MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA PRÁCTICA

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN
BIOSEGURIDAD
La bioseguridad, podría definirse como un conjunto de normas diseñadas para la protección del individuo
(manipuladores de alimentos, personal de salud, pacientes, etc.), de la comunidad, así como del medio ambiente
contra el contacto accidental con patógenos biológicos, químicos o elementos radiactivos. El propósito de la
bioseguridad incluye:

 Evitar accidentes que dañen a quienes trabajan en el laboratorio.

 Impedir la salida del área de trabajo de agentes nocivos para la salud humana y animal.
 Asegurar que en los estudios, pruebas clínicas o maniobras que se realicen dentro del recinto se extremen
todas las medidas de bioseguridad necesarias para reducir al mínimo los riesgos de accidentes.

RIESGOS: Definición y Tipos

La Organización Panamericana de la Salud (O.P.S.) define como riesgo, en términos generales, a la probabilidad que
se produzca un daño en un individuo o grupo poblacional en un área geográfica determinada. Teniendo en cuenta la
multicausalidad de los accidentes en el laboratorio, las principales causas de riesgos pueden agruparse en:

1. Riesgos Biológicos

Las infecciones que se adquieren son originadas por contacto con virus, bacterias, parásitos y hongos. Se encuentra
presente cada vez que se realiza una actividad práctica en el Laboratorio, donde se requiera manipulación de cultivos
de microorganismos, los cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden llegar a provocar infección
si no son manipulados adecuadamente.

Para que se produzca un accidente por un agente biológico deben estar presente básicamente 4 elementos: un
hospedero susceptible, un agente infeccioso, una concentración de éste y una ruta de transmisión adecuada;
siendo este último el que mejor se puede controlar en el laboratorio.

Las vías de infección, o sea la forma en que los microorganismos pueden ingresar al hospedero son a través de:

 Boca: Comer, beber, fumar en el laboratorio. Transferencia indirecta a través de los dedos o utensilios
contaminados (lápices, bolígrafos, etc.)
 Piel (intacta o lesionada): Inoculación accidental con una aguja hipodérmica u otros elementos punzantes.
Cortaduras o rasguños.
 Ojos: Salpicadura de materiales infecciosos. Transferencia indirecta a través de dedos contaminados.
 Pulmones: Inhalación de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).

Mecanismo de transmisión

Las infecciones se transmiten cuando los microorganismos pasan de una persona u objeto contaminado a otra
persona. Todos los microorganismos, inclusive la microbiota normal, pueden causar infección o enfermedad. Por
ejemplo, los gérmenes habituales sobre la piel del personal de salud pueden causar infección al ser introducidos a un
sitio estéril durante una cirugía.

Modos de transmisión

 Contacto: es la transferencia directa de los microorganismos al tocar un objeto contaminado, por relaciones
sexuales, por transmisión fecal/oral o por gotitas al hablar o toser.

 Vehículo: elemento que sirve para llevar los microorganismos de un sitio u objeto a la persona. Puede ser la
comida, la sangre, el agua, el instrumental y demás objetos utilizados en el laboratorio.
 Llevado por el aire: los microorganismos se llevan por la circulación del aire. - Vector: los insectos y arácnidos
pueden transmitir microorganismos.

2.Riesgos Ambientales

Estos riesgos están relacionados con el microclima de trabajo.

• Iluminación: Cuando es escasa o presenta marcados contrastes entre la luz localizada o la general, obliga a
continuas adaptaciones visuales, que producen fatiga y favorecen los accidentes.

• Ruido: Si es excesivamente discordante e inoportuno provoca molestias y disminuye la concentración, pero

si su intensidad y frecuencia son prolongadas puede provocar lesiones auditivas.

• Temperatura: Cuando es demasiado alta produce agobio y agotamiento, haciendo peligrar la concentración
en el trabajo.

• Ambiente: Las partículas inertes que contaminan el ambiente pueden provocar graves problemas de salud.

3.Riesgos Tecnológicos

 Sustancias químicas: líquidos inflamables, materiales inestables, productos tóxicos o cáusticos, vapores,
humos y gases. La mayoría de los solventes pueden provocar lesiones cutáneas con efectos corrosivos y alérgicos.

 Sustancias cancerígenas: Manifiestan su acción mucho tiempo después de la exposición, por eso a veces no
se los relaciona con el efecto.

 Radiaciones: La radiación ultravioleta (UV) producida por diferentes equipos puede resultar peligrosa si se
exponen los ojos a la luz directa o reflejada.

4. Riesgo Personal

Existen situaciones como la fatiga física debida al trabajo estático o dinámico y la fatiga subjetiva provocada por la
rutina, falta de estímulo, escasas perspectivas de futuro, etc., que llevan a un desgaste psíquico progresivo,
disminuyendo la atención y aumentando el riesgo de accidentes.

SEGURIDAD BIOLÓGICA
Las Normas de Seguridad Biológica pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo relacionado con la
manipulación de material peligroso, y su rigurosidad varía con la peligrosidad de los agentes. La seguridad biológica
se fundamenta entonces en tres elementos:

 Técnicas de Laboratorio. Se refiere a todas aquellas prácticas y técnicas microbiológicas que se realizan dentro y
fuera del laboratorio. Un buen seguimiento de las mismas ayuda a contener los riesgos biológicos. Como práctica
de mayor importancia se encuentra el desarrollo o adopción por parte de cada laboratorio de un Manual de
Seguridad Biológica en el que se identifiquen los riesgos que pueda sufrir el personal y que especifique los
procedimientos que puedan minimizar esos riesgos, como así también las responsabilidades.
 Equipo de seguridad (Barreras Primarias): Dispositivos o aparatos que garantizan la seguridad por ejemplo, las
cabinas de seguridad biológica; como las prendas de protección personal (guantes, barbijos, batas, calzado, etc.).
 Diseño y Construcción de la Instalación (Barreras Secundarias). La magnitud de las barreras secundarias
dependerá del tipo de agente infeccioso que se manipule en el laboratorio. Dentro de ellas se incluyen la
separación de las zonas donde tiene acceso el público, la disponibilidad de sistemas de descontaminación
(autoclaves), filtrado del aire de salida al exterior, flujo de aire direccional, etc.
LOS FACTORES DE INTERÉS EN LA EVALUACIÓN DEL RIESGO
 Patogenicidad (capacidad de un agente infeccioso de producir daño) o la sospecha de que puede ser
infeccioso, incluyendo la incidencia y la gravedad de la enfermedad (es decir, una baja morbilidad contra una alta
mortalidad, una enfermedad aguda contra una crónica). Cuanto más grave sea la enfermedad que potencialmente
se pueda contraer, mayor será el riesgo. Por ejemplo, el Staphylococcus aureus rara vez provoca una enfermedad
grave o que revista riesgo de muerte dentro del ambiente del laboratorio y es relegada a un Nivel de Bioseguridad 2.
Los virus como el Ebola, Marburg y fiebre Lassa, que producen enfermedades con altas tasas de mortalidad y para
los cuales no existen ni vacunas ni tratamiento, son manipulados en un Nivel de Bioseguridad 4.

 Ruta de transmisión: parenteral, por aire o por ingestión de agentes infecciosos. Los agentes que pueden
transmitirse por aire son los que han originado la mayoría de las infecciones de laboratorio. Es aconsejable, al
planificar un trabajo con un agente relativamente no caracterizado y cuyo modo de transmisión no sea cierto,
considerar la posibilidad de que se transmita por aerosol. Cuanto mayor sea el potencial, mayor será el riesgo.

 Estabilidad del agente es una consideración que involucra no sólo la infección por aerosol (por ejemplo, de
bacterias que forman esporas), sino también la habilidad del agente para sobrevivir durante largo tiempo en el
ambiente. Se deben tener en consideración factores tales como la desecación, la exposición a la luz solar o a luz
ultravioleta o la exposición a desinfectantes químicos.

 Dosis infecciosa del agente: La dosis que origine la infección puede variar de una a miles de unidades. La
compleja naturaleza de la interacción de los microorganismos y del hospedero presenta un desafío significativo aun
para el más sano e inmune de los empleados del laboratorio, y puede generar un serio riesgo a aquellos que posean
una menor resistencia.

 Estado inmune del personal de laboratorio está directamente relacionado a su susceptibilidad a la

enfermedad al trabajar con un agente infeccioso.

 Concentración: número de organismos infecciosos por unidad de volumen.

 Origen del material potencialmente infeccioso también representa un elemento crítico al determinar el
riesgo. “Origen” puede referirse a la ubicación geográfica (por ejemplo, dentro o fuera del país), al hospedero (por
ejemplo, ser humano o animal infectado o no infectado) o a la naturaleza de la fuente (zoonótica potencial asociada
con el brote de una enfermedad).

