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Leptina (2)
• Se secreta desde el tejido adiposo, entra al cerebro desde la sangre e interactúa con receptores específicos
en neuronas del hipotálamo (y otras áreas).
• Si en cerca del hipotálamo ventral:
• Además de proporcionar información sobre la masa adiposa general también informa sobre la distribución
de la grasa (la leptina se secreta a tasas más altas de grasa subcutánea vs visceral por lo que la leptina
circulante correlaciona mejor con la grasa subcutánea total que con la grasa corporal total.
• Dado que las mujeres tienen más grasa subcutánea que los hombres, el mensaje de adiposidad difiere en
hombres y mujeres y correlaciona con la distribución de grasa, de hecho los niveles de leptina son más altos
en mujeres que en hombres incluso antes de la pubertad.
(3) Tras la pubertad, el estrógeno y la testosterona modulan la síntesis y secreción de leptina mediante
mecanismos transcripcionales del receptor de esteroides sexuales:
En cuanto a la testosterona:
• Las fluctuaciones en la leptina durante el ciclo menstrual correlacionan directamente con los niveles de
estrógenos (pero no de progesterona).
• El 17 b-estradiol aumenta el ARNm de leptina del tejido adiposo
• El estradiol administrado a mujeres ovariectomizadas o machos intactos aumenta la sensibilidad
hipotalámica a la leptina y favorece la acumulación de grasa subcutánea (respecto a la visceral).
• Esto sugiere que los estrógenos regulan en equilibrio energético y la distribución de la grasa corporal al
interactuar con las vías de señalización de la leptina (la deficiencia de estrógenos afecta a la sensibilidad a
la leptina).
(4) Insulina
La insulina también se considera una señal de adiposidad. Las diferencias con la leptina son:
1. Mientras que la leptina se secreta directamente en los adipocitos en proporción a su actividad metabólica,
la insulina se secreta en las células beta pancreáticas en respuesta a los aumentos en la glucosa circulante.
2. En cuanto a la vida media plasmática, la de la leptina es de 45 minutos y la de la insulina es mucho más
corta, de 2-3 minutos.
Por tanto, aunque tanto los niveles de leptina como de insulina son proporcionales a la cantidad de
adiposidad total, teniendo en cuenta la vida media plasmática y que la actividad metabólica de los
adipocitos es más estable que los niveles circulantes de glucosa (que cambian con la alimentación, el
ejercicio y el estrés), la leptina es una señal más estable para indicar adiposidad mientras que la capacidad
de la insulina para predecir los niveles del tejido adiposo es resultado de la señal integrada a lo largo del
tiempo en lugar de un momento particular del tiempo.
3. Otra diferencia es que las distintas señales correlacionan de forma diferente con el tejido adiposo según
su localización, de manera que la leptina sérica correlaciona más con la grasa subcutánea y la insulina
refleja mejor la visceral. La acción de la insulina está afectada en individuos con más tejido adiposo visceral
que como hemos visto es el que proporciona el factor de riesgo para el síndrome metabólico a medida
que aumenta la adiposidad.
4. Por último, existe dimorfismo sexual ya que mientras que las ratas hembras son más sensibles a la acción
catabólica de la leptina, los machos son más sensibles a la acción de la insulina. Si bien ambas señales
producen respuestas catabólicas, hay respuestas sexualmente dimórficas. Recientemente, se ha visto que
en humanos, la administración intranasal de insulina disminuye el peso, la grasa corporal y el volumen en
la cintura en hombres pero no en mujeres.
(5) Estrógenos
Regulan la adiposidad
• La grasa visceral varía inversamente con los niveles de estrógenos de manera que en las mujeres se
acumula cuando los niveles de estrógenos se vuelven lo suficientemente bajos. En el tejido adiposo se
expresan distintos receptores.
• En ratas, el aumento preovulatorio del estradiol se asocia con una disminución en la ingesta de
alimentos durante el estro.
