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Recibido: 31 de agosto de 2021| Aceptado: 8 de febrero de 2022

DOI: 10.1111/iej.13710

REVISAR

Un análisis crítico de métodos de investigación y modelos

experimentales para estudiar regantes y sistemas de riego.

Christos Boutsioukis1 |María Teresa Arias Moliz2 |Luis E. Chávez de Paz3

1Departamento de Endodoncia, Abstracto

Centro Académico de Odontología
La irrigación juega un papel esencial en el tratamiento de conductos. El propósito de esta revisión
de Ámsterdam (ACTA), Universidad
de Ámsterdam y Vrije Universiteit narrativa fue evaluar críticamente los métodos y modelos experimentales utilizados para estudiar
Amsterdam, Ámsterdam, Países irrigantes y sistemas de riego y proporcionar direcciones para futuras investigaciones. Los estudios
Bajos
sobre el efecto antimicrobiano de los irrigantes deben utilizar biopelículas maduras de múltiples
2Departamento de Microbiología, Facultad de
Odontología, Universidad de Granada,
especies cultivadas en la dentina o dentro de los conductos radiculares y deben combinar al menos
Granada, España dos métodos de evaluación complementarios. La disolución de los restos de tejido pulpar debe
3Práctica privada, Estocolmo, Suecia examinarse en presencia de dentina y, preferiblemente, dentro de los conductos radiculares

humanos. La tomografía microcomputada es actualmente el método de elección para la evaluación

Correspondencia
Christos Boutsioukis, Departamento de de los restos dentinarios acumulados y su eliminación. Se necesita una combinación de
Endodoncia, Centro Académico de experimentos en conductos radiculares transparentes y modelos numéricos para abordar la
Odontología de Ámsterdam (ACTA),
penetración del irrigante. Finalmente, los modelos para evaluar la extrusión de irrigante a través del
Universidad de Ámsterdam y Vrije
Universiteit Amsterdam, Gustav agujero apical deberían simular los tejidos periapicales y proporcionar datos cuantitativos sobre la
Mahlerlaan 3004, 1081 LA, Ámsterdam,
cantidad de irrigante extruido. Imitando elen vivocondiciones lo más cercanas posible y la
Países Bajos.
Correo electrónico:c.boutsioukis@acta.nl
estandarización de las muestras y los protocolos experimentales son requisitos universales,

independientemente del criterio de valoración sustituto estudiado. Se deben abandonar los modelos

obsoletos y poco realistas en favor de otros más apropiados y válidos que tengan una aplicación y

traducción más directa a la endodoncia clínica.

PALABRAS CLAVE

biopelícula, desechos, extrusión, irrigante, penetración, tejido pulpar, barrillo dentinario

INTRODUCCIÓN Las complejidades y la presencia de bacterias como estructuras de

La irrigación juega un papel esencial durante el tratamiento de
conducto (Zehnder,2006). El paradigma actualmente aceptado
sugiere que los irrigantes logran la mayor parte de la limpieza y
desinfección del sistema de conductos radiculares, mientras que la
instrumentación es principalmente un medio para obtener acceso a
la anatomía apical (Gulabivala et al.,2005), ya que los instrumentos
no pueden llegar a muchas áreas (Peters,2004). Anatómico
biopelículas adherentes a la superficie son los principales desafíos
para el riego (Chávez de Paz & Ordinola Zapata,2019) y motivar un
interés de investigación continuo. Como resultado, se han publicado
una gran cantidad de estudios sobre este tema y continuamente se
realizan nuevos estudios. Evidentemente no todos ellos son
aceptados para su publicación. Un informe reciente sugirió que
aproximadamente el 85% de todos los manuscritos (incluidos
aquellos sobre irrigación) que se envían a un

Este es un artículo de acceso abierto bajo los términos delCreative Commons Atribución-NoComercial-SinDerivadasLicencia, que permite el uso y distribución en cualquier medio,
siempre que se cite adecuadamente la obra original, el uso no sea comercial y no se realicen modificaciones o adaptaciones.
© 2022 Los Autores.Revista Internacional de Endodonciapublicado por John Wiley & Sons Ltd en nombre de la Sociedad Británica de Endodoncia

Int Endod J.2022;55(Suplemento 2):295–329. wileyonlinelibrary.com/journal/iej |295

