Instituto Politecnico Nacioal

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Bioquímica General

Práctica
Reacciones enzimaticas de oxido
reducción I
Sección: 3

Grupo: 4QM2

Integrantes:
• Cantú Cárdenas Josué Alberto

• Mendoza Nolasco Ericka

INTRODUCCIÓN
Una oxidorreductasa es una enzima
que cataliza la transferencia de
electrones desde una molécula
donadora (agente reductor) a otra
aceptora (agente oxidante) algunas
enzimas necesitan de coenzimas
(compuestos orgánicos no proteicos
que requieren las enzimas para su
actividad y pueden unirse temporal o
permanentemente)
Funciones de las coenzimas:
1. Ayudar en las reacciones de
acoplamiento energético
intracelular.
2. Actúan como transportadores de
átomos de hidrógeno, electrones
o grupos químicos (por ejemplo,
el NADH actúa como
transportador de hidrógenos).
3. Facilitar las reacciones
asociándose con los sustratos
enzimáticos en los sitios activos
de la enzima.
La deshidrogenasa láctica (DHL) es
una proteína enzimática que actúa
sobre piruvatos y lactatos en conjunto
con el dinucleótido de adenina-
nicotinamida, la NAD es un derivado de
la vitamina B3 que actúa como
coenzima transportando átomos de
hidrógeno, esta enzima que se
encuentra en prácticamente todos los
tejidos del cuerpo humano. Las
isoenzimas son enzimas que difieren en
la secuencia de aminoácidos de la
estructura primaria de la proteína, pero
catalizan la misma reacción química.
Isoenzimas de la LDH:
• LDH-1. Se encuentra en el
corazón y glóbulos rojos.
• LDH-2. Se encuentra en los
glóbulos blancos, pero en menor
cantidad que LDH 1.
• LDH-3. Se encuentra en el tejido
muscular.
• LDH-4.Se encuentra en células
de los riñones, páncreas y
ganglios linfáticos.
• LDH-5.Se encuentra en el
hígado y músculo esquelético.
Objetivos
• Obtener un extracto crudo con
LDH y otro con la coenzima
NAD+ a partir del músculo de la
rata.
• Observar la relación que existe
entre la reducción del azul de
metileno y la actividad
enzimática.
• Realizar los experimentos en
condiciones anaeróbicas
utilizando aceite vegetal.
• Analizar las propiedades de un
extracto crudo sobre la actividad
enzimática
• Modificar el equilibrio de la
reacción unilizando KCN
RESULTADOS Tubo 1: Decoloración intensa respecto
al color inicial.
Tubo 2: La decoloración fue menor que
en el tubo 1.
Tubo 3: Decoloración parcial,
intermedia entre el tubo 1 y tubo 2.
Tubo4: sin cambios de coloración.
Tubo 5: Decoloración casi inperceptible.

