ESPECTROFOTOMETRIA DEL VISIBLE DEMOSTRACION

DE LAS LEYES FOTOMETRICAS Y ERROR RELATIVO DE

LA CONCENTRACION

Nombre: Jean Pierre rojas Baez

1) OBJETIVOS
• Preparar soluciones de permanganato de potasio
• Medición de los patrones a la longitud de onda de trabajo
• Construir la curva de calibración
• Verificar la conformidad de la ley Beer
• Determinar las concentraciones límites de los patrones

2) GENERALIDADES
Después de determinar la longitud de onda a la cuál deben de realizarse las medidas, se
calibra el método midiendo una serie de patrones del constituyente en estudio. Generalmente
se prepara una solución diluida de la sustancia que se desea determinar, se pipetean
cuidadosamente porciones de esta solución, de distinto volumen, se añade el reactivo que
forma color, y se ajustan las condiciones para que se desarrolle el color en forma óptima, se
diluye cada solución a un volumen predeterminado en una fiola, y luego se mide la
absorbancia de cada solución a la longitud de onda analítica o de trabajo.

Las medidas de la absorbancia se realizan comúnmente utilizando un blanco, que debe ser
idéntico a la muestra en todo, excepto en que no debe contener el constituyente que se ha de
determinar. El blanco deberá contener los reactivos, aditivos, disolvente, etc., en la misma
naturaleza y concentración que las utilizadas en cada muestra desconocida en la que se
desarrolle color. De esta manera, las lecturas de las muestras están corregidas
automáticamente para cualquier absorción pequeña por acción de los reactivos y del
disolvente. Con los datos absorbancia para las diferentes concentraciones de las series patrón
se construye una curva de calibrado. La cantidad de luz absorbida por cada patrón se
encuentra bien definida y se debe ajustar a ciertas leyes físicas denominadas leyes
fotométricas:

a) Ley Lambert - Bouguer

Presenta dos partes:

1.- “La relación entre la energía radiante transmitida, P, y la incidente, Po, es una
constante expresada como T, y se denomina TRANSMITANCIA”.
T = P / Po
2.- “La energía de radiación transmitida decrece en progresión geométrica cuando
la longitud del camino óptico aumenta en progresión aritmética”. Se expresa
matemáticamente de la siguiente manera:
◼ log T = ab = A = - log T = - ( P/ Po ) = log ( Po/ P )

b) Ley Beer
Expresa la relación entre transmitancia y concentración de material absorbente, es
decir, que la transmitancia disminuye en progresión geométrica cuando la
concentración aumenta en progresión aritmética. Por tanto:
 -log T = ac = A = - log (P / Po) = log (1/ T) = -log T

c) Ley Combinada Lambert - Beer

Resulta de la combinación de la ley de Lambert con la de Beer y suele llamarse
simplemente ley de Beer. Esta ley establece que: “la cantidad de luz o energía
ultravioleta o infrarroja absorbida o transmitida por una solución es una función
exponencial de la concentración de sustancia absorbente presente y de la longitud de
la trayectoria hacia la muestra”. Se obtiene las siguientes relaciones:
A = abc = = - log T = -log (P/ Po) = log (Po / P ) = log ( 1 / T ).

Donde:
T = transmitancia
a = absortividad del medio
b = Trayecto óptico
P = poder de radiación transmitida
Po= poder de radiación incidente.

Esta forma matemática de la ley combinada muestra que la absorbancia A en función

de la concentración “c” es una línea recta de pendiente “a”, y la representación de
log T frente a la concentración es una línea recta de pendiente negativa. La
representación gráfica de esta ley se denomina representaciones de la ley Beer.

3) FUNDAMENTO
La obtención de la curva de calibrado y la demostración de la ley de Beer se determinan
experimentalmente, preparando una serie de soluciones patrones y midiendo la absorbancia
de cada solución a la longitud de onda analítica, máxima o de trabajo. Con los datos de
absorbancia frente a las concentraciones de los patrones se gráfica en un sistema cartesiano
y la representación debe ser una línea recta de pendiente positiva si cumple con la ley Beer.

4) ARREGLO EXPERIMENTAL
5) APARATOS
• Espectrofotométro : HACH
• Cubeta : 1 cm. De trayecto óptico
• Región de trabajo : Espectro visible
• Longitud de Onda de trabajo : 525 nm

6) MATERIALES
• Fiolas de 100 y 250 ml.
• Buretas por 25 ml.