296 | MÉTODOS PARA ESTUDIAR EL RIEGO
TABLA 1 Ejemplos de experimentos de investigación básica y traslacional para diversos criterios de valoración sustitutos utilizados en estudios de irrigación del conducto radicular
Punto final sustituto Investigación básica
Efecto antimicrobiano Medición del mínimo inhibidor
concentración de un irrigante contra
bacterias planctónicas
Disolución de restos de tejido pulpar. Disolución de tejido de pulpa bovina mediante un irrigante.
en un tubo de ensayo
Eliminación de restos de dentina Disolución de restos de dentina mediante un irrigante en
un tubo de ensayo
revista líder en endodoncia son rechazados (Ahmad et al.,
2019), a menudo debido a importantes fallas metodológicas
y de diseño experimental (Nagendrababu et al.,2021). Este es
un problema importante debido al tiempo y recursos
invertidos en estos estudios.
Los esfuerzos para mejorar la calidad de los manuscritos
presentados han llevado al desarrollo de pautas de presentación de
informes para varios tipos de estudios en Endodoncia
(Nagendrababu et al.,2020), pero estas pautas se centran en la
preparación del manuscrito más que en el diseño y la metodología
del estudio. La metodología de los estudios sobre irrigación del
conducto radicular fue evaluada críticamente hace una década (Shen
et al.,2012), por lo que se justifica una actualización que cubra los
últimos avances en este campo. Esta información podría ayudar a los
investigadores a seleccionar los métodos y modelos más adecuados.
El conocimiento de sus fortalezas y debilidades también puede
ayudar a los autores de futuras revisiones sistemáticas y a los
lectores a interpretar los hallazgos de los estudios publicados y
distinguir entre investigaciones confiables y no confiables.
La investigación sobre la irrigación del conducto radicular implica
una amplia variedad de métodos y modelos, que van desde la
investigación básica y traslacional (o aplicada) hasta la investigación
clínica. La investigación básica tiene como objetivo generar
conocimiento sobre mecanismos fundamentales relacionados, por
ejemplo, con la biopelícula, las reacciones químicas y la acción física
de los irrigantes, sin intentar extrapolar los hallazgos directamente a
la práctica clínica. La investigación traslacional, por otro lado, tiene
como objetivo refinar este conocimiento y traducirlo en mejores
tratamientos para los pacientes utilizando modelos de laboratorio o
animales que imiten fielmente elen vivocondiciones en humanos
(Fang & Casadevall,2010). Los estudios clínicos son la prueba
definitiva para estos tratamientos donde se evalúan en condiciones
de la vida real.
El principal resultado de interés en endodoncia clínica es la
prevención o curación de la periodontitis apical (Azarpazhooh et
al.,2022; Ørstavik,2019), pero muy pocas publicaciones sobre
irrigación del conducto radicular lo han informado (Liang et al.,
2013). Para facilitar la investigación básica y traslacional basada
en laboratorio, criterios de valoración sustitutos, como el efecto
antimicrobiano, la disolución del tejido pulpar
Investigación traslacional
Matanza/eliminación de una biopelícula multiespecífica
cultivado dentro de un conducto radicular humanoex-vivo
por un irrigante
Evaluación histológica del tejido pulpar.
restos de conductos radiculares humanos irrigados
ex-vivo
Evaluación micro-CT del acumulado.
Restos de dentina en conductos radiculares de dientes
humanos extraídos después de la irrigación.
En su lugar se han utilizado restos de dentina, eliminación de restos
de dentina y barro, y la penetración del irrigante en el sistema de
conductos radiculares. Del mismo modo, la extrusión involuntaria de
irrigante a través del agujero apical se ha utilizado como criterio de
valoración sustituto para los accidentes de extrusión, que son un
efecto secundario importante, aunque raro, de la irrigación
(Boutsioukis et al.,2013). Estos criterios de valoración son más fáciles
de cuantificar que los resultados primarios correspondientes y
requieren períodos de observación más cortos, por lo que han
dominado la literatura en este campo, aunque a menudo carecen de
la validación necesaria y su correlación con los resultados primarios
se basa en suposiciones. Algunos ejemplos de experimentos de
investigación básica y traslacional por criterio de valoración sustituto
se pueden encontrar entabla 1.
El propósito de esta revisión narrativa fue evaluar críticamente
los métodos y modelos experimentales actuales que se utilizan para
estudiar irrigantes y sistemas de riego y proporcionar direcciones
para futuras investigaciones. La revisión está organizada según los
distintos puntos finales de interés.
EFECTO ANTIMICROBIANO
Debido al papel clave de las bacterias en el desarrollo de la
enfermedad pulpar y periapical (Chávez de Paz,2007; Kakehashi y
otros,1965; Möller et al.,1981), la reducción de la carga microbiana
intracanal es sin duda el criterio de valoración sustituto más
relevante al estudiar la irrigación del conducto radicular. Hay
evidencia de que este criterio de valoración se correlaciona con la
curación de la periodontitis apical, al menos en dientes
unirradiculares evaluados mediante imágenes bidimensionales
(Sjögren et al., 1997), pero es necesario confirmar estos hallazgos en
los dientes posteriores mediante imágenes tridimensionales.
Pruebas de contacto directo en cultivos planctónicos
(in vitro)
Los cultivos planctónicos se han utilizado ampliamente para determinar el
efecto antimicrobiano de los irrigantes del conducto radicular (Generali
BOUTSIOUKIS et al.
y otros,2020; Li y otros,2020; Nudera et al.,2007; Tong et al., 2011
; Torabinejad et al.,2003). Estas pruebas sencillas con bacterias
en fase líquida miden la concentración mínima inhibidora y la
concentración mínima bactericida de un irrigante (Andrews,2011
). Como las bacterias planctónicas rara vez se encuentran en
condiciones reales en el conducto radicular, la relevancia clínica
de estas pruebas es muy limitada.
Otro método que se utilizó ampliamente en el pasado es la
prueba de difusión en agar (Sassone et al.,2008; Siqueira et al.,
2000). Aunque simple y fácil de realizar, esta prueba tiene
importantes limitaciones que comprometen la validez de los
resultados. El efecto antimicrobiano medido se ve fuertemente
afectado por la capacidad de los irrigantes de difundirse a través
del agar, que depende de su peso molecular. Por tanto, las
comparaciones entre diferentes irrigantes no son fiables.
Además, las bacterias se encuentran en un estado planctónico y
la prueba no puede distinguir entre efectos bacteriostáticos y
bactericidas (Tobias,1988). Al contrario de su uso para
determinar la eficacia de los antibióticos sistémicos contra
bacterias específicas (Bonev et al.,2008), no existen estándares
aceptados para su uso para comparar irrigantes (Shen et al.,
2012). Por lo tanto, esta prueba no debe usarse para comparar la
actividad antimicrobiana de los irrigantes del conducto radicular,
ni siquiera como paso de selección preliminar (Consejo Editorial
del Journal of Endodontics,2007).
Modelos de biopelículasin vitroyex-vivo
Las infecciones del conducto radicular son causadas por biopelículas
microbianas de múltiples especies organizadas en comunidades
heterogéneas adheridas a las superficies dentinarias (Svensäter &
Bergenholtz, 2004). El modo de crecimiento de las biopelículas ofrece
varias ventajas sobre sus homólogos planctónicos, por ejemplo, una
mayor resistencia a los agentes antimicrobianos (Costerton et al.,1999).
Varios factores contribuyen a la resistencia a los antimicrobianos; la
sustancia polimérica extracelular (EPS) actúa como barrera de difusión y
dificulta la penetración de antimicrobianos en la biopelícula; la diferente
disponibilidad de oxígeno y nutrientes obliga a las células a entrar en
estados metabólicos de crecimiento lento o de hambre en las capas
internas de la biopelícula, volviéndolas menos susceptibles a los
antimicrobianos; Las 'células persistentes' existentes expresan un
fenotipo altamente persistente cuando se exponen a antimicrobianos
(Costerton et al., 1999; Folkesson et al.,2008; Hall-Stoodley et al.,2004;
Luis,2007); El gran número y la alta diversidad de microorganismos
dentro de la biopelícula facilitan la transferencia de genes que pueden
conferir resistencia a antibióticos y antimicrobianos (Lerminiaux &
Cameron,2019). Esta mayor resistencia a los antimicrobianos se ha
observado en bacterias aisladas de conductos radiculares infectados
(Chávez de Paz et al.,2007). En general, las biopelículas son el objetivo
principal de los irrigantes y, por lo tanto, se utilizan una variedad de
métodos para determinar su
|297
efecto antimicrobiano contra el crecimiento de biopelículasin vitrooex-
vivo.
Estructura y composición de la biopelícula.
La mayoría dein vitroLos modelos de biopelículas utilizados para
estudiar el efecto de la irrigación del conducto radicular se han
compuesto de una única especie bacteriana (Du et al.,2014; Morago
et al., 2019; Rodrigues et al.,2018; Zeng et al.,2020),
predominantementeenterococo faecalis. Las biopelículas de una sola
especie son fáciles de cultivar y permiten un alto rendimiento
experimental (Swimberghe et al.,2021). En el pasado, se pensaba que
esta especie sobrevivía a los procedimientos de tratamiento y
persistía incluso como una monoinfección, lo que provocaba el
fracaso del tratamiento (Siren et al.,1997; Sundqvist et al.,1998). Sin
embargo, estudios más recientes han cuestionado su papel (Zehnder
& Guggenheim, 2009; Zehnder y Paqué,2011).mi.faecalisno está
presente en muchos casos fallidos y, cuando se encuentra, casi
nunca se encuentra entre las especies más prevalentes (Bouillaguet
et al.,2018; Siqueira et al.,2016; Zandi et al.,2018). Quizás la
característica más atractiva demi.faecalises su capacidad para tolerar
una amplia gama de condiciones de crecimiento, lo que facilita
enormemente su manipulación en el laboratorio. Es probable que la
atención injustificada prestada a una sola especie haya desviado
nuestra comprensión del efecto antimicrobiano de varios irrigantes.
Por ejemplo, mi.faecalises particularmente susceptible a la
clorhexidina y los primeros estudios de laboratorio que utilizaron
solo esta especie llegaron a la conclusión errónea de que la
clorhexidina es un agente antimicrobiano muy fuerte que podría
potencialmente reemplazar al NaOCl (Menezes et al.,2004). Un
trabajo más reciente que utiliza biopelículas multiespecies ha
anulado esta conclusión (Ruiz-Linares et al.,2017).
Aunque los modelos de biopelículas de una sola especie
representan una clara mejora con respecto a las bacterias
planctónicas utilizadas en el pasado, todavía no se parecen a las
condiciones de la vida real, ya que tienen una naturaleza
multiespecífica (Bouillaguet et al.,2018; Gomes et al.,2015; Siqueira y
Rôças,2014; Zandi et al.,2018). Interacciones complejas entre
especies (Tan et al.,2017) dan como resultado una mayor producción
de biopelículas, una mayor virulencia y una mayor resistencia a
varios antimicrobianos (Jiang et al.,2011a; Stojicic et al.,2012). Así, se
han establecido modelos de biopelículas multiespecíficas formados a
partir de cepas de laboratorio o aislados clínicos de bacterias del
conducto radicular (Busanello et al.,2019; Chávez de Paz, 2012;
Marinković et al.,2020; Swimberghe et al.,2021). Estos modelos
suelen incluir un pequeño número de especies seleccionadas en
función de su disponibilidad y compatibilidad entre especies. Sin
embargo, incluso los modelos multiespecíficos pueden no ser
capaces de replicar las comunidades naturales de conductos
radiculares debido a las diferencias en las condiciones ambientales y
la dificultad para incluir microorganismos con requisitos de cultivo
restringidos (Chávez de Paz & Marsh,2015).
298 | MÉTODOS PARA ESTUDIAR EL RIEGO
El aumento de la biodiversidad de los modelos de biopelículas
multiespecíficas puede comprometer su estandarización y
reproducibilidad. Además, se ha demostrado que las cepas de
laboratorio utilizadas en modelos multiespecíficos expresan
características fenotípicas diferentes a las de sus homólogos clínicos
(Chávez de Paz et al.,2015).
Como alternativa, se pueden cultivar biopelículas naturales
directamente a partir de muestras de conductos radiculares
infectados (Clegg et al., 2006; Du et al.,2013; Ruiz-Linares et al.,2017;
Shen et al., 2011;Figura 1) o placa dental (Shen et al.,2009,2011;
Stojicic et al.,2013). Por ejemplo, se han cultivado biopelículas de
placa dental formadas naturalmente en dispositivos de ortodoncia
intraorales especiales (del Carpio-Perochena et al.,2015; Ordiñola-
Zapata et al.,2013). Estas biopelículas multiespecíficas formadas
naturalmente, especialmente aquellas compuestas por bacterias del
conducto radicular, se parecen más en la composición, las
interacciones entre especies y la cooperación metabólica de las
biopelículas del conducto radicular.en vivo, lo que lleva a una mayor
resistencia a los antimicrobianos (Chávez de Paz,2007; Chávez de Paz
y Marsh,2015; Tan et al.,2017). Sin embargo, la selección del tiempo
de incubación, los medios de crecimiento y las condiciones
atmosféricas más adecuados es un desafío y algunas especies, como
las que no son cultivables, pueden perderse a lo largo del flujo de
trabajo del laboratorio (Rudney et al.,2012). Además, inicialmente se
desconoce la composición microbiana exacta; la biodiversidad dentro
de cada muestra sólo puede explorarse posteriormente utilizando
técnicas moleculares como la secuenciación del gen 16S rRNA (ver
sección 'Métodos moleculares'). Por lo tanto, las biopelículas
naturales de múltiples especies no se pueden reproducir en
diferentes laboratorios o en diferentes momentos. A pesar de estas
limitaciones, los modelos de biopelículas multiespecies son los
modelos de elección para futuros estudios para investigar el efecto
antimicrobiano de los irrigantes. Ya no se recomiendan las
biopelículas de una sola especie para este propósito (Swimberghe et
al.,2021).
FIGURA 1Microfotografía SEM de una biopelícula natural de múltiples especies cultivada
a partir de una muestra de conducto radicular necrótico en la dentina durante 3
semanas
Recubrimiento de sustratos y superficies.
Se han utilizado superficies tanto sintéticas como naturales para
cultivar biopelículas.in vitro. Superficies sintéticas, como vidrio,
poliestireno, polidimetilsiloxano, resina epoxi e hidroxiapatita
(Layton et al.,2015; Liu y otros,2010; Pereira et al.,2021b; Petridis
et al.,2019; Shen et al.,2010a; Townsend y Maki,2009), permiten
una mejor estandarización de las muestras en términos de
tamaño, forma, composición y características superficiales. Sin
embargo, pueden alterar las etapas iniciales de la formación de
biopelículas porque las bacterias se adhieren a receptores
orgánicos en la dentina, como las fibrillas de colágeno, que
influyen en la estructura y composición de la biopelícula (Kishen
et al.,2008; Con amor y Jenkinson,2002). Además, los sustratos
sintéticos no pueden reproducir los finos detalles de la
microanatomía de la dentina y las interacciones químicas entre
los irrigantes y la dentina, por ejemplo el consumo del cloro libre
disponible en las soluciones de NaOCl (Macedo et al.,2010; Shen
et al.,2012) o el desprendimiento de bacterias del biofilm debido
a la quelación por EDTA (Banin et al.,2006). Cuando se necesita
una superficie sintética para el crecimiento de una biopelícula
multiespecie, la hidroxiapatita parece tener la mayor ventaja
(Shen et al.,2010a).
También se han utilizado superficies naturales, por ejemplo
bloques de dentina humana y raíces completas, para investigar
el efecto antimicrobiano de los irrigantes.ex-vivo(Haapasalo y
Ørstavik,1987; Ma et al.,2011; Morago et al.,2019). Sin embargo,
los cambios relacionados con la edad, como el depósito continuo
de dentina peritubular (Carrigan et al.,1984; Eldarrat et al.,2010),
la permeabilidad reducida (Thaler et al.,2008) y el número
reducido de túbulos dentinarios infectados (Kakoli et al.,2009),
junto con la variabilidad en la configuración y mineralización de
la dentina, son difíciles de controlar y pueden confundir los
resultados (Thaler et al.,2008). Aún así, la dentina humana es el
sustrato elegido para el crecimiento de biopelículas. El uso de
pares de dientes extraídos del mismo paciente puede reducir
estas diferencias (Baumgartner et al., 2007; Kho y Baumgartner,
2006; Miller y Baumgartner, 2010) pero sólo se pueden comparar
dos grupos a la vez y puede resultar difícil obtener suficientes
muestras sanas.
Para superar algunas de las limitaciones de la dentina humana, a
menudo se utiliza la dentina bovina como alternativa. Los dientes
bovinos son más fáciles de obtener y su edad puede estandarizarse
junto con otras condiciones ambientales. Sin embargo, la dentina
bovina tiene una morfología, composición química y propiedades
ligeramente diferentes (Yassen et al.,2011), en particular un menor
contenido mineral y reticulación de colágeno (Enrich-Essvein et al.,
2021), así como un número significativamente mayor de túbulos
dentinarios en comparación con la dentina humana (Camargo et al.,
2007). Su uso como sustituto de la dentina humana cuando se cultiva
biopelícula aún no se ha validado.
Es necesaria la esterilización de las muestras antes del crecimiento de
la biopelícula para estandarizar las condiciones iniciales. El
BOUTSIOUKIS et al.
La elección del método de esterilización depende de la tolerancia
del material/tejido al calor, la humedad y los productos
químicos. La esterilización debe asegurar la eliminación
completa de todos los microorganismos sin afectar sus
propiedades físicas, químicas y biológicas. El autoclave a vapor
es el método más utilizado para la esterilización de la dentina
(Nawrocka & Łukomska-Szymańska,2019), y tiene sólo un efecto
mínimo sobre su estructura y contenido mineral (Parsell et al.,
1998; Pashley y otros,1993). Sin embargo, cuando la dentina se
trata previamente con un agente quelante, el autoclave
desnaturaliza y desintegra las fibrillas de colágeno expuestas,
por lo que afecta la permeabilidad de la dentina (Jiang et al.,2019
; Soares et al.,2011) y adhesión bacteriana (Chivatxaranukul et
al.,2008), que son importantes durante los pasos iniciales de la
formación de biopelículas. La radiación gamma ha dado
resultados prometedores sin efectos adversos notables sobre la
dentina (White et al.,1994), pero requiere equipos costosos y un
ajuste cuidadoso de sus parámetros operativos (Nawrocka &
Łukomska-Szymańska,2019). El óxido de etileno y la inmersión
en etanol, peróxido de hidrógeno, glutaraldehído, compuestos
de amonio cuaternario o hipoclorito de sodio no son
suficientemente eficaces (Dominici et al.,2001; Pashley y otros,
1993; Sandhu et al.,2012) y también pueden interferir con la
adhesión bacteriana (Sandhu et al.,2012).
Una vez esterilizadas las muestras, suelen recubrirse con
saliva, mucina, albúmina sérica bovina o colágeno para facilitar
la adhesión bacteriana (Busanello et al.,2019; Kayaoglu et al.,
2005; Layton et al.,2015; Li y Bowden, 1994; Lundström et al.,
2010). El recubrimiento imita la película acondicionadora que se
adsorbe naturalmente en la dentina y actúa como receptor de
adhesinas bacterianas, por lo que es útil para todo tipo de
sustratos. Puede influir en la formación y organización
estructural de una biopelícula (Shen et al.,2010a; Stepanović y
otros,2004) y su resistencia a los antimicrobianos (Chávez de Paz
et al.,2010; Violante et al.,2013). Sin embargo, aún no está claro
qué protocolo de recubrimiento es el más adecuado para la
formación de biopelículas.
Crecimiento de biopelículas
El biofilm se puede cultivar en condiciones estáticas, lo que
puede provocar que el suministro de nutrientes escasee en
algún momento (Kishen & Haapasalo,2012; Merritt y otros,2005).
Alternativamente, se puede cultivar en condiciones dinámicas en
cámaras de flujo (Chávez de Paz et al.,2010) o dispositivos de
fermentación (Pereira et al.,2020; Petridis et al.,2019) donde un
flujo continuo controlado de medio proporciona nutrientes
frescos y drena el medio viejo y los productos de desecho
(Busanello et al.,2019; Chin et al.,2006; Pavarina et al.,2011; Shen
et al.,2012; Tolker-Nielsen y Sternberg, 2011). Es probable que el
exudado que penetra en una persona infectada
|299
canal raízen vivofluye muy lentamente y la fuerza de corte aplicada no es
lo suficientemente fuerte como para afectar la formación de biopelículas.
En consecuencia, los modelos de biopelículas estáticas parecen parecerse
más a las biopelículas del conducto radicular.en vivoque los dinámicos
(Shen et al.,2012), aunque ninguno de los tipos es capaz de replicar
completamente unen vivoinfección.
El modelo de 'bloque de dentina' se ha utilizado ampliamente
para hacer crecer biopelículas en condiciones estáticas o dinámicas y
evaluar el efecto de los irrigantes del conducto radicular en la
dentina infectada (Haapasalo & Ørstavik,1987). La geometría
estandarizada y la infección de las muestras mejoran la
reproducibilidad. Debido a su pequeño tamaño, se pueden obtener
múltiples bloques del mismo diente (particularmente de dientes
bovinos o del tercio coronal de dientes humanos), lo que permite
comparar las muestras antes de la aleatorización (Baca et al.,2011).
Es necesario confirmar el crecimiento de la biopelícula en la
superficie de los bloques (ver sección 'Microscopía') antes del
experimento (Shen et al.,2012). Cabe señalar que el tamaño de los
bloques de dentina varía entre los estudios, lo que dificulta las
comparaciones directas, y que se excluye el efecto de la geometría
del conducto radicular, por lo que los resultados deben interpretarse
con cierta cautela. Sin embargo, este modelo se puede utilizar para la
detección inicial del efecto antimicrobiano de los irrigantes. En otro
modelo similar, las bacterias son forzadas a ingresar a los túbulos
dentinarios mediante centrifugación para crear una infección
profunda más estandarizada (Ma et al.,2011). Este método de
contaminación es marcadamente diferente de la forma en que se
infectan los conductos radiculares.en vivo. La centrifugación puede
tener un impacto negativo sobre las bacterias (Ma et al.,2011), por lo
que los anaerobios obligados no son adecuados ya que es posible
que no sobrevivan al proceso. Otra limitación importante de estos
modelos es que los bloques normalmente se obtienen del tercio
coronal de dientes jóvenes para evitar la dentina esclerótica (Paqué
et al.,2006; Vasiliadis et al.,1983a); por lo tanto, los hallazgos no
pueden extrapolarse directamente al tercio apical.
También se han cultivado biopelículas dentro de los conductos
radiculares.ex-vivo(Gazzaneo et al.,2019). Este modelo se parece más
a las condiciones de la vida real que los bloques de dentina, pero la
anatomía del conducto radicular puede comprometer la eficacia del
proceso de infección. Por tanto, es importante incluir conductos
radiculares con anatomía similar. Generalmente se requiere una
instrumentación previa para facilitar la entrada de bacterias en el
conducto radicular después de la inmersión en la suspensión
bacteriana (Gazzaneo et al.,2019) o inoculación (Villalta-Briones et al.,
2021). De cualquier manera, se debe confirmar la formación exitosa
de biopelículas en la pared del conducto radicular (Bhuva et al.,2010).
Edad del biofilm
La formación de biopelículas se inicia mediante la unión de bacterias
planctónicas a una superficie previamente recubierta. Después,
300 | MÉTODOS PARA ESTUDIAR EL RIEGO
Las microcolonias conducen a una colonización total y crecimiento en
la superficie y forman una comunidad de biopelículas compleja
(Sauer et al.,2002). A medida que la biopelícula madura, aumenta su
resistencia a diversos antimicrobianos (Lim et al.,2009; Shen et al.,
2011; Stojicic et al.,2013; Swimberghe et al.,2021; Wang y otros,2012;
Yang y otros,2016). En vista de estos hallazgos y dado que la mayoría
en vivoEs probable que las biopelículas sean bastante antiguas
(semanas, meses o incluso años) en el momento del tratamiento de
conducto; las biopelículas maduras son una opción más realista al
evaluar la actividad antimicrobiana de los irrigantes.in vitrooex-vivo.
Desafortunadamente, la mayoría de los estudios disponibles sobre
este tema utilizaron biopelículas muy jóvenes (<7 días; Swimberghe
et al.,2019a), por lo que es posible que hayan sobreestimado el
efecto de los irrigantes. Parece que se alcanza un hito importante
después de 3 semanas de maduración de la biopelícula,
independientemente de la composición inicial de la biopelícula
(Stojicic et al.,2013). Sin embargo, este período puede ser intrínseco a
ese modelo particular y a las condiciones ambientales, por lo que se
recomienda examinar la cinética de crecimiento de la biopelícula en
cada modelo particular antes de iniciar un estudio para identificar y
comprender su etapa de maduración (Swimberghe et al.,2019a).
Durante el crecimiento de la biopelícula, los medios generalmente se
actualizan una vez por semana (Shen et al.,2011; Stojicic et al.,2013; Wang
y otros,2012). El suministro constante de nutrientes mantiene a las
bacterias en una fase de crecimiento exponencial y favorece la
eliminación de bacterias no adheridas y subproductos metabólicos. Esta
condición es claramente diferente de la situación clínica, particularmente
en lo que respecta a infecciones secundarias o persistentes. Los
nutrientes son muy escasos en un tratamiento de conducto previamente
tratado y la falta de nutrientes hace que las bacterias sean más
resistentes a las condiciones ambientales adversas, incluidos los
antimicrobianos. Por lo tanto, el tipo de biopelícula utilizada (hambruna/
estresada o metabólicamente activa) debe decidirse en función del
enfoque particular de cada estudio. El crecimiento de biopelículas
hambrientas/estresadas parece más razonable cuando se simula una
infección persistente.
Evaluación del efecto antimicrobiano de los
irrigantes sobrein vitroyex-vivobiopelícula
Hasta el momento, no existe un método estándar de oro para la
evaluación del efecto antimicrobiano de los irrigantes sobre el
biofilm, por lo que se recomienda combinar dos o más métodos
complementarios que juntos puedan proporcionar una visión más
completa (Camilleri et al.,2020).
Prueba de contacto directo sobre biopelícula
Se puede realizar una prueba de contacto directo con biopelículas
cultivadas. in vitropara determinar la erradicación mínima de biopelículas
FIGURA 2 MBEC™: dispositivo de alto rendimiento (Innovotech) que
se puede utilizar para cultivar biopelículas en 96 clavijas de poliestireno (mitad superior).
Un canal de flauta (mitad inferior) guía el medio de crecimiento inoculado a través de las
clavijas cuando el dispositivo se coloca sobre un balancín.
concentración (MBEC;Figura 2). Esta prueba es rápida, fácil
de realizar y reproducible (Arias-Moliz et al.,2010; Ceri et al.,
