio en los métodos de cuantitativos.
93
➢ Para las pruebas semi-cuantitativas o

cualitativas, el uso de un medio específico de
referencia o un medio de cultivo que da una
“la reacción positiva" ayuda al ínterpretar los
resultados.
➢ El medio de referencia debe ser de conocida
buena calidad
94
Productividad:
➢ Definición: rendimiento, recuperación, crecimiento de un
microorganismo que se espera que desarrolle en el medio de
cultivo.
➢ Según el medio de cultivo, se usa una cepa apropiada de
referencia target para evaluar la productividad ISO/TS 11133-
2:2000
95
Productividad:
➢ En un medio de cultivo no selectivo como por ejemplo el PCA se
evalúa el adecuado desarrollo de las cepas target o blanco.
➢ En este caso se usan E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 6538
y B. subtilis ATCC 6633
96
Productividad: Pruebas cuantitativas
➢ Para las pruebas cuantitativas la proporción de Productividad PR

es definido como sigue:
PR = Ns /No
donde
➢ Ns: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo
a probar (obtenido de uno o más placas)
➢ No: es el recuento total de colonias obtenido en el medio de cultivo
de referencia definido obtenido de uno o más placas que debe ser
› 100 ufc.
97
Productividad: Criterio de conformidad

➢ PR debe ser mayor o igual a un valor límite para que el
medio de cultivo sea conforme.
➢ En general para que los medios no selectivos como el PCA
sea conforme, el PR debe ser › a 0,7.
98
Ejemplo:
➢ Se desea evaluar la productividad del PCA.
➢ El medio de referencia usado es agar tripticasa soya (TSA)
1) Ns ( dil -6):140 ufc
No ( dil -6): :170 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,8 esto quiere decir que el medio testeado es conforme
99
2) Ns ( dil -6):100 ufc

No ( dil -6): 230 ufc
PR = Ns /No
PR= 0,4 esto quiere decir que el medio testeado no es
conforme en cuanto a su productividad.
10
• Productividad: Pruebas semi-cuantitativas en medios de

cultivos sólidos
➢ Se inocula en forma de estrías diluciones del cultivo

➢ Las placas inoculadas se incuban a temperatura y tiempo
que depende del medio de cultivo evaluado.
10
Productividad: Pruebas semi-cuantitativas en medios de cultivos

sólidos
➢ Se evalúa la productividad del medio teniendo en cuenta el valor
de cada estría con crecimiento
10
Productividad: Pruebas cualitativas

➢ Se llevarán a cabo visualmente asignando un score de
crecimiento.
➢ Score para medios sólidos:

• 0 no hubo crecimiento
• 1 hubo crecimiento débil
• 2 hubo buen crecimiento
10
Productividad: Pruebas cualitativas

➢ Score para medios líquidos:
• 0 no hubo turbidez
•1 hubo turbidez muy tenue
• 2 hubo buena turbidez
10
Selectividad:
➢ Definición: la supresión del crecimiento de un microorganismo que
se espera sea inhibido en el medio de cultivo.
➢ Según el medio se usa una cepa apropiada de referencia no-target
para evaluar la selectividad ISO/TS 11133-2:2000
10
Selectividad:
➢ Para llevar a cabo la prueba de la selectividad, el medio de cultivo
selectivo a evaluar y un medio de la referencia se inoculan con un
microorganismo y nivel apropiado.
➢ Se emplea una suspensión del microorganismo de no-target que
contiene 104 ufc a 106 ufc por ml se inocula en la placa o en el
tubo de medio.
10
Selectividad:
➢ Caldo Lauril sulfato (LST) se evalúa el desarrollo de las cepas
target y no target.
➢ En este caso las cepas target que se usan son E.coli ATCC
25922, C.freundii ATCC 43864 y las cepas no target Enterococcus
faecalis ATCC 29212.
➢ Evalúa reacciones características: gas y turbidez.
10
Registro evaluación de medios de cultivo

➢ La información a registrar es:
➢ Medio de cultivo evaluado.
➢ Nº ID o Nº lote de medio evaluado.
➢ Fecha de realización del análisis.
➢ Cepa usada (Género y especie del microorganismo y tipo y Nº de
colección).
10
Registro evaluación de medios de cultivo

➢ Medio de referencia usado para evaluar la productividad.
➢ Medio de referencia usado para evaluar la Selectividad.
➢ Resultado de productividad (unidades).
➢ Resultado de selectividad (unidades).
➢ Medio de cultivo conforme (SI/NO)
➢ Personal responsable.
10
11.- REACTIVACION DE CEPAS
Cepas de referencia:
➢ La acreditación de un método de ensayo en microbiología
requiere cepas de referencia.
➢ El número y la elección del género y especie de las mismas
dependerá de los ensayos que se efectúan y las necesidades
particulares de estos últimos.
11
Cepas de referencia:
➢ Son necesarios para demostrar la trazabilidad
➢ Se debe elaborar e implementar un procedimiento
documentado para el uso y manejo de cepas de
referencia.
➢ En microbiología es necesario demostrar la

trazabilidad de los cultivos.
11
Para qué se emplean las cepas de referencia en microbiología?

➢ Evaluación de la calidad de los medios de cultivo
➢ Realizar controles de calidad interno durante la ejecución de los
ensayos.
➢ Realizar controles de calidad de los reactivos.
➢ Pruebas confirmatorias.
➢ Validar/ Verificar métodos.
➢ Establecer trazabilidad
11
Los cultivos (cepas) de referencia pueden ser:

➢ Cepas de referencia: Microorganismos obtenidos de una
colección nacional o internacional reconocida.
➢ Cepas de trabajo: Cepas obtenidas a partir del cultivo de una cepa
de referencia preparada y conservada por un laboratorio.
➢ Cepas de reserva: Subcultivos de microorganismos obtenidos a

partir de las cepas de referencia para ser utilizados en los ensayos
88 que lo precisen.
Las cepas de referencia deben tener:

➢ Viabilidad: Las colecciones de cultivo reconocidas deben presentar
un instructivo para su resucitación.
➢ Pureza: Se debe garantizar que el cultivo sea puro.
➢ Estabilidad: deben mantener las características fenotípicas y
genotípicas originales.
89
➢ La manipulación y modo de conservación de los cultivos de

referencia deben evitar:
▪ El deterioro de las cepas.

▪ La contaminación cruzada.
▪ Mutaciones, deterioro o alteración de las características típicas de
las cepas.
➢ Su crecimiento característico debe ser documentado sobre cada
90 medio en el que se utiliza como cepa control.

➢ Con el objetivo de evitar cambios en las características de los

cultivos de referencia, el número de repiques a partir de la
cepa de referencia, debe ser limitado.
➢ Los cultivos de referencia deben ser obtenidos de una
colección de cultivos nacional o internacional de reconocido
prestigio para demostrar su trazabilidad.
116
➢ Son microorganismos definidos:

• Por lo menos a nivel de género y especie
• catalogados.
•muy caracterizados.
•de origen conocido.
• se comercializan liofilizados.
117
➢ Si una cepa se adquiere por cualquier vía que no sea la propia

colección, NO se puede mencionar utilizando el número que
tienen en esa colección.
➢ Adquisición de Cepas de referencia:

1 ra. opción: Obtención directa a partir de una colección
nacional e internacional reconocida.
118
➢ Proveedores de cepas de referencia:
Ejemplos:
• ATCC (American Type Culture Collection).
• SVM (Foundation for the Advancement of Public and Environmental
Protection)
• CECT (Colección española de cultivos tipos).
• CNCM (Collection Nationale Cultures Microorganismes)lnst.Pasteur,
Fance
• NCCB (The Netherlands Culture Collection of Bacteria, Holanda).
• NRRL: (ARS Culture Collection, USA).
• UKNCC: (United Kingdom National Culture Collections, (Reino Unido).
119
PRACTICA N° 7
ASEGURAMIENTO DE CALIDAD
PARA LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA
11.-REACTIVACION DE
CEPAS
2 da. opción: Proveedores comerciales certificados.
•Comercializan repiques de cepas de referencia adquiridas en
una colección reconocida.
•Generalmente el 3er o 4 repique.