 Disponibilidad de una profilaxis eficaz o la intervención terapéutica. La forma de profilaxis más usual
consiste en la inmunización con una vacuna eficaz. La evaluación del riesgo incluye determinar si existe una
inmunización efectiva disponible

 Supervisión médica garantiza que las medidas de seguridad que se han tomado realmente produzcan los
resultados de salud esperados. La supervisión médica es parte de la evaluación del riesgo. Puede incluir bancos de
suero, el monitoreo de la salud del empleado y la participación en las medidas post-exposición.

 Nivel de capacitación del personal que se encuentra expuesto al riesgo, como ser las personas que trabajan
en el laboratorio y el personal de mantenimiento, el personal de limpieza, etc.

CRITERIOS DE CLASIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS INFECTANTES POR GRUPO DE RIESGO

Grupo de nivel de riesgo 1. Riesgo individual y comunitario escaso o nulo

Grupo de riesgo constituido por microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en
humanos o animales.

Grupo de nivel de riesgo 2. Riesgo individual moderado, riesgo comunitario bajo

Grupo de riesgo constituido por agentes patógenos que pueden provocar enfermedades en humanos o en animales,
pero que tiene pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal del laboratorio, la comunidad, los
animales o el ambiente.
La exposición en el laboratorio puede provocar una infección, pero aplicando medidas eficaces de tratamiento y
prevención, el riesgo de propagación es limitado.

Grupo de nivel de riego 3. Riesgo individual elevado, riesgo comunitario moderado Grupo de riesgo constituido por
agentes patógenos que pueden provocar enfermedades graves en humanos o en animales, con bajo riesgo de
propagarse en la comunidad. Se aplicará al diagnóstico, investigación y producción en el cual se trabaja con agentes
que pueden causar enfermedad grave o potencialmente letal, principalmente como resultado de la exposición a
aerosoles.

Puede disponerse o no de medidas eficaces de tratamiento y prevención.

Grupo de nivel de riesgo 4. Riesgo individual y comunitario elevado

Grupo de riesgo constituido por agentes patógenos que pueden provocar enfermedades graves en las personas o en
los animales, con alto riesgo de propagarse en la comunidad. No suele disponerse de medidas eficaces de
tratamiento y prevención.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD
Nivel de bioseguridad 1

a. El trabajo es generalmente realizado sobre mesadas abiertas y se usan técnicas de microbiología adecuadas.

b. No se requiere equipamiento de contención ni diseño especial de infraestructura.

c. El personal de laboratorio debe tener capacitación continua y supervisión de un profesional habilitado.

d. El personal debe usar la indumentaria de protección adecuada.

Nivel de bioseguridad 2

a. El personal de laboratorio debe tener entrenamiento específico para manipular agentes patógenos y estar
supervisado por un profesional habilitado.

b. El acceso al laboratorio debe estar restringido al personal autorizado.

c. Se deben tomar precauciones extremas con elementos corto punzantes.

d. Las operaciones generadoras de aerosoles potencialmente infecciosos deben ser realizadas con
equipamiento y/o procedimientos de contención física.

e. El personal debe usar la indumentaria de protección adecuada.

Nivel de bioseguridad 3 – Laboratorios de contención

a. La capacitación debe ser específica.

b. Todos los procesos que involucran manipulación de este nivel de material infeccioso debe ser realizados en
cabinas de seguridad biológica.

c. El personal debe usar indumentaria de protección adecuada y disponer de vestuario “doble” con ducha.

d. El laboratorio debe tener diseño e instalaciones adecuadas para la contención.

e. Es necesario el tratamiento de los efluentes líquidos.

f. Se debe usar filtración absoluta HEPA (High Efficiency Particulate Air; es un tipo de filtro de aire de alta
eficiencia) y presión negativa en el laboratorio.

Nivel de bioseguridad 4 – Laboratorios de máxima contención

a. El acceso al laboratorio debe ser estrictamente controlado y debe estar aislado del resto de las instalaciones.
 b. Dentro de las áreas todas las actividades deben estar confinadas a gabinetes de seguridad biológica clase 3 o
clase 2 con traje presurizado para el operador.

c. Se debe realizar el tratamiento “in situ” de los efluentes.

d. Se debe usar filtración absoluta doble HEPA del aire extraído, y aplicar presión negativa en el laboratorio.

IMPORTANCIA DEL LAVADO DE MANOS

¿Por qué lavarse las manos?

Mantener las manos limpias es una de las medidas para evitar enfermarnos y transmitir los microbios a otras
personas. Muchas enfermedades se propagan por no lavarse las manos con agua corriente y jabón.

¿Cómo los microorganismos llegan a las manos y hacen que las personas se enfermen?

Las heces (caca) de las personas o los animales son una fuente importante de microbios. Estos tipos de microbios
pueden llegar a las manos después de que las personas usan el baño o cambian un pañal, pero también de formas
menos obvias, como después de manipular carnes crudas que contengan cantidades invisibles de caca de animales.
Los microorganismos pueden llegar a las manos, si las personas tocan cualquier objeto que contenga gérmenes
debido a que alguien haya tosido o estornudado sobre él o haya entrado en contacto con algún otro objeto
contaminado. Si estos microbios llegan a las manos y no se eliminan pueden pasarse entre las personas y hacer que
estas se enfermen. El lavado de manos ayuda a prevenir infecciones por los siguientes motivos:

EL LAVADO DE MANOS: UN HÁBITO SALUDABLE EN LA COCINA

Previene las intoxicaciones alimentarias cuando estés preparando alimentos para vos o para otras personas..

Momentos clave cuando los microorganismos se pueden propagar:

 Antes, durante y después de preparar cualquier alimento.

 Después de manipular carne, aves, pescado o huevos crudos.

 Antes de comer.

 Después de tocar la basura.

 Después de limpiar las mesadas con un trapo u otras superficies con sustancias químicas.

 Después de tocar a las mascotas o manipular sus alimentos o golosinas. Después de toser, estornudar o
sonarse la nariz.

DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN
Esterilización Es la destrucción o eliminación completa de toda forma de vida
microbiana. Puede llevarse a cabo por procesos físicos o químicos.

Desinfección Es un proceso que elimina la mayoría o todos los microorganismos

sobre los objetos inanimados, con excepción de las esporas
bacterianas. Se efectúa por medio de agentes químicos.

Descontaminación Inactividad de los gérmenes patógenos de los objetos, de modo que

sea seguro manipularlos

Limpieza Es la remoción física de materia orgánica o suciedad de los objetos.

Desinfectante Sustancia que destruye los microorganismos presentes, a excepción
de las esporas bacterianas. Se utiliza este término en sustancias
aplicadas sobre objetos inanimados.

Antiséptico Sustancia química de aplicación tópica sobre tejidos que destruye o

inhibe los microorganismos sin afectar a los tejidos sobre los que
se aplica

Germicida Agente que destruye microorganismos en especial patógenos, en

tejidos vivos y objetos inanimados. Según el germen sobre el que
actúa se denomina fungicida (hongos),

virucida (virus), bactericida (bacterias)

Bacteriostático Sustancia química que previene el crecimiento de bacterias pero no

necesariamente las destruye. Depende del tiempo, temperatura,
pH

Antibiótico Sustancia química natural procedente del metabolismo de los

microorganismos y sus derivados sintéticos que destruyen o
inhiben el crecimiento de bacterias u otros microorganismos

Tabla 1. Definición de términos relacionados con los procedimientos de desinfección y esterilización.

La esterilidad de una sustancia u objeto dependerá entre otros factores:

Del microorganismo: tipo, número, velocidad de muerte.

Del proceso: tiempo de esterilización.

De la limpieza: cantidad y tipo de suciedad. NUNCA LO SUCIO SE ESTERILIZA.

Del material a esterilizar: características.

Métodos de Esterilización

Físicos Químicos

 Calor seco ESTUFA  Óxido de etileno (gas)

 Calor húmedo AUTOCLAVE  Glutaraldehídos (líquido)
 Radiaciones ionizantes  Peróxido de hidrógeno (plasma)
 Rayos Gamma
 Radiaciones NO ionizantes
 Rayos U.V
 Filtración

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN
1.FÍSICOS

1.1 Calor seco: ESTUFA

Este método utiliza aire caliente seco.

El procedimiento que debe seguirse es el siguiente:

1°. Acomodar el instrumental en cajas metálicas o envueltos en papel aluminio o papel apto para temperaturas
elevadas. Se colocan en el enrejado sin que tomen contacto con las paredes ni el piso.

2°. Cerrar herméticamente las puertas de la estufa.

3°. Encender la fuente de calor y esperar que la temperatura interior alcance la temperatura seleccionada para
esterilizar.