1999). Sin embargo, la biopelícula entra en contacto con un
exceso de irrigante en ausencia de dentina, por lo que MBEC
es un predictor muy pobre del efecto antimicrobiano del
irrigante.ex-vivoyen vivo. Por lo tanto, esta prueba sólo es
adecuada para el cribado inicial y siempre debe
complementarse con métodos más precisos (Arias-Moliz et
al., 2010; Ferrer-Luque et al.,2010; Giardino et al.,2020a,
2020b).
Muestreo
El muestreo eficaz de las bacterias en una biopelícula depende de la
ubicación. Cuando la biopelícula reside sobre un bloque de dentina o
una superficie inerte, se puede recuperar en un líquido (p. ej., caldo o
solución salina) mediante agitación, sonicación o centrifugación
(Baca et al.,2011). Se requiere un ajuste fino del protocolo de
recuperación para cada combinación particular de biopelícula/
sustrato para garantizar que la fuerza de corte aplicada sea
suficiente para separar completamente la biopelícula de la superficie
sin dañar las bacterias.
Cuando la biopelícula crece dentro de un conducto radicular, las
muestras se pueden obtener mediante una combinación de puntas de
papel, limas y/o fresas (Ercan et al.,2004; Ferrer-Luque et al.,2014; Gomes
et al.,2003; moller,1966; Peters y otros,2011), un procedimiento difícil y
sensible a la técnica (Sathorn et al., 2007). Las puntas de papel por sí solas
sólo pueden tomar muestras de bacterias planctónicas de la luz del
conducto radicular principal y de bacterias ligeramente adheridas a la
pared. El procedimiento se puede mejorar introduciendo una solución en
el conducto radicular y raspando la pared con limas o fresas en un
esfuerzo por aflojar la biopelícula y la dentina adyacente antes de insertar
las puntas de papel (Möller, 1966). Luego se utiliza un vórtex o sonicación
de las puntas de papel y las limas/fresas para recuperar las bacterias de
las que se tomaron muestras.
BOUTSIOUKIS et al.
La información sobre la ubicación exacta de las bacterias en el
conducto radicular se pierde durante el muestreo. Además, la
carga microbiana en las áreas muestreadas puede no ser
representativa de las bacterias restantes en istmos, canales
laterales y otras irregularidades anatómicas que son difíciles de
alcanzar con instrumentos e irrigantes (Sathorn et al.,2007).
Estas limitaciones de muestreo pueden superarse parcialmente
enex-vivoexperimentos mediante criopulverización de las raíces, lo
que facilita la recuperación de bacterias de zonas de difícil acceso
(Alves et al.,2009). Sin embargo, este es un método destructivo, por
lo que no es posible realizar pruebas repetidas de las mismas
muestras y se debe tener cuidado de desinfectar la superficie
externa de la raíz antes de la pulverización.
Cultivo
El número de bacterias viables y cultivables en una muestra se puede
determinar colocando placas de agar (Hannig et al., 2007) y contar
las colonias formadas (unidades formadoras de colonias, UFC),
método que se ha utilizado ampliamente (figura 3). Cabe destacar
que mediante este método sólo se cuantifican las bacterias viables
que son capaces de dividirse y formar colonias en el medio de cultivo
suministrado (Azeredo et al.,2017). Una alta proporción de las
bacterias presentes en las infecciones del conducto radicular son
viables pero no cultivables (VBNC), lo que significa que son bacterias
metabólicamente activas y virulentas que pueden iniciar la formación
de biopelículas, aunque en menor grado que las bacterias viables,
pero carecen de la capacidad de crecer en medios de cultivo (Li et al.,
2014). Como resultado, el cultivo de muestras de una biopelícula
natural de múltiples especies
FIGURA 3UFC de unE. faecalissuspensión cultivada en una placa de agar
Brain Heart Infusion (BHI; Scharlau Chemie SA) (se muestra la parte
inferior). Una gota de 10 µl de la suspensión, ya sea sin diluir o diluida en
el rango de 10−1a 10−5, fue plateado en cada ubicación
|301
Un modelo que incluya bacterias VBNC subestimará la diversidad
y el número total de bacterias. Además, los métodos de cultivo
son laboriosos y requieren mucho tiempo; Es necesario preparar
una amplia gama de medios de cultivo y las muestras deben
incubarse durante períodos prolongados para detectar
microorganismos de crecimiento lento.
Métodos moleculares
Los métodos moleculares se basan en la detección de ácidos
nucleicos de microorganismos. Entre ellas, la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) es la que revolucionó el campo de la biología
molecular (Mullis et al.,1994). Las primeras implementaciones
carecían de la capacidad de cuantificar la cantidad de ADN en la
muestra. La reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa/en
tiempo real (qPCR) superó este problema al monitorear el número de
ciclos térmicos hasta que se produce una cierta cantidad de ADN.
Este número se correlaciona con la cantidad inicial de ADN y, por
tanto, con el número de bacterias. La qPCR es muy sensible y se
pueden detectar tan solo 10 células bacterianas en una muestra
(Siqueira & Rôças,2017). Las bacterias se pueden identificar
utilizando cebadores específicos de cada especie o cebadores
universales que detectan un amplio espectro de bacterias. Estos
últimos son muy útiles cuando se analizan biopelículas naturales de
múltiples especies, pero no son tan sensibles e incluso no pueden
apuntar a todas las especies en una muestra (Döring et al.,2008; Horz
et al.,2005).
La qPCR se ha propuesto como una alternativa al cultivo al
estudiar el efecto de la irrigación del conducto radicular (Blome
et al.,2008; Rodrigues et al.,2017; Zandi et al., 2016,2019). Este
método es más sensible que el cultivo y puede detectar
microorganismos independientemente de su fase de
crecimiento. Aunque se ha informado una correlación positiva de
estos hallazgos con los recuentos de UFC (Aul et al.,1998;
Malawista et al.,1994), la qPCR también puede detectar ADN
extracelular libre y ADN de células muertas (Brundin et al.,2014,
2015; Klein y otros,2012; Siqueira y Rôças,2005a,2005b; Young y
otros,2007). Por lo tanto, es posible que se subestime el efecto
de los antimicrobianos sobre la biopelícula. Algunos estudios
informaron que la vida media del ADN libre en un conducto
radicular infectado parece ser muy corta debido a la acción de
las ADNasas y, por lo tanto, tiene sólo un efecto menor en la
cuantificación de bacterias mediante qPCR (Siqueira,2008) pero
otros han llegado a la conclusión de que este ADN puede
conservarse durante meses, por lo que puede ser una
importante fuente de error (Brundin et al.,2014, 2015; Young y
otros,2007). Para superar este problema, se ha propuesto un
preprocesamiento para degradar el ADN libre antes de la qPCR
(İriboz et al.,2018). Esto se puede lograr mediante el tratamiento
con ADNasa durante la preparación de la muestra (İriboz et al.,
2018). Alternativamente, las muestras se pueden tratar con un
tinte de viabilidad fotorreactivo que se une
302 | MÉTODOS PARA ESTUDIAR EL RIEGO
selectivamente al ADN de células con membrana comprometida
y conduce a su degradación tras la exposición a la luz antes de la
extracción y amplificación del ADN, una técnica denominada
viabilidad-PCR (Codony et al.,2020; Nkuipou-Kenfack et al.,2013).
Sin embargo, parte del ADN de las células enfermas puede
persistir (Codony et al.,2020). Recientemente, el procedimiento
de desinfección del campo operatorio y los controles de
esterilidad que se habían utilizado en una serie de estudios que
emplean PCR y qPCR también fueron criticados porque se
basaban en los requisitos de los métodos basados en cultivos
en lugar de los moleculares (Figdor & Brundin, 2016). Para
cumplir su propósito, los controles de esterilidad deben
analizarse de la misma manera que las muestras experimentales
en un estudio. También se debe enfatizar que los métodos
moleculares generalmente están sujetos a las mismas
limitaciones de muestreo que los métodos basados en cultivos.
La PCR con transcriptasa inversa es otro método molecular
que se ha utilizado para cuantificar las bacterias restantes
siguiendo diferentes protocolos de irrigación. Este método se
basa en la detección de ARN bacteriano y proporciona
información más confiable sobre la viabilidad de los
microorganismos en la muestra en comparación con la qPCR
porque el ARN tiene una vida media más corta que el ADN y se
degrada rápidamente después de la muerte celular (Kempsell et
al. .,2000; Miskin et al.,1999; Teske et al.,1996). Sin embargo, el
ARN también es más difícil de aislar y conservar (Kawane et al.,
2014).
Un desarrollo más reciente en métodos moleculares es la
secuenciación de próxima generación (NGS), también conocida
como secuenciación de alto rendimiento (İriboz et al.,2018; Zandi
et al., 2018). NGS se basa en la amplificación por PCR y
secuenciación del gen 16S rRNA, que permite el análisis de la
composición taxonómica de ecosistemas microbiológicos. Es un
método muy sensible pero el proceso de extracción de ADN
puede no ser igualmente efectivo para todos los taxones (Manoil
et al.,2020). Además, la NGS tampoco puede determinar la
viabilidad de las bacterias y puede detectar ADN libre y ADN
procedente de células muertas (Siqueira, 2008), al igual que
otros métodos moleculares. Por último, el coste de este método
sigue siendo elevado y el equipo necesario no está ampliamente
disponible. Aunque la NGS se ha empleado principalmente para
caracterizar la composición de la microbiota presente en las
infecciones del conducto radicular (Keskin et al.,2017; Sánchez-
Sanhueza et al.,2018; Zahran et al.,2021), también se ha utilizado
para estudiar el efecto de la preparación quimiomecánica sobre
la diversidad microbiana (Gomes et al., 2015; İriboz et al.,2018;
Zandi et al.,2018). Además, la relación ARNr/ADN calculada a
partir de datos de NGS se ha utilizado para estimar la proporción
de bacterias activas en una muestra antes y después de la
instrumentación (Nardello et al., 2020). Por lo tanto, NGS puede
ser una herramienta valiosa para analizar el efecto de los
irrigantes tanto en la composición como en la viabilidad de
biopelículas multiespecies.
Microscopía
La microscopía óptica combinada con tinción histológica permite
la visualización de microorganismos en una muestra (Vera et al.,
2012b). Aunque la resolución no es muy alta, puede
proporcionar información cualitativa valiosa sobre la biopelícula,
su ubicación dentro del sistema de conductos radiculares y su
relación con los restos de tejido pulpar (Nair et al.,2005; Peters y
otros,2011; Ricucci y Siqueira,2008). Gracias a su bajo aumento,
se pueden obtener imágenes de partes más grandes de una
muestra en comparación con otros métodos. Sin embargo,
requiere una laboriosa preparación de la muestra que incluye
fijación, descalcificación, corte y tinción. Además, solo
proporciona información bidimensional y los hallazgos
recopilados en 2 o 3 secciones pueden no ser representativos de
todo el conducto radicular. Además, la microscopía óptica no es
un método muy sensible para detectar bacterias y no
proporciona información sobre su viabilidad. Por lo tanto, no es
adecuado para la cuantificación del efecto antimicrobiano de los
irrigantes del conducto radicular, pero podría usarse como
complemento de los métodos cuantitativos.
La microscopía electrónica de barrido (SEM) proporciona
imágenes de alta resolución y gran aumento de estructuras
superficiales que permiten la caracterización morfológica de la
biopelícula en una muestra. Se pueden obtener imágenes fácilmente
de superficies irregulares debido a su mayor profundidad de campo
en comparación con la microscopía óptica (Azeredo et al.,2017;
Morago et al., 2016;Figura 1). Ha sido ampliamente utilizado para
confirmar la presencia o crecimiento de una biopelícula en una
muestra y para la evaluación cualitativa del efecto de los irrigantes
del conducto radicular sobre la biopelícula (Arias-Moliz et al.,2021;
Marinković et al., 2020; Shen et al.,2011). Sin embargo, las muestras
deben someterse a una laboriosa preparación antes de obtener
imágenes, incluida la fijación, la congelación o el secado en puntos
críticos y el recubrimiento con un material conductor. Estos procesos
pueden alterar la morfología celular e introducir artefactos (Hannig
et al.,2010). El secado también conduce al colapso de los polímeros
de la matriz de biopelículas (Kachlany et al.,2001; Pequeño y otros,
1991) y el recubrimiento conductor puede oscurecer algunas
estructuras (Bergmans et al.,2005; Pequeño y otros,1991). Al igual
que la microscopía óptica, el SEM no proporciona información sobre
la viabilidad de las bacterias y no permite su identificación o
cuantificación. Además, no proporciona ningún dato sobre las capas
de biopelículas debajo de la superficie. Algunas limitaciones
adicionales del SEM se analizan en la sección sobre eliminación de
desechos y capa de barro.
La microscopía electrónica de barrido ambiental (ESEM) se basa en los
mismos principios que el SEM, pero se pueden obtener imágenes de la
muestra en bajo vacío después de una preparación mínima o nula, por lo
que las muestras biológicas, incluidas las estructuras delicadas de
biopelículas como la matriz de EPS, se pueden obtener imágenes sin
previo aviso. deshidratación o recubrimiento (Bergmans et al., 2005;
Collins y otros,1993; Priester et al.,2007). Esto reduce
BOUTSIOUKIS et al.
los artefactos (McKinlay et al.,2004) y permite la evaluación
longitudinal de la misma área en diferentes momentos, por
ejemplo antes y después del riego (Bergmans et al.,2008; Reis et
al.,2008), aunque el reposicionamiento exacto de la muestra en
la cámara del microscopio no es sencillo (Reis et al.,2008). Su
resolución es menor que la SEM, por lo que se pueden obtener
menos detalles topográficos (Bergmans et al., 2005) y, al igual
que en SEM, sólo se puede examinar la superficie de la muestra
y no se proporciona ninguna información sobre la viabilidad de
las bacterias.
La microscopía de barrido láser confocal (CLSM) se encuentra
actualmente entre las técnicas más valiosas paraen el lugar
visualización y cuantificación de una biopelícula (Lawrence et al.,1991
; Neu y Lawrence,2014). Su resolución permite la visualización de
células individuales (Daddi Oubekka et al., 2012). La captura de
múltiples imágenes a lo largo de diferentes planos focales y el
procesamiento por computadora permiten la reconstrucción
tridimensional de la biopelícula y la medición de parámetros como el
volumen, el espesor y la cobertura de la superficie de la biopelícula
(Chávez de Paz,2009). A diferencia del MEB, no se requiere fijación,
secado ni recubrimiento, por lo que el biofilm permanece hidratado y
sin alteraciones. Para visualizar los distintos componentes de la
biopelícula, la muestra se puede teñir con fluorocromos. La tinción
dual con SYTO 9 y yoduro de propidio (PI; kit de viabilidad bacteriana
Live/Dead Baclight; Invitrogen) es probablemente el método más
utilizado para discriminar entre células intactas (teñidas con SYTO 9)
y dañadas (teñidas con PI) en función de la integridad. de su
membrana. SYTO 9 marca células viables y VBNC (Netuschil et al.,
2014). Por lo tanto, este kit de viabilidad puede revelar la distribución
celular tridimensional en una biopelícula (Hope et al.,2002) y el efecto
de los antimicrobianos sobre ellos, tanto en la superficie como en el
interior de los túbulos dentinarios (Ma et al.,2011; Villalta-Briones et
al.,2021). Se considera una buena práctica ajustar y validar el
protocolo de tinción antes de cada estudio (Stocks,2004) para hacer
frente a las diferencias entre especies, particularmente al examinar
una biopelícula multiespecie (Zotta et al.,2012). CLSM tiene una
pequeña profundidad de campo, por lo que para obtener imágenes
de la biopelícula que crece en la dentina, su superficie debe
aplanarse de antemano, un proceso que inevitablemente altera su
morfología.Figura 4). CLSM también trabaja en muy
FIGURA 4Reconstrucción tridimensional de exploraciones CLSM de biopelículas naturales de múltiples especies cultivadas a partir de una muestra de conducto radicular infectado
en dentina durante 3 semanas: (a) control sin tratamiento, (b) después del tratamiento con NaOCl al 2,5 % durante 1 min, (c) después del tratamiento con 0,2 % cetrimida durante
1 min. Las bacterias de color verde son células con membranas intactas y las bacterias de color rojo son células con membranas dañadas después de la tinción Live/Dead
(BacLight; Invitrogen)
|303
gran aumento, por lo que no es factible escanear toda la muestra y la
evaluación se limita a unos pocos puntos seleccionados. En algunos
casos, los restos de dentina y el barro dentinario también pueden
retener los fluorocromos y provocar errores. Finalmente, un error
común en la interpretación de los hallazgos del CLSM es que,
después de la tinción viva/muerta, las células teñidas de verde y de
rojo se consideran incorrectamente células vivas y muertas,
respectivamente. Sin embargo, las células con membranas intactas
(teñidas de verde) pueden estar metabólicamente inactivas y, por lo
tanto, muertas, y las células con una membrana dañada (teñidas de
rojo) aún pueden estar vivas (Netuschil et al.,2014).
En fluorescenciaen el lugarEn la hibridación (FISH), las sondas
fluorescentes se unen a secuencias específicas de ARNr 16S en
bacterias permeabilizadas durante la incubación en condiciones
controladas. FISH puede ayudar a la identificación microscópica
de bacterias y también proporciona información detallada sobre
la organización espacial de comunidades microbianas mixtas (
Figura 5; Chávez de Paz et al.,2015; Lukic et al.,2020; Sunde et al.,
2003). Además, es muy sensible y puede detectar
microorganismos independientemente de su crecimiento,
aunque se dispone de datos limitados sobre la detección de
bacterias VBNC (Gao et al.,2021). Sin embargo, requiere una
preparación extensa de las muestras, sólo hay un número
limitado de sondas disponibles y la hibridación puede no ser
igualmente eficiente en todos los casos (Azeredo et al., 2017).
También es limitado el número de microorganismos diferentes
que pueden detectarse simultáneamente. Finalmente, al igual
que otras técnicas moleculares, FISH también puede detectar el
ADN extracelular libre y el ADN derivado de células muertas.
La tomografía de coherencia óptica (OCT) es un método de
obtención de imágenes basado en interferometría de baja
coherencia. La luz dispersada por la biopelícula se registra y procesa
para obtener una imagen transversal o completamente
tridimensional de la biopelícula (Wagner & Horn,2017). Este método
no es invasivo y no requiere preparación de muestras, por lo que es
posible realizar evaluaciones repetidas de la biopelícula en su estado
nativo. Los cambios en la estructura de la biopelícula (volumen,
espesor, porosidad y rugosidad) después de la aplicación de un
irrigante se pueden visualizar y cuantificar mediante análisis de
imágenes (Busanello et al.,2019; Wagner y Cuerno,2017;Figura 6). Él
304 | MÉTODOS PARA ESTUDIAR EL RIEGO
FIGURA 5 Reconstrucción tridimensional de exploraciones CLSM.
de células de biopelícula marcadas con 16S rRNA FISH en cocultivos de 3
especies aisladas de conductos radiculares infectados.Streptococcus gordonii
Las células se unen a la sonda STR405 (fluorescencia verde) y se detectaron
mediante excitación con láser Ar (480 nm).Lactobacillus salivarius(rojo y
Actinomyces naeslundii(azul) se detectaron simultáneamente utilizando láseres
G-HeNe (543 nm) y UV (390 nm). [para más información ver Chávez de Paz (
2012)]
FIGURA 6Exploraciones OCT de una biopelícula de doble especie
(Estreptococo oralyActinomyces naeslundii) cultivado dentro de canales laterales
artificiales hechos de polidimetilsiloxano utilizando un fermentador de película de
profundidad constante (a) antes y (b) después de la activación ultrasónica de NaOCl
al 2% en el conducto radicular principal adyacente (a la izquierda)
también proporciona una visión superior de las interfaces
sustrato-biopelícula y fluido-biopelícula (Busanello et al.,2019;
Pereira et al.,2020,2021a). Su resolución espacial es menor que
otras técnicas de microscopía como SEM y CLSM pero el campo
de visión es mayor, por lo que es posible escanear la muestra
completa en muy poco tiempo. Se requiere acceso óptico directo
a la biopelícula al menos desde una dirección. Otra desventaja es
que la OCT no proporciona información sobre la composición de
la biopelícula y la viabilidad de las bacterias (Wagner & Horn,
2017).
La microscopía de fuerza atómica (AFM) es un método de microscopía
de sonda de barrido de alta resolución que puede medir la fuerza
cohesiva de la biopelícula y la fuerza de adhesión entre la biopelícula y el
sustrato (James et al.,2017). No se requiere ninguna preparación especial
de la muestra de biopelícula (Müller et al.,2009) pero la superficie
escaneada tiene que ser plana, por lo que en la mayoría de los casos debe
modificarse la morfología natural de la dentina. AFM se ha utilizado para
estudiar el efecto de los irrigantes sobre la fuerza de adhesión a corto
plazo entre las bacterias y la dentina del conducto radicular o los
materiales de obturación (Kishen et al.,
2008; Xu y otros,2019). Sin embargo, no es posible
funcionalizar las puntas del AFM con la misma cantidad de
bacterias cada vez, lo que puede afectar la magnitud de la
fuerza medida (Kishen et al.,2008).
Métodos químicos
El ensayo de cristal violeta es un ensayo colorimétrico que se ha
utilizado para la cuantificación rápida y aproximada de la masa
de biopelícula después de la exposición a irrigantes (Christensen
et al., 1985; Li y otros,2020; Mohmmed et al.,2016). Este ensayo
se ha aplicado a biopelículas cultivadas en placas de
microtitulación (Alves et al.,2013; Li y otros,2020; Mohmmed et
al.,2016; Wilson y otros,2015) y también dentro de conductos
radiculares artificiales creados en bloques acrílicos (Layton et al.,
2015; Townsend y Maki,2009). Es fácil de realizar, económico y se
puede aplicar a diferentes especies bacterianas. Sin embargo, no
puede diferenciar entre células vivas y muertas (Peeters et al.,
2008; Pitts y otros,2003), por lo que solo puede cuantificar la
eliminación de biopelículas (Peeters et al.,2008). Además, la
reproducibilidad es un problema (Arnold,2008; Peeters y otros,
2008) y no existe un protocolo estándar, por lo que se dificultan
las comparaciones entre diferentes estudios. Debido a estas
limitaciones, su uso debería limitarse a la detección de posibles
agentes antibiofilm antes de utilizar métodos de cuantificación
más laboriosos y precisos (Alves et al.,2013).
El ensayo de trifosfato de adenosina (ATP) mide la producción
de ATP de las bacterias y refleja la actividad metabólica de
células viables y VBNC (Beumer et al.,1992; Sánchez et al.,2013).
Se pueden tomar medidas usando una variedad de ensayos
enzimáticos, por ejemplo el basado en luciferasa (Braissant et al.,
2020). Este ensayo es fácil de realizar, los resultados se obtienen
en unos pocos minutos y puede detectar tan solo 10 células
bacterianas (Tan et al., 2015). Los resultados se han
correlacionado con los recuentos de UFC en una amplia gama de
especies bacterianas (Choi et al., 2018; Solana et al.,2017; Tan et
al.,2015). Sin embargo, la reacción no es específica, por lo que no
es posible identificar los microorganismos, y la cantidad de ATP
producida puede variar dependiendo de la especie, por lo que es
difícil calcular el número de células microbianas en una
biopelícula multiespecie (Stewart,1990). Por tanto, el ensayo de
ATP se puede utilizar principalmente como complemento de
otros métodos.
El ensayo XTT se basa en la reducción del colorante XTT a
formazán (Roehm et al.,1991). La cantidad de formazán es
proporcional al número de células microbianas metabólicamente
activas. Este ensayo se ha utilizado para cuantificar el efecto de
los irrigantes sobre la biopelícula (Rana et al., 2019; Wright y
otros,2021; Ye et al.,2019). Sin embargo, se han informado
problemas relacionados con la variabilidad intra e interespecies
(Peeters et al.,2008). También es caro, consume más tiempo y es
menos sensible (>106UFC/
BOUTSIOUKIS et al.
ml) que otros métodos químicos (Honraet & Nelis, 2006;
Peeters y otros,2008). En consecuencia, no se recomienda
su uso.
La resazurina es un indicador redox estable que se reduce a
resorufina por bacterias metabólicamente activas (O'Brien et al.,
2000; Pettit et al.,2005). De manera similar al ensayo XTT, puede
cuantificar tanto bacterias viables como VBNC (Gao et al.,2021) y
sus resultados se correlacionan bien con los recuentos de UFC
(Jiang et al.,2011a; Pettit et al.,2005; Sandberg y otros,2009). Es
un método rápido, económico y que requiere menos tiempo en
comparación con el ensayo XTT (O'Brien et al.,2000; Peeters y
otros,2008) y se ha utilizado como método de detección inicial
para explorar el efecto de diferentes concentraciones de
irrigante en la biopelícula (Jiang et al., 2011a).
Desafortunadamente, su sensibilidad es relativamente baja (>10
5–107UFC/ml; Jiang et al.,2011a; Sandberg y otros, 2009) y los
microorganismos metabolizan la resazurina a un ritmo variable,
por lo que se requieren diferentes tiempos de incubación para
biopelículas de múltiples especies (Peeters et al.,2008). De
manera similar al ensayo de ATP, la resazurina se puede utilizar
para complementar otros métodos.
ex-vivoModelos para evaluar la
sustantividad del riego.
Algunos irrigantes pueden unirse a la dentina y ejercer un efecto
antimicrobiano con el tiempo (sustantividad) que puede prevenir la
(re)colonización bacteriana después del tratamiento de conducto
(Komorowski et al.,2000; Rosenthal y otros,2004). Sin embargo,
publicadoex-vivoLos estudios a menudo evaluaron esta propiedad en
condiciones poco realistas. Los bloques de dentina que sirvieron
como muestras de prueba estaban totalmente sumergidos en el
irrigante (Baca et al.,2012; Barrios et al.,2013; Komorowski et al.,2000
; Parsons y otros,1980; Rosenthal y otros,2004), en algunos casos
hasta por 40 min (Parsons et al.,1980), lo que exageró el efecto, y
posteriormente fueron expuestos a altas concentraciones de
bacterias (Baca et al.,2012; Barrios et al.,2013), que también difiere
de las condiciones en un tratamiento de conducto. El uso de una sola
especie, a saber mi.faecalis, como microorganismo de prueba, como
ya se ha explicado, introdujo más sesgos. Algunos estudios
evaluaron el efecto antimicrobiano en lugar de la sustantividad
(Khademi et al., 2006). Rara vez se obturaba el conducto radicular
(Rosenthal et al., 2004), por lo que se ignoró en su mayor parte el
posible efecto adverso de los materiales de relleno sobre la
sustantividad. Finalmente, los irrigantes que demuestran
sustantividad (como la clorhexidina) tienen una fuerte afinidad por la
dentina, por lo que pueden transferirse junto con la dentina a los
ensayos de prueba y dar lugar a resultados falsos negativos
(Rosenthal et al.,2004). Por lo tanto, es esencial una neutralización