7) REACTIVOS
• Solución Stock O,100N de permanganato de potasio
• Solución madre de permanganato de potasio de 100 ppm .de manganeso
• Soluciones patrones de manganeso

8) TECNICA
1.- PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PATRONES
Preparar a partir de la solución Stock de KMnO4 0, 1000 N una solución estándar
diluida de 100 ppm en manganeso para un volumen de 250 ml y luego por dilución
preparar las soluciones patrones.

2.- SELECCIÓN DE MODO BÁSICO DE TRABAJO

(a) ENCENDIDO Y APAGADO

• Conecte la toma de alimentación externa en un enchufe de
la red eléctrica.
• Pulse el interruptor de encendido/apagado durante
aproximadamente un segundo para encender el instrumento
• Pulse el interruptor de encendido/apagado durante 3 a 5
segundos para apagar el instrumento. Una señal acústica
confirma que el instrumento se ha apagado (no prender el
instrumento rápidamente después de apagarlo, espere unos
20 segundos antes de volver a encenderlo, para no dañar los
sistemas electrónico y mecánico)

(b) DIAGNOSTICO
• Cada vez que se enciende el instrumento, se ejecuta
automáticamente una serie de pruebas de autodiagnóstico
 para asegurar el correcto funcionamiento de los principales
componentes del sistema
• Este procedimiento, que dura unos dos minutos,
autocomprueba el normal funcionamiento del sistema,
pruebas de lámpara, ajustes de filtros, la calibración de las
longitudes de onda y el voltaje. Los distintos tests que
funcionan correctamente se confirman con una marca de
verificación.
Una vez completados los diagnósticos de puesta en mercha,
aparece el MENU PRINCIPAL
• Si el instrumento detecta alguna desviación relativa a la
última calibración, es recomendable llevar a cabo una
verificación del sistema. (pulsar la tecla INICIO, esta
verificación dura aproximadamente 6 minutos).

(C) MENU PRINCIPAL

• En el menú principal se pueden seleccionar diversos modos
de trabajo

MENU DE MODO PRINCIPAL

Modo No “ “

1.- PROGRAMAS ALMACENADOS /PROGRAMAS DE CODIGOS

DE BARRAS
2.- PROGRAMAS DEL USUARIO
3.- PROGRAMAS FAVORITOS
4.- LONGITUD DE ONDA UNICA
5.- LONGITUD DE ONDA MULTIPLE
6.- LAPSO DE TIEMPO
7.- VERIFICACIONES DEL SISTEMA
8.- RECUPERAR DATOS
9.- CONFIGURACION DEL INSTRUMENTO

(D) MODO LONGITUD DE ONDA UNICA

El modo “longitud de onda única” se puede utilizar de tres maneras. Para
mediciones de la muestra a una longitud, se puede programar el
instrumento para medir la absorbancia, el % de transmitancia o la
concentración del analito.
• En el menú principal pulse LONGITUD DE ONDA UNICA
• Pulse OPCIONES para configurar los parámetros

AJUSTE DE PARÁMETROS ANALÍTICOS

Luego que el modo longitud de onda única es seleccionado, aparecen las
opciones de configuración de longitud de onda única. Estos parámetros
son los siguientes:
 OPCIONES DE CONFIGURACIÓN DE LONGITUD DE ONDA
ÚNICA
OPCION
1. MEMORIZAR APAGADO/ENCENDIDO los datos de medición se
memorizan automáticamente)

2. % TRANS/ABS/CONC cambia entre % de Transmitancia, lecturas de

absorbancia o concentración)
3. LONGITUD DE ONDA ( ) introduce la longitud de onda de la
medición, utilice el teclado alfanumerico para introducir la longitud e
onda de medición (rango entre 340-900 nm
4. ICONO TEMPORIZADOR (funciona a modo de cronometro)
5. FACTOR DE CONCENTRACION (factor de multiplicación para
convertir los valores de ABS en valores de concentración)
6. RESOLUCION DE LA CONCENTRACION (seleccione la posición de
la coma decimal en las lectruras de concentración calculadas)
7. GUARDAR COMO PROGRAMA DEL USUARIO (memoriza los
parámetros seleccionados como programa de usuario)
8. RECUPERAR DATOS (recupera datos de medición escaneados de
longitudes de onda o lapsos de tiempo guardados)
9. CONFIGURACION DEL INSTRUMENTO (ajustes de funcionamiento
básicos del isntrumento)

3- MEDICIÓN DE ESTÁNDARES A LA LONGITUD DE ONDA

UNICA
• Coloque la cubeta de blanco (agua destilada)
completamente limpia y seca EN EL SOPORTE
PORTACUBETAS.
• Seleccionar ern opciones la tecla longitud de onda e
Introducir la longitud de onda de la medición utilizando el
teclado alfanumérico (450 nm)
• Pulse CERO (La tecla medición sólo se activará cuando
se haya realizado la medición del cero).
• Coloque la cubeta de muestra en el soporte
portacubetas. Pulse medición y tome nota del valor de
absorbancia
• Realizar mediciones de absorbancia a la longitud de onda de trabajo

9) DESARROLLO EXPERIMENTAL DE LA TECNICA:

A) CÁLCULO DEL VOLUMEN DE LA SOLUCIÓN STOCK
REQUERIDO PARA PREPARAR UNA SOLUCIÓN MADRE
DE 100 ppm EN MANGANESO PARA UN VOLUMEN DE 250
ML.
 Se aplica la ecuación de dilución para calcular el volumen de la
solución stock de MnO4 1130.50 ppm Mn (0.1 000 N)

V1 x 1130.55 ppm Mn = 250 ml x 100 ppm

V1 = 22.11 ml

Medir por bureta 22.1 ml de la

solución stock y depositar en
fiola x 250 ml

Diluir con agua destilada y

enrasar. Homogenizar la
solución

ur.11

b) CÁLCULOS PARA PREPARAR 100 ML DE LAS SOLUCIONES

PATRONES O ESTÁNDARES ppm Mn. A PARTIR DE LA
SOLUCIÓN MADRE
Se prepara a partir de la solución diluída de 100 ppm Mn. Cálculo del
volumen a medir
V1 x 100 ppm = 100 ml x 0.5 ppm V1 = 0.5 ml
V2 x 100 ppm = 100 ml x 1.0 ppm
V2 = 1.0 ml
V3 = 2.0 ml
V4 = 4.0 ml

TABLA DE PREPARACIÓN DE SOLUCIONES PATRONES

No Concentración ppm Volumen a Volumen final

Patrón Mn medir de la soluciónml
de
100 ppm ml
1 0,5 0.5 100.0
 2 1,0 1.0 100.0
3 2,0 2.0 100.0
4 4,0 4.0 100.0
5 6,0 6.0 100.0
6 8,0 8.0 100.0
10,0 10.0 100.0
7
8 12,0 12.0 100.0
9 16,0 16.0 100.0
10 20,0 20.0 100.0
11 30,0 30.0 100.0
12 40.0 40.0 100.0

C) PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES PATRONES

Se preparan las soluciones patrones diluidas para un volumen de 100 ml a
partir de la solución de 100 ppm Mn

Medir el volumen calculado

y depositar la solución en
fiola por 100.0 ml

Diluir, enrasar con agua

destilada. Homogenizar las
soluciones
 D) SELECCIÓN DEL MODO DE TRABAJO (MODO CUANTITATIVO)
Medir cada patrón a la longitud de onda de trabajo de 520 nm

E) MEDICIÓN DE LAS SOLUCIONES PATRONES

- TABLA N°1 DE RESULTADOS:

No patrón Concentración ABS %T
ppm Mn
1 0.5 0.035 92.25
2 1.0 0.055 88.1
3 2.0 0.099 73.61
4 4.0 0.191 64.42
5 6.0 0.28 52.48
6 8.0 0.365 43.15
7 10.0 0.444 35.97
8 12.0 0.512 30.76
9 14.0 0.716 19.28
10 16.0 0.875 13.34
11 20.0 1.338 4.59
12 30.0 1.798 1.59
 - Grafico N°1: Absorbancia versus concentracion
Abs vs concentracion (ppm)
2
y = 0.0613x - 0.0723
1.5 R² = 0.9728

1
ABS

0.5

0
0 5 10 15 20 25 30 35

-0.5
Concentracia

CÁLCULO DEL ERROR DE LA ABSORBANCIA O LA CONCENTRACIÓN

c = 0.434  T
c t logt

Donde:
c/c = Error relativo de la concentración
 T = grado de inertidumbre 1% (0.01)
t = transmitancia

1) Cálculo del error relativo para 1 % t

0.434 (0.01) x 100% = -21.7
0.01 log 0.01
2) Cálculo del error relativo para 5 % t
= 0.434 (0.01) x 100% = -6.67
0.05 log 0.05
3.- Cálculo del error relativo para 10 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =-4.34
0.1 log 0.1
4.- Cálculo del error relativo para 15 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =-3.51
0.15 log 0.15
5.- Cálculo del error relativo para 20 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =-3.1
0.20 log 0.20
6.- Cálculo del error relativo para 30 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =-2.76
0.30 log 0.30
7.- Cálculo del error relativo para 40 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =-2.72
0.40 log 0.40
8.- Cálculo del error relativo para 50 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =-2.88
0.50 log 0.50
9.- Cálculo del error relativo para 60 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =-3.26
0.60 log 0.60
10.- Cálculo del error relativo para 70 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =-4
0.70 log 0.70
11.- Cálculo del error relativo para 80 % t
= 0.434 (0.01) x 100% = -5.6
0.80 log 0.80
12.- Cálculo del error relativo para 90 % t
= 0.434 (0.01) x 100% =-10.53
0.90 log 0.90
13.- Cálculo del error relativo para 95 % t
= 0.434 (0.01) x 100% = -20.5
0.95 log 0.95

- Tabla N°2:TABULACIÓN DE DATOS

%t ABS Dc/c

95 0.0222 20.50
90 0.0458 10.53
80 0.097 5.60
70 0.155 4.00
60 0.222 3.26
50 0.300 2.88
40 0.397 2.72
30 0.523 2.77
20 0. 699 3.10
15 0.824 3.51
10 1.000 4.34
5 1.301 6.67
1 2.000 21.70

- Grafico N°2: CURVA DEL ERROR RELATIVO DE LA CONCENTRACIÓN

 10. INTERPRETACION DE DATOS

Medición de la Muestra
Insertar una muestra y entonces presionar la tecla “STAR/STOP “, para iniciar su medición.

INTERPRETACIÓN DE DATOS:
Se observa que los gráficos obtenidos a partir del proceso experimental son parecidos son
muy parecidos, en caso del grafico uno se observa una pendiente positiva con una función
lineal y valor de R2 cercano a uno lo cual indica que el proceso realizado es óptimo, del
mismo modo el segundo grafico demuestra cierto grado de similitud bastante cerca similares
a las imágenes

En el caso del primer grafico se observa la relación directa entre la concentración y la

absorbancia ,lo cual nos podría indicar que a medida que aumenta la concentración la
absorbancia aumenta mientras que el segundo grafico nos indica el comportamiento de los
compuestos a través de la transmitancia
10) CUESTIONARIO
1. ¿Qué son y cuáles son las leyes fotométricas?
• Ley de Lambert-Bouguer: Presenta dos partes; “La relación entre la energía
radiante transmitida, P, y la incidente, P0, es una constante expresada como T, y
se denomina TRANSMITANCIA”, “La energía de radiación transmitida decrece
en progresión geométrica cuando la longitud del camino óptico aumenta en
progresión aritmética”.
• Ley de Beer: Expresa la relación entre transmitancia y concentración de
material absorbente, es decir, que la transmitancia disminuye en progresión
geométrica cuando la concentración aumenta en progresión aritmética.
• Ley Combinada Lambert-Beer: Resulta de la combinación de la Ley de
Lambert con la de Beer y suele llamarse simplemente ley de Beer. Esta ley
establece que: “La cantidad de luz o energía ultravioleta o infrarroja absorbida o
transmitida por una solución es un función exponencial de la concentración de
sustancia absorbente presente y de la longitud de la trayectoria hacia la muestra”.
2. ¿Cómo obtiene y para qué se utiliza una curva de calibración o de trabajo?
La obtención de la curva de calibrado y la demostración de la ley de Beer se determinan
experimentalmente, preparando una serie de soluciones patrones y midiendo la
absorbancia de cada solución a la longitud de onda analítica, máxima o de trabajo. Con
los datos de absorbancia frente a las concentraciones de los patrones se grafica en un
sistema cartesiano y la representación debe ser una línea recta de pendiente positiva si
cumple con la Ley Beer.
3. ¿Cómo comprueba experimentalmente la Ley Beer?
Con los datos de absorbancia frente a las concentraciones de los patrones se grafica en
un sistema cartesiano y la representación debe ser una línea recta de pendiente positiva
si cumple con la Ley Beer.
4. Señalar las razones por las cuales se dan las limitaciones de la Ley de Beer.
La ley de Lambert-Beer tiene unas limitaciones que son:
i. Limitaciones propias: Los niveles de energía en los que se mueven los
electrones son distintos. Lo mismo ocurre en disoluciones de baja
concentración de especies absorbente, pero con concentraciones elevadas de
otras especies (sales interferentes). Los iones de las sales interaccionan con
las especies absorbentes y se modifica la capacidad de absorción. De esta
manera el diagrama de energía y la capacidad de absorción de radiación
variaran. Por lo tanto el efecto salino también afecta.
ii. Limitaciones debidas a desviaciones químicas: Y esta asociación,
disociación, reacción depende de la dilución. La ley de Beer no se cumple
debido a los cambios en los equilibrios que se producen. Cuanto más
 parecidos sean los coeficientes de absorción molar de las especies, la
relación lineal tiende a ser más recta.
iii. Desviaciones instrumentales con radiaciones policromáticas: Otra de las
razones por las que no obtenemos una linealidad se puede deber a
desviaciones instrumentales, del instrumento en si. Si seleccionamos una
longitud de onda única, lo ideal sería que el monocromador dejase escapar
esa longitud de onda que seleccionamos (Radiación monocromática).
5. ¿A qué se denominan y cuáles son los errores personales?
Son difíciles de determinar y se dan debido a las limitaciones de carácter personal.
Como, por ejemplo, los errores de paralaje, o los problemas de tipo visual. Son una
de las causas probables de los errores sistemáticos, aquellos que son constantes a lo
largo de todo el proceso de medida y, por tanto, afecta a todas las medidas de un
modo definido y es el mismo para todas ellas.
6. ¿Qué criterios se manejan para seleccionar las soluciones patrones para ser
utilizadas en un método espectrofotométrico?
• La especie debe estar coloreada.
• Las soluciones deben de contener solamente a la especie en solución y no otras
que tengan coloración propia y pueden absorber radiación.
• La longitud de onda óptima debe de ser marcada y apta para su estudio.
7. Dar razones de porqué en espectroscopía se utilizan soluciones diluidas.
Para que las concentraciones no sean muy altas y la curva no salga elevado
8. ¿Cuándo una curva de calibración no parte del origen?, señalar las razones
que determinan este tipo de curva.
Cuando una curva de calibración no parte del origen, significa que la relación entre
la señal analítica (como la absorbancia) y la concentración del analito no es
lineal. Aquí hay algunas razones que pueden determinar este tipo de curva:
1. Interferencias químicas o físicas:
o Algunos componentes en la muestra pueden afectar la señal analítica
sin estar relacionados directamente con la concentración del analito.
Estas interferencias pueden desplazar la curva de calibración.
2. No linealidad intrínseca:
o Algunos métodos analíticos, como la espectrofotometría, pueden
tener respuestas no lineales en ciertos rangos de concentración. Por
ejemplo, la absorbancia puede aumentar de manera no proporcional a
medida que aumenta la concentración.
3. Saturación del detector:
o Si el detector alcanza su límite de respuesta (por ejemplo, en
espectrofotometría UV-visible), la señal no seguirá una relación
lineal con la concentración.
4. Efectos de fondo:
 o La presencia de componentes en blanco o de fondo (como solventes
o impurezas) puede afectar la señal analítica y desviar la curva de
calibración.
5. Respuesta no específica:
o Algunos métodos pueden detectar otros compuestos además del
analito objetivo. Esto puede generar una curva de calibración no
lineal.
6. Comportamiento no ideal del analito:
o Algunos analitos pueden tener propiedades químicas o físicas que no
siguen una relación lineal con la señal. Por ejemplo, en reacciones
químicas complejas, la concentración puede afectar la cinética de la
reaccion