 150°C: Mantener 2 horas 30 minutos

 160°C: Mantener 1 hora 30 minutos
 180°C: Mantener 1 hora

El tiempo que debe esperarse calentando la estufa y el tiempo que tarda la misma en enfriar el material no debe
contárselo como tiempo de esterilizado.

Ventajas: facilidad de instalación, facilidad de manejo y la facilidad de poder esterilizar material dentro de
recipientes cerrados

Desventajas: son necesarias altas temperaturas, con lo cual los instrumentos a esterilizar pueden ser deteriorados
por el excesivo calor; NO distribución homogénea de la temperatura; excesivo consumo de energía eléctrica.

1.2. Calor húmedo: AUTOCLAVE

Es el método más efectivo y sencillo para esterilizar. En este procedimiento actúa de

manera combinada el calor y la presión. El calor húmedo es producido en forma de vapor
de agua a presión y el mecanismo de destrucción se realiza a través de la coagulación de
las proteínas bacterianas, destruyendo los microorganismos más resistentes como las
esporas.

Modo de uso

1°. Debe disponerse el material preparado correctamente para su esterilización

sobre enrejado debajo del cual se coloca agua.

2°. Se cierra herméticamente la tapa, se calienta hasta que solo escape vapor por
la espita abierta (válvula de seguridad), se cierra este elemento y se espera que
la temperatura llegue a 121°C.

3°. Esta temperatura corresponde a una presión interior de 1 atmósfera, es el

momento de bajar la llama y esperar 15 minutos, manteniendo la misma
temperatura y presión interior que asegura la destrucción de toda forma de vida
microbiana.

4°. Debe aguardarse, una vez apagada la llama, que la presión marque cero en el manómetro para abrir la tapa.

La limitación de esta técnica es que el material esterilizado queda húmedo una vez finalizado el proceso.

Esterilización por radiaciones: Espectro electromagnético

1.3 Radiaciones ionizantes

Esquema de una planta esterilizadora de alimentos por radiación gamma

Son rayos provenientes de la energía atómica que producen iones y radicales

libres como resultado de la desintegración de radioisótopos produciendo una
modificación irreversible de la estructura funcional de ácidos nucleicos,
proteínas y lípidos de los microorganismos. Los rayos X, gamma, beta,
protones, neutrones, partículas alfa son radiaciones de alto poder de
penetración, esto quiere decir que ionizan átomos bacterianos por lo que inactivan tanto genoma como a los
sistemas enzimáticos.

Se aplican a productos termolábiles a nivel industrial como antibióticos, vacunas, alimentos, materiales plásticos.

1.4. Radiaciones NO ionizantes

Rayos UV (ultravioleta)

La acción de este tipo de radiación es múltiple, se ejerce por acción directa con alteración de proteínas e
indirectamente por la formación de ozono en contacto con el aire y peróxido de hidrógeno en contacto con el agua.
Se utiliza para desinfección de superficies, ambientes como los quirófanos, tratamiento de agua para consumo.

1.5. Filtración

Es un procedimiento físico de esterilización de fluidos en el cual los microorganismos no son destruidos, sino
simplemente retenidos por un material filtrante. La filtración sólo puede ser utilizada con fluidos, sean líquidos o
gaseosos.

Se suele utilizar con soluciones cuyos componentes sean termolábiles y

por lo tanto no pueden ser esterilizadas en el autoclave.

La filtración tiene la desventaja de que es ineficaz con determinados

microorganismos, como los virus que son mucho más pequeños que el
tamaño del poro, por lo que no son retenidos.

El material filtrante debe de ser inerte para no reaccionar con los

componentes de la solución, presentar resistencia mecánica y tener un
tamaño de poro menor que los microorganismos que deben ser
retenidos. Se usan filtros de nitrocelulosa desechables con tamaño de poro de 0,45 o de 0,22 micras.

Esquema de filtración empleando un Kitasato: El fluido es impulsado mediante la presión ejercida por un sistema de
vacío.

2.QUÍMICOS
2.1. Gas: OXIDO DE ETILENO

Cámara industrial de Óxido de etileno (ETO)

Es un gas activo contra todo tipo de bacterias, incluyendo esporas, virus y

bacilos tuberculosos. Su acción microbicida se produce por alquilación de la
pared celular del microorganismo que inhabilita a la célula para tener el
metabolismo normal o reproducción. Es utilizado en todo aquel material
termolábil o que no resista las condiciones de esterilización por calor húmedo o seco; por ejemplo: plásticos, goma,
equipos electrónicos.

Es mutagénico, tóxico, la inhalación causa nauseas, vómitos y trastornos neurológicos, al igual que cualquier otro
tipo de gas, es inflamable y de riesgo cuando su utilización no se realiza adecuadamente, bajo condiciones
controladas y por personal competente.

2.2. Líquidos: GLUTARALDEHÍDO AL 2%

Elimina los microorganismos por alquilación. Actúa por inmersión.

En solución acuosa es ácido, poco estable y no posee actividad esporocida. Sin embargo, cuando la solución de
alcaliniza (pH 7.5-8.5), se activa y posee actividad esporocida provocando alteración del RNA, DNA y alterando la
síntesis de proteínas.

Para desinfección de alto nivel el producto debe actuar durante 30 minutos mientras que para esterilizar se requiere
de un mínimo de 10 horas.

Se utiliza como desinfectante en frío para equipo médico sensible al calor.

2.3. Plasma: PERÓXIDO DE HIDRÓGENO

Se genera por inyección de peróxido de hidrógeno en presencia de radiofrecuencia, formándose un campo

electromagnético en el que como consecuencia del choque de iones se desprende hidrógeno y oxígeno, generando
un estado de plasma que será el agente esterilizante.

Se utiliza para elementos termosensibles.

CONTROLES DE ESTERILIZACIÓN

Son importantes para comprobar el funcionamiento correcto de cualquier método de esterilización. En

Microbiología es necesario determinar en una muestra o alimento la presencia de microorganismos y para ello
debemos garantizar que los materiales utilizados no estén contaminados así se comprueba que los gérmenes
aislados corresponden a la muestra o alimento investigado.

Para certificar la calidad del proceso, y el resultado de la esterilización, se emplean controles de esterilización de
diversos tipos:

 Físicos: son implícitos del propio aparato utilizado en la esterilización. Indicadores como la temperatura, la
presión o el tiempo son controlados por termostatos, manómetros y cronómetros. Por sí solos, los controles físicos
no garantizan el correcto proceso de esterilización pero tienen la suficiente importancia como para descartar un ciclo
de esterilización si alguno de los indicadores no se cumple.

Método de Esterilización
Indicadores físicos
 Calor húmedo Tiempo, Temperatura, Presión

Calor seco Tiempo y Temperatura

Óxido de etileno Tiempo,Temperatura, Humedad

Plasma Gas Tiempo, Temperatura, Humedad

Formaldehído Tiempo, Temperatura, Humedad

Radiaciones Ionizantes Dosimetría

Indicadores físicos que se deben controlar en los métodos de esterilización

 Químicos: están basados en indicadores colorimétricos. Son tiras reactivas compuestas de franjas con tintas
reactivas, compuestas por sales metálicas, que cambian de color. Se aplican a cada paquete a esterilizar.

Indicadores químicos para estufa

 Biológicos: son dispositivos que utilizan formas de resistencia bacterianas (ESPORAS) atenuadas. Se
consideran el único medio de garantía para confirmar la esterilización.

Se suelen utilizar ampollas o tubos cerrados con esporas, que se someten al proceso de esterilización. Después se
ponen en contacto con el medio de cultivo que contiene el tubo y se incuban a temperatura y tiempo determinados.
Finalmente se observa si hay cambio del color del medio, que sería la señal de crecimiento de microorganismos y el
fallo en el proceso de esterilización.

DESINFECTANTES
Los desinfectantes deben reunir las siguientes propiedades:

 Amplio espectro antimicrobiano.

 Rápida acción microbicida.
 Facilidad de uso.
 Escasa capacidad para alterar el instrumental.
 Solubilidad en agua
 Estabilidad de la forma concentrada y diluída del producto.
 Toxicidad reducida
 Ininflamabilidad
 Costos bajos o moderados

La eficacia de los desinfectantes se puede ver alterada por:

 Sustancias interferentes (materia orgánica, dureza del agua).

 Tipo y grado de contaminación microbiana.
 Concentración y pH de la solución desinfectante.
 Tiempo de exposición
 Diseño y composición del objeto a desinfectar
 Temperatura a la que se realiza el proceso de desinfección.

Clasificación de los desinfectantes

ACIDOS ORGANICOS: acético, benzoico y bórico. El modo de acción es por bajar el pH a niveles incompatibles con la
vida de la mayoría de los microorganismos, cuando desciende por debajo de 5 también comienzan a precipitar
proteínas. Son poco tóxicos, producen irritación en mucosas.