cuidadosa de los irrigantes antes de la evaluación, pero esto rara vez
se hizo en los estudios publicados.
|305
Consideraciones para estudios con animales.
Los estudios en animales pueden reproducir más de cerca laen
vivo condiciones en humanos quein vitroyex-vivoestudios
(Haapasalo,2016). Muchos de los métodos ya descritos también
se pueden aplicar en estudios con animales, pero no sería ético
aplicarlos en estudios clínicos (García de Paula-Silva et al.,2009;
Holanda,1992; López et al.,2015; Silva et al.,2004; Sperandio et
al.,2008; Tanomaru Filho et al.,2002). Sin embargo, las directrices
éticas para los estudios con animales también son estrictas y los
estudios pueden resultar muy costosos. La contaminación es
una preocupación cuando se toman muestras de conductos
radiculares de animalesen vivoy, debido a la naturaleza
polimicrobiana de las biopelículas de la vida real, se recomienda
no confiar exclusivamente en métodos de cuantificación
dependientes del cultivo (Cohenca et al.,2010). Además, el
control de los factores de confusión no es tan eficaz como enin
vitroyex-vivoestudios, por lo que puede ser necesario un tamaño
de muestra mayor (Shen et al.,2012). También puede haber
diferencias en la anatomía del conducto radicular, la respuesta
del huésped y los tejidos entre animales y humanos, por lo que
los hallazgos no deben extrapolarse directamente a la situación
clínica, aunque suelen ser más relevantes clínicamente que los
de estudios de laboratorio (Haapasalo,2016).
Consideraciones para estudios clínicos.
Los estudios clínicos tienen un mayor nivel de evidencia ya que
permiten probar irrigantes y técnicas de irrigación en condiciones de
la vida real (Haapasalo,2016). La anatomía del conducto radicular, la
temperatura, los nutrientes, la dentina, la respuesta del huésped y la
biopelícula están todos presentes (Shen et al.,2012). Sin embargo,
algunos de estos parámetros no pueden controlarse, por lo que
actúan como factores de confusión. Por ejemplo, no es posible (ni
ético) crear infecciones del conducto radicular estandarizadas.
Generalmente se recomienda un tamaño de muestra mayor para
evitar este problema (Haapasalo,2016) pero reclutar suficientes
pacientes puede resultar difícil. Obtención de una muestra
representativa de los conductos radiculares.en vivotambién es
notoriamente desafiante (Ruksakiet et al.,2020) y se deben seguir
protocolos especiales para desinfectar el campo operatorio (Figdor &
Brundin,2016; moller,1966). Al igual que en los estudios con
animales, es preferible no confiar únicamente en métodos
dependientes del cultivo al estudiar biopelículas naturales.en vivo(
Vianna et al.,2006). Los estudios clínicos también deben seguir
directrices éticas muy estrictas (Shen et al.,2012). Dependiendo del
diseño de cada estudio, es posible que se puedan tratar los dientes.
en vivoy evaluarlosex-vivo(Nair y otros,2005; Vera et al.,2012b). Sin
embargo, los conductos radiculares pueden contaminarse fácilmente
incluso durante la extracción del diente (Kapalas et al.,2011).
306 | MÉTODOS PARA ESTUDIAR EL RIEGO
DISOLUCIÓN DE RESTOS DE TEJIDO
PULPAR
Los restos de tejido pulpar se consideran una fuente potencial
de nutrientes para las bacterias que sobreviven en el conducto
radicular (Love, 2012), y también pueden interactuar con los
irrigantes y limitar su acción antimicrobiana (Haapasalo et al.,
2007). Por lo tanto, su disolución y eliminación del sistema de
conductos radiculares es uno de los objetivos de la irrigación
(Zehnder, 2006), aunque todavía no hay evidencia de que tenga
algún efecto sobre la curación de la periodontitis apical.
El tejido pulpar humano sigue siendo la primera opción para
in vitro yex-vivoexperimentos centrados en este criterio de
valoración sustituto. Sin embargo, la dificultad para obtenerlo en
cantidad suficiente (Cullen et al.,2015; Slutzky-Goldberg et al.,
2013) ha motivado el uso de otros tejidos, como el tejido de
pulpa bovina (Al-Jadaa et al.,2009a,2009b; Camps y otros,2009;
Guneser et al.,2015) o carne (Haapasalo et al., 2014; Stojicic et al.,
2010; Tartari et al.,2015,2017; Tejada et al.,2019), tejido de pulpa
de cerdo (Clarkson et al.,2012) o mucosa palatina (Conde et al.,
2017; Naenni et al.,2004), tejido de rata (Hand et al.,1978), y
carne de camarón (Ballal et al., 2021). Estos tejidos están
fácilmente disponibles y pueden cortarse en muestras
estandarizadas (Stojicic et al.,2010). Se recomienda
encarecidamente que el uso de cualquier tejido sustituto esté
suficientemente justificado en cuanto a su similitud con el tejido
pulpar humano.
in vitroLos estudios a menudo han sumergido una muestra de
tejido estandarizada en abundante irrigante dentro de un tubo de
ensayo u otro recipiente similar y han medido su velocidad de
disolución (Cullen et al.,2015; Guneser et al.,2015; Haapasalo et al.,
2014; Mano y otros,1978; Stojicic et al.,2010). Estos experimentos de
ciencia básica examinan el efecto químico directo del irrigante sobre
el tejido en condiciones óptimas y bien controladas, por lo que son
útiles para la detección inicial, pero los resultados no deben
extrapolarse directamente a la práctica clínica. La ausencia de
dentina conduce a una sobreestimación de la capacidad de
disolución (Tejada et al.,2019). Además, los tubos de ensayo no
pueden reproducir la dinámica de fluidos de un conducto radicular
humano cuando se administra o agita el irrigante (consulte la sección
"Puntos generales"), por lo que experimentos de este tipo no deben
usarse para comparar métodos de irrigación. Además de su peso, las
muestras de tejido también deben estandarizarse en términos de
tamaño y forma (Haapasalo et al.,2014; Stojicic et al.,2010) porque la
superficie expuesta del tejido es uno de los parámetros que afectan
su velocidad de disolución (Guneser et al.,2015). Cuando la
cuantificación se basa en el tiempo hasta la disolución completa
(Cullen et al.,2015), el final de la reacción puede ser difícil de
determinar debido a la gran cantidad de burbujas producidas (Shen
et al.,2012). Por lo tanto, en su lugar se ha utilizado la pérdida de
peso de la muestra después del contacto con el irrigante durante un
tiempo fijo (Hand et al.,1978; Naenni et al.,
2004; Stojicic et al.,2010). Sin embargo, en este caso, las
mediciones pueden verse afectadas por el estado de hidratación
de la muestra, que debe estandarizarse antes de pesar (Hand et
al.,1978; Stojicic et al.,2010; Tartari et al., 2017). Además, los
irrigantes hipertónicos extraerán agua de la muestra y reducirán
su peso, mientras que los irrigantes hipotónicos tendrán el
efecto contrario. La disolución del tejido también se ha evaluado
indirectamente mediante la medición del cloro disponible en la
solución de NaOCl antes y después de la interacción con el tejido
(Moorer & Wesselink, mil novecientos ochenta y dos) o medición
de la cantidad del aminoácido hidroxiprolina en el tejido restante
(Koskinen et al., 1980). Evidentemente, estos métodos son más
complicados y requieren más tiempo que el pesaje.
Para incluir las interacciones químicas con la dentina en los
experimentos, algunos estudios han añadido polvo de dentina
(Guneser et al.,2015; Tejada et al.,2019) o barras a la solución
(Cullen et al.,2015) o los experimentos se han realizado dentro
de cavidades de dentina artificiales en lugar de recipientes
inertes (Slutzky-Goldberg et al.,2013). El polvo de dentina tiene
una relación superficie-volumen exagerada en comparación con
la pared del conducto radicular, lo que probablemente conduce
a una sobreestimación de su efecto químico sobre el irrigante.
Además, la preparación de muestras de dentina, ya sea en forma
de polvo, barras o cavidades, conduce a modificaciones
estructurales inevitables de la dentina, que también pueden
afectar las reacciones químicas (Shen et al.,2012).
También se han empleado sistemas de conductos radiculares
artificiales creados en bloques de plástico transparentes para imitar
las condiciones de flujo y el contacto entre el irrigante y el tejido
dentro de un conducto radicular real (Al-Jadaa et al.,2009a,2009b;
Malentacca et al.,2012), aunque sin incluir los efectos químicos de la
dentina. Estos modelos contienen canales accesorios que se rellenan
con tejido triturado y su disolución se cuantifica mediante fotografía
digital. Puede resultar difícil garantizar un llenado completo y
homogéneo de estos conductos accesorios y el tejido triturado
puede ser más fácil de disolver que el tejido pulpar intacto.en vivo.
Además, es posible que una evaluación bidimensional no pueda
describir completamente un efecto tridimensional.
También se han realizado experimentos en dientes humanos con
surcos artificiales (Conde et al.,2017) o cavidades de reabsorción
(Ballal et al.,2021; Ulusoy et al.,2018). Las raíces se dividen para crear
estas irregularidades y se rellenan con una cantidad de tejido blando
previamente pesada y luego se vuelven a ensamblar. Se vuelve a
pesar el tejido que queda después de la irrigación. Aunque la
estandarización del tejido puede no ser tan precisa como en elin vitro
Experimentos en tubos de ensayo, estos modelos combinan
condiciones de flujo más realistas con el efecto químico de la dentina
y permiten una mejor comprensión de la disolución del tejido dentro
del conducto radicular. Sin embargo, los surcos artificiales suelen ser
mucho más anchos que las aletas y los istmos reales y las cavidades
se asemejan a casos avanzados de resorción interna, por lo que el
tejido
BOUTSIOUKIS et al.
La disolución puede sobreestimarse debido a la superficie de
contacto exagerada.
En lugar de muestras de tejido colocadas artificialmente,
algunos estudios han utilizado dientes humanos con una pulpa
vital cuya extracción ya había sido programada. En algunos
casos, los dientes fueron tratados.en vivoy posteriormente
extraído, fijado y procesado para examen histológico (Burleson
et al.,2007; Gutarts et al.,2005), mientras que otros estudios
utilizaron dientes recién extraídos con pulpa vital que fueron
reparados inmediatamente y luego tratadosex-vivo(De-Deus et
al.,2013; Varela et al.,2019). Unen vivoEl diseño del estudio
requiere aprobación ética y puede resultar difícil reclutar
suficientes pacientes para dicho procedimiento y controlar
posibles factores de confusión (Shen et al.,2012). Elex-vivoEl
diseño, por otro lado, puede permitir una mejor estandarización
de la anatomía post-extracción, pero se debe enfatizar que el
tejido pulpar fijo es más difícil de disolver que el tejido no fijado
(Thé,1979), por lo que el efecto de los irrigantes puede estar
subestimado. Independientemente del diseño, se debe
confirmar la presencia de tejido pulpar intacto para garantizar
una condición inicial estandarizada.
El examen histológico de las muestras después de la
irrigación requiere una preparación compleja y que requiere
mucho tiempo y que puede introducir artefactos debido a la
contracción del tejido. La evaluación bidimensional de los cortes
puede brindar información cuantitativa sobre la superficie
cubierta por los restos de tejido pulpar en el conducto radicular
principal, las aletas no instrumentadas y los istmos, pero la
cantidad de detalles histológicos proporcionados excede lo
necesario para este propósito. La evaluación suele limitarse a
unos pocos cortes que pueden no ser representativos de todo el
conducto radicular. Finalmente, este es un método destructivo
que no permite la evaluación longitudinal de los mismos
ejemplares antes y después del riego.
Recientemente, se examinó la eliminación de restos de tejido
pulpar teñidos con una solución radiopaca.ex-vivomediante
tomografía microcomputarizada con contraste (De-Deus et al.,2021).
Este nuevo método no es destructivo, por lo que es posible obtener
imágenes repetidas de las muestras antes y después de la irrigación.
Se pueden utilizar dientes extraídos con pulpa intacta en lugar de
raíces partidas con tejido colocado artificialmente y no existen
restricciones anatómicas. Este método también es más fácil y
requiere menos tiempo que la evaluación histológica y al mismo
tiempo proporciona datos cuantitativos tridimensionales. También se
ha descrito un enfoque similar que utiliza tomografía
nanocomputada (Hildebrand et al.,2021). Por el momento, el
contraste logrado no es muy alto, pero con algunas mejoras
adicionales, estos métodos podrían convertirse en la primera opción
paraex-vivoestudios en el futuro.
Películas de colágeno artificial (Bryce et al.,2018; Huang et al.,
2008; McGill y otros,2008) o hidrogeles (Macedo et al., 2014a;
Robinson y otros,2018; Swimberghe et al.,2019b) también se han
utilizado como objetivos para irrigantes de conductos radiculares.
|307
Estos materiales fueron propuestos originalmente como
sustitutos de las biopelículas; sin embargo, se parecen más a
restos de tejido pulpar que a biopelículas, por lo que se
describen aquí. Se aplica fácilmente una cantidad estandarizada
del material a la pared principal del conducto radicular después
de dividir la raíz (Bryce et al., 2018; Huang et al.,2008; McGill y
otros,2008) o insertados en istmos artificiales transparentes y
canales laterales (Macedo et al.,2014a; Robinson y otros,2018;
Swimberghe et al., 2019b). Las muestras se pueden evaluar
antes y después del riego y los modelos transparentes incluso
permiten la visualización en tiempo real de la extracción. Sin
embargo, en estos casos falta la interacción entre el irrigante y la
dentina. En este punto, se debe enfatizar que ni siquiera los
dientes limpiados pueden reproducir estas interacciones
químicas en su totalidad porque la composición de la dentina se
altera durante la limpieza (Huang et al.,2012; Marshall y otros,
1997; Rosales et al.,1999). La eliminación de películas de
colágeno e hidrogeles también puede diferir hasta cierto punto
de la eliminación de restos de tejido pulpar, por lo que los
irrigantes y métodos de irrigación más prometedores deberían
probarse más a fondo con tejido pulpar real.
Vale la pena mencionar que en el laboratorio se puede crear
una condición inicial potencialmente irreal cuando un conducto
radicular ya preparado (ya sea real o artificial) se llena o cubre
completamente con tejido pulpar o cualquier material sustituto.
Clínicamente, la preparación con instrumentos eliminaría la
mayor parte del tejido pulpar del conducto radicular principal,
desbridaría gran parte de su pared y también crearía un camino
para el irrigante. Sin embargo, este paso a menudo se omite en
los experimentos de laboratorio y las muestras se exponen
directamente a los irrigantes. En estas condiciones, las técnicas
de agitación que emplean limas/puntas oscilantes de metal o
plástico se ven favorecidas en comparación con otros métodos
de irrigación debido a su acción física directa sobre el tejido
pulpar/material sustituto además de su acción indirecta debido a
la agitación del irrigante. Esta acción directa adicional puede
parecer deseable en el laboratorio, pero clínicamente ya se
habría producido el mismo resultado mediante la preparación
del conducto radicular sin la necesidad de limas/puntas
oscilantes. Por tanto, este modelo de laboratorio no es adecuado
para la evaluación de este tipo de técnicas de agitación. El
problema se puede evitar si el tejido o material sustituto se
coloca en una aleta, surco, istmo o canal lateral donde las limas/
puntas oscilantes no pueden contactar físicamente con él, por lo
que su eliminación sólo puede lograrse mediante el irrigante
agitado.
ELIMINACIÓN DE RESIDUOS DE
DENTINA Y BARROCOTA
La eliminación de restos de dentina y la capa de barro,
subproductos de la instrumentación, es de interés porque es
308 | MÉTODOS PARA ESTUDIAR EL RIEGO
Se cree que pueden albergar bacterias o dificultar el acceso de los
irrigantes a ellas (Gulabivala et al.,2005; Paqué et al.,2009). De manera
similar a otros criterios de valoración sustitutos utilizados en estudios de
irrigación del conducto radicular, hasta el momento no hay evidencia de
que la eliminación de restos de dentina o la capa de barrillo aumente la
probabilidad de curación de la periodontitis apical.
Microscopía electrónica de barrido
Los desechos y la capa de barro en la pared del conducto radicular se
evaluaron durante décadas con un aumento muy alto utilizando el
SEM ampliamente disponible (Figura 7). Numerosoex-vivoLos
estudios se centraron casi exclusivamente en dientes unirradiculares
que se dividieron longitudinalmente para permitir la evaluación
(Baumgartner & Cuenin,1992; Baumgartner y Mader,1987; McComb
y Smith,1975; Yamada et al.,1983). Sin embargo, varias preguntas
clave sobre la eliminación de restos de dentina y la capa de barro no
han sido respondidas y esto se ha atribuido en gran medida a las
limitaciones metodológicas y la falta de reproducibilidad de la
mayoría de los estudios SEM (De-Deus et al.,2011; Hülsmann et al.,
2005).
El examen mediante SEM requiere la deshidratación de las
muestras y su recubrimiento con un material conductor. Este
procedimiento puede introducir artefactos que pueden interferir con
la evaluación (De-Deus et al.,2011) y es destructivo, por lo que los
ejemplares sólo pueden examinarse una vez, después del riego. Se
desconoce el estado previo del conducto radicular; por lo tanto, es
imposible concluir sin lugar a dudas que una determinada área
estaba inicialmente cubierta con restos de dentina o una capa de
barro y estos se eliminaron mediante irrigación (Gulabivala et al.,
2005). Una gran parte de la pared del conducto radicular no se toca
con los instrumentos (Peters,2004), y no se forma una capa de barro
en esas áreas (Sen et al.,1995). Además, se pueden producir restos
de dentina adicionales y una capa de barrillo mediante los
dispositivos de agitación de irrigación que se utilizan para eliminarlos
(Boutsioukis & Tzimpoulas,2016; Kanaan et al.,2020; Retsas et al.,
2016; Rodrigues et al.,2021), lo que también confunde los resultados
de los exámenes transversales. Un grupo de control sin riego no es
prueba suficiente del estado previo al riego del conducto radicular.
(a)
FIGURA 7Microfotografías SEM de dentina (a) cubierta con una capa de barro y (b) después de la eliminación de la capa de barro con NaOCl al 2,5%
seguido de EDTA al 17%
porque el área de interés es muy grande y diversa en comparación
con los pocos lugares seleccionados que realmente se examinan (De-
Deus et al.,2011). También es rara una selección genuinamente
aleatoria de estos lugares. En cambio, los operadores tienden a
seleccionar áreas relativamente limpias y, a menudo, existe un sesgo
adicional debido a la falta de cegamiento (Gulabivala et al.,2005;
Hülsmann et al.,2005). Además, las muestras se examinan con
distintos aumentos (De-Deus et al.,2011; Hülsmann et al.,2005).
La evaluación de los restos de dentina remanentes y de la capa
de barrillo en las imágenes SEM también es problemática. La
evaluación se limita inevitablemente a dos dimensiones y es
cualitativa o semicuantitativa. A menudo se utilizan sistemas de
puntuación subjetivos, pero los observadores no están calibrados y
rara vez se comprueba la reproducibilidad de los resultados
(Gulabivala et al.,2005; Hülsmann et al.,2005). La diferencia entre
restos de dentina y barrillo dentinario no está bien definida. La
puntuación de la capa de barrillo residual a menudo se basa en el
número de túbulos abiertos (Lottanti et al.,2009), que
inevitablemente se ve confundida por la cantidad de dentina
esclerótica en cada muestra (Vasiliadis et al.,1983a,1983b), pero esto
rara vez se tiene en cuenta (Lottanti et al.,2009). La edad de las
muestras casi nunca se informa a pesar de que la cantidad de
dentina esclerótica aumenta con la edad (Vasiliadis et al.,1983a).
También se debe enfatizar que la relevancia clínica de los desechos
residuales y la capa de barro en la pared del conducto radicular
principal o su eliminación tal como se observa en las imágenes SEM
aún no está clara (Gulabivala et al., 2005; Zehnder,2012). Dada la
abundancia de estudios publicados, las limitaciones metodológicas
ampliamente reconocidas y la relevancia clínica incierta de los
hallazgos, se desaconseja una evaluación adicional mediante SEM de
los restos de dentina y la eliminación de la capa de barro, lo cual está
en línea con la política del International Endodontic Journal (Zehnder,
2012).
Métodos alternativos para estudiar la
eliminación de la capa de barrillo.
ESEM es una versión de SEM adaptada para el examen de
muestras hidratadas (se proporcionan más detalles en
(b)
BOUTSIOUKIS et al.
el apartado 'Efecto antimicrobiano/Microscopía') y se ha propuesto
como una alternativa para el estudio de la capa de barrillo. Las
muestras pueden examinarse repetidamente antes y después del
riego (Kanaan et al.,2020), por lo que el problema del pequeño
campo de visión se soluciona parcialmente, pero la evaluación sigue
siendo bidimensional y está limitada por los mismos problemas que
el SEM. Otra opción es el AFM, que proporciona datos de alta
resolución sobre la topografía de la superficie tridimensional de las
muestras luego de una preparación mínima de la muestra. Sin
embargo, la adquisición de imágenes es lenta, por lo que no es
posible obtener imágenes repetidas de fenómenos que progresan
rápidamente en intervalos cortos. Además, existen limitaciones en la
variación de la altura de la superficie de la muestra, por lo que
generalmente se requiere el pulido de las muestras (De-Deus et al.,
2006). Finalmente, la microscopía óptica co-sitio es otro método no
destructivo que permite la evaluación casi en tiempo real de la
eliminación de la capa de barro de una muestra mediante un análisis
basado en software. Nuevamente es necesario pulir las muestras
antes del experimento debido a la limitada profundidad de campo
del microscopio con el aumento requerido (De-deus et al.,2007; Reis
et al.,2008).
Métodos alternativos para estudiar la
eliminación de restos de dentina
En principio, ESEM y AFM también podrían usarse para examinar
restos de dentina en la pared del conducto radicular principal
después de la división de la raíz. Sin embargo, actualmente, el interés
de la investigación se centra en las grandes cantidades de restos de
dentina que se acumulan en áreas no instrumentadas del sistema de
conductos radiculares, como aletas, istmos y conductos accesorios,
durante la instrumentación. En los casos infectados, dichos desechos
acumulados podrían dificultar el acceso de los irrigantes a la
biopelícula intacta (Gulabivala et al.,2005; Paqué et al.,2009; Siqueira
et al., 2018) y podría decirse que este es un problema más
importante que las partículas de dentina dispersas o una fina capa
de barro que cubre las áreas instrumentadas (Haapasalo et al.,2012).
Un numero dein vitroyex-vivoLos estudios han examinado la
eliminación de restos de dentina de depresiones o surcos artificiales
creados a lo largo de conductos radiculares rectos en raíces divididas
después de la instrumentación. Para este propósito se han utilizado
conductos radiculares tanto artificiales como reales (Jiang et al.,
2011b; Lee y otros,2004; Rödig et al.,2010; van der Sluis et al.,2006).
El modelo de "diente partido" permite la estandarización de la
anatomía del conducto radicular y la cantidad de desechos
preoperatorios, y se puede realizar un examen repetido bajo un
microscopio estereoscópico normal sin deshidratación ni
recubrimiento. Sin embargo, la fabricación de las muestras requiere
mucho tiempo, el modelo se limita principalmente a conductos
radiculares rectos y los surcos y depresiones son relativamente
grandes en comparación con las aletas, istmos y conductos
accesorios reales no instrumentados. Además, los restos de dentina
|309
se empaqueta manualmente en lugar de acumularse gradualmente
durante la instrumentación y la evaluación de su eliminación se basa
en la puntuación de una imagen bidimensional. Una preocupación
adicional es que el montaje y desmontaje de los modelos pueda
mover los escombros.
Otro enfoque es preseccionar la raíz en algunos niveles
perpendicularmente al conducto radicular antes de la
instrumentación y volver a ensamblarla (Howard et al.,2011; Klyn et
al., 2010; Tomás y otros,2014). Este modelo no se limita a conductos
radiculares rectos, los restos de dentina se acumulan naturalmente
durante la instrumentación y es posible realizar evaluaciones
repetidas en varias etapas de la preparación quimiomecánica. La
cantidad de restos de dentina se mide en dos dimensiones en los
niveles preseleccionados bajo un microscopio estereoscópico
después del desmontaje de las muestras, pero los hallazgos de estos
niveles pueden no ser representativos de todo el conducto radicular.
La fabricación de las muestras también requiere mucho tiempo y la
ubicación de los restos también puede alterarse durante la
manipulación de las muestras.
La evaluación de la eliminación de restos de dentina de los
conductos radiculares mejoró enormemente con la introducción de
la tomografía microcomputarizada (micro-CT; Paqué et al.,2009,2011
). Este método proporciona imágenes tridimensionales de alta
resolución del sistema de conductos radiculares.ex-vivo(Figura 8) sin
dañar los especímenes (Peters et al.,2000; Existencias,2008), por lo
que la evaluación longitudinal cuantitativa antes y después de la
irrigación es posible incluso en dientes con anatomía compleja. Los
restos de dentina se acumulan gradualmente durante la
instrumentación (Paqué et al., 2009) pero la cantidad de desechos no
se puede estandarizar, por lo que es posible que se requiera un
tamaño de muestra mayor. No se recomienda alterar los protocolos
de preparación quimiomecánica para favorecer la acumulación de
desechos (Leoni et al., 2017; Paqué et al.,2009) porque podría crear
un desafío poco realista para los regantes. En alta resolución, el
tiempo de escaneo de una raíz completa sigue siendo del orden de
horas, aunque es probable que disminuya en el futuro. Los
parámetros de escaneo se pueden estandarizar fácilmente, pero hay
varios pasos críticos durante el procesamiento de datos que
requieren atención (Moinzadeh et al.,2015). Es necesario filtrar las
exploraciones para reducir el ruido y evitar hallazgos espurios. Los
escaneos consecutivos también deben registrarse automáticamente
mediante un análisis de correlación de imágenes digitales, en lugar
de alinearse manualmente, para permitir una sustracción de
imágenes más precisa en tres dimensiones. La segmentación
automatizada independiente del observador de los escaneos para
distinguir la dentina del aire es preferible a la determinación visual
del umbral, siendo este último altamente subjetivo (Moinzadeh et al.,
2015). Finalmente, se debe tener en cuenta que los datos
cuantitativos extraídos de las exploraciones con micro-CT se ven
fuertemente afectados por el tamaño del vóxel, por lo que los
hallazgos de estudios que utilizaron diferentes tamaños de vóxel no
son comparables (Paqué & Peters,2011). Es
310 | MÉTODOS PARA ESTUDIAR EL RIEGO

FIGURA 8Secciones transversales por micro-CT de dientes humanos extraídos: un canino maxilar dividido y reensamblado (a) antes y (c) después del
empaquetamiento manual de restos de dentina en una depresión creada artificialmente (flecha) y la raíz mesial de un molar mandibular (b) antes y (d) después de la
preparación con instrumentos rotatorios de Ni-Ti. Obsérvese los restos de dentina que se acumularon en la aleta no instrumentada del molar durante la
preparación (flecha)

Es de destacar que dicho análisis tridimensional no se puede llevar a
cabo utilizando los escáneres de tomografía computarizada de haz
cónico actualmente disponibles debido a su resolución espacial
(Talwar et al.,2016) todavía no es suficiente para la detección precisa
de restos de dentina acumulados.
CAUDAL DE IRRIGANTE Y
PENETRACIÓN
Para ejercer cualquier efecto físico o químico sobre la biopelícula, los
restos de tejido pulpar, los restos de dentina y la capa de barrillo, los
irrigantes primero deben alcanzar estos objetivos. Por lo tanto, la
información sobre su penetración en el sistema de conductos
radiculares puede ser una guía útil para seleccionar los métodos de
irrigación que tienen mayores posibilidades de llegar a las áreas de
interés para realizar más pruebas enex-vivoyen vivoestudios.
Además, la velocidad de irrigación en istmos artificiales y canales
laterales se ha correlacionado con la eliminación de biopelículas de
esas áreas (Pereira et al.,2021a). Sin embargo, hasta el momento no
se ha demostrado una relación directa entre la penetración del
irrigante y la curación de la periodontitis apical.
Desafortunadamente, las soluciones radiopacas (agentes de contraste o
sus mezclas con irrigantes de uso común) tienen una densidad y
viscosidad mucho mayores que el NaOCl y otros irrigantes. Dependiendo
del tipo de experimento, otras propiedades como la tensión superficial de
la solución y su ángulo de contacto con la dentina también pueden ser
relevantes (Boutsioukis et al.,2014) y suelen ser bastante diferentes
también. Estas propiedades físicas tienen un impacto en la penetración
del irrigante, particularmente en las partes más estrechas del sistema de
conductos radiculares (Teplitsky et al., 1987), por lo que las soluciones
radiopacas no son sustitutos confiables de los irrigantes en tales
experimentos.
Incluso si una hipotética solución radiopaca pudiera imitar
perfectamente el flujo de un irrigante, su penetración dentro del sistema
de conductos radiculares es un proceso dinámico que debe examinarse
en tiempo real. Las radiografías y las exploraciones por micro-CT sólo
pueden capturar una imagen estática del conducto radicular entre unos
segundos y unas horas después de la irrigación. Los cambios de presión,
la flotabilidad, la vibración de la muestra o el inevitable aumento de
temperatura durante la exploración con micro-CT podrían alterar la
distribución del irrigante y el tamaño y ubicación de cualquier burbuja
(Boutsioukis et al.,2014). Además, se desconoce el límite de detección de
soluciones radiopacas dentro del conducto radicular mediante
radiografías periapicales o micro-CT (de Gregorio et al.,2009).

Experimentos utilizando soluciones radiopacas.
Seguimiento de soluciones radiopacas administradas en conductos
radiculares.in vitrooex-vivocon la ayuda de radiografías periapicales
fue uno de los primeros métodos propuestos para estudiar la
penetración del irrigante (de Gregorio et al.,2009; Muñoz y Camacho-
Cuadra, 2012; Peeters y Gutknecht,2014; RAM,1977; Teplitsky y otros,
1987). Más recientemente, este método también se combinó con
micro-CT para obtener una vista tridimensional del patrón de
penetración (Tay et al.,2010; Versiani et al.,2015).
Cuando el trazado radiográfico de estas soluciones se realiza
en estudios clínicos (Munoz & Camacho-Cuadra, 2012; Vera et al.,
2012a), existen preocupaciones éticas adicionales. NaOCl es una
solución muy reactiva y sus efectos dependen principalmente de
la cantidad de cloro libre disponible (Zehnder et al.,2002). Por
tanto, al mezclar NaOCl con agentes de contraste, es imperativo
verificar que no se reduzca el cloro disponible. Además, la
exposición repetida de los pacientes a una radiación que no es
beneficiosa para su tratamiento ni proporciona datos fiables
sobre la irrigación
BOUTSIOUKIS et al. |311

La penetración viola el principio ALARA (tan bajo como sea

razonablemente posible). Teniendo en cuenta las limitaciones antes
mencionadas, se recomienda el rastreo de soluciones radiopacas para
estudiar la penetración del irrigante.ex-vivooen vivoestá desanimado.

Experimentos usando tintes.

Otros estudios han optado por el trazado visual de tintes o mezclas

de tintes e irrigantes en bloques de resina transparente o dientes
aclarados (de Gregorio et al.,2009; Parque y otros, 2013; Vera et al.,
2012a). Se han evaluado tanto la penetración del tinte como la
eliminación del tinte preinyectado del conducto radicular. Aunque los
tintes se parecen más a los irrigantes del conducto radicular que a
las soluciones radiopacas en términos de propiedades físicas, sus
patrones de flujo aún pueden diferir hasta cierto punto (Boutsioukis
et al.,2014). No existen estándares validados sobre el tipo de tinte
que se debe utilizar en lugar del irrigante o su concentración óptima.
Por lo tanto, se deben examinar de antemano las propiedades físicas
del tinte y su parecido con los irrigantes de uso común. Como el
NaOCl puede blanquear el tinte, a menudo se utiliza agua destilada o
del grifo como irrigante en experimentos de eliminación de tinte. La
irrigación debe continuar durante un período de tiempo clínicamente
relevante o al menos hasta que se alcance un estado casi
estacionario, pero incluso entonces la interpretación puede ser difícil
porque puede no haber ninguna interfaz definida para marcar el
nivel máximo de penetración/aclaración. La transición puede tener
lugar sobre un área ocupada por tinte diluido (Bronnec et al.,2010). FIGURA 9 Medición experimental de la velocidad del irrigante mediante

Las moléculas de tinte continuarán difundiéndose a través de esta
área con el tiempo a una velocidad que puede no igualar la velocidad
de difusión de las moléculas/iones del irrigante, por lo que la
evaluación inmediatamente después del final del riego es
fundamental.
La sustitución de la dentina por bloques acrílicos transparentes o
dientes impresos en 3D también puede afectar la penetración del
irrigante porque las propiedades superficiales del polimetacrilato de
metilo y otras resinas hidrofóbicas son diferentes de las de la dentina
hidrofílica (Boutsioukis et al.,2014). Lo mismo se aplica a los dientes
limpiados (Robertson et al.,1980; Venturi et al.,2003) cuya superficie
también se vuelve menos hidrófila que la dentina intacta durante el
procesamiento (Huang et al., 2012; Marshall y otros,1997; Rosales et
al.,1999). Estos problemas son particularmente importantes cuando
se examina la penetración del tinte en conductos radiculares vacíos
donde se desarrolla un flujo de dos fases (tinte y aire). El ambiente
hidrofóbico puede favorecer el atrapamiento de burbujas de aire en
estos casos (Boutsioukis et al.,2014).
imágenes de alta velocidad y análisis de velocimetría de imágenes de
partículas: (a) vectores de velocidad y (b) magnitud de la velocidad en el tercio
apical de un conducto radicular artificial durante la irrigación con jeringa con
una aguja de extremo cerrado de 30G. La aguja es de color negro. [Reimpreso
y modificado con permiso de Wiley (Boutsioukis et al.,2010a)]
y monitorear los gradientes de temperatura con una cámara
infrarroja (Hsieh et al.,2007). Este método tiene la ventaja de utilizar
dientes humanos e irrigantes reales, pero aumentar la temperatura
puede disminuir ligeramente la viscosidad del irrigante y dar lugar a
un patrón de penetración más favorable. Es posible obtener
imágenes en tiempo real, pero la cámara registra la transferencia de
calor en lugar del flujo de irrigación, que puede diferir en algunos
casos. Su resolución espacial y temporal también puede resultar
insuficiente para un análisis detallado del flujo.
Imágenes de alta velocidad

Para visualizar y cuantificar el flujo en detalle, actualmente se considera el

Imágenes infrarrojas
Otra forma de estudiar la penetración del irrigante es administrar
irrigante tibio (50 °C) en conductos radiculares enfriados (10 °C).ex-vivo
método de última generación la obtención de imágenes de alta velocidad
del irrigante que fluye sembrado con partículas trazadoras microscópicas
de flotabilidad neutra y el análisis con algoritmos de velocimetría de
seguimiento de partículas o velocimetría de imagen de partículas
(Boutsioukis et al. Alabama.,2010a; Koch y otros,2014; Verhaagen
312 | MÉTODOS PARA ESTUDIAR EL RIEGO

y otros,2014a). Este método proporciona datos de resolución temporal de

alta resolución sobre la velocidad del irrigante dentro del conducto
radicular (Figura 9). Al ser un método óptico, requiere un acceso óptico
directo al irrigante al menos desde dos lados, por lo que se deben utilizar
conductos radiculares artificiales hechos de resina transparente o
polidimetilsiloxano. La concentración de las partículas trazadoras debe
equilibrarse para que se puedan capturar suficientes detalles del flujo sin
alterar el flujo mismo (Westerweel,1993). Las imágenes deben realizarse
con una cámara de alta velocidad que sea lo suficientemente rápida como
para capturar las características importantes del flujo en la escala de
tiempo relevante. La cámara debería poder grabar varios fotogramas
consecutivos a velocidades de fotogramas al menos 2 veces más rápidas
(y preferiblemente entre 5 y 10 veces más rápidas) que la frecuencia
temporal más alta del evento de interés de alta velocidad (Versluis,2013).
Por ejemplo, para capturar el flujo oscilatorio alrededor de una lima
ultrasónica durante la activación del irrigante (F≈30 kHz), la cámara debe
ser capaz de grabar al menos un ciclo de oscilación completo a una
velocidad de 150 000 a 300 000 fotogramas por segundo para capturar la
transmisión inestable; Es posible que se requieran velocidades de cuadro
FIGURA 1 0 Caudal de riego calculado por diferentes
aún más altas para capturar la dinámica de las burbujas de cavitación
Modelos de dinámica de fluidos computacional: líneas de corriente promediadas en
transitorias (Macedo et al.,2014b). De lo contrario, el análisis revelará sólo
el tiempo que indican el flujo de irrigación principal creado por (a) una aguja de
una visión aproximada del flujo promediada en el tiempo y es posible que
extremo abierto de 30G, (b) una de extremo cerrado de 30G y (c) una aguja de
se pasen por alto fenómenos transitorios importantes (Koch et al.,2016; extremo cerrado de 31G en un conducto radicular mesial de un molar mandibular.
Layton et al.,2015). [Reimpreso y modificado con permiso de Elsevier (Boutsioukis & Gutiérrez Nova, 2021

)]. (d). Flujo bifásico (irrigante y aire) en la parte apical de un conducto radicular recto

simplificado durante la fase inicial de administración de irrigante mediante una aguja

de extremo cerrado de 30G. La interfaz aire-irrigante se representa como una

Penetración en los túbulos dentinarios. superficie azul. Observe las burbujas de aire apicalmente a la aguja (parte superior de

la imagen). Las agujas son de color rojo.

Evaluación de la penetración del irrigante en los túbulos dentinarios,

un proceso muy lento dominado por la difusión (Verhaagen et al.,
2014b), requiere un enfoque diferente. Las pruebas de penetración
directa utilizando colorantes o mezclas de colorantes e irrigantes
tienen un valor limitado debido a sus propiedades, como ya se ha
explicado. Además, la falta de penetración también puede atribuirse
a la esclerosis dentinaria (Vasiliadis et al.,1983a). Por lo tanto, se
recomienda un enfoque de dos pasos: primero, un tinte debe
penetrar todos los túbulos permeables (control positivo) y luego, se
debe permitir que el irrigante (principalmente NaOCl) penetre estos
túbulos y blanquee el tinte (Zou et al., 2010). A continuación se
determina el patrón de penetración basándose en la extensión de la
zona blanqueada. Parámetros que se sabe que afectan la difusión,
como la temperatura, la concentración del irrigante y el tiempo de
exposición (Verhaagen et al.,2014b) debe controlarse
cuidadosamente para evitar sesgos. Aun así, hay que subrayar que
se desarrollará un gradiente de concentración de cloro a lo largo de
los túbulos (Verhaagen et al.,2014b) y aún no está claro si la
concentración suficiente para blanquear el tinte también es
suficiente para matar bacterias o alterar la biopelícula. Un requisito
adicional es que los ejemplares deben mantenerse completamente
hidratados, lo más cerca posible de su estado natural.en vivo
condición (Jameson et al.,1994; Papá y otros,1994). Sólo se necesitan
unos pocos
minutos en un ambiente seco para que la dentina pierda una
cantidad significativa de agua libre debido a la deshidratación
(Jameson et al.,1994). La dentina seca es mucho más hidrofóbica que
la dentina húmeda (Rosales et al.,1999), y bajo estas condiciones, la
tensión superficial del irrigante puede limitar la penetración ex-vivo,
algo muy poco probable que suceda en dentina húmeda en vivo.
Dinámica de fluidos computacional
También se han utilizado modelos numéricos para obtener
información adicional sobre el flujo de irrigantes dentro del sistema
de conductos radiculares (Boutsioukis et al.,2009,2010a; Chen y
otros, 2014; Shen et al.,2010b; Verhaagen et al.,2014b). Estos
modelos versátiles complementan los experimentos y proporcionan
información sobre la velocidad y presión del irrigante, así como sus
derivados, como la tensión de corte de la pared, en áreas del sistema
de conductos radiculares donde las mediciones experimentales son
difíciles o incluso imposibles.Figura 10). Sin embargo, se basan en
una gran cantidad de supuestos y escenarios e incluso pequeñas
modificaciones en estos pueden producir resultados muy diferentes.
Por lo tanto, la confirmación de que
BOUTSIOUKIS et al.
Que las predicciones del modelo sean una aproximación suficiente a
la realidad (validación) es un requisito universal para todos los
modelos nuevos antes de que se utilicen para simular cualquier caso
real. Esto se puede hacer en comparación con experimentos de
validación diseñados adecuadamente (Oberkampf & Trucano,2002)
que reproducen los elementos esenciales del modelo y proporcionan
datos cuantitativos sobre las cantidades físicas relevantes
(normalmente velocidad y presión del irrigante). Casi nunca es
posible una coincidencia perfecta entre experimentos y simulaciones
numéricas debido a errores experimentales y numéricos inevitables,
por lo que se debe tener en cuenta el nivel de acuerdo al interpretar
las predicciones del modelo. Las geometrías simplificadas del
conducto radicular que se modelaron en los primeros estudios
(Boutsioukis et al.,2009,2014; Chen y otros,2014; Shen et al.,2010b)
han sido reemplazados gradualmente por otros más realistas
basados en micro-CT de dientes humanos (Boutsioukis & Gutierrez
Nova,2021; Loroño et al.,2020; Snjaric et al.,2012; Wang y otros,2015)
pero los beneficios de la complejidad adicional aún no se han
demostrado. La simplificación geométrica es sólo una de las muchas
fuentes potenciales de error en un modelo numérico, por lo que
cambiar a geometrías de conducto radicular más realistas no
garantiza la precisión de los resultados, aunque sí aumenta la carga
de trabajo y el tiempo y los recursos computacionales necesarios. En
el proceso de optimización del modelo, es más razonable reducir
todos los tipos de error al mismo orden de magnitud, de modo que
ninguno de ellos tenga un efecto desproporcionadamente grande en
los resultados, que eliminar solo un tipo de error (Oberkampf y
Trucano). ,2002).
EXTRUSIÓN IRRIGANTE A TRAVÉS DEL
FORAMEN APICAL
La extrusión inadvertida de irrigante a través del agujero apical
puede provocar daño tisular y sintomatología pronunciada
(Guivarc'h et al.,2017; Hülsmann & Hahn, 2000), por lo que se
considera un efecto secundario importante de la irrigación del
conducto radicular. Se han empleado una variedad de métodos
para investigar los parámetros involucrados en estos accidentes.
Medición del irrigante extruido. ex-
vivo
Un enfoque es utilizar la cantidad de irrigante que se extruye
a través del agujero apical.ex-vivocomo punto final sustituto.
Aunque la hipótesis de que esta cantidad esté correlacionada
con el riesgo o la gravedad de un accidente parece plausible,
no ha sido confirmada por ningún estudio clínico
(Boutsioukis et al.,2013).
El modelo propuesto por Fairbourn et al., (1987) y posteriormente
modificado por Myers y Montgomery (1991) ha sido
|313
Se utiliza ampliamente para cuantificar el irrigante extruido.ex-
vivo bajo diversas condiciones y aún permanece en uso (Dos Reis
et al.,2020; Vidas et al.,2020). En este modelo, la raíz de la
muestra está unida a un vial vacío donde se recoge el irrigante
extruido durante la irrigación, de modo que el agujero apical
está completamente rodeado de aire ambiental. Los tejidos
periapicales no están simulados en absoluto, aunque pueden
actuar como una barrera natural.en vivo(Salzgeber y brillante,
1977), y esto conduce a una sobreestimación considerable de la
extrusión de irrigante (Psimma et al.,2013a). Por tanto, este
modelo tiene una relevancia clínica muy limitada. Otro modelo
basado en la cuantificación de gotas de irrigante expulsadas a
través del agujero apical (George & Walsh,2008) comparte las
mismas limitaciones. Cabe destacar que el aire, ya sea que fluya
libremente o esté confinado dentro de un vial (Araquam et al.,
2009; Mangalam et al.,2002), no es suficiente para simular la
resistencia de los tejidos periapicales a la extrusión del irrigante.
En un esfuerzo por imitar el efecto de los tejidos periapicales
y desarrollar modelos más realistas, los ápices de las raíces se
han sumergido en agua (Psimma et al.,2013a,2013b), varios tipos
de geles (Fukumoto et al.,2006; Hauser y otros, 2007; Mitchell y
otros,2011), masilla de silicona (Azim et al., 2018; Rodríguez-
Figueroa et al.,2014), o espuma floral (Altundasar et al.,2011;
Genc Sen y Kaya,2018). El agua aún puede ejercer menos
resistencia a la extrusión en comparación con una lesión
periapical, pero facilita la cuantificación en tiempo real del
irrigante extruido mediante métodos electroquímicos (Psimma
et al.,2013a). Los geles y las masillas de silicona pueden
parecerse más al tejido dentro de una lesión periapical, pero
dificultan la detección del irrigante extruido. A menudo se
utilizan métodos químicos que se basan en el cambio de color
del gel (Fukumoto et al.,2006; Mitchell y otros,2011; Yost y otros,
2015) y la cuantificación se basa en el área decolorada
bidimensional que puede no ser representativa del efecto
tridimensional. Por el contrario, la espuma floral es un material
poroso con poca relevancia clínica que puede absorber o perder
humedad con el tiempo. Esto puede interferir con las medidas
del irrigante extruido, por lo que no se recomienda su uso.
Aparte de estos materiales, se ha desarrollado una válvula
electrónica ajustable que permite la extrusión del irrigante sólo
cuando la presión apical del irrigante supera un cierto umbral
(Charara et al.,2016) y un aparato que aplica una presión
opuesta predefinida en el agujero apical para resistir la extrusión
del irrigante (Cai et al.,2018) también han sido propuestos. Es
muy poco probable que los tejidos periapicalesen vivose
comportan como una válvula y no existe un umbral de presión
validado para la extrusión del irrigante (ver más detalles en la
sección "Presión del irrigante apical"), por lo que la relevancia
clínica de estos modelos es cuestionable.
En general, la selección del material o método para
simular los tejidos periapicales y su relevancia para elen
vivoLas condiciones deben estar justificadas. Es más, es
314 | MÉTODOS PARA ESTUDIAR EL RIEGO
Se recomienda que la extrusión se evalúe cuantitativa en lugar
de cualitativamente y que todas las mediciones se conviertan al
volumen de irrigante extruido, que se puede comparar
fácilmente entre estudios. La evaluación binaria (sí/no) asigna la
misma importancia a la extrusión menor y mayor, lo que podría
inducir a error. La extrusión pasiva de irrigante a través del
agujero apical parece ocurrir continuamente a una velocidad
muy baja (~1 μl/s) durante el tratamiento del conducto radicular.
ex-vivoyen vivomientras el canal contenga irrigante (Chu,2010;
Psimma et al.,2013a), pero no hay evidencia de manifestaciones
clínicas consiguientes en la gran mayoría de los casos clínicos
tratados. Por lo tanto, puede que no haya diferencia entre no
extruir y extruir pequeñas cantidades de irrigante.
Presión irrigante apical
En lugar de evaluar la cantidad de irrigante extruido, varios
estudios midieron la presión del irrigante en o cerca del agujero
apical durante la irrigación (Conard, 2012; Khan y otros,2013;
Magni et al.,2021; Parque y otros, 2013; Verhaagen et al.,2012a).
Esta presión es más fácil de medir que la extrusión del irrigante y
se ha considerado como un criterio de valoración sustituto
adecuado, a pesar de la falta de una validación adecuada. Los
transductores de presión en miniatura instalados en el agujero
apical pueden reducir el error experimental durantein vitroyex-
vivomedidas (Conard, 2012; Verhaagen et al.,2012a), por lo que
deberían ser preferidos. Grandes transductores conectados al
ápice a través de largos tubos y contenedores (Khan et al.,2013;
Parque y otros, 2013) puede permitir que el irrigante fluya a
través del agujero apical. En tal caso, el lugar donde se mide la
presión se vuelve incierto porque se desarrolla un gradiente de
presión a lo largo del camino desde el agujero apical hasta el
transductor. También es importante medir la presión apical en
cada raíz de forma independiente incluso si la irrigación se
realiza simultáneamente en todos los conductos (Ordinola-
Zapata et al.,2021). De lo contrario, se puede desarrollar un flujo
poco realista a través del recipiente circundante debido a
diferencias en la presión apical en cada agujero y esto puede
introducir errores adicionales en las mediciones.
Se han utilizado varios umbrales de presión arbitrarios para
traducir las mediciones de presión apical en riesgo de extrusión
(Charara et al.,2016; Khan y otros,2013; Parque y otros, 2013), a
menudo basado en la hipótesis de que existe una presión constante
en el área periapical que se opone a la extrusión del irrigante (Cai et
al.,2018; Zhu et al.,2013). Hasta el momento, ninguno de estos
umbrales ha sido validado, por lo que se desaconseja enfáticamente
su uso para formular recomendaciones de seguridad clínica.
Además, la hipótesis de una presión opuesta constante en la zona
periapical se contradice con los datos disponibles.en vivoevidencia
(Mohorn et al.,1971a,
1971b) y también conduce a una serie de paradojas (Psimma
& Boutsioukis,2019). Los valores de presión apical son
principalmente útiles para comparar el riesgo relativo de
diferentes métodos o protocolos de riego cuando no es
factible una medición directa de la cantidad de irrigante
extruido, por ejemplo durante simulaciones numéricas
(Boutsioukis et al.,2010b; Shen et al.,2010b) pero no deben
sobreinterpretarse. Además, la comparación de la presión
apical creada por métodos de irrigación de presión positiva y
negativa (Chen et al.,2021; Haapasalo et al.,2016; Zhu et al.,
2013) puede ser engañoso, ya que aún no se comprenden
bien la importancia clínica y los riesgos potenciales de una
presión negativa alta en el agujero apical.
Estudios clínicos
No se pueden realizar ensayos clínicos aleatorios sobre la
extrusión involuntaria de irrigante debido a restricciones éticas,
pero se han publicado estudios clínicos que examinan
radiográficamente la penetración de soluciones radiopacas más
allá del agujero apical (Salzgeber & Brilliant,1977; Sousa et al.,
2021). Cabe señalar que las soluciones radiopacas tienen
propiedades físicas diferentes a las de los irrigantes (ver sección
'Flujo y penetración del irrigante'), por lo que estos experimentos
demuestran principalmente la presencia de un espacio continuo
en el área periapical adyacente al agujero apical y no la extrusión
del irrigante.per se. Además, incluso si una pequeña cantidad de
irrigante se filtra hacia los tejidos periapicales, esto por sí solo
puede no ser suficiente para desencadenar los signos y síntomas
descritos colectivamente como "accidente de extrusión", como
ya se explicó. Otra preocupación es la exposición repetida de los
pacientes a la radiación.
PUNTOS GENERALES
La investigación básica y traslacional (o aplicada) son áreas
complementarias de la ciencia que interactúan de forma
bidireccional. La investigación básica proporciona el
conocimiento fundamental que debe traducirse en aplicaciones
clínicas (enfoque de abajo hacia arriba), pero no es raro que las
observaciones en la investigación traslacional generen nuevas
preguntas que deben abordarse en el nivel científico básico
(enfoque de arriba hacia abajo; Fang & Casadevall ,2010). El
límite entre estas dos áreas no está bien definido, y la mayoría
de los estudios se ubican en algún lugar del espectro entre la
ciencia básica pura y la investigación traslacional pura.
La traducción de ideas generadas por experimentos de
ciencia básica en tratamientos mejorados requiere el uso de
modelos validados que imiten laen vivocondiciones en humanos
lo más fielmente posible. Una consideración importante con
respecto al riego es que, en la mayoría de los casos,
BOUTSIOUKIS et al.
el conducto radicularen vivoes un sistema apicalmente cerrado
(Tay et al.,2010), que es un dominio muy difícil de penetrar para
los irrigantes. Lo mismo se aplica a los canales laterales, istmos y
túbulos dentinarios (Boutsioukis,2019). Así, en estudios de
laboratorio, la superficie de la raíz y particularmente el agujero
apical deben sellarse con suficientes capas de cianoacrilato o
composite antes de la irrigación, teniendo cuidado de no
bloquear el conducto radicular. Este es un requisito crítico para
todo tipo de estudios sobre irrigación, con excepción de los
estudios sobre la extrusión inadvertida de irrigante a través del
agujero apical. Cabe señalar que la cera, el esmalte de uñas y la
masilla de silicona pueden no ser suficientes para crear un sello
apical hermético a los líquidos y al aire (Tay et al.,2010). Además,
crear un sistema apicalmente cerrado es más difícil cuando las
raíces se dividen/seccionan y se vuelven a ensamblar (Bhuva et
al.,2010; Villalta-Briones et al.,2021). La relevancia clínica de los
modelos de laboratorio que no garantizan un sistema de
conductos radiculares cerrado apicalmente durante la irrigación
es muy limitada (Parente et al.,2010; Tay et al.,2010).
La geometría del conducto radicular también es de suma
importancia. Los experimentos en tubos de vidrio, vasos de
precipitados o grandes conductos radiculares bovinos no pueden
reproducir la dinámica de fluidos que ocurre dentro del espacio
confinado de un conducto radicular humano (Verhaagen et al.,2012a)
y, por lo tanto, pueden sobreestimar o subestimar el rendimiento de
varios sistemas de riego. Por ejemplo, la penetración del irrigante y
la eliminación de las burbujas de aire atrapadas es mucho más fácil
en estas condiciones (Boutsioukis et al.,2014). Del mismo modo, las
limas/puntas sónicas y ultrasónicas oscilan con gran amplitud (Jiang
et al.,2010; Neuhaus et al.,2016; Verhaagen et al.,2012b)
probablemente funcionen mucho mejor cuando oscilan sin
restricciones que dentro de un conducto radicular humano.
Es imperativa una estandarización adecuada de los
protocolos experimentales para aumentar la validez interna del
estudio y reducir los factores de confusión. Se sabe que el
tamaño de la preparación apical afecta tanto a la penetración de
los irrigantes en el tercio apical (Boutsioukis et al.,2010b; Hsieh
et al.,2007) y su desbridamiento (Huang et al.,2008), por lo que
debería estandarizarse. Un error común es pensar que la
estandarización puede basarse en el tamaño de la primera lima
que se "une" en el extremo del canal (Saini et al.,2012; Topçuoğlu
et al.,2018a,2018b). Existe amplia evidencia de que el tamaño de
esta lima no se corresponde con el diámetro inicial del conducto
radicular (Paqué et al.,2010; Weiger et al.,2006; Wu et al.,2002).
En lugar de confiar en la retroalimentación táctil subjetiva, se
recomienda seleccionar conductos radiculares de forma similar y
prepararlos todos con el mismo tamaño apical y conicidad.
Otro parámetro crítico que necesita estandarizarse es la
profundidad de inserción de agujas, cánulas y limas/puntas
de agitación (Adorno et al.,2016; Boutsioukis et al., 2010c;
Malki et al.,2012; Pérez et al.,2017). la inserción
|315
La profundidad se ha definido en algunos estudios basándose en el
punto de unión de estos componentes dentro del conducto radicular
(Desai & Himel,2009; Hauser y otros,2007). Este punto es muy
subjetivo y puede variar incluso en conductos radiculares preparados
con el mismo tamaño apical y conicidad. Por lo tanto, es preferible
definir la profundidad de inserción utilizando el extremo apical del
instrumental como punto de referencia. Cabe señalar que el
movimiento constante de entrada y salida de estos componentes a lo
largo del conducto radicular, que pueden aplicar algunos médicos, es
difícil de estandarizar en estudios de laboratorio sin recurrir a brazos
robóticos.
El efecto químico del riego es sensible a las diferencias en la
concentración, el volumen, la superficie de contacto, la temperatura
y el tiempo del irrigante (Chau et al.,2015; Moorer y Wessellink,mil
novecientos ochenta y dos), mientras que el efecto mecánico es
sensible a las diferencias en el caudal y la intensidad de la agitación
(Boutsioukis & Gutierrez Nova,2021; Jiang et al., 2011b). Por lo tanto,
dependiendo del tipo de experimento y de los irrigantes o métodos
de riego particulares utilizados, los parámetros relevantes también
deben estandarizarse. Los dispositivos de riego que funcionan con
baterías deben conectarse a una fuente de alimentación externa
para garantizar su rendimiento estable. Finalmente, si no se puede
estandarizar algún parámetro que se sabe que afecta el riego,
entonces se debe aumentar el tamaño de la muestra y estos
parámetros deben incluirse en el análisis de los resultados como
covariables.
Para ayudar a la interpretación de los hallazgos, es esencial
comparar los nuevos irrigantes y métodos de irrigación también
con los estándares clínicos actuales (Dutner et al.,2012;
Willershausen et al.,2015). Una comparación entre dos métodos
de irrigación que rara vez se utilizan o entre estos métodos y
ninguna irrigación proporciona muy poca información útil para
la gran mayoría de los médicos porque carece de un punto de
referencia común. Los estándares clínicos deben aplicarse de
acuerdo con un protocolo óptimo clínicamente relevante; de lo
contrario, se puede sobrestimar la eficacia relativa de los nuevos
irrigantes y métodos de irrigación. Además, el valor de una
simple clasificación de irrigantes o métodos de irrigación según
un criterio de valoración sustituto se limita a los materiales o
dispositivos comparados. Una vez que estos son reemplazados o
retirados del mercado, esta información deja de ser útil. Por lo
tanto, además de la clasificación, también vale la pena
comprender los mecanismos fundamentales responsables del
desempeño observado, lo que a menudo requiere un enfoque
de ciencia básica. Este conocimiento puede ayudar a diseñar
nuevos irrigantes y métodos de riego o predecir su desempeño.
Como ya se mencionó, con la excepción del efecto
antimicrobiano, los criterios de valoración sustitutos
comúnmente utilizados, como la eliminación de restos de tejido
pulpar, restos de tejido duro o la capa de barro, no se han
correlacionado directamente con la curación de la periodontitis
apical. En cambio, su uso se ha basado en una serie de hipótesis.
316 | MÉTODOS PARA ESTUDIAR EL RIEGO
y supuestos que los vinculan con la reducción de la carga microbiana.
Sin embargo, una hipótesis plausible no es suficiente para justificar
el uso de un criterio de valoración sustituto. Los ejemplos de fuga
(De-Deus,2012; Consejo editorial de la Revista de Endodoncia,2007;
Wu y Wessellink, 1993), que se usó ampliamente en el pasado para
clasificar los materiales de obturación del conducto radicular y, más
recientemente, la extrusión apical de desechos (Pappen et al.,2019),
que todavía se informa en estudios de preparación de conductos
radiculares, sirven como recordatorio de que los criterios de
valoración sustitutos deben validarse. El propósito de la validación no
es sólo confirmar que realmente están correlacionados con los
resultados clínicos primarios, sino también determinar el tamaño
mínimo del efecto que conduce a un cambio clínicamente relevante
en el resultado primario. Se recomienda encarecidamente que estas
limitaciones se reconozcan en la sección de Discusión de futuros
estudios sobre irrigación del conducto radicular.
Aunque una descripción detallada de las pruebas estadísticas
está más allá del alcance de esta revisión, vale la pena
mencionar dos puntos importantes que con frecuencia se pasan
por alto. Contrariamente a la creencia común (Leoni et al.,2017;
Liang et al.,2013; Tomás y otros,2014; Versiani et al.,2016), las
pruebas estadísticas de parámetros preoperatorios o índices
anatómicos derivados de muestras asignadas aleatoriamente a
dos o más grupos y el hecho de no demostrar una diferencia
significativa no prueba que estos grupos sean equivalentes al
inicio. Sólo muestra que no hay evidencia suficiente para
rechazar la hipótesis nula (sin diferencia). La diferencia entre los
grupos tiene que ser bastante sustancial para conducir a unapag
-valor inferior a 0,05 (el nivel alfa comúnmente utilizado).
Dependiendo de la variabilidad dentro de cada grupo y del
tamaño de la muestra, que rara vez se selecciona para
garantizar suficiente potencia al comparar estos parámetros
preoperatorios, es fácil que grandes diferencias entre grupos
pasen desapercibidas. Cuando se examinan múltiples
parámetros, también se pueden esperar resultados significativos
espurios (errores de tipo I) (Altman,1985; Altman y suave,1995;
de Boer et al., 2015). Por lo tanto, tales pruebas se consideran
ilógicas y engañosas y se desaconseja enfáticamente su uso
(Harvey, 2018). La creación de grupos equilibrados con respecto
a cualquier parámetro preoperatorio importante debe basarse
principalmente en criterios de inclusión claramente definidos y
una aleatorización adecuada (estratificada si es necesario) junto
con un tamaño de muestra suficientemente grande.
Otro problema que suele encontrarse en la investigación es la
agrupación de datos no contabilizados. Los bloques de dentina que
se originan en el mismo diente, los dientes que se originan en el
mismo paciente y las mediciones en varias áreas de la misma
muestra de biopelícula son ejemplos de casos en los que los datos
obtenidos están relacionados en varios niveles. Por lo tanto, el
supuesto fundamental de muestras independientes que subyace a
muchas pruebas estadísticas comunes (Altman,1991) es violado. Los
datos agrupados requieren métodos estadísticos especiales para su
análisis (Masood et al.,2015). Alternativamente, los experimentos
pueden diseñarse para evitar la agrupación de datos, por ejemplo
incluyendo especímenes verdaderamente independientes en cada
grupo.
OBSERVACIONES FINALES
La irrigación es uno de los elementos clave del tratamiento de
conducto. A pesar de los esfuerzos de décadas, todavía existen
muchas lagunas en nuestra comprensión de la penetración de los
irrigantes en el sistema de conductos radiculares, su interacción con
la biopelícula bacteriana, los restos de tejido pulpar y los restos de
dentina, y sus efectos secundarios, por lo que se necesitan más
investigaciones. necesarios en estas áreas. Para este fin se han
utilizado una amplia variedad de métodos y modelos experimentales.
Los que no son confiables o poco realistas no son infrecuentes y esto
puede haber contribuido a la aparición de hallazgos contradictorios
en la literatura. Cuando un método o modelo no es lo
suficientemente confiable o realista (criterios que pueden ir
endureciéndose con el tiempo a medida que sale a la luz nueva
evidencia), el buen juicio científico dicta que debe ser reemplazado
por uno mejor que tenga una aplicación y traducción más directa a la
endodoncia clínica. . Prolongar su uso simplemente porque "no hay
alternativa" fomenta el estancamiento y la dependencia excesiva de
una metodología defectuosa. Los métodos de investigación deberían
evolucionar continuamente. También es necesario validar los
modelos y los criterios de valoración sustitutos deben
correlacionarse con resultados clínicos reales en lugar de basarse
únicamente en suposiciones. Finalmente, en la mayoría de los casos,
no existen métodos y modelos ideales que funcionen perfectamente
independientemente de las condiciones y al mismo tiempo
proporcionen todas las respuestas. Por tanto, puede ser necesario
combinar dos o más complementarios y tener en cuenta sus
fortalezas y debilidades a la hora de interpretar los resultados.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores han declarado explícitamente que no existen
conflictos de intereses en relación con este artículo.
ORCIDO
Christos Boutsioukis https://orcid.
org/0000-0002-1347-1034
María Teresa Arias Moliz https://orcid.
org/0000-0003-0559-2159
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Cómo citar este artículo:Boutsioukis, C., Arias-Moliz,
MT & Chávez de Paz, LE (2022) Un análisis crítico de
métodos de investigación y modelos experimentales
para estudiar irrigantes y sistemas de riego. Revista
Internacional de Endodoncia, 55 (Suplemento 2), 295–
329. Disponible de:https://doi.org/10.1111/ iej.13710