Tabla 1. Decoloración de azul de

metileno
Tiempo + Intensidad de Azul de
de metileno
incuba Tu Tu Tu Tub Tu
ción bo bo bo o 4 bo
Figura 1: Tubos previos a la reacción 1 2 3 5
de la LDH ordenados del 1 al 5 de 0 min ++ ++ ++ +++ ++
izquierda derecha. ++ ++ ++ ++ ++
15 min + ++ ++ +++ ++
Se puede observar la coloración + ++ +
caracteristica de la forma oxidada del
azul de metileno en todos los tubos sin DISCUSIÓN
decoloración ni modificación alguna.
Tubo 1:
El contenido del tubo 1 está
diseñado para ser el control
positivo de esta prueba. La
enzima Lactato
deshidrogenasa está
llevando a cabo una
reacción de óxido-
reducción, donde el lactato
actúa como sustrato
sufriendo una oxidación
para formar el piruvato, durante está
reacción se está llevando a cabo
Figura 2: Resultados finales de simultáneamente la reducción del
coloración transcurridos 15 minutos de NAD+ en NADH, esté último es el que
la reacción enzimática de la LDH. lleva a cabo la reducción del Azul de
Metileno. El cambio de coloración en el
azul de metileno evidencia la formación
de NADH en la reacción enzimática de
la LDH, debido a que este presenta una
coloración azul intenso en su forma
oxidada y es incoloro en su forma
reducida. La disminución de coloración
es directamente proporcional a la
formación de NADH, por lo que al tener
un producto incoloro hubo gran
actividad enzimática. Fue necesario
utilizar el aceite vegetal para llevar en
condiciones anaeróbicas la reacción, ya
que la presencia de oxígeno
mantendría al azul de metileno en su
forma oxidada y no se notarían los
cambios en la coloración. El cianuro de
potasio también fue indispensable al
reaccionar con el piruvato para formar
la cianhidrina de piruvato y desplazar el
equilibrio hacia la formación de piruvato
y por lo tanto de NADH.
Tubo 2:
En el tubo 2 se observa la
ausencia del extracto de
Coenzima NAD+ obtenido
en el laboratorio. La
reacción se está llevando a
cabo debido a que en
nuestro extracto crudo de
lactato deshidrogenasa es
muy probable que haya
restos de NAD+ , por lo que si se va a
reducir el azul de metileno, aunque no
tan rápido como en la prueba positiva al
agregarse el extracto de la coenzima.
La coloración del tubo indica una mayor
eficiencia en el proceso de reducción
del azul de metileno, debido a que es la
parte donde se tienen las condiciones
más anaeróbicas posibles.
Tubo 3:
En el tubo 3 se tiene una
ausencia de sustrato. La
reacción se está llevando a
cabo de igual manera que el
tubo 2 al tratarse de ser un
extracto crudo. Se ve más
avanzada la reacción al ser
más abundante la presencia
de lactato en el extracto en crudo.
Tubo 4:
El tubo 4 no cuenta con
presencia del extracto de
enzima, por lo que este
sería nuestro control
negativo. Se tiene un nulo
cambio en la coloración
debido a que no hay
formación de NADH capaz
de reducir el azul de
metileno. A diferencia del extracto crudo
de enzima el extracto de coenzima
NAD+ no va a contar con restos de
enzima al someterse a un proceso de
ebullición, perdiendo su actividad
enzimática o precipitándose con los
restos celulares durante la
centrifugación.
 Tubo5: formación de productos durante
En el tubo 5 no se cuenta la reacción enzimática.
con cianuro de potasio
siendo este el responsable BIBLIOGRAFÍA
de desplazar el equilibrio de
la reacción. Debido a que la • Blue-White Screening &
reacción con la enzima Protocols for Colony
Lactato deshidrogenasa es Selection.(2021).Coenzimas
reversible una vez que se - Sigma-Aldrich .
llegó al punto de equilibrio Sigmaaldrich.com.Recupera
no se observaron cambios al no do de: sigmaal
aumentar la concentración de NADH drich.com/MX/es/products/ch
por lo que después de transcurridos 15 emistry-and-biochemi
minutos la coloración permanece cals/biochemicals/coenzyme
constante. s
• Aranda Torrelio, E. (2010).
CONCLUSIONES Interpretación de la
deshidrogenasa láctica.
• La reducción del azul de Revista de La Sociedad
metileno a su forma incolora Boliviana de
pone en evidencia la formación Pediatría.Recuperado
de NADH durante la reacción de:http://www.scielo.org.bo/s
enzimática del lactato cielo.php?script=sci_a
deshidrogenasa. rttext&pid=S1024-
• El extracto crudo de lactato 06752010000200009
deshidrogenasa contiene restos
de la Coenzima NAD+ y del
sustrato.
• El cianuro de potasio desplaza el
equilibrio de la reacción a la
formación de piruvato y de poder
reductor.
• La reacción se necesita llevar a
cabo en condiciones anaerobias
para evitar la oxidación del azul
de metileno.
• La disminución en la coloración
del azul de Metileno es
directamente proporcional a la