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ACTIVIDADES: ESPECTROFOTOMETRÍA
En el trabajo práctico utilizarán espectrofotómetros digitales, marca Jenway 6300 (Figura 1).
Estos equipos permiten variar la longitud de onda (λ) entre 320 y 1000 nm.
INSTRUCCIONES DE USO
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1. Encendido del equipo: Una vez que se encuentre ubicado en el lugar donde se va a
utilizar, conectar el mismo a la red eléctrica (220V) y encenderlo apretando la tecla
encendido que se encuentra en la parte posterior del equipo (Figura 2). Esperar 10 minutos
hasta que se estabilice.
Figura 2
(a) (b)
Figura 3
4. Puesta a cero: en una cubeta de medida colocar el blanco (que puede ser agua o
solvente dependiendo de la experiencia). Abrir la tapa del equipo y colocar la cubeta en el
porta-cubeta, luego cerrar la tapa. Presionar la tecla CAL y esperar (Figura 4). Aparecerá en
el visor la lectura 0,000 de absorbancia o 100 % de transmitancia, según el modo de trabajo
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seleccionado. Una vez realizada la puesta a cero, retirar la cubeta con el blanco. La puesta
a cero deberá realizarse cada vez que se modifique la longitud de onda.
Figura 4
OBJETIVO
En este taller se realizarán de forma práctica los controles de Luz espuria, Volumen
mínimo, Cubetas y Linealidad fotométrica.
Junto a cada espectrofotómetro encontrarán las cartas de control del equipo, con
los resultados de los controles de Centro de Banda, Veracidad y Precisión. Deberán
analizar dichos resultados para concluir si el equipo pasa o no los controles
correspondientes.
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MATERIALES
PROCEDIMIENTO
Para realizar este control se puede trabajar a cualquier longitud de onda. Aquí la fijaremos
en la región en que posteriormente va a ser usado el equipo.
1. Seleccionar la opción transmitancia en el display del equipo.
2. Fijar con el selector de longitud de onda la λ en 500 nm.
3. Colocar 3 mL de agua en una cubeta de medida y llevar a T% = 100%. Retirarla.
4. Colocar la cubeta de obstrucción (cubeta pintada de negro) y registrar el valor de T %
obtenido.
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c. Control de cubetas
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Si se quisiera realizar este control, se debería hacer un barrido espectral de una o varias
soluciones de referencia, de distinto color de modo de controlar distintas longitudes de
onda. De cada sustancia coloreada se conoce el valor de λ al que presenta máxima
Absorbancia (valor de referencia).
Para ello:
1. Cargar una cubeta con agua y otra cubeta con la solución de referencia.
2. Con el selector de longitud de onda fijar diferentes valores de λ (para poder medir en
cada una de dichas λ los correspondientes valores de Abs).
Por ejemplo, para la solución de Rojo Congo, se podría proceder como se indica a
continuación:
entre 400 y 480 nm seleccionar la λ cada 20 nm
· entre 480 y 490 nm seleccionar la λ cada 5 nm
· entre 490 y 510 nm seleccionar la λ cada 2 nm
· entre 510 y 540 nm seleccionar la λ cada 10 nm
· entre 540 y 600 nm seleccionar la λ cada 20 nm
3. Para cada λ seleccionada llevar a 0.000 de Abs con la cubeta con agua.
4. Medir la Abs del rojo congo a las distintas λ seleccionadas, registrarlas.
5. Graficar Abs de rojo congo en función de la longitud de onda.
6. Determinar gráficamente la longitud de onda de máxima absorbancia. Comparar el valor
obtenido con el valor teórico de la solución de rojo congo (498+/- 1 nm).
Se considera como aceptable un corrimiento entre +/- 3 nm. En caso de que la diferencia
entre la lectura y el valor de referencia se encuentre dentro de dicho rango, la misma puede
ser considerada como error sistemático y corregirse.
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solución de trabajo).
8. Informar el rango de linealidad fotométrica, es decir, entre qué valores de absorbancia,
el equipo tiene una respuesta lineal.
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OBJETIVOS
MATERIALES
PROCEDIMIENTO
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-No pipetear directamente del frasco que contiene el reactivo de Biuret Hay dispuestos
vasos de precipitados en los cuales se debe vertir una cantidad moderada del reactivo
(tener en cuenta el volumen total a utilizar).
-No usar el mismo material volumétrico para dispensar diferentes soluciones sin haberlo
lavado bien previamente.
-Usar guantes durante el trabajo práctico para evitar el contacto de los reactivos con las
manos. Los reactivos pueden tener un pH alto, que daña la piel, y las soluciones
coloreadas pueden manchar.
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2. Mezclar delicadamente cada tubo con tapón de plástico, por inversión, evitando la
formación de espuma.
3. Incubar a temperatura ambiente 20 min.
4. Seleccionar la longitud de onda según la establecida en el item “a” y llevar a 0,000 de Abs
con agua.
5. Leer las Abs de todos los tubos.
6. Corregir los valores de Abs
7. Graficar Abs en función de concentración de CH (concentración en el tubo) de los
testigos procesados.
8. A partir del gráfico, obtener la ecuación de la recta e informar el rango de linealidad.
9. Utilizando la ecuación del gráfico, calcular la concentración de muestra incógnita en cada
uno de los tubos donde se procesó.
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- ¿Qué ocurriría si por error no se cierra completamente la tapa del porta cubetas al realizar
una lectura de Abs? Si esta situación se mantiene cuando realizan el control de luz espuria,
¿cómo influiría en el valor de T % medido?
- ¿Qué ocurriría si se realiza el control de luz espuria con un volumen inferior al volumen
mínimo?
- Cuándo el operador seleccionó la longitud de onda óptima de trabajo, ¿Qué criterio adoptó
para decidirlo?
- Para realizar el control de linealidad fotométrica se utiliza una sustancia que se sabe que
“cumple con la Ley de Lambert-Beer” y que permite medir absorbancias hasta 1,500. Si
luego realizan la medida en un espectrofotómetro observando que hay linealidad hasta
0.800 ¿a qué se podría atribuir? ¿Qué parte del instrumental puede no estar en
condiciones?
- Realizaron el control de linealidad fotométrica con Rojo Congo (cc solución madre = 1.0
g/L) y éste se cumplió hasta una Abs de 1,500 con el equipo usado. Posteriormente se
preparó una solución madre de otro colorante: Rojo Certificado, de igual concentración que
el anterior y a partir de ésta se hicieron distintas diluciones. Luego se midieron las
absorbancias de la madre y de sus distintas diluciones. La linealidad con este colorante se
mantuvo hasta a 0.800 de Abs, correspondiente a una concentración de 0.75 g/L. ¿Qué
pueden decir de dicha sustancia? ¿Podrían calcular la absortividad de dicha sustancia?
¿Qué tendrían que tener en cuenta?
- En el protocolo de la reacción con el reactivo de Biuret, ¿qué función cumple cada uno de
los tubos utilizados? ¿Por qué debe realizarse un blanco de cada uno de los reactivos a
utilizar? ¿Qué implica corregir las lecturas? ¿Podría reducirse o aumentarse de alguna
manera la cantidad de tubos preparados?
- ¿Podrían leer las absorbancias de todos los tubos del protocolo del Biuret contra el tubo
blanco de reactivo en vez de leerlo contra el tubo que contiene agua? En caso de que la
respuesta sea negativa ¿Cuáles deberían leer contra blanco de agua indefectiblemente?
- Si la concentración de proteínas calculada fuese superior a 100 g/L, ¿sería válido este
resultado? En caso de que no lo fuera, ¿Qué tratamiento realizarían con la muestra para
llegar a un valor confiable?
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