ALCOHOLES: Etílico, isopropanol, xilitol. De baja potencia pero de moderada eficacia en concentraciones apropiadas,
pueden ser bactericidas pero su acción es lenta contra bacterias patógenas comunes.
 ALDEHÍDOS: Formaldehído, glutaraldehído, ortoftaladehído.

BIGUANIDAS: Clorhexidina digluconato.

DETERGENTES: son productos de limpieza. Contienen surfactantes, los cuales disminuyen la tensión superficial y
permiten una mayor penetración en la superficie. Puede ser catiónicos como los amonios cuaternarios; aniónicos
como los jabones.

HALÓGENOS:

1. Cloro e hipoclorito de sodio: Mata a bacterias, virus, hongos y micobacterias. No mata a las esporas. Su
mecanismo de acción es por liberación de cloro o ácido hipocloroso que inhibe la acción enzimática,
desnaturaliza las proteínas, inactiva a los ácidos nucleicos. Es el desinfectante universal a pesar de ser un
oxidante corrosivo para los metales.

Utilizado a gran escala para la desinfección de superficies, de ropa hospitalaria, desechos; descontaminar
salpicaduras de sangre, desinfección de equipos y mesas de trabajo resistentes a la oxidación, eliminación de olores
y desinfección del agua. Las soluciones de trabajo deben ser preparadas diariamente.

CONCENTRACIÓN Hipoclorito de Hipoclorito de Hipoclorito de sodio Hipoclorito de sodio al

FINAL sodio al 1% sodio al 0.5% al 0.2% 0.05%

USO Para desinfección Para desinfección Para desinfección de Para desinfección de

SIN presencia de superficies ropa
CON presencia de
materia orgánica
materia orgánica (coronavirus)

TIEMPO DE CONTACTO 5 minutos 5 minutos 5 minutos 30 minutos

(*) Para preparar las distintas soluciones desinfectantes hay que revisar la etiqueta del envase comercial y buscar la
concentración de hipoclorito de sodio

2. Yodo: Sólido a temperatura ambiente, ligeramente soluble en agua. Es desinfectante sobre tejidos vivos. Su
mecanismo de acción es unirse a las proteínas irreversiblemente y lo que conduce a su precipitación y oxidar
los elementos del protoplasma bacteriano. Se une a la Povidona para hacer más efectivo su poder
antiséptico. Se usa en soluciones al 0,075 g/l (75 ppm de yodo libre).

MÉTODOS DE CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO IMPLICADOS EN LA CONSERVACIÓN DE

ALIMENTOS
Para lograr que la conservación evite la descomposición provocada por la pérdida de las características
organolépticas, higiénicas y nutricionales de los alimentos, es necesario aplicar tratamientos adecuados y procesos
que transformen los alimentos frescos en productos que puedan mantener una óptima calidad por un período de
tiempo más o menos prolongado. A través de este medio, los alimentos mantienen la inocuidad por más tiempo, un
aspecto, textura y sabor agradable, y según el método utilizado puede llegar a conservar su valor nutritivo similar al
original. Sin embargo, cabe aclarar que no hay ningún método de conservación que brinde resguardo durante un
tiempo ilimitado frente a los riesgos potenciales.

A través de estos tratamientos se logra:

• Retardo de la actividad microbiana: Esto se logra al eliminar u obstaculizar el crecimiento de los

microorganismos existentes por métodos como bajas temperaturas, desecación y destrucción por calor.

• Retraso de la auto descomposición: A través del escaldado (someter al calor), se retrasan las reacciones
químicas como, por ejemplo, la oxidación.

PASTEURIZACIÓN
Consiste en un proceso de calentamiento seguido de enfriamiento realizado en los alimentos (principalmente
productos lácteos) para destruir los microorganismos patógenos. Es un tratamiento para disminuir las poblaciones
de agentes patógenos a niveles que no causen intoxicaciones alimentarias a los humanos, mientras se consuman
dentro del tiempo y las condiciones indicadas en el envase.

Ventajas

▪ Se lleva a cabo a temperaturas inferiores a 100ºC. Los cambios de temperaturas no controlados, pueden
ocasionar alteraciones no deseables en las características y calidad de los alimentos.
▪ Se enfría rápidamente para que la variación brusca de temperatura termine de eliminar las bacterias nocivas.

Desventajas

▪ La destrucción parcial de los microorganismos alterantes de la leche.

▪ Existen esporas que resisten este proceso
▪ Por esta destrucción sólo parcial de los microorganismos alterantes debe conservarse siempre a temperaturas
de refrigeración

Distintos métodos de Pasteurización

1. Pasteurización lenta de baja temperatura VAT o LTLT (Low Temperature, Long Time)

Procedimiento: Se utilizan autoclaves de distintas capacidades, se calienta sólo hasta 65ºC. Se mantiene a esa
temperatura durante un tiempo que va de los 5 hasta los 30 minutos. Se deja enfriar lentamente, a veces más de 24
horas hasta los 6°C, luego se envasa y sella.

Ventajas

▪ Conserva mejor el valor nutritivo de la leche.

▪ Elimina mohos, levaduras y la mayor parte de las formas vegetativas de las bacterias.
▪ Proporciona a la leche un periodo máximo de utilización de una semana.

Desventajas

▪ El tiempo de pasteurización es muy prolongado y el espacio empleado es muy extenso para el tratamiento de
volúmenes grandes de leche.
▪ Es un proceso no continuo, generalmente sin regeneración de calor.
▪ La eficacia de eliminación de microorganismos es menor.
▪ Este tratamiento apenas se emplea, ya que es muy lento y exige frecuentes modificaciones.

2. Pasteurización rápida de alta temperatura HTST (High Temperature Short Time)

A) En BATCH o Lotes

Procedimiento: Se utilizan pasteurizadores que son autoclaves industriales donde se calienta la leche a 72°C durante
15 a 20 segundos y luego se enfría a 6°C.

Ventajas

▪ Prácticamente no modifica la naturaleza física, química y nutritiva de la leche.

▪ Garantiza la destrucción del 100% de las bacterias patógenas y el 99% de las bacterias alterantes.
▪ El tiempo de vencimiento se alarga hasta en 5 días, con respecto a la leche pasteurizada lentamente, siempre
que se mantenga en heladera a una temperatura no superior a 8°C.

Desventajas

▪ Debe mantenerse refrigerada para evitar el crecimiento de los gérmenes que no se han podido eliminar.
▪ Una vez abierto el envase, debe consumirse en un plazo máximo de 3-4 días.

B) FLUJO CONTINUO
Procedimiento: El calentamiento y enfriamiento a la leche circulante se hace entre dos placas o dos tubos de metal,
llamados intercambiadores de calor.

Ventajas

▪ Proceso empleado en el procesamiento de 1.000 a 10.000 l/h de leche.

▪ Proceso continuo, casi instantáneo, con posibilidad de reutilizar por lo menos el 75% del calor empleado en el
calentamiento de la leche.
▪ Es el más conveniente, ya que expone al alimento a altas temperaturas durante un período breve, y necesita
poco equipamiento industrial para realizarlo, lo cual reduce los costes de mantenimiento de equipos.

Desventajas

▪ Necesidad de contar con personal altamente cualificado para la realización del trabajo y de controles
estrictos durante todo el proceso de producción.

Usos Es el método más aplicado por la industria alimentaria a gran escala.

3. Ultra pasteurización UHT (Ultra High Temperature)

Procedimiento: Mediante un flujo continuo se hace pasar la leche por el pasteurizador UHT a una temperatura de
135°C- 150°C de 2 a 10 segundos. Se enfría a 4 °C. Luego pasa a una máquina, ubicada por debajo del UHT, que llena,
sella y pone la fecha en las cajas automáticamente. Estos envases han sido esterilizados. Se cierran herméticamente.
Las cajas de leche se trasladan a un almacén refrigerado donde permanecen hasta su comercialización.

Ventajas:

▪ Asegura la destrucción de los microorganismos patógenos y de las formas esporuladas.

▪ Mínima degradación del alimento debido al breve período de exposición a temperatura alta.
▪ Alimentos envasados en condiciones asépticas lo que evita una contaminación posterior.
▪ No requiere refrigeración para su conservación. Una vez abierto el envase debe ser mantenido en la
heladera.
▪ Tiempo de conservación de aproximadamente 6 meses.