• El estradiol ejerce un efecto inhibidor sobre la ingesta de energía disminuyendo el tamaño de las
porciones pero no el número de comidas.
• La ovariectomía produce un rápido aumento de la ingesta y el peso corporal que se revierte con el
tratamiento con estradiol (en ratas administrar estrógenos cada 4 días imita los ciclos del estro y
devuelve la adiposidad al nivel de los controles). Una vez se ha establecido un nuevo peso corporal la
ingesta de alimentos vuelve al nivel de los controles.
• Los estrógenos parecen regular el peso corporal mediante cambios iniciales en la ingesta de alimentos,
la adiposidad general y el gasto de energía.
(8) Interactúan con la señalización de la leptina
Animales
Los ratones C57BL/6 fueron alojados en jaulas individuales en condiciones específicas libres de patógenos,
mantenidos en una habitación con temperatura controlada con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, y
proporcionaron acceso ad libitum al agua y al chow de laboratorio estándar (Servicios de Dieta Especial). Los
ratones transgénicos homocigotos que expresan selectivamente EGFP en neuronas que contienen POMC y GFP
de renilla humanizada (hrGFP) en neuronas que contienen NPY fueron proporcionados por M. Low (Oregon
Health & Science University, Portland, OR) y B. Lowell (Harvard Medical School, Boston, MA), respectivamente.
Para todos los experimentos, el tamaño de la camada se ajustó a 6 cachorros 1 día después del nacimiento
para garantizar una nutrición adecuada y estandarizada hasta el destete. Sólo se estudiaron ratones machos.
Los ratones Ghrl–/– (en un fondo C57BL/6) se obtuvieron de Regeneron Pharmaceuticals y se criaron en las
instalaciones de Monash Animal Services. Esta línea genética de ratón ha sido descrita anteriormente (17).
Ensayos de grelina
Las crías masculinas de ratones C57BL/6 fueron decapitadas en P6 (n = 5), P10 (n = 5), P14 (n = 4) y P90 (adulto,
n = 6), y la sangre del tronco se recolectó en un tubo refrigerado que contenía Pefabloc (AEBSF; Roche
Diagnostics). Los niveles totales y acilados de grelina en el plasma se evaluaron utilizando kits ELISA (Millipore).
Los niveles de grelina acilada también se caracterizaron en neonatos de ratón inyectados con grelina. Para ello,
se inyectó grelina (2 mg/kg) o vehículo (0,9% NaCl) a ratones P10, y se recogió sangre del tronco en un tubo
refrigerado que contenía Pefabloc (AEBSF; Roche Diagnostics) por decapitación 15 minutos, 1 hora o 12 horas
después de la inyección (n = 4–6 por grupo)
Para los experimentos de ayuno, los ratones P6 y P14 fueron separados de sus presas y colocados en una
almohadilla calentada durante 4 horas antes del experimento. La sangre del tronco se recogió en un tubo
refrigerado que contenía Pefabloc (AEBSF; Roche Diagnostics), y los niveles de grelina acilada en el plasma se
evaluaron utilizando kits ELISA (Millipore).
Se diseccionaron ARH y DMH de ratones P6, P10, P14 y P90 (n = 4-5 por grupo; para el análisis ghsr) y estómagos
de ratones P14 (n = 7 por grupo; para análisis de grelina) alimentados ad libitum. También se diseccionaron
hipotalamis de P12 ob/ob y compañeros de camada WT (n = 6 por grupo) alimentados ad libitum. El ARN total
se aisló utilizando el kit de aislamiento de ARN Arcturus PicoPure (Invitrogen). El aDNc se generó con el Kit de
Transcripción Inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems). El análisis cuantitativo de PCR en
tiempo real se realizó utilizando TaqMan Fast universal PCR Mastermix. La expresión de ARNm se calculó
utilizando el método 2-ddCt después de la normalización con GAPDH como gen de limpieza. Se utilizaron los
ensayos de expresión génica TaqMan inventariados Ghsr (Mm00616415_m1), grelina (Mm00445450_m1) y
Gapdh (Mm99999915_g1). Todos los ensayos se realizaron utilizando un sistema de PCR en tiempo real
StepOnePlus de Applied Biosystems.
Materiales. El anti-grelina NOX-B11-2 y los Spiegelmers de control no funcional fueron preparados por
NOXXON Pharma AG, Berlín, como se describió anteriormente (23).
Inyecciones neonatales en ratones WT. Se utilizaron descendientes de ratones C57BL/6. A partir de P4, los
cachorros fueron tratados diariamente con inyecciones i.p. de NOX-B11-2 (15 mg /kg) o un control inactivo
(23) durante un total de 18 días (n = 8-10 por grupo). Para garantizar el desarrollo idéntico de los cachorros
dentro de la misma camada, todos los cachorros de la misma presa recibieron la administración de sustancias
similares. Cada grupo experimental en todos los experimentos consistió en descendientes de al menos 3
camadas.
Inyecciones en adultos en ratones WT. Los ratones P100 fueron tratados diariamente con inyecciones i.p. de
anti-grelina NOX-B11-2 (15 mg/kg) o un control inactivo (23) durante un total de 7 días (n = 3 por grupo).
Inyecciones neonatales en ratones ob/ob. A partir de P4, los cachorros fueron tratados diariamente con
inyecciones i.p. de NOX-B11-2 (15 mg/kg) o un control inactivo durante un total de 8 días (n = 4 por grupo).
Mediciones fisiológicas
Los ratones (n = 8-10 por grupo) se pesaron cada 2 días de P4 a P22 (destete) y semanalmente después del
destete utilizando una balanza analítica (n = 8-10 por grupo). La longitud naso-anal también se midió en el
destete. Para medir el consumo de alimentos, los ratones se alojaron individualmente en jaulas y, después de
1 semana de aclimatación, la ingesta de alimentos se midió cada 24 horas durante 3 días a partir de porciones
prepesadas de alimentos dispensados desde las tapas de las jaulas de alambre. La ingesta diaria promedio de
alimentos de cada ratón (n = 6-8 por grupo) se utilizó para las comparaciones estadísticas. La resonancia
magnética (micro-MRI Bruker-Pharmascan 7T) se realizó en ratones alimentados ad libitum para evaluar la
grasa corporal in vivo (n = 3-4 por grupo). Se adquirieron dieciocho secciones transversales de 0,75 mm de
espesor que cubrían toda la cavidad abdominal. La grasa visceral, subcutánea y total se cuantificó utilizando el
software ITK-Snap 2.0.0 (54). Los niveles de glucosa alimentados se evaluaron en ratones adultos (n = 6-8 por
grupo) utilizando un glucómetro (One Touch Ultra; Johnson & Johnson). La tolerancia a la glucosa se realizó en
ratones adultos (n = 12 por grupo) mediante una administración i.p. de glucosa (1,5 mg / g de peso corporal)
después del ayuno nocturno, y luego los niveles de glucosa en sangre se midieron 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120 y
150 minutos después del desafío de glucosa, como se describió anteriormente (55). La prueba de sensibilidad
a la leptina se realizó en ratones adultos (n = 5 por grupo). Brevemente, los ratones fueron inyectados i.p. a las
6:30 pm con vehículo (tampón de citrato de sodio 5 mM, pH 4.0) el día 1, seguido de leptina el día 2 (1 mg /
kg, PeproTech). Los animales fueron pesados diariamente durante el período de inyección. Los niveles séricos
de leptina se ensayaron en las muestras utilizando un kit ELISA de leptina (Millipore) (n = 6-8 por grupo).
Los estómagos de ratones P14 alimentados ad libitum (n = 7-8 por grupo) fueron rápidamente diseccionados
y pesados. Luego fueron cortados, vaciados de su contenido y pesados nuevamente. La diferencia entre el peso
del estómago lleno y vacío se utilizó como una estimación de la ingesta de leche.
Implantes DiI
Los ratones (n = 4-6 por grupo) fueron perfundidos con 4% de PFA. Los cerebros fueron removidos y codificados
numéricamente para garantizar un procesamiento y análisis imparciales. Cristales de 1,1′-dioctadecil-3,3,3′,3′-
tetrametilindocarbocianina perclorato (DiI; Santa Cruz) fueron implantados como se describió anteriormente
(14). Brevemente, se utilizó un alfiler de insecto para colocar un cristal de DiI (15 μ m de diámetro) en el ARH
de cada cerebro bajo guía visual. Después de la incubación en la oscuridad durante 2 semanas a 37 ° C, se
recolectaron secciones hipotalámicas de cada cerebro y se evaluaron mediante microscopía confocal como se
describe a continuación.
Los ratones (n = 3-7 por grupo) fueron perfundidos transcárdicamente con 4% de PFA. Luego, los cerebros se
congelaron y se seccionaron a un grosor de 30 μ m y se procesaron para inmunofluorescencia utilizando
procedimientos estándar (14). Los anticuerpos primarios utilizados para la IHC incluyeron antiAgRP de conejo
(1:4.000; Phoenix Pharmaceuticals) y ovejas anti-α-MSH (1:40.000; Millipore). Los anticuerpos primarios se
visualizaron con Alexa Fluor 488 cabra anti-conejo IgGs o Alexa Fluor 568 burro antisheep IgGs (1:200;
Invitrogen). Las secciones fueron contrateñidas con bisbencamida (1:10.000; Invitrogen) para visualizar
núcleos celulares y cubren barridos con glicerol tamponado (pH 8.5).
Inmunohistoquímica cFos
En P12, los ratones fueron inyectados i.p. con grelina (2 mg/kg; Phoenix Pharmaceuticals) o vehículo solo (0.9%
NaCl) y perfundido 2, 6, 12 o 24 horas después. Las inyecciones ocurrieron 12 horas después de la última
inyección de anti-grelina o solución de control. A los ratones P21 y P36 inyectados neonatalmente con
compuesto control o anti-grelina también se les inyectó i.p. con grelina (2 mg/kg; Phoenix Pharmaceuticals) o
vehículo solo (0.9% NaCl) y perfundido 2 horas después. Los cerebros se congelaron, se seccionaron a un grosor
de 25 μ m y se incubaron en un antisuero primario de conejo dirigido contra el dominio N-terminal de Fos (1:
2,000; Ab-5; Oncogén). El anticuerpo primario se localizó con IgGs purificadas por afinidad conjugadas con
Alexa 488 (1:200; Invitrogen). Las secciones se contrateñieron con bisbencamida (1:10.000) para visualizar los
núcleos celulares y se cubrieron con glicerol tamponado (pH 8,5).
Inmunohistoquímica pSTAT3
Grelina (2 mg/kg; Phoenix Pharmaceuticals) se inyectó i.p. en cachorros diariamente de P4 a P9. Los controles
recibieron inyecciones de equivolumen del vehículo (0,9% NaCl). En P10, los ratones recibieron una inyección
de grelina (2 mg/kg, i.p.), seguida 2 días después por la administración de leptina (3 mg/kg, i.p.) (n = 4–6 por
grupo). Los animales fueron perfundidos 45 minutos después con una solución de PFA al 2%. Las secciones
coronales congeladas se cortaron a 25 μ m y se trataron previamente durante 20 minutos en NaOH al 0,5% y
H2 O2 al 0,5% en PBS de potasio, seguido de inmersión en glicina al 0,3% durante 10 minutos. Las secciones se
colocaron en SDS al 0,03% durante 10 minutos y se colocaron en suero normal al 4% + Tritón X-100 al 0,4% +
BSA al 1% (fracción V) durante 20 minutos antes de la incubación durante 48 horas con un anticuerpo anti-
pSTAT3 de conejo (1:1.000; Señalización celular). El anticuerpo primario se localizó con Alexa Fluor 568 cabra
anti-conejo IgGs (1:200; Invitrogen). Las secciones fueron contrateñidas con bisbencamida (1:10.000;
Invitrogen) para visualizar núcleos celulares, y cubiertos con glicerol tamponado (pH 8.5).
Los cerebros se recolectaron de ratones P4 y se seccionaron a un grosor de 200 μ m con un vibroslicer como
se describió anteriormente (14). El ARH se diseccionó cuidadosamente de cada sección bajo un
estereomicroscopio. Los explantes (n = 6-19 cultivos por grupo) se cultivaron en una matriz de colágeno de
cola de rata (BD Biosciences). A partir del primer día in vitro, cada explante se transfirió a águila media basal
(Invitrogen) fresca modificada que contenía grelina (100 ng/ml; Phoenix Pharmaceuticals), leptina (100 ng/ml;
PeproTech), leptina más grelina (100 ng/ml cada uno), o vehículo solo. Para validar aún más los efectos de
bloqueo del compuesto anti-grelina sobre las acciones de la grelina, los explantes de ARH también se trataron
con grelina y NOX-B11-2 (100 ng / ml), o grelina y un control inactivo (100 ng / ml). Después de 48 horas, los
explantes se fijaron en PFA, y las neuritas que se extendían desde los explantes se tiñeron con β III-tubulina
(conejo, 1:5.000; Covance) como se describió anteriormente (56).
Para los experimentos histológicos, se adquirieron 2 secciones a través de la ARH (para tinción pERK y pSTAT3)
y PVH, DMH y LHA (para tinción α-MSH y AgRP y etiquetado DiI) de animales de cada grupo experimental (n =
3-7 animales por grupo) utilizando un sistema confocal Zeiss LSM 710 equipado con un objetivo ×20. Para los
experimentos in vitro, se adquirieron secciones a través de 5 regiones de interés diferentes (100 × 100 μ m)
espaciadas a 100, 200, 300, 400 y 500 μ m que se extienden radialmente desde el borde de los explantes ARH
(n = 6-19 por grupo) utilizando un sistema confocal Zeiss LSM 710 equipado con un objetivo ×10. Las
diapositivas se codificaron numéricamente para oscurecer el grupo de tratamiento. El análisis de imágenes se
realizó utilizando el software de análisis ImageJ (NIH). Para el análisis cuantitativo de la densidad de la fibra
(para α-MSH, AgRP y DiI), cada plano de imagen se binarizó para aislar las fibras marcadas del fondo y
compensar las diferencias en la intensidad de la fluorescencia. La intensidad integrada, que refleja el número
total de píxeles en la imagen binarizada, se calculó para cada imagen. Este procedimiento se llevó a cabo para
cada plano de imagen en la pila, y se sumaron los valores de todos los planos de imagen en una pila. El valor
resultante es un índice preciso de la densidad de los procesos en el volumen muestreado (14). Para el análisis
cuantitativo del número de células, los números de células pERK-, pSTAT3-, POMC-, NPY-, POMC+pERK-, y
NPY+pERKlabeled en el ARH se contaron manualmente utilizando el software de análisis ImageJ (NIH). Solo las
células GFP positivas que tenían un núcleo teñido con bisbenzamida correspondiente se incluyeron en nuestros
recuentos. Para las comparaciones estadísticas se utilizó el número promedio de células contabilizadas en 2
hemisecciones ARH de cada ratón.
Estadística
Todos los valores se expresaron como medias ± SEM. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad
Prism (versión 5.0a). La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Student de 2 colas no
apareadas y un ANOVA de 2 vías seguido de la prueba post hoc de Bonferroni cuando fue apropiado. P < 0,05
se consideró estadísticamente significativo.