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OBJETIVOS

Con los datos obtenidos experimentalmente, el alumno realizar el balance de


carbonos y el balance de xido-reduccin. Discutir y evaluar el significado de dicho
balance para la clula microbiana.

Verificar que tipo de fermentacin lleva a cabo Saccharomyces cerevisiae

HIPOTESIS
Si la levadura Saccharomyces cerevisiae lleva a cabo, en condiciones anaerbicas el
proceso metablico de fermentacin alcohlica de la glucosa; entonces podremos
emplear ciertos mtodos para cuantificar los productos generados estequiometricamente
en base a la cantidad de glucosa fermentada.
DISEO EXPERIMENTAL
Lavaremos las clulas de levadura con agua destilada y centrifugacin 6 veces para
garantizar que se encuentran sin glucosa, ya que segn su procedencia, pueden contener
grandes cantidades de esta azcar, interfiriendo con nuestros resultados. Obtendremos
una concentracin celular 30% v/v con regulador de fosfatos.

Para analizar el proceso de fermentacin colocaremos en un matraz especial de


fermentacin la suspensin celular y regulador de fosfatos en la cmara principal. La
funcin del regulador de fosfatos es que el pH del sistema permanezca constante
despus de la fermentacin, ya que el CO 2 acidifica el medio. En el vaso central se
colocan NaOH para que reaccione con el CO 2 producto de la fermentacin. Pasaremos
una corriente de gas nitrgeno para desplazar el aire y por lo tanto el oxgeno contenido
en el matraz para que la levadura no pueda utilizar el oxgeno y realice fermentacin y
cerraremos hermticamente el recipiente.

Incubaremos para que la levadura se acostumbre a la nueva temperatura e inyectaremos


glucosa en la cmara principal para que inicie el proceso de fermentacin. Continuamos
incubando; aadiremos una pequea cantidad de cido tricloroactico en la cmara
principal para desnaturalizar protenas entre ellas las que median el trasporte de glucosa

en Saccharomyces cerevisiae. Destapamos el recipiente y agregamos ms TCL para


asegurarnos que se detenga completamente el transporte, y por lo tanto la fermentacin.

Neutralizamos con NAOH y aforamos a 10 mL para realizar la determinacin de etanol


colocaremos K2Cr2O7 en la cmara central de una caja Conway y en su borde externo
vaselina para que al momento de taparla con un vidrio quede cerrada hermticamente. En
la cmara externa se colocan alcuotas de la muestra con K2CO3.
Para determinar el etanol producido por la fermentacin se utiliz el mtodo Conway el
cual consiste en la oxidacin del alcohol por accin de una solucin de dicromato de
potasio en medio cido (cido sulfrico), donde el dicromato de potasio reacciona con el
etanol producto de la fermentacin, con ayuda del carbonato de potasio saturado, es
oxidando en presencia de cido sulfrico.
El carbonato de potasio funge como un agente liberador de los grupos -OH y que sern
atrapados por el dicromato que es el agente atrapante, modificando su coloracin inicial
amarillo a verde. Posteriormente leemos en el espectrofotmetro a 445nm el dicromato
que no reaccion, ya que a mayor concentracin de etanol, menor dicromato residual y
por lo tanto menor absorbencia es por ello que se observara una curva de calibracin con
pendiente negativa.
3CH3CH2OH + 2k2Cr2O7 + 8H2SO4
1H2O

3CH3COOH + 2Cr2(SO4)3 + 2K2SO4 +

Para la determinacin de la glucosa residual centrifugaremos la muestra y el


sobrenadante le agregaremos DNS para que reaccione con la glucosa y de un compuesto
colorido. El compuesto colorido lo leeremos en el espectrofotmetro. Con la curva de
glucosa sabremos qu cantidad de glucosa residual tenemos. Haremos el clculo de
cuenta le colocaremos y cuanta residual tendremos y obtendremos la que fermento la
levadura.

Determinacin de CO2 por gravimetra:


Despus de la fermentacin quedo una muestra en el vaso central, en esta muestra lo
que paso fue que el dixido de carbono liberado de la fermentacin reacciona con el
hidrxido de sodio formando bicarbonato de sodio el cual al estar en presencia de exceso
de hidrxido de sodio, vuelve a reaccionar hasta formar carbonato de sodio.
CO2 + NaOH
NaHCO3 + NaOH

NaHCO3
Na2CO3 + H2O

Despus la muestra se transfiri cuantitativamente sobre 20 ml de BaCl 2 al 5% contenido


en un matraz Erlenmeyer de 125 ml. Se hicieron 2 lavados, de dicho vaso central el cual

contena la muestra, con agua destilada libre de CO2 en este paso lo que ocurri fue que
el cloruro de bario reacciono con la muestra y se formo otra sal de carbonato de bario la
cual precipito mejor debido al peso atmico del bario.
Na2CO3 + BaCl2

BaCO3 + 2NaCl

El precipitado de BaCO3 que quedo se recupero por filtracin a travs de papel filtro de
Whatman No 1 de peso conocido. El papel con la muestra se deseca en una estufa a 60
C durante 20 y 24 horas y posteriormente haciendo uso del factor gravimtrico obtenemos
la cantidad original de dixido de carbono en milimoles.
Determinacin de Glucosa residual por el mtodo de DNS.

Para determinar la cantidad de glucosa residual se utilizo el mtodo del 3,5 dinitrosaliclico
(DNS), esto nos sirvi para calcular la cantidad de glucosa fermentada para
posteriormente sacar los milimoles de glucosa este mtodo se basa en la reduccin del
DNS (color amarillo) por la glucosa pasando a color rojo cuya presencia puede detectarse
por lectura de la absorbancia a 540 nm.

DETERMINACIN DE GLUCOSA RESIDUAL.

TABLA 1.Datos obtenidos en la curva tipo de glucosa.


g de Glucosa
Absorbencia a 540 nm
0
0
100
0.066
200
0.161
300
0.272
400
0.308
500
0.490

Curva tipo de Glucosa


1.2
1

f(x) = 0x + 0.08
R = 0.96

0.8

Absorbencia a 540 nm

0.6
0.4
0.2
0
0

100

200

300

400

g de Glucosa

y=9.3914 x 104 x0.0186

500

600

Despejando x:

Donde:

x=

y = absorbencia
x = concentracin

y +0.0186
4
9.3914 X 10

TABLA 2.Datos obtenidos en las muestras de glucosa.


Muestra
Absorbencia a 540 nm
g de Glucosa
0.2 ml de sobrenadante
0.109
135.868
problema
0.5 ml de sobrenadante
0.376
420.1716
problema
1 ml de sobrenadante
0.009
29.3885
testigo

mg de Glucosa
67.9344
84.0343
2.9388

CACULOS PARA LA DETERMINACION DE GLUCOSA RESIDUAL

Problema:
Dilucin 1:10
Alcuota 0.2 mL y 0.5 mL

mg de Glu residual=mgGlu x ( dil )

Testigo:
Dilucin 1:10
Alcuota 0.5 mL

( ali1 ) ( 10)

CALCULO DE GLUCOSA REAL

glucosaresidual x=

0.109+0.0186
9.3914 x 104

1
0.2

) (10) (10) /1000g = 67.9344

mg/10ml

glucosaresidual x=
mg/10ml

0.376+0.0186
9.3914 x 104

1
0.5

) (10) (10) /1000g = 84.0343

glucosaresidual x=

0.009+0.0186
9.3914 x 104

1
1

) (10) (10) /1000g

= 2.9388

mg/10ml
Glucosa real del Problema = Glucosa Residual Problema Glucosa Residual del Testigo
Glucosa real del Problema = 67.9344 mg/10ml 2.9388 mg/10ml = 64.9956 mg/ 10 ml glucosa
Glucosa real del Problema = 84.0343 mg/10ml 2.9388 mg/10ml = 81.0955 mg/ 10 ml glucosa

CALCULO DE GLUCOSA FERMENTADA


Glucosa fermentada = Gluc inicial Gluc residual real
Glucosa fermentada = 180 mg 64.9956 mg = 115.0044 mg/10 mL
Glucosa fermentada = 180 mg 81.0955 mg = 98.9045 mg/10 mL
Promedio: 106.9544mg/10ml
180.0 mg de Glu 1 mmol de Glu
106.9544 mg de Glu x mmol de Glu

x = 0.594191 mmol de Glu

mmol glucosa fermentada = 0.594191

DETERMINACION DE ETANOL FORMADO.


TABLA 3.Datos obtenidos en la curva tipo de glucosa.
g de Etanol
Absorbencia a 445 nm
0
1.330
250
1.220
500
1.158
1000
0.991
1500
0.846
2000
0.670
2500
0.505

y=3.236723 x 104 X + 1.318351


Despejando x:

Donde:
y = absorbencia
x = concentracin

X=

y1.318351
3.236723 x 104

TABLA 4.Datos obtenidos en las muestras de Etanol en la fermentacin.


Muestra
Absorbencia a 445 nm
g de Etanol
mg de Etanol
0.2 ml de muestra
0.972
1120.91
53.5033
fermentada
0.5 ml de muestra
0.600
2571.15
44.3875
fermentada
1 ml de muestra testigo
1.167
21.01
4.6760
DETERMINACION DE ETANOL FORMADO EN LA FERMENTACION.

Dado que las dos muestras entran en la curva y no hay mucha diferencia entre ellas se
hace un promedio con el cual este ser ocupado en el clculo.

mgde Etanol
1
= ( mgde Etanol )
(10)
10 mL
alic

( )

CALCULO DE ETANOL REAL.

mg
0.9721.318351
de etanol x=
10 ml
3.236723 x 104
mg/10ml

1
0.2

) (10)

/1000g

= 53.5033

mg
0.6001.318351
de etanol x=
10 ml
3.236723 x 104

1
0.5

) (10)

/1000g

= 44.3875

mg/10ml

mg
1.1671.318351
de etanol testigo x=
10 ml
3.236723 x 104

1
1

) (10) /1000g = 4.6760

mg/10ml
Etanol real del Problema = Etanol Problema Etanol Testigo
Etanol real del Problema = 53.5033 mg/10ml 4.6760 mg/10ml = 48.8272 mg/ 10 ml etanol
Glucosa real del Problema = 44.3875 mg/10ml 4.6760 mg/10ml = 39.7114 mg/ 10 ml etanol

Promedio 48.8272+39.7114/2= 44.2693

CALCULO DE ETANOL FORMADO.

46.0 mg de Etanol 1 mmol de Etanol


44.2693 mg de Etanol x mmol de Etanol

x = 0.9623 mmol de Etanol

mmol de Etanol formado = 0.9623

DETERMINACION DE CO2 POR GRAVIMETRIA

TABLA 5.Datos obtenidos en la curva tipo de glucosa.


Muestras
Papel filtro problema

Peso en gramos (g)

Peso en mili gramos (mg)

0.8020

802

Papel filtro +BaCO3 problema

0.8642

864.2

BaCO3 de fermentacin

0.0622

62.2

Papel filtro testigo

0.7950

795

Papel filtro + BaCO3 testigo

0.9289

928.9

BaCO3 testigo

0.1339

133.9

Primero obtenemos los mg de BaCO3 del problema y testigo:

BaCO 3=Peso de papel con muestra Peso de papel sin muestra

BaCO3 Problema = Peso de papel con muestra Peso de papel sin muestra
BaCO3 Problema = 864.2 mg 802 mg
BaCO3 Problema = 62.2 mg

BaCO3 Testigo = Peso de papel con muestra Peso de papel sin muestra
BaCO3 Testigo = 928.9 mg 795 mg
BaCO3 Testigo = 133.9 mg

BaCO3 real del Problema = Problema Testigo


BaCO3 real del Problema = 62.2 mg 133.9 mg = -71.7 mg/ 10 mL

PARA OBTENER LOS mg DE CO2:

mg de CO2 =mg de BaCO 3 F .G .

Donde F .G .=71.7

Donde F .G .=71.7

PM CO 2
=0.223
PM BaCO 3

PM 44CO 2
=15.9874
PM 197.33 BaCO 3

Por tanto;
mg de CO2 = -15.9874 mgCO2

Sabemos que:
44.0 mg de CO2 1 mmol de CO2
-15.9874 mg de CO2 x mmol de CO2

x = -0.3633 mmol

mmol de CO2 formado = -0.3633

Tabla 6. Balance de fermentacin.

Compuestos

Concentracin
[mmol]

Moles de
producto
por moles
de Glu

Estado de
oxidacin

Val de
produc
oxid

Val de
prodc
red

Carbono
recuperado

-3.2391

3.2391

FUENTE DE ENERGA
Glucosa
(C6H12O6)

0.5941

PRODUCTOS.
Etanol
(C2H6O)
Dixido de
carbono
(CO2)

0.9623

1.6195

-2

+2

SUMA

0
0

O
0
=
R 3.2391

O
=0
R

0
3.2391

3.2391

C Recuperado =

3.2391
( 100 )
6

C Recuperado =53.985

DISCUSIN:
Al realizar nuestro balance de fermentacin del microorganismo Saccharomyces
cerevisiae al observar las cantidades, de etanol CO 2, no eran las esperadas, ya que
tericamente debamos obtener por cada mol de glucosa, dos moles de etanol y dos de
CO2 (condiciones anaerbicas), obtuvimos menos de ese valor. Las condiciones
anaerbicas, en la prctica se emple un mtodo, el cual una vez agregada la levadura a
nuestros matraces de fermentacin inyectamos N 2 para mantener a la levadura en
condiciones de anaerobiosis y as fermentara la glucosa, luego de eso se incubo en las
manos de un integrante del equipo, esto fue porque los microorganismos son mesfilicos,
es decir, necesitan de ciertas temperaturas para poder crecer.
Al realizar el balance de fermentacin, podemos discutir que en la determinacin de CO 2,
no se lleva a cabo acabo, ya que el matraz de reaccin no es el apropiado para
determinar este producto, por lo tanto suponemos que no se llev a cabo una buena
absorcin de este en el hidrxido de sodio, ya que nos arroja un valor negativo. En la
determinacin de etanol, pudimos observar que no obtuvimos 0.9623 mmol de este
producto, con esto podemos decir que aqu el mtodo no fue el adecuado ya que la
muestra probablemente estaba contaminada. Al calcular el ndice O/R nos da un valor de
cero y no podemos saber cuntos productos reducidos u oxidados hay en la reaccin, se
ve afectado el %C recuperado, ya que obtuvimos menos del 53.985%.
INTERFERENCIAS EN LA DETERMINACIN CON DNS
Al obtener valores bajos de azcar residual, no se pueden considerar la presencia de
interferencias en el proceso de fermentacin.
Estas interferencias se presentan cuando se obtienen valores muy parecidos al de la
concentracin inicial de la glucosa o se presentan valores mayores al inicial.
Esto se debe a la presencia de otros compuestos con estructura parecida al azcar, como
el cido gluconico que pueden reaccionar con el DNS y entonces obtenemos una lectura
que no solo nos da la presencia de la glucosa, sino tambin de otros compuestos y es
por eso que obtenemos lecturas similares o mayores a la inicial.
Otra de las causas por la cual podemos obtener una lectura incorrecta en el sistema, y de
este modo no cuantificar del modo adecuado la concentracin de glucosa, es la
contaminacin de las clulas con el hidrxido de la cmara central, al contaminarse las
clulas con este reactivo y al llevar al cabo la reaccin con el DNS, el hidrxido reacciona
con el DNS y pasa de cido dinitrosaliclico a dinitrosalicilato, el cual ya no lleva a cabo la
reaccin con el azcar y por lo tanto no nos da la reaccin colorida, y es por eso que
obtenemos lecturas de absorbencia baja, y por lo tanto al interpolar y realizar clculos
obtenemos una concentracin de glucosa residual baja.

BIBLIOGRAFIA

SOLOMON E.P., BERG L.R., MARTIN D.W. Biologa. Octava edicin. Interamericana
McGraw-Hill. 2008. Mxico. Parte 2. Captulo 8.
ROSE, Anthony H. Microbiologa qumica. Introduccin a la Fisiologa Microbiana
Ed. Alhambra, pp 244.

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