Desventajas:

▪ Necesita equipamiento más complejo y costoso: una planta para empaque aséptico y operarios más
experimentados.
▪ Las lipasas termo resistentes o proteasas pueden conducir a deterioro del sabor y envejecimiento de la
leche.
▪ Hace perder características organolépticas a la leche.
▪ Destruye algunas vitaminas. Desnaturaliza proteínas. Carameliza azúcares (lactosa)
▪ Afecta algunos componentes de la leche: concentración de sales, coagula la lacto albúmina, modifica la
caseína.
▪ No afecta las grasas.
▪ Homogeneización (dos fases)
▪ Procesos de depuración: centrifugación (para eliminar leucocitos, conglomerados de caseína y restos
orgánicos).
TINDALIZACIÓN
Se utiliza cuando las sustancias químicas no pueden calentarse por encima de los 100°C sin que resulten dañadas
como medios con alta concentración de azúcares o el suero sanguíneo. Consiste en el calentamiento del material de
70 a 80°C hasta 1 hora durante 3 días con sucesivos períodos de incubación. Las esporas crecerán durante los
períodos de incubación y en la siguiente exposición al calor las células vegetativas serán destruidas. Para efectuar
esta técnica se utiliza un baño María de nivel constante provisto por termorregulador. A 100°C se puede usar el
autoclave sin espita. Es un método largo, engorroso, inclusive no es seguro por lo que se debe usar en casos
extremos cuando no se puede aplicar otro.

Método

1° Calentamiento: Mueren las formas vegetativas. Mantener en estufa a 37°C por 24hs para inducir el pasaje de las
esporas a formas vegetativas.

2° Calentamiento: Mueren las nuevas formas vegetativas. Mantener en estufa a 37°C por 24hs para inducir el paso
de alguna espora rezagada a forma vegetativa. 3° Calentamiento: Elimina las formas vegetativas formadas en último
término.

BAJAS TEMPERATURAS
El efecto de las bajas temperaturas depende del microorganismo en particular y de la intensidad de la aplicación.
Por ejemplo, a la temperatura habitual de refrigeración (de 0° a 7 °C) la actividad metabólica de la mayoría de los
microorganismos es tan reducida que no pueden reproducirse ni elaborar toxinas. En otras palabras, la refrigeración
habitual tiene un efecto bacteriostático.

Sin embargo, las especies psicrófilas crecen lentamente a la temperatura del refrigerador y pueden alterar el aspecto
y el sabor de los alimentos después de un tiempo. Por ejemplo, un único microorganismo que se reproduzca sólo
tres veces por día en una semana constituirá una población de más de 2 millones. Las bacterias patógenas por lo
general no crecen a las temperaturas del refrigerador.

Algunas bacterias puedan crecer a temperaturas de varios grados por debajo del punto de congelación. La mayoría
de los alimentos permanecen sin congelar hasta -2 °C o menos. Las temperaturas por debajo del punto de
congelación obtenidas de manera rápida (- 18 ° C freezer) tienden a mantener inactivos a los microbios pero no
necesariamente los eliminan.

La congelación lenta es más perjudicial para las bacterias; los cristales de hielo que se forman y crecen rompen sus
estructuras celulares y moleculares. La descongelación, que siempre es más lenta, en realidad constituye la parte
más perjudicial del ciclo de congelacióndescongelación. Una vez congelada la tercera parte de la población de
algunas bacterias vegetativas puede sobrevivir un año mientras que otras especies podrían tener muy pocos
sobrevivientes después de ese tiempo. Muchos parásitos, como el nematodo Trichinella spiralis que produce la
triquinosis humana, son destruidos por varios días a temperaturas de congelación.

Los métodos más utilizados son:

REFRIGERACIÓN: Consiste en mantener el alimento a bajas temperaturas sin que llegue a congelarse (2 – 8°C). A
esta temperatura los microorganismos se multiplicarán muy lentamente.

CONGELACIÓN: Consiste en someter el alimento a temperaturas inferiores al punto de congelación durante un

tiempo reducido (-18°C o menos). Este proceso provoca que parte del agua del alimento se convierta en hielo. De
este modo los microorganismos existentes previos a la congelación no crecen, pero tampoco mueren. Del punto de
vista nutricional, es recomendable que cuando se saquen los alimentos del freezer se utilice en la cocción el líquido
que estos liberan, ya que en este líquido puede encontrarse una gran cantidad de vitaminas y minerales
hidrosolubles que podemos perder si no lo utilizamos.

ULTRACONGELACIÓN: Es apta para gran variedad de frutas, verduras, carnes, pescados, mariscos como así
también alimentos precocidos. Mediante este proceso se somete al alimento a un enfriamiento muy rápido,
llevándolo a temperaturas inferiores a los - 30°C, lo cual permite que se formen cristales de hielo de menor tamaño,
que evitan la ruptura de los tejidos del alimento (en la congelación como la formación del cristal de hielo es más
lenta, su tamaño es más grande y por lo tanto rompe tejidos).

LIOFILIZACIÓN
Consiste en someter los alimentos a procesos de congelación seguidos de sublimación del hielo formado para
privarlos de la mayor parte del agua.

Método

1° Preparación del alimento: Lavado, pelado, cortado, blanqueado y acondicionado del alimento.

2° Congelación: A temperaturas entre -20° C y -40° C de forma rápida para evitar la formación de grandes cristales de
hielo.

3° Deshidratación primaria por sublimación del hielo: Reducción de la presión generando un vacío y aplicación de
calor para favorecer la evaporación del hielo. En esta etapa el agua se evapora sin pasar a estado líquido por lo que
se mantienen todas las propiedades de color y aroma pero en forma seca.

4 ° Deshidratación secundaria: Evaporación del agua no congelada mediante reducción de la presión al mínimo y
elevación de la temperatura con el fin de lograr que el porcentaje de humedad final sea menor al 2%.

El producto queda seco, lo único que pierde es el agua por lo que los componentes característicos del aroma se
mantienen. Esta pérdida de líquido aligera significativamente el peso del alimento respecto al original; por este
motivo, se ha generalizado su uso en el desarrollo de alimentos destinados a expediciones.

La mayoría de los productos que se liofilizan se componen en gran parte de agua, eliminarla facilita el control de los
patógenos, que encuentran en el agua un medio necesario para sobrevivir y expandirse, a la vez que alarga la
conservación del producto sin necesidad de que se mantenga la cadena de frío.

Las principales aplicaciones de la liofilización: café, té, vegetales y frutas; carnes y productos del mar, comidas
preparadas y lácteos.

MICROSCOPÍA. COLORACIONES. MEDIOS DE CULTIVO. SIEMBRA

MICROSCOPÍA
Microscopio óptico: un instrumento que permite observar en un tamaño aumentado elementos que son
imperceptibles a simple vista.

Partes del microscopio óptico

Sistema óptico: formado por conjunto de lentes y elementos de manipulación de luz necesarios para generar una
imagen aumentada.

 Foco o fuente de luz: emite rayos de luz dirigidos hacia la muestra

 Condensador: concentra los rayos de luz sobre la preparación a observar
 Diafragma: regular la cantidad de luz incidente
 Objetivo: conjunto de lentes que reciben la luz proveniente de la muestra y permiten aumentar la imagen
observada
 Ocular: amplía la imagen proveniente del objetivo y es a través de él que se puede obserevar finalmente la
muestra

Sistema mecánico: proporciona el soporte estructural

  Base o pie: permite mantener el microscopio en posición estable.
 Brazo: es la estructura principal, conecta la base con el sistema óptico
 Platina: es la pieza horizontal donde se coloca la muestra. No está conectada de forma fija con el brazo.
 Tornillos Macrométrico y micrométrico: permiten regular la posición de la platina Revólver: es la parte
donde están montados los objetivos, normalmente 3 o 4, y que puede girar para seleccionar el objetivo
deseado
 Tubo: conecta los objetivos con el ocular

Funcionamiento

Se basa en la propiedad de algunos materiales que permiten cambiar la dirección de los rayos de luz; esto permite
fabricar lentes capaces de hacer converger o divergir los rayos de luz. Mediante la combinación de estas lentes se
puede generar una imagen aumentada de cualquier objeto.

En el microscopio óptico, las lentes del objetivo generan una imagen real aumentada de la muestra, esta imagen real
es a continuación ampliada mediante las lentes del ocular dando lugar a una imagen virtual de tamaño superior a la
muestra original.

El otro elemento esencial es la luz, por este motivo vienen equipados con un foxo de luz y un condensador para
focalizar un haz de luz hacia la muestra. Una vez la luz ha atravesado la muestra, las lentes son las encargadas de
desviar esta luz de forma correcta para generar la imagen aumentada

Representación del funcionamiento del microscopio óptico

Casi todos los microorganismos requieren, antes de ser examinados en un microscopio óptico, una preparación
especial; esto es debido a que poseen poco contraste natural, es decir, se ven prácticamente trasparentes. Para
realizar una tinción se prepara un extendido en un portaobjetos, se fija y finalmente se colorea.