•Deben mantener sus recipientes originales.
•Requerimiento en la recepción: certificado de origen
2
11.-REACTIVACION DE
CEPAS
El certificado del cultivo de referencia debe poseer:
• Nombre y dirección del organismo de certificación
• Título del documento.
• Condiciones del certificado (provisorio)
• Nombre del material
• Número de muestra (Nº del lote puntual)
• Fecha de certificación
3
11.-REACTIVACION DE
CEPAS
4
11.-REACTIVACION DE
CEPAS
• Preparador del MR
• Descripción del MR
• Destino
• Disponibilidad de otras formas y tamaño del MR
• Fuente del MR
• Proveedor del MR
• Almacenamiento.
• Instrucciones para el uso correcto del MR.
• Método de preparación del MR.
5
11.-REACTIVACION DE
CEPAS
• Determinación de homogeneidad.
• Valores obtenidos para una determinada propiedad y sus límites de
confianza.
• Valores asignados pueden ser generados por un laboratorios o un
grupo de laboratorio.
• Incertidumbre
6
11.-REACTIVACION DE
CEPAS
Cepas de Referencia y de Reserva
Pueden ser subcultivadas una sola vez para obtener cepas de
reserva
De las cepas de reserva se obtendrán las cepas de trabajo
Las cepas de reserva se deben conservar utilizando técnicas que
mantengan las características deseadas de la cepa de referencia
(liofilización, ultracongelación,conservación en nitrógeno líquido)
7
11.-REACTIVACION DE
CEPAS
Cepas de Reserva
La técnica de conservación depende de:
Tipo de microorganismo
Disponibilidad de equipos del laboratorio
Frecuencia de uso
Medidas de bioseguridad
Método de distribución dentro del laboratorio
8
11.-REACTIVACION DE
CEPAS
Cepas de Reserva
La técnica de conservación depende de:
La técnica elegida debe asegurar el mínimo número de repiques de la
cepa original
Si se congela, una vez descongelada no se puede volver a congelar
9
11.-REACTIVACION DE
CEPAS
El registro de las cepas de reserva debe tener:
Identificación de la cepa.
Género y especie del microorganismo.
Tipo y Nº de la colección.
Nº de lote cepa de referencia.
Nº de criovial o vial.
Fecha de reconstitución de la cepa referencia.
10
11.-REACTIVACION DE
CEPAS
El registro de las cepas de reserva debe tener:
Nº de repique.
Frasco en uso.
Fecha de baja criovial.
Ubicación de almacenamiento.
Observaciones
11
11.-REACTIVACION DE
CEPAS
12
12.-CONTROL DE AIRE Y
SUPERFICIES
El laboratorio debe asegurarse que las
condiciones ambientalesno invaliden los
resultados de ensayo ni comprometan la

calidad requerida de los resultados.
El laboratorio debe establecer:
Un programa de limpieza y desinfección
13
SUPERFICIES
Para la desinfección se deben tomar en cuenta agentes
antimicrobianos que no pongan en riesgo la salud del operador y
que no dañen las superficies de trabajo
Limpieza y desinfección
• Organizar las tareas de limpieza y desinfección del laboratorio.
• Establecer la frecuencia de realización de las mismas
14
SUPERFICIES
Se detallanlas superficies a limpiar y/o desinfectar, el nivel
de
limpieza requerido ,los desinfectantes a preparar y su modo de uso.
El personal que realiza la actividad
Propósito: para que los laboratorios estén en condiciones adecuadas
para realizar los ensayos.
15
SUPERFICIES
Son los procedimientos operativos
empleados durante la realización del
trabajo en el laboratorio.
Tiene como principal objetivo evitar la
contaminación en todas las etapas del
ensayo.
16
SUPERFICIES
MONITOREO AMBIENTAL:
La calidad microbiológica del aire y las superficies del laboratorio en
microbiología es un indicador de la efectividad de las tareas realizadas
en cuanto a:
• Los programas de limpieza y desinfección y a el cumplimiento del
reglamento interno de trabajo.
17
SUPERFICIES
MONITOREO AMBIENTAL: Procedimiento
Establece :
Metodología para la toma de muestra.

Lugares de toma de muestra.
Límites de tolerancia o criterios de aceptación o rechazo.
Frecuencia de monitoreo.
Acciones correctivas a tomar en caso de
de los límites
11
desvíos establecidos.
SUPERFICIES
El procedimiento de muestreo para monitoreo ambiental puede
incluir:
Determinación cuantitativa de microorganismos presentes
en el ambiente
Determinación cualitativa de algunos patógenos y/o
indicadores dependiendo de los ensayos que realiza el
laboratorio
19
SUPERFICIES
Toma de muestra: durante un tiempo se exponen placas Petri con
medio de cultivo en el área de trabajo.
Áreas a monitorear o zonas de toma de la muestra: área de
siembra, área de preparación de la muestra.
Tiempo y temperatura de incubación: Luego de la exposición al aire,
las placas se cierran e incuban durante 48 horas para Aerobios
Mesofilos y de 3 a 5 días para hongos.
20
SUPERFICIES
Frecuencia de realización de los controles. Semanal en diferentes
turnos de trabajo.
Criterio de conformidad :número máximo de colonias por tiempo de
exposición de las placas. Ejemplo durante 15 minutos se permite hasta
15 colonias
Los resultados se expresan como unidades de colonias (UFC) por placa
21
SUPERFICIES
Método para muestreo de superficies
Colocar sobre la superficie que se va a muestrear una plantilla estéril
con un área de 10x10 cm.
Humedecer un hisopo estéril en una solución (10 mL)y
eliminar el exceso de líquido.
Con el hisopo inclinado en ángulo de 30° frotar 3 veces la superficie

delimitada por la plantilla, cada una en dirección opuesta.
22
SUPERFICIES
Método para muestreo de superficies
Regresar el hisopo al tubo y retirar del mismo la parte que estuvo en
contacto con los dedos.
Criterio de conformidad : <1UFC/cm2 ,si los resultados sobrepasan el
límite, hacer una limpieza según procedimiento de Saneamiento y
volver a realizar el control microbiológico de superficie.
23
13.-BUENAS PRACTICAS DE
LABORATORIO
Las BPL son un conjunto de reglas, procedimientos operativos y
prácticos establecidas por una determinada organización para asegurar
la calidad y la rectitud de los resultados generados por un laboratorio".
La práctica de las BPL promueve la calidad y la validez de los datos de
las pruebas.
BPL Resultado
Muestra
del ensayo
24
LABORATORIO
Ventajas de las BPL
Se Evitan:
Re trabajos: Re muestreos, Re análisis, Generación de datos cruzados.
Errores: Perdida de credibilidad,Salud y seguridad,
responsabilidad entre las consecuencias.
Falta de calidad en un proceso.

Se Obtiene:
11 Optimización de costos de calidad.

LABORATORIO
26
LABORATORIO
Hábitos de trabajo en el laboratorio
Trabajar de forma ordenada y sin prisa.
Mantener limpias las zonas de y sin
trabajo accesorios
innecesarios Trabajar de forma ordenada y sin prisa.
Mantener limpias las zonas de trabajo y sin
accesorios innecesarios
27
LABORATORIO
Hábitos de trabajo en el laboratorio
Si el análisis lo requiere, use los equiposde protección
personal
determinados.
Utilizar siempre gradillas y soportes.
No trabajar separado de las mesas.
Al circular por el laboratorio ir con precaución, sin correr o
jugar e
28
interrumpir a los que están trabajando.
LABORATORIO
1.Personal
2.Medio ambiente
3.Validación de métodos de
ensayo. 4.Equipamiento
5. Reactivos y medios de cultivo

6. Materiales de referencia y cultivos de referencia
29
LABORATORIO
7. Muestreo
8. Manejo e identificación de muestras
9. Eliminación de residuos contaminados
10. Garantía de calidad de resultados y control de calidad de desempeño
11. Procedimientos de ensayos
12. Informes de ensayos
30
LABORATORIO
1.-Personal
Los ensayos microbiológicos deben
realizados y ser supervisados por una
persona
experimentada.
El personal debe tener entrenamiento básico en
microbiología y experiencia práctica relevante
antes de ser autorizado a realizar el trabajo.
31
LABORATORIO
1.-Personal
El personal debe estar entrenado en los procedimientos necesarios
para la contención de microorganismos dentro de las instalaciones del
laboratorio.
El personal debe estar entrenado en el manejo seguro de
microorganismos
32
LABORATORIO
1.-Personal
Normas de conducta y hábitos personales
Mantener en todo momento los mandiles abotonados.
No dejar objetos personales en mesas de trabajo.
No comer ni beber en los laboratorios.
No guardar alimentos ni bebidas en las refrigeradoras del laboratorio.
No fumar en los laboratorios.
33
LABORATORIO
1.-Personal
Los mandiles no deberían llevarse a lugares de uso común: cafeterías,
comedores, etc.
En caso de utilizar gafas con medida estas deben tener
cordón de seguridad.
34
LABORATORIO
1.-Personal
Lavarse las manos antes de abandonar el laboratorio, al quitarse los
guantes protectores.
No debe trabajar nunca una persona sola en el laboratorio
y especialmente fuera de horas habituales o en operaciones con
riesgo.
35
LABORATORIO
2.-Medio Ambiente
Los laboratorios microbiológicos y algunos equipos de apoyo deben
ser de dedicación exclusiva y estar separados de otras áreas.
El aire suministrado al laboratorio debe ser de calidad adecuada y no
debe representar una fuente de contaminación.
36
LABORATORIO
2.-Medio Ambiente
El acceso al laboratorio de microbiología debe estar
restringido al
personal autorizado.
El personal debe estar al tanto de: los procedimientos adecuados de
ingreso y salida, incluyendo la vestimenta; el uso previsto de un área
determinada; las restricciones impuestas al trabajo dentro de tales
áreas
37
LABORATORIO
2.-Medio Ambiente
Las actividades del laboratorio, deben
estar segregadas en espacios diferentes o
al menos por tiempos, con la finalidad de
minimizar el riesgo de contaminación
cruzada y los resultados falsos positivos o
falsos negativos
38
LABORATORIO
2.-Medio Ambiente
Los equipos de laboratorio utilizados en el laboratorio de
microbiología no deben usarse fuera del área de microbiología.
Monitoreo ambiental en el laboratorio ,cuando sea necesario y
apropiado debe establecerse un programa de monitoreo
ambiental
39
LABORATORIO
2.-Medio Ambiente
Se debe contar con un programa documentado
de limpieza y desinfección. Se debe contar con
un procedimiento para el manejo de derrames.
Se debe disponer de instalaciones adecuadas
para lavado y desinfección de manos.
Instalaciones para los ensayos.
40
LABORATORIO
3.-Validación de métodos de ensayo
El laboratorio debe demostrar que los criterios de
desempeño del método de ensayo estándar pueden ser
satisfechos por el laboratorio antes de introducir el ensayo
como ensayo de rutina y que el método de ensayo
específico para un producto dado es adecuado.
41
LABORATORIO
4. Equipamiento
El laboratorio debe tener un programa documentado para la calificación,
calibración, verificación del desempeño y mantenimiento de sus
equipos.
La fecha de calibración y mantenimiento y la fecha en que debe
realizarse la re calibración deben indicarse en una etiqueta adherida al
instrumento
42
LABORATORIO
4. Equipamiento
La estabilidad de la temperatura, la uniformidad de la
distribución de la temperatura y el tiempo necesario para
alcanzar condiciones de equilibrio en las incubadoras, baños
de agua, hornos y cuartos de temperatura controlada deben
establecerse inicialmente y documentarse, en particular para
los usos habituales.
43
LABORATORIO
5. Reactivos y medios de cultivo
Parala preparación se debe usar agua de calidad
microbiológica
adecuada .
Se debe determinar y verificar el periodo de vida útil de los medios
preparados.
Deben asegurar que todos los reactivos, medios, diluyentes y

otros
44
líquidos de suspensión, estén adecuadamente etiquetados .
LABORATORIO
6. Materiales de referencia y cultivos de referencia
Los cultivos de trabajo para el uso rutinario deben ser
subcultivos
primarios de los stocks de referencia .
Si los stocks de referencia han sido descongelados, no deben volver a
congelarse ni reutilizarse.
Los cultivos de trabajo no se deben subcultivar. Usualmente, no más de

cinco generaciones (o pasajes) de la cepa de referencia original
45
LABORATORIO
7. Muestreo
Cualquier procesode desinfección utilizado en la obtención
de la muestra no debe comprometer el nivel microbiano dentro de la
muestra.
Los análisis de las muestras se deben realizar lo más pronto posible
después del muestreo
El muestreo debe realizarse solo por personal capacitado.
46
LABORATORIO
8. Manejo e identificación de muestras
Los envases y etiquetas de las muestras pueden estar
altamente
contaminados y deben manipularse y almacenarse con cuidado.
Las muestras en espera de los ensayos deben almacenarse
en condiciones adecuadas .
Las porciones de muestras del laboratorio que se sabe están

contaminadas deben descontaminarse antes de su eliminación.
47
LABORATORIO
9. Eliminación de residuos contaminados
Los procedimientos para la eliminación de materiales contaminados
deben diseñarse para minimizar la posibilidad de contaminación del
ambiente o materiales de trabajo.
48
LABORATORIO
10. Procedimientos de ensayos
Los ensayos deben realizarse normalmente de acuerdo a
los
procedimientos descritos .
Pueden emplearse procedimientos de ensayos alternativos siempre que
estén debidamente validados y su equivalencia con métodos oficiales
haya sido demostrada.
49
LABORATORIO
11. Informes de ensayos
El resultado no deberá informarse como “cero para una unidad definida”
a menos que esto sea un requisito regulatorio.
Los resultados de los ensayos cualitativos deben informarse
como “detectado/no detectado en una cantidad o volumen definido”.
50
PRACTICA
Evaluación de la
incertidumbre de la
medición en ensayos
microbiológicos en aguas y
alimentos (en el marco de la
ISO/IEC 17025)
OBJETIVOS
• Conocer las definiciones y normativa relacionada a la estimación de

la incertidumbre de la medición.
• Conocer los principales modelos para la estimación de la
incertidumbre en las mediciones microbiológicas.
• Saber obtener y tratar los datos para la estimar la incertidumbre en
los ensayos microbiológicos.
• Saber utilizar la incertidumbre de la medición en la evaluación de la
conformidad.
CAPÍTULO 1
MARCO
NORMATIVO
(ISO/IEC 17025 y
directrices)
ISO/IEC 17025
DA-acr-06D
DA-acr-09D
DA-acr-09D
DA-acr-09D
DA-acr-09D
DA-acr-09D
DA-acr-09D
DA-acr-09D
CAPÍTULO 2
TÉRMINOS Y
DEFINICIONES
Términos y definiciones
• Mensurando: magnitud particular
sujeta a medición [JCGM 100:2008]
• Magnitud: atributo de un fenómeno,

cuerpo o sustancia, que es susceptible
de ser distinguido cualitativamente y
determinado cuantitativamente
[JCGM 100:2008]
• Medición: conjunto de operaciones

que tienen por finalidad determinar
un valor de una magnitud [JCGM
100:2008]
• Medición directa: cuando el valor de una magnitud se obtiene en
una medición única y con un instrumento de medición de lectura
directa.
• Medición indirecta: cuando el valor de una magnitud se obtiene a
partir de valores de otras magnitudes, relacionados entre sí
mediante una cierta función matemática.
Y = f (X1, X2, . . . , XN )
Y = magnitud de salida (N, numero de microorganismos)
Xi = magnitudes de entrada (C, V, d)
f = función matemática que contiene cada magnitud capaz de
contribuir a una componente significativa de la incertidumbre del
resultado de medida.
y = f (x1, x2, . . . , xN)

xi = estimaciones de entrada (valores medidos de cada magnitud)
• Exactitud: proximidad entre el
resultado de una medición y el Mucha variabilidad
La media se acerca al
valor verdadero [ISO 3534-2] valor
(incluye componentes aleatorios y

un error sistematico)
• Veracidad: proximidad entre el valor

promedio obtenido a partir de una
serie de resultados de medición y un
valor verdadero [ISO 3534-2] (su
medida generalmente se expresa en
función del sesgo)
• Precisión: proximidad entre resultados

de medición independientes obtenidos Cuan impreciso soy
en condiciones estipuladas [ISO 3534-2]

(Cuando se hacen repeticiones, hay
variables que no podemos controlar)
• Sesgo: diferencia entre la media o resultado de la medición y el valor verdadero
[ISO 3534-2]
• Repetibilidad: precisión bajo condiciones de repetibilidad (mismo método,
operador, equipos, cortos intervalos de tiempo [ISO 3534-2]
• Reproducibilidad: precisión bajo condiciones de reproducibilidad (mismo método
y diferentes laboratorios, operadores, equipos) [ISO 3534-2]
• Error de medida: resultado de una
medición menos un valor
verdadero del mensurando [JCGM
100:2008] Toda medición esta
sujeto a un error de medida
• Error sistemático: componente del
error de medida que, en
mediciones repetidas (promedio),
permanece constante o varía de
manera predecible [VIM 2.17] Es
un reflejo del sesgo
• Error aleatorio: componente del
error de medida que, en
mediciones repetidas, varía de
manera impredecible [VIM 2.19]
No podemos saber su origen
Enfoque Global
Variabilidad que
no conocemos
• Incertidumbre de medida: parámetro asociado al resultado de una
medición, que caracteriza la dispersión de los valores que podrían
ser razonablemente atribuidos al mensurando [JCGM 100:2008].
Y=y±U
Y = mensurando (magnitud de salida)
y = estimación de salida (resultado de la
medición)
U = incertidumbre expandida
y = f (x1, x2, . . . , xN)

xi = estimaciones de entrada (valores
medidos de cada magnitud)
NOTA: Si la función f no representa la medición a un grado de exactitud adecuado, deben introducirse en f

magnitudes de entrada adicionales, para eliminar la falta de adecuación (ej. muestreo, submuestreo,
analista, incubación, etc.)
• Incertidumbre típica, u(xi): incertidumbre de medida como
expresada desviación típica [VIM 2.30], indertidumbre estandar una
• Desviación típica, s(x): raíz cuadrada positiva de la varianza [ISO 3534-1]
• Incertidumbre típica relativa, u(xi)/|xi| o w(xi): cociente entre la incertidumbre
típica y el valor absoluto del valor medido (promedio de una medida) [VIM 2.32]
• Varianza, s2(x): medida de dispersión, igual a la suma de los cuadrados de las
desviaciones de las observaciones con respecto a su valor medio, dividido por el
número de observaciones menos uno [ISO 3534-1]
Desviación
estandar
u(xi) =
Términos estadísticos
• Incertidumbre típica combinada, uc(y): incertidumbre típica del resultado
de una medición igual a la raíz cuadrada de la suma de las u2(xi) [JCGM
100:2008].
Ley de propagación de la incertidumbre
Magnitudes
de entrada
correlacionad
as
Magnitudes
de entrada
no
correlacionad
as
• Incertidumbre típica combinada, uc(y): incertidumbre típica del
resultado de una medición igual a la raíz cuadrada de la suma de las
u2(xi) [JCGM 100:2008].
y x x3
x1 2
𝐶
𝑁= 𝑁 = 𝑓(𝐶, 𝑉, 𝐹)
𝑉×𝐹
𝜕𝑁 𝑁 𝜕𝑁 −𝑁 𝜕𝑁 −𝑁
𝐶𝐶 = = 𝐶𝑉 = = 𝑉 𝐶𝐹
𝜕𝐶 𝐶 𝜕𝑉 = =
𝜕𝐹 𝐹
❑ Incertidumbre típica combinada, uc(y): incertidumbre típica del
resultado de una medición igual a la raíz cuadrada de la suma de
las u2(xi) [JCGM 100:2008].
▪ Reglas básicas para combinar dos componentes de
incertidumbre independientes:
Incertidumbre de la suma (A + B)
Incertidumbre típica Incertidumbre relativa

las u2(xi) [JCGM 100:2008].
Incertidumbre de la diferencia (A - B)
las u2(xi) [JCGM 100:2008].
Incertidumbre de un producto (AB)

las u2(xi) [JCGM 100:2008].
Incertidumbre de una división (A/B)

❑ Varianza relativa combinada: suma de las varianzas
relativas estimadas asociadas a la estimación de xi , w2(xi)
[JCGM 100:2008].
w 2(y) =
c
Desviacion típica al
cuadrado
Ensayos Microbiológicos. Principios
Generales para la estimación de
Incertidumbre de la medición
39
40
41
42
• Incertidumbre expandida, U:
magnitud que define un intervalo en
torno al resultado de una medición,
y en el que se espera encontrar una
fracción importante de la
distribución de valores que podrían
ser atribuidos razonablemente al
mensurando [JCGM 100:2008]
• Factor de cobertura, k: factor
numérico utilizado como
multiplicador de la incertidumbre
típica combinada, para obtener la
incertidumbre expandida [JCGM
100:2008]
• Evaluación Tipo A de la incertidumbre de medida: método de
evaluación de la incertidumbre mediante análisis estadístico de
series de observaciones [JCGM 100:2008], Se hacen una serie de
ensayos o repeticiones
❑ Evaluación Tipo B de la incertidumbre de medida: método de evaluación
de la incertidumbre por medios distintos al análisis estadístico de series
de observaciones [JCGM 100:2008]
Ejemplo:
✔ resultados de mediciones anteriores;
✔ experiencia o conocimientos sobre
los materiales e instrumentos
utilizados;
✔ especificaciones del fabricante;
✔ datos suministrados por certificados
de calibración u otros tipos de
certificados;
✔ incertidumbres asignadas a valores
de referencia procedentes de libros y
manuales.
• Evaluación Tipo B de la incertidumbre de medida:
Incertidumbre obtenida de una fuente externa
U proviene de un
U proviene de intervalo de confianza
multiplicarla con un
múltiplo (m)
Incertidumbre obtenida de una distribución supuesta
Distribución rectangular Ejemplo: Balanza digital
Si los límites de ±a son dados sin nivel de Dato del fabricante:

confianza y hay motivos para esperar que sea Resolución: 0.01
probable que hayavalores extremos (ej.
a = 0.01/2
Instrumentos de medición digitales)
u(xi) = a /√3 = 0.005/√3 = 0.0029
Incertidumbre obtenida de una distribución supuesta
Distribución triangular
Ejemplo: Material volumétrico
Si los límites de ±a son dados sin nivel de Equipos Analógicos
confianza, pero hay motivos para esperar que
sea improbable que haya valores extremos Dato del
(ej. instrumentos de medición analógicos) fabricante: Pipeta:
10 ml Tolerancia: ±
0.1 ml
u(xi) = a /√6 = 0.1/√6 = 0.0408
• Muestra: uno o más ítems seleccionados de
una población (información y decisiones).
• Muestra de laboratorio: muestra destinada
para el ensayo.
• Muestra de ensayo: muestra preparada de la
muestra de laboratorio para tomar porciones
de ensayo.
• Porción de ensayo: cantidad
representativa de la muestra de ensayo
para preparar la dilución inicial.
CAPÍTULO 3
FUENTES DE
INCERTIDUMBRE EN LAS
MEDICIONES
MICROBIOLÓGICAS
Fuentes de incertidumbre
(Jarvis, 2016)
•Muestreo:
✔ Principales fuentes de la incertidumbre:
•Muestreo:
✔ Heterogeneidad (distribución de los
microorganismos en las muestras):
(A) Aleatorio:
Distribución de Poisson
(B) Regular (baja-dispersión):
Distribución normal.
(C) Contagioso (sobre-dispersión):
Distribución binomial negativa.
❑ Muestreo:
✔ Heterogeneidad (distribución de los
microorganismos en las muestras):
▪ Tipos de distribución contagiosa:
a) Grupos pequeños
b) Grupos grandes con individuos
distribuidos aleatoriamente
c) Grupos grandes con individuos
distribuidos uniformemente
❑ Muestreo:
✔ Estrategias del muestreo:
A. Dispersión aleatoria (s2 ≈ 𝑥ҧ)
o ligeramente contagiosa.
B. Dispersión contagiosa (s2 >
𝑥ҧ)
C. Dispersión aleatoria (s2 ≈ 𝑥ҧ)
D. Dispersión normal (s2 < 𝑥ҧ)
❑ Muestreo:
❑ Muestreo:
❑ Muestreo:
✔ Transporte y preservación:
Murray et. al, 2015 Pao et. al, 2012

❑ Preparación de la muestra:
✔ Submuestreo (efecto de la matriz):
❑ Preparación de la muestra:
✔ Homogenización:
❑ Dilución:
✔ Dilución inicial:
❑ Dilución:
✔ Diluciones adicionales:
❑ Inoculación:
✔ Error en el volumen inoculado:
u(ti) = VxΔTx2,1x10-4/√3
u(ci) = Tolerancia / √6
❑ Conteo de colonias:
✔ Las “UFC” se distribuyen
según el
modelo de Poisson:
2
𝑠𝑥 == 1
𝑠
2𝑟𝑒𝑙 =2 2 𝑥
𝑥 𝑥
𝑥: 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠
CAPÍTULO 4
MODELOS DE
EVALUACIÓN DE LA
INCERTIDUMBRE
(Enfoque por
componentes)
Componentes o “bottom-up”
❑ Mensurando:
Confirmación de Colonias
Dilución Volumen de muestra Recuentos
Probadas Confirmadas
1 142 3 3
-3
1 134 3 2
0.1 16 2 2
-4
0.1 13 2 2
SUMATORIA 2.2 305.0 10.0 9.0
(∑)
❑ Distribución de colonias sin confirmación:
Niemelä, J4/2003
Volumen de Recuento
Dilución (f)
muestra s (zi o
(v) nci)
1 142
-3
1 134
0.1 16
-4
0.1 13
ISO 29201:2012
SUMATORIA (∑) 2.2 305.0
1
𝑤2𝑍 = 𝑢2 = = 0.0033
𝑑,𝑟𝑒𝑙 305
61
❑ Distribución de colonias con Niemelä, J4/2003
confirmación:
Confirmación de Colonias
Recuentos
Probadas Confirmadas
(zi o nc)
(ni o nz) (ki o nk)
142 3 3
134 3 2
16 2 2 ISO 29201:2012
13 2 2
305.0 10.0 9.0
1 1 1
𝑤2𝑋 = 𝑢2 =
𝑥,𝑟𝑒𝑙 305 9+ 10− = 0.0144
Incertidumbre
estándar relativa
Niemelä, J4/2003
❑ Dilución:
Volumen Recuento
Dilución ( f )
de s (zi o
k : número de
muestra nci) diluciones (todas
(v) iguales)
-3
1 142 ISO 29201:2012
1 134
0.1 16
-4
0.1 13
SUMATORIA 2.2 305.0
(∑)
a = 1 ml , b = 9ml
2
2 2 9
𝑤 =𝑢 = 0.00015 + 0.00017 = 0.0003
𝑓 𝑓,𝑟𝑒𝑙 1+9
𝑤2 = 𝑢2 = 3 × 0.0003 = 0.0009
𝐹 𝐹,𝑟𝑒𝑙
❑ Dilución:
a = 1 ml , Tolerancia = ± 0.01 ml
21𝑚𝑙 = 𝑢2 + 𝑢2 + 𝑢2 𝑟𝑒𝑝
𝑢 𝑐𝑎𝑙 𝑇°𝐶
/
𝑢𝑐𝑎𝑙 = 0.01 6 = 0.0041
𝑢 = 𝑎 × ∆𝑇 × 𝐶𝐷 / 3 = 1 × 3 × 2.1 × 10−4
/
3 = 0.0004
𝑇°𝐶
2 = 0.0001
𝑢 𝑟𝑒𝑝
21𝑚𝑙 = 0.00412 + 0.00042 + 0.0001 = 0.00015
𝑢
/
𝑢
21𝑚𝑙,𝑟𝑒𝑙
= 0.00015 12 = 0.00015
VOLUMEN: 1 ml
Analistas
Repeticiones (n)
ABC DFG HIJ Promedio
1 1.01 0.98 1.01 1.00
2 1.02 0.99 0.98 1.00
3 1.00 1.00 1.00 1.00
4 1.00 1.00 1.01 1.00
5 0.99 1.01 1.00 1.00
6 1.00 1.00 0.99 1.00
7 0.99 1.02 1.00 1.00
8 0.98 1.00 1.00 0.99
9 1.00 0.98 1.02 1.00
10 1.01 0.99 1.00 1.00
2
si 0.0001 0.0002 0.0001 1.00
n-1 9 9 9 27.0000 ∑ (n-1)
2 2
si (n-1) 0.0012 0.0014 0.0011 0.0037 ∑ (si )
s2 (U2rep) 0.0001
❑ Dilución:
b = 9 ml , Tolerancia = ± 0.1 ml
29𝑚𝑙 = 𝑢2 + 𝑢2 + 𝑢2 𝑟𝑒𝑝
/
𝑢𝑐𝑎𝑙 = 0.1 6 = 0.0408
𝑢 = 𝑎 × ∆𝑇 × 𝐶𝐷 / 3 = 9 × 3 × 2.1 × 10−4 / 3 = 0.0033
𝑇°𝐶
2 = 0.0121
𝑢 𝑟𝑒𝑝
2
𝑢 9𝑚𝑙 = 0.04082 + 0.00332 + 0.0121 = 0.01378
2 / 2
𝑢 9𝑚𝑙,𝑟𝑒𝑙 = 0.01378 9 = 0.00017
VOLUMEN: 9 ml
Analistas
Repeticiones
(n) ABC DFG HIJ Promedio
1 9.11 9.09 9.12 9.11
2 8.87 8.87 8.88 8.87
3 9.08 8.95 8.95 8.99
4 9.12 9.15 9.07 9.11
5 8.87 8.93 9.13 8.98
6 8.91 8.86 9.06 8.94
7 9.07 9.09 9.08 9.08
8 9.13 9.13 9.13 9.13
9 8.92 8.88 8.87 8.89
10 8.95 9.04 8.89 8.96
2
si 0.0117 0.0128 0.0118 9.01
n-1 9 9 9 27.0000 ∑ (n-1)
2 2
si (n-1) 0.1054 0.1155 0.1058 0.32666 ∑ (si )
s2 (U2rep) 0.0121
❑ Volumen inoculado:
Dilución (f) Volumen de muestra (vi) Recuentos (zi o nci)
1 142
-3
1 134
0.1 16
-4
0.1 13
SUMATORIA (∑) 2.2 305.0
Niemelä, J4/2003
ISO 29201:2012
f : factor de dilución (10 veces), n: número de placas por

dilución (2)
❑ Volumen inoculado:
a = 1 ml , Tolerancia = ± 0.01 ml
21𝑚𝑙 = 𝑢2 + 𝑢2 + 𝑢2 𝑟𝑒𝑝
𝑢𝑐𝑎𝑙 = 0.01/ 6 = 0.0041

/
𝑢𝑇°𝐶 = 1 × 3 × 2.1 × 10−4 3 = 0.0004
2 = 0.0001
𝑢 𝑟𝑒𝑝
2 2
21𝑚𝑙 = 0.0041 + 0.0004 + 0.0001 = 0.0001
𝑢
21𝑚𝑙,𝑟𝑒𝑙 Τ 2
𝑢 = 0.0001 1 = 0.0001
𝑤2𝑉 = 2𝑥0.0001 + 0.12 2𝑥0.0001 + 0.0003 /2.22 =

0.000042
𝑤2𝑉 = 2𝑥0.0001/2.22 = 0.000041 (aproximación)
2 𝑟𝑒𝑙,Σ𝑉 = 1/(10 + 1)2 0.0001

102 + 1 + 0.0001 =
𝑢 2
0.000043
2 = 0.0001/2 = 0.00005 (aproximación)

𝑢 𝑟𝑒𝑙,Σ𝑉
❑ Submuestreo (efecto matriz):
❑ Niemelä no lo considera
Condiciones:
▪ Repetibilidad. (6 a 10 repeticiones)
▪ Repeticiones del submuestreo ensayo (k ≥ 2) y
(n ≥ 2). del
▪ Muestra natural representativa de la matriz a
evaluar.
▪ Bajo nivel de contaminación <30 UFC/g,
100
UFC/g>.
ISO 29201:2012
MATRIZ : Carnes Resultados Transformación

Submuestra Muestra Conteo en Conteo en Conteo 1 Conteo 2
(k) representativa placa (n=1) placa (Ln) (Ln)
(n=2)
1 Cruda picada 65 63 4.174 4.143
2 Cruda picada 63 66 4.143 4.190
3 Cruda picada 64 68 4.159 4.220
4 Cruda picada 64 66 4.159 4.190
5 Cruda picada 62 65 4.127 4.174
6 Cruda picada 63 61 4.143 4.111
7 Cruda picada 66 63 4.190 4.143
8 Cruda picada 65 64 4.174 4.159
9 Cruda picada 65 68 4.174 4.220
10 Cruda picada 64 62 4.159 4.127
❑ Submuestreo (efecto ISO 29201:2012

matriz):
ANÁLISIS DE VARIANZA
Análisis estadístico: Origen de las Suma de Grados de Promedio de los
▪ ANOVA de un factor (Excel). variaciones cuadrados libertad cuadrados
▪ Análisis de varianza agrupado Entre grupos 0.007712416 9 0.000856935

Dentro de los 0.008242498 10 0.00082425
por filas. grupos
▪ Nivel de confianza, α=0.05.
Total 0.015954914 19
0.0008569 − 0.0008243
𝑠2𝐵 = = 0.00002 ≈ 𝑢2 𝑀,𝑟𝑒𝑙 𝑠𝐵 = 0.00002 = 0.004 ≈ 𝑢 𝑀,𝑟𝑒𝑙
2
ISO 29201:2012
k = número de submuestra
n = número de placa
(repetición)
Entre las 6 submuestras
Dentro de cada submuestra
Total de las muestras
SS= varianza de la suma
CT = Termino de corrección
MS = Media de la varianza
❑ Submuestreo (efecto matriz):
Análisis estadístico:
Ejemplo. Se obtuvieron
recuentos: Cuadrado de la Suma
Serie de Suma de la
Sub muestras nc Ln nc ( Ln nc)2 de la submuestra Ln
diluciones submuestra Ln nc
nc
1 34 3.52636052 12.4352185
1
2 45 3.80666249 14.4906793 7.333023014 53.77322653
1 50 3.91202301 15.303924
2
2 61 4.11087386 16.8992839 8.02289687 64.36687418
1 60 4.09434456 16.7636574
3
2 72 4.27666612 18.2898731 8.371010681 70.07381983
1 82 4.40671925 19.4191745
4
2 70 4.24849524 18.0497118 8.655214489 74.91273786
1 58 4.06044301 16.4871974
5
2 64 4.15888308 17.2963085 8.219326094 67.55732144
1 40 3.68887945 13.6078316
6
2 59 4.07753744 16.6263116 7.766416898 60.31723143
∑ Ln nc 48.36788805
∑ (Ln nc)2 195.6691718 CT 194.9543828 MS
∑ (Ln nc)2 sub 391.0012113 ENTRE 0.546222792 0.10924456
DENTRO 0.168566161 0.0281
TOTAL 0.714788953 0.06498081
Wm 0.201432617
❑ Conteo de colonias: Niemelä, J4/2003 ISO 29201:2012

Condiciones : Placa
Conteo de los 𝑤2 𝑜 𝑢2
▪ Varios analistas analistas 𝑡 𝐿,𝑟𝑒𝑙
𝑥ҧ s
1 A B C (s/𝑥ҧ)2
(reproducibilidad). 2 62 58 63 61.00 2.646 0.0019
▪ Niveles concentración 3 224 227 230 227.00 3.000 0.0002
(bajo, medio y alto). 4 65 66 63 64.70 1.528 0.0006

5 193 187 190 190.00 3.000 0.0002
▪ Mismo método y
6 65 64 64 64.30 0.5.77 0.0001
matriz. Wt2 (Promedio) 0.0006
𝑥ҧ = Media
Cuanto influye la capacidad s = desv. Estandar
(s/𝑥ҧ) = desv. Estandar
del analista en reconocer relativa
❑ Conteo de colonias: Niemelä, J4/2003 ISO 29201:2012
Volumen de Recuentos
Dilución ( f )
muestra (v) (zi o nci)
1 142
-3
1 134
0.1 16
-4
0.1 13
SUMATORIA 2.2 305.0
(∑) 1422 + 1342 + 162 + 132
𝐷𝑎𝑡𝑜: 𝑤2𝑇 = 0.0006 ×
3052
𝑤2𝑡 𝑜 𝑢2 = 0.0006 38545
𝐿,𝑟𝑒𝑙
𝑤2𝑇 = 0.0006 × = 0.00024
93025
❑ Incubación: tiempo y posición
Condiciones
▪ Repetibilidad. ISO 29201:2012
▪ Sembrar 6 a 10 placas en paralelo.
• Conteos bajos
• Técnica de diseminación (0.1 ml,
entre 30 – 100 UFC)
▪ Ubicar las placas al azar (niveles
y ruma max 4)
▪ Incubar por tiempos cortos.
▪ Adicionar al azar al tiempo de
incubación entre 0 a 8 horas .
•Incubación: tiempo y posición
ISO 29201:2012
Muestra 1 (Día 1) Incubadora: ID-01 Muestra 2 (Día 2) Incubadora: ID-01
Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo
Ubicaci Conteo Ubicaci Conteo
Placa Nivel Ruma mínimo adicional Placa Nivel Ruma mínimo adicional
ón (nc) ón (nc)
(h) (h) (h) (h)
1 1 4 2 18 3.5 68 1 2 12 1 18 1.5 194
2 2 11 1 18 5.0 74 2 1 3 2 18 3.0 214
3 3 7 3 18 1.5 51 3 3 9 3 18 5.5 223
4 1 5 4 18 4.0 67 4 3 6 1 18 2.0 209
5 2 10 2 18 6.0 56 5 2 11 4 18 4.0 237
6 3 12 2 18 2.5 63 6 1 5 3 18 6.5 201
u =s u =s
nc1,rel nc1 nc2,rel nc2
/ / 0.0727
𝑥ҧ 0.1334 𝑥ҧ
u 2 0.0178 u 2 0.0053
nc1,rel nc2,rel
Dist. Poisson u 2=1/ u 2=1/
Z1,rel Z2,rel
𝑥ҧ 0.0158 𝑥ҧ 0.0047
u =s /
Incertidumbre estandar relativa : nc1,rel nc1 𝑥ҧ
S
nc1 = desv. estandar
𝑥ҧ = promedio
Cálculos:
ISO 29201:2012
2𝑛 2𝑖1,𝑟𝑒𝑙 = 𝑢2𝑛 1,𝑟𝑒𝑙 𝑢2 2

− +𝑍1,𝑟𝑒𝑙 + 𝑢2Σ𝑉,𝑟𝑒𝑙
2 = 𝑠𝑐 𝑢 𝑐 𝑢 𝐿,𝑟𝑒𝑙
𝑢 𝑛𝑐,𝑟𝑒𝑙 𝑥ҧ 𝑛2
𝑐 2𝑖1,𝑟𝑒𝑙 = 0.0178 − 0.0158 + 0.0006 + 0.00004 = 0.0019
𝑢
1 2𝑖2,𝑟𝑒𝑙
2
= 𝑛𝑢2,𝑟𝑒𝑙 − 𝑍2,𝑟𝑒𝑙 2 + 𝑢2 + 𝑢2
= 𝑢 𝑐 𝑢 𝐿,𝑟𝑒𝑙 Σ𝑉,𝑟𝑒𝑙
2
𝑢 𝑍,𝑟𝑒𝑙 𝑥ҧ𝑛 𝑐 2
𝑢𝑖2,𝑟𝑒𝑙 = 0.0053 −(0.0047 + 0.0006 + 0.00004)= 0.0005
0.0019 − 0.0005
2 = = 0.0014
𝑢 𝐼,𝑟𝑒𝑙 2
Cálculos:
Muestra 1
Placa Bandeja Area Nivel en pila Tiempo z
1 2 5 5 19.50 25
2 1 4 4 18.00 40
3 1 3 1 22.00 54
4 3 6 1 21.50 32
5 3 4 6 19.50 20
6 1 1 4 21.00 35
Media 34.3333333
SD 11.9777572
RSD 0.34886671
❑ Combinación de incertidumbres
ISO 29201:2012:
▪ Modelos de dos componentes:
ISO 29201:2012:
Componente Símbolo Varianza relativa

Dilución u 2 0.000900
F,rel
Volumen u 2 0.000043
V,rel
u 2
Submuestreo M,re 0.000020
u 2
l y = ΣC / [V(n1+0.1n
2 )d]
Conteo L,re
l
0.000600
u 2 y = 305 / [1(2+2x0.1)x10-3
Incubación I,re
l
0.001200
u 2 ]
Subtotal O,re
l
0.002763
u 2
Distribución (conf) d,re
l
0.014400 y = 138 363 ≈ 140 000
Suma: u 2+ u 2 u 2 0.017163
O,rel d,rel
u
c,rel
y = 1.4 x 105
c,rel 0.131769
ISO 29201:2012:
▪ Modelo de dos componentes:
En intervalo de En escala relativa y En escala logarítmica

escala normal Logaritmica natural común
(sin confirmación)
ISO 29201:2012:
▪ Modelos de dos componentes:
En intervalo de escala En escala relativa y

Modelo global (sin confirmación) logarítmica natural
(con confirmación)
❑ Expresión de la incertidumbre
ISO 29201:2012:

Dilución u 2 0.000900
F,rel
u 2
Volumen V,rel
0.000043
u 2
Submuestreo M,rel
0.000020
Conteo u 2 0.000600
L,rel
Incubación u 2 0.001200
I,rel
Subtotal u 2 0.002763
O,rel
Distribución u 2 0.014400
d,rel
Suma: u 2+ u 2 u 2 0.017163
O,rel d,rel c,rel
u 0.131769
c,rel
❑ Incertidumbre expandida
ISO 29201:2012:
En intervalo de escala
𝑢𝑐 = 1,4 × 105 + 0,002963 × 1.4 × 105 2 = 7630
𝑈 = 2 × 𝑢𝑐 = 15260 ≈ 15000 = 1.5 × 104

y = 1.4 x 105
Límite superior: y = 1.4 x 105 + 1.5 x 104 = 1.6 x 105
Límite inferior: y = 1.4 x 105 ‒ 1.5 x 104 = 1.3 x 105
En escala relativa y
logarítmica natural
(con confirmación)
U = 2 x uc,rel = 2 x 0.13 = 0.26

y = 1.4 x 105 = 11.85 en ln
Límite superior: y = 1.4 x 105 x exp(0.26) = 1.8 x 105
y = 11.85 + 0.26 = 12.11 en ln (e12.11 = 1.8 x 105 )
Límite inferior: y = 1.4 x 105 / exp(0.26) = 1.1 x 105
y =11.85 - 0.26 = 11.59 en ln (e11.59 = 1.1 x 105 )
Factor de conversión= 0.1886
En escala logarítmica
común
0.1886
𝑢𝑐(𝑙𝑔) = + 0,002763 × 0.1886 = 0.029
1,4 × 105
𝑈 = 2 × 𝑢𝑐(𝑙𝑜𝑔) = 0.0457 en lg
y = 1.4 x 105 = 5.1 en lg
Límite superior: y = 5.1461 + 0.0457 = 5.2 en lg 105 .2= 1.6 x 105
Límite inferior: y = 5.1461 ‒ 0.0457 = 5.1 en lg 105 .1= 1.3 x 105
Niemelä, J4/2003:
▪ Modelo de alta incertidumbre productiva:
Niemelä, J4/2003:

𝑤𝑦 = 𝑤2 + 𝑤2 + 𝑤2 + 𝑤2 + 𝑤2 + 𝑤2
Dilución 2 0.000900 𝑋 𝐹 𝑉 𝑀 𝑇 𝐼
wF
2
Volumen wV 0.000043
Submuestreo 2 0.000020
wM 𝑤𝑦 = 0.13
Conteo wT2
2 0.000240
Incubación wI 0.001200
𝑢𝑦 = 𝑦 × 𝑤𝑦
Distribución (confir) wX
2 0.014400
Suma 0.016303 5
wy
2
𝑢𝑦 = 1.4 × 10 × 0.13 =
Incertidumbre relativa wy 0.130396 18200
❑ Incertidumbre expandida
Niemelä, J4/2003:
𝑢𝑦 = 18200
𝑈 = 𝑘 × 𝑢𝑦 = 2 × 18200 = 36400
Niemelä, J4/2003:
𝑈 = 𝑘 × 𝑢𝑦 = 2 × 18200 = 36400 = 3,6 × 104
y = ΣC / [V(n1+0.1n2)d] Límite superior: y = 1.4 x 105 + 3.6 x 104 = 1.8 x

105
y = 305 / [1(2+2x0.1)x10-3]
Límite inferior: y = 1.4 x 105 ‒ 3.6 x 104 = 1.0 x 105
y = 138 363 ≈ 140 000
y = 1.4 x 105
Niemelä, J4/2003: (sin usar factor de cobertura)
Genera no conformidad en INACAL
𝐴𝑝𝑟𝑜𝑥𝑖𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑎 𝑢𝑛 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑣𝑎𝑙𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑓𝑖𝑎𝑛𝑧𝑎
𝑎𝑙 95%
𝐿í𝑚𝑖𝑡𝑒 𝑖nfe𝑟𝑖𝑜𝑟
𝐿í𝑚𝑖𝑡𝑒 𝑠𝑢𝑝𝑒𝑟𝑖𝑜𝑟
y = ΣC / [V(n1+0.1n2)d]
y = 305 / [1(2+2x0.1)x10-3]
y = 138 363 ≈ 140 000 L.S.: y = 1.4 x 105 (1+2x0.13) = 1.8 x 105
y = 1.4 x 105 L.S.: y = 1.4 x 105 (1‒2x0.132)/ (1+2x0.132) = 1.3 x 105


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4.

CONTROL DE CALIDAD DE ENSAYOS

Controles de tercer Nivel

➢ Después de el enjuague se procede a incubar

➢ Pasado el tiempo de incubación se verifica

➢ Se considera un resultado aceptable

➢ Indicador Biológico: Consiste en preparaciones estandarizadas de

➢ Pasado el tiempo de incubación, revisar el cambio de viraje del

➢ Los controles químicos se realizan comúnmente mediante

➢ Se coloca una cinta indicadora de vapor o calor seco y cuando

➢ Atendiendo a su grado de impureza, el agua de

➢ Agua de Grado 1.- Exenta de partículas sólidas, sus impurezas

➢ Agua de Grado 2.- Agua con presencia de partículas y coloides

➢ Agua de Grado 3.- Apropiada para la mayoría de los procesos

68 Referencia SMEWW- APHA-AWWA-WEF 9020B

➢ Conductividad: propiedad indicativa del contenido total en sales

➢ Carbono orgánico total (COT): hace referencia a la

➢ Metales pesados : Los ejemplos de metales pesados incluyen el

➢ Cloro residual : El cloro residual libre en el agua se

➢ Evaluación del cloro residual

➢ Conteo en placa de heterótrofos:

➢ Esterilización ultravioleta: Proceso de

➢ UV-C: Se sitúa en un intervalo de longitudes de onda de

¿Cómo desinfecta una luz UV-C?

Cuando la luz UV se encuentra con

➢ Las lámparas UV en laboratorio se debe limpiar con etanol al 70%.

➢ Cultivar la cepa de Escherichia Coli por 24 horas.

➢ Luego de las exposiciones a luz colocar la tapa sin sellarlas

➢ Realizar la incubación de las placas de APC a 35 °C por 48 horas.

➢ Para el cálculo de porcentaje de reducción se usa la siguiente

➢ Medios de cultivo: Son necesarios para el aislamiento,

➢ Clasificación de medios de cultivo:

-Enriquecido: son medios no selectivos que se

❑ Requisitos de los medio de cultivo provistos por el fabricante:

• Nombre del medio y lista de componentes, incluido cualquier

• Fecha de vencimiento del medio.

• Controles físicos y criterios de aceptabilidad aplicados.

2. El almacenamiento debe realizarse en las

En medios selectivos y/o diferenciales hay que evaluar:

➢ Para evaluar cada lote de medio de cultivo según Norma ISO/TS

➢ Se puede emplear los siguientes métodos:

➢ Evaluación de la calidad de los medios de cultivo: La elección

➢ Para las pruebas semi-cuantitativas o

➢ Para las pruebas cuantitativas la proporción de Productividad PR

Productividad: Criterio de conformidad

2) Ns ( dil -6):100 ufc

• Productividad: Pruebas semi-cuantitativas en medios de

➢ Se inocula en forma de estrías diluciones del cultivo

Productividad: Pruebas semi-cuantitativas en medios de cultivos

Productividad: Pruebas cualitativas

➢ Score para medios sólidos:

Productividad: Pruebas cualitativas

➢ Evalúa reacciones características: gas y turbidez.

Registro evaluación de medios de cultivo

Registro evaluación de medios de cultivo

➢ En microbiología es necesario demostrar la

Para qué se emplean las cepas de referencia en microbiología?

Los cultivos (cepas) de referencia pueden ser:

➢ Cepas de reserva: Subcultivos de microorganismos obtenidos a

Las cepas de referencia deben tener:

➢ La manipulación y modo de conservación de los cultivos de

▪ El deterioro de las cepas.

➢ Su crecimiento característico debe ser documentado sobre cada