COLORACIONES
Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste. La mayoría, son solamente
efectivos después de que los microorganismos hayan sido fijados, es decir, se encuentren muertos y adheridos al
portaobjetos. Se puede realizar una fijación por calor de la llama que mata las células microbianas por
desnaturalización de sus proteínas. Las proteínas coaguladas unen las células al portaobjeto y cuando se desea fijar
especímenes delicados se utiliza la fijación química que es menos agresiva que el calor. Para ello se añade una gota
del fijador, por ejemplo, formaldehído, o glutaraldehído, sobre la muestra líquida con los microorganismos.

Tipos de colorantes Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados.
Los colorantes básicos son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion cargado positivamente. Los colorantes
más utilizados son los de tipo básico, ya que la mayor parte de las células microbianas poseen cargas débilmente
negativas en su superficie, lo cual facilita su unión. Entre los más comunes se encuentran la safranina, la fucsina
básica, el cristal violeta y el azul de metileno.

Los colorantes ácidos son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion cargado negativamente, es decir que se
unen a las partes de las células cargadas positivamente. Se utilizan para teñir tejidos animales infectados con
microorganismos. Entre los más frecuentes están la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.

Los mordientes, aunque no son colorantes, tienen gran importancia en algunas técnicas de tinción, ya que
intensifican la tinción porque aumentan la afinidad de la célula por el colorante. También se pueden utilizar para
producir un engrosamiento de ciertas estructuras celulares externas, como los flagelos, que debido a su delgadez no
podrían ser visualizados de otra forma.

Existen tres tipos de técnicas de tinción:

1. Simple: se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico. Se utiliza solamente para incrementar el
contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción
simple mejora la observación de la célula completa.

2. Diferencial: se utiliza para distinguir entre tipos de microorganismos. Consta de dos etapas: una tinción
primaria (siguiendo el mismo método que en una tinción simple) seguida de una tinción de contraste. En la
tinción de contraste se utiliza otro colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer
colorante. Estas tinciones son muy utilizadas en microbiología. Por ejemplo, la tinción de Gram y la tinción de
ácido-alcohol resistencia (Tinción de Ziehl-Neelsen para micobacterias).

Tinción de Gram

Clasifica las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. La técnica incluye tinción primaria,
decoloración y tinción de contraste. Durante la decoloración donde se utiliza normalmente solución de acetona o
etanol las bacterias Gram negativas pierden su tinción primaria con cristal violeta y las Gram positivas retienen el
colorante. Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias Gram negativas,
previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta más intenso.

El distinto comportamiento frente a los colorantes de las bacterias Gram positivas y Gram negativas se debe a las
diferencias existentes en sus superficies externas (paredes celulares). Las células Gram negativas poseen una capa de
peptidoglicano delgada y una membrana externa. Las bacterias Gram positivas poseen una capa gruesa de
peptidoglicano y carecen de membrana externa.

Diagramas de la estructura de las paredes celulares de Gram positivas y Gram Negativas.

Esta tinción es extraordinariamente útil. Esta técnica es, casi siempre, la primera prueba que se lleva a cabo en la
identificación de un microorganismo. Con sólo un microscopio y unos cuantos frascos de colorante podemos
averiguar si un organismo es Gram positivo o Gram negativo, su morfología celular y su agrupación típica. Esto, a
veces, es suficiente para determinar con qué tipo de bacteria estamos trabajando. Es más, el tratamiento de una
infección depende de que el agente sea Gram positivo o Gram negativo, ya que algunos antibióticos actúan sólo
sobre los primeros, y otros sobre los segundos. La penicilina, por ejemplo, es más efectiva contra bacterias Gram
positivas; mientras que la estreptomicina y la tetraciclina actúan sobre ambas.

Se observan bacterias coloreadas mediante la tinción de Gram. Los cocos Gram positivos son los que tienen color
violeta intenso. Los bacilos Gram negativos son de color rosado.

Tinción de bacterias ácido alcohol resistente

Las bacterias ácido alcohol resistentes no pueden ser clasificadas según la tinción de Gram. Sin embargo pueden ser
teñidas con algunas tinciones combinadas con calor como la de Ziehl-Neelsen. Esto se debe a la composición de
algunas paredes bacterianas que hacen difícil la entrada de los colorantes, tal es el caso de las bacterias que
pertenecen al género Mycobacterium.

El calor afecta la estructura de los ácidos micólicos que conforman la pared bacteriana permitiendo que el colorante
entre en la bacteria. Es decir, que el calor está actuando como mordiente ya que aumenta la afinidad de la célula por
el colorante.

1 .Cubrir la preparación con Fucsina ácida

 .

3. Específicas: Incrementan el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares, entre las
que se incluyen las esporas, los flagelos y las cápsulas. Por ejemplo Tinción con Verde de Malaquita para
endosporas; Método de Kirkpatrick para observación de flagelos; Tinta china para observación de cápsula en S.
pneumoniae y Cryptococcus neoformans. También si el color se obtiene gracias a una molécula fluorescente unida
a un anticuerpo que se une de forma específica a una estructura celular en concreto que queremos visualizar,
estaremos ante una tinción de este tipo.

TINZIÓN DE ESPORAS

El verde de malaquita es un colorante básico (tiene una carga positiva débil) y por lo tanto se une débilmente a la
bacteria. Penetra en las células vegetativas, cuando se calienta la preparación, el colorante también penetra en las
endosporas. Durante el lavado, el verde de malaquita se elimina de las células vegetativas pero no de las esporas.

Tinta china

Es un método de coloración especial para destacar la presencia de la cápsula en algunos microorganismos,

principalmente Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae y Cryptococcus neoformans.

Esta técnica utiliza tinta china para su ejecución, por tanto, es una metodología sencilla y económica para aplicar que
brinda información de gran valor diagnóstico en poco tiempo. Se la conoce también como tinción negativa porque lo
que realmente se tiñe es el fondo sobre el que están los microorganismos apareciendo los microorganismos sin
teñir.

La muestra que se utiliza comúnmente es el líquido cefalorraquídeo por lo que representa una
alternativa rápida para el diagnóstico presuntivo de meningitis, especialmente por C.
neoformans.

SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO

En muchos aspectos, el pequeño tamaño de los microorganismos los hace sujetos ideales para la experimentación.
Se pueden cultivar millones de organismos en un solo mililitro de medio de cultivo para su estudio. La rápida
multiplicación de estos diminutos seres constituye una ventaja experimental, ya que se puede trabajar con muchas
generaciones en un solo día. Para permitir el crecimiento de microorganismos en el laboratorio, es necesario
aportarles un medio con nutrientes y condiciones fisicoquímicas adecuadas para su desarrollo. El medio de cultivo
es aquel que contiene agua y una serie de nutrientes, necesarios para su metabolismo. Normalmente se utilizan
placas de Petri con agar más nutrientes específicos (según el microorganismo que se desea aislar).

En la placa, las zonas de crecimiento aisladas con masas de células que han crecido a partir de una célula original se
denominan colonias.

De forma muy general, los medios de cultivo están compuestos por una base mineral que proporciona todos los
electrolitos en forma iónica, este medio basal debe suplementarse con sustancias orgánicas que actúan como fuente
de energía. Estos suplementos variarán de acuerdo con las propiedades nutricionales particulares del organismo que
se desea cultivar. El agar es un polisacárido obtenido a partir de las algas rojas que se utiliza para solidificar los
medios de cultivo.

No todos los microorganismos son cultivables en el laboratorio, pero sí una enorme cantidad de ellos.

Distintos tipos de medios de cultivos sólidos sin sembrar. 1) Agar Nutritivo 2) Agar sangre 3) CLDE: Cistina Lactosa
deficiente en Electrolitos

La gran diversidad metabólica que tiene este conjunto de organismos explica la amplia gama de medios de cultivo
que existen en el mercado.

Estos medios pueden promover el desarrollo de microorganismos solamente si cumplen ciertos requisitos para el
crecimiento.

CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS:

A. Disponibilidad de nutrientes

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono,
nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias
inductoras del crecimiento.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o
extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo
provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además,
representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no
suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos
más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como
suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como
las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de
naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades
metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

B. Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o
agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran
cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

C. Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de microorganismos pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal (20%), son los
llamados aerobios. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una
atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en
condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios
facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

D. Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de
las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas
en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad
necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

E. Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay
excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

F. pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de
ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos.
No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano
pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

G. Concentración salina

La mayoría de los organismos crece bien en medios ordinarios pero hay otros como los halófilos que requieren altas
concentraciones de sal.

H. Temperatura de incubación

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 40°C. Otros como los psicrófilos
crecen entre 5 y 15ºC mientras que los termófilos entre 50 y 80ºC o incluso a temperaturas superiores
(hipertermófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura m ucho más cortos,
alrededor de 35-36ºC, y los saprofitos tienen rangos más amplios.

I. Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que
puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados
en dichos medios. El método más empleado para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Pueden clasificarse de muchas maneras:

a) Según la proporción de agar:

Líquidos (caldos). No contiene ningún agente gelificante, por lo que los microorganismos crecen por todo el medio.
El crecimiento es más rápido puesto que la movilidad permite acceder de una forma más fácil a los nutrientes.

Sólidos. Tienen una proporción de agar de, aproximadamente, el 1.5%. El crecimiento se desarrolla en la superficie
del medio. En placas de Petri o en tubos de ensayo. Semisólidos. Aquellos que contienen una proporción de agar
inferior al 0.5%. Se utilizan para pruebas bioquímicas y de movilidad.

b) Por su naturaleza: naturales, artificiales, sintéticos o semisintéticos.

 c) Por su finalidad metabólica:

Nutritivos. Permiten el crecimiento de la mayoría de los microorganismos.

De enriquecimiento. Contienen componentes adicionales para permitir el desarrollo de microorganismos exigentes.

No selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están
enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para
el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)

Selectivos. Se añaden sustancias que inhiben el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el
crecimiento de otras.

Diferenciales. Contienen sustancias que ponen de manifiesto alguna característica de la especie o grupo de
microorganismos. Presentan formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición
y respiración sobre todo) específicas de las bacterias.

Enriquecidos. Ralentizan o suprimen el crecimiento de la microbiota competitiva normal potenciando el cultivo y

crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

d) Por su uso

-Pruebas bioquímicas

De izquierda a derecha: TSI, Lisina decarboxilasa, Fenilalanina, SIM, Nitritos, Urea y Citrato

-Recuento de bacterias

Petrifilm® Medio comercial para el recuento de bacterias ácido lácticas

-Especiales. Tienen formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de
bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).

-Transporte

-Medios de mantenimiento.

TÉCNICAS DE SIEMBRA
En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados en poblaciones
mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de
otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros. Un cultivo axénico o puro es aquel que
contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta
origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia.
Para obtener cultivos puros a partir de una población microbiana mixta, se utilizan las denominadas técnicas de
aislamiento, que fueron desarrolladas durante el siglo XIX. El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas
especies microbianas.

SIEMBRA
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin
de iniciar un cultivo microbiano. Para sembrar en microbiología es necesario mantener la habitación sin corrientes
de aire y estar al lado de la llama de un mechero (no más de 15 cm. de distancia). También se puede trabajar bajo
campana, o en flujo laminar, previa esterilización con luz UV.

1. El ansa de siembra se agarra del mango como si

fuera un lápiz y se flamea hasta rojo vivo.
2. El tapón se maneja con el dedo meñique de la
mano derecha. Se flamea la boca del tubo
después de abrir y antes de cerrar. Se enfría el
ansa antes de tomar una gota del cultivo.
3. Se siembra en la placa de Petri. Toda la
operación se realiza a no más de 15 cm de la
llama del mechero.
4. Se estría en el medio de cultivo por agotamiento
siguiendo el esquema.
5. Colonias aisladas en Agar Sangre.

CULTIVO EN MEDIO SÓLIDO

1. Siembra en placa: Puede ser en superficie (utilizando espátula de Drigalski, ansa o hisopo) o por mezcla (el
inóculo con el medio de cultivo agarizado aún fundido, a temperatura de unos 45ºC, se mezclan y se vierte
en la placa de Petri).

Las placas se incuban invertidas, ya que la alta concentración de agua en el medio puede provocar condensación en
la tapa de la misma durante la incubación y si cae sobre la superficie del agar, se extiende dando un crecimiento
confluente. En medio sólido cada célula viable dará origen a una colonia y por lo tanto la siembra en placas se puede
utilizar, no solo para cultivar microorganismos, sino además para contar y aislar. En general cuando se quieren tener
colonias aisladas a partir de un material determinado, es necesario diluir la muestra en tubos con suero fisiológico
estéril.

2. Tubos con agar inclinado:

Previo a la siembra y con posterioridad a esta es importante pasar la boca del tubo (sin la tapa) por la llama del
mechero (flameado). Esta operación genera corrientes de convección que previenen que los contaminantes del aire
caigan dentro de los recipientes. El calentamiento puede también matar los microorganismos que se encuentren en
la boca de los recipientes. Para realizar la siembra se puede utilizar el ansa, realizando un movimiento suave sobre la
superficie del agar en forma de zigzag, desde el fondo hasta la parte superior, cuidando de no dañar el agar. También
se puede utilizar el ansa en punta. En este caso, se realiza la punción y luego
se siembra en la superficie de manera similar a lo descripto, pero
extremando los cuidados para no romper la superficie. Luego de la
incubación, se observará el aspecto general del medio y la aparición de
crecimiento sobre su superficie. Este tipo de siembra permite el cultivo de
microorganismos aerobios o anaerobios facultativos y además se utiliza para
almacenar cultivos durante cortos períodos de tiempo a temperaturas de 4ºC, o para la amplificación de un inóculo
pequeño.

CULTIVO EN MEDIO SEMISÓLIDO

Se utilizan tubos sin inclinar. Se siembra por picadura o punción utilizando un ansa en punta. Este tipo de medio
contiene una proporción menor de agar que los medios sólidos. El medio queda inoculado al introducir el ansa en
profundidad, pero sin tocar el fondo del tubo, retirándolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al
realizar la picadura.

En medio semisólido se podrá comprobar si el microorganismo es o no móvil, ya que en el primer caso se observará
que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura, detectándose turbidez (ver ejemplo tubo
1 de la figura Movilidad). Los microorganismos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de la picadura (ver ejemplo
tubo

2). Este tipo de siembra en picadura sirve, también, como otro método de conservación de microorganismos
anaerobios facultativos.
CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO
Habitualmente se realiza en tubos, frascos o erlenmeyers. Antes y después de realizada la siembra, se debe pasar la
boca del recipiente (sin tapa) por la llama del mechero (flameado). En los cultivos líquidos no tiene lugar la
formación de colonias, por lo tanto, no sirven como técnica de aislamiento. La utilización de medios de cultivo
líquidos permite la obtención de una población microbiana grande, con un elevado número de microorganismos,
para ser utilizados posteriormente. En estos cultivos se examinará la existencia de enturbiamiento más o menos
intenso, la formación de una película o velo sobre la superficie, la aparición de sedimento en el fondo del tubo, etc.

Formas de desarrollo en medios líquidos

1. Formación de película
2. Desarrollo con enturbiamiento leve.
3. Desarrollo con enturbiamiento intenso.
4. Sedimento en el fondo del tubo.

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO
Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población heterogénea de microorganismos. En hábitats
naturales raramente encontramos un solo tipo de microorganismo en una muestra, por lo tanto, es necesario hacer
algún procedimiento de aislamiento para separar e identificar los distintos tipos de microorganismos presentes. El
objetivo del aislamiento es obtener colonias bien separadas (las colonias se forman a partir de una sola “unidad
formadora de colonias” U.F.C) de las que se conseguirá un cultivo puro. Una vez obtenidos los cultivos puros se
podrán estudiar las características macroscópicas, microscópicas, fisiológicas, etc. de un microorganismo en
particular. Hay que tener en cuenta que siempre el aislamiento se da en un medio sólido. El medio líquido sirve para
enriquecer, pero no para aislar.

El aislamiento se puede lograr directamente a partir de una muestra cuando el o los microorganismos están en una
proporción adecuada. Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporción
en la muestra, o interesa un solo tipo de microorganismo, se lleva a cabo un procedimiento que involucra una
primera etapa de aumento del número de microorganismos del tipo que se desea aislar en relación al resto de la
población (enriquecimiento). Luego se aísla por el método de estrías o por dilución y se identifica.

Aislar es separar un tipo de microorganismo a partir de una población que lo contiene. En general
cuando se quieren tener colonias aisladas a partir de un material determinado, es necesario diluir la
muestra. En la práctica se puede aislar utilizando alguno de los siguientes procedimientos:

A) Aislamiento en placa por estrías

i) Agotamiento de ansa

ii) Depósito y posterior quemado

B) Aislamiento por dilución del medio líquido y posterior sembrado en medio sólido.
MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
INTRODUCCIÓN

Todas aquellas personas que, por su actividad laboral, tienen contacto directo con los alimentos durante su
preparación, fabricación, transformación, elaboración, envasado, almacenamiento, transporte, distribución, venta,
suministro y servicio, son consideradas MANIPULADORES DE ALIMENTOS.

Los microorganismos han sido responsables de la producción de gran parte de los alimentos que consumimos ya que
alteran los constituyentes de forma que los estabilizan permitiendo mayor duración; proporcionan compuestos que
confieren sabores característicos a los alimentos por ellos producidos. También son agentes alteradores y
responsables del deterioro de los alimentos.

Desde el punto de vista sanitario, los alimentos pueden ser vehículos de infecciones (ingestión de microorganismos
patógenos) o de intoxicaciones (ingestión de toxinas producidas por microorganismos). En este sentido se han
desarrollado las técnicas de control microbiológico de los alimentos.

Muchas veces la causa de contaminación del alimento se debe a medidas higiénicas inadecuadas en la producción,
preparación y conservación; lo que facilita la presencia y el desarrollo de microorganismos que producto de su
actividad y haciendo uso de las sustancias nutritivas presentes en éste, lo transforman volviéndolo inaceptable para
la salud humana. Por esta razón, es que una de las principales actividades en la conservación y elaboración de
alimentos es la reducción de la contaminación de los mismos.

Para poder llevar a cabo esta actividad es necesario lo siguiente:

 Identificar los agentes contaminantes y las fuentes de contaminación.

 Caracterizar el potencial tóxico de los agentes y de las sustancias contaminantes.
 Valorar en términos reales el impacto sobre la salud del consumidor.
 Controlar los niveles de los contaminantes en los alimentos.
 Establecer programas prácticos para las personas involucradas en todos los sectores de la cadena alimentaria
(productores primarios y secundarios; transportistas y distribuidores; organismos de control y consumidores).

CÓDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO

En nuestro país las normas relacionadas con el control en todos los aspectos de la producción de alimentos están
establecidas por la ley 18.284 que “Declara vigente en todo el territorio de la República Argentina, con la
denominación de Código Alimentario Argentino, las disposiciones higiénico-sanitarias, bromatológicas y de
identificación comercial del Reglamento Alimentario aprobado por Decreto 141/1953.”

En el CAPÍTULO I DISPOSICIONES GENERALES de dicho Código encontramos el Artículo 6 que estipula los siguientes
conceptos “A los efectos de este Código se establecen las siguientes definiciones:

Consumidor: Toda persona o grupo de personas o institución que se procure alimentos para consumo propio o de
terceros.

Alimento: toda substancia o mezcla de substancias naturales o elaboradas que ingeridas por el hombre aporten a su
organismo los materiales y la energía necesarios para el desarrollo de sus procesos biológicos. La designación
"alimento" incluye además las substancias o mezclas de substancias que se ingieren por hábito, costumbres, o como
coadyuvantes, tengan o no valor nutritivo.

Aditivo alimentario: Cualquier substancia o mezcla de substancias que directa o indirectamente modifiquen las
características físicas, químicas o biológicas de un alimento, a los efectos de su mejoramiento, preservación, o
estabilización, siempre que: a) Sean inocuos por sí mismos o a través de su acción como aditivos en las condiciones
de uso. b) Su empleo se justifique por razones tecnológicas, sanitarias, nutricionales o psicosensoriales necesarias. c)
Respondan a las exigencias de designación y de pureza que establezca este Código.
Alimento genuino o normal: Se entiende el que, respondiendo a las especificaciones reglamentarias, no contenga
sustancias no autorizadas ni agregados que configuren una adulteración y se expenda bajo la denominación y
rotulados legales, sin indicaciones, signos o dibujos que puedan engañar respecto a su origen, naturaleza y calidad.

(Res 205, 7.03.88) "Alimento alterado: El que por causas naturales de índole física, química y/o biológica o derivadas
de tratamientos tecnológicos inadecuados y/o deficientes, aisladas o combinadas, ha sufrido deterioro en sus
características organolépticas, en su composición intrínseca y/o en su valor nutritivo".

Alimento contaminado: el que contenga:

a) Agentes vivos (virus, microorganismos o parásitos riesgosos para la salud), sustancias químicas, minerales u
orgánicas extrañas a su composición normal sean o no repulsivas o tóxicas.

b) Componentes naturales tóxicos en concentración mayor a las permitidas por exigencias reglamentarias.

Alimento adulterado: El que ha sido privado, en forma parcial o total, de sus elementos útiles o característicos,
reemplazándolos o no por otros inertes o extraños; que ha sido adicionado de aditivos no autorizados o sometidos a
tratamientos de cualquier naturaleza para disimular u ocultar alteraciones, deficiente calidad de materias primas o
defectos de elaboración.

Alimento falsificado: El que tenga la apariencia y caracteres generales de un producto legítimo protegido o no por
marca registrada, y se denomine como éste sin serlo o que no proceda de sus verdaderos fabricantes o zona de
producción conocida y/o declarada.”

CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS
Un criterio microbiológico para alimentos define la aceptabilidad de un proceso, producto o lote de alimentos
basándose en la ausencia o presencia o el número de microorganismos y/o la investigación de sus toxinas por
unidad de masa, volumen o área.

Al establecer un criterio microbiológico se tienen en cuenta los siguientes factores:

 Evidencia epidemiológica de que el alimento en cuestión es un vehículo significativo de enfermedad.

 Susceptibilidad del alimento a ser contaminado por patógenos.
 Probabilidad de crecimiento microbiano en el alimento durante su manufactura, almacenamiento,
distribución y preparación.
 Tratamiento que recibe el alimento antes de ser consumido (p.e. proceso de cocción).  La susceptibilidad de
los probables consumidores a agentes patógenos y toxinas. Para establecer un criterio microbiológico se
debe definir previamente cuál será el propósito del mismo. Por ejemplo si se quiere evaluar la inocuidad
del alimento, se requiere la determinación de microorganismos patógenos y/o toxinas y en algunos casos la
utilización de microorganismos indicadores (relacionados con la presencia de un patógeno). O si se quiere
observar el cumplimiento de las Buenas Prácticas de Manufactura (BPM), la utilidad de un alimento como
ingrediente para un propósito determinado, o para establecer la fecha de vencimiento del producto.
La evaluación que se hace de la inocuidad de los alimentos y de su aptitud para el consumo humano a través
del cumplimiento con el criterio microbiológico designado para el producto en cuestión, puede referir a la
ausencia de patógenos o a la demostración de la aplicación de Buenas Prácticas de Higiene. Esto quiere decir
que no alcanzan solamente los criterios microbiológicos sino que también es de suma importancia verificar
la aplicación de las Buenas Prácticas de Manufactura u otros sistemas como HACCP (Hazard Analysis and
Critical Control Points) para asegurar que los microorganismos indeseables sean eliminados o minimizados a
un nivel tal que no puedan ocasionar daño a los seres humanos.

ELECCIÓN DE MICROORGANISMOS
Cuando se evalúa el riesgo microbiológico asociado a un alimento específico todos los microorganismos
transmisibles a través de los alimentos deben ser considerados incluyendo bacterias, virus, hongos, levaduras, algas
y parásitos.
Los riesgos asociados como las toxinas o metabolitos producidos por estos organismos y algunas propiedades
intrínsecas (por ejemplo la resistencia a antibióticos) deben también ser considerados en la evaluación.

La presencia de algunos microrganismos en los alimentos no es necesariamente un índice de riesgo para el

consumidor. Los vegetales y animales son la principal fuente de los alimentos que comemos y se encuentran
naturalmente asociados a microorganismos, lo que implica que los alimentos que se obtengan también estarán
asociados naturalmente a microorganismos. Los microorganismos elegidos para la elaboración del criterio deben ser
relevantes para el alimento y las circunstancias particulares (producto crudo o listo para consumir, perfil del
consumidor).

Si el criterio establece la búsqueda de microrganismos indicadores, su propósito debe ser detallado claramente, por
ejemplo, detectar la higiene inadecuada, indicar posible presencia de patógenos.

Es importante tener presente que, mientras para un alimento cocido o listo para consumir la tolerancia para un
determinado microorganismo es cero, sí se puede permitir la presencia del mismo en el alimento crudo – dentro de
ciertos niveles- si éste fuera sometido a cocción.

Dentro de los microorganismos que componen un criterio microbiológico se pueden distinguir dos tipos:

a) Organismos INDICADORES: para la evaluación de la inocuidad microbiológica de los alimentos. Suele utilizar
técnicas sencillas y accesibles que permiten evaluar:
- RECUENTO DE AEROBIOS MESÓFILOS
 Calidad de la materia prima
 Problemas de almacenamiento
 Abuso de temperatura
- ESCHERICHIA COLI – COLIFORMES FECALES
 Potencial contaminación fecal o posible presencia de patógenos
- STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA POSITIVA
 Contaminación por manipulación humana
- COLIFORMES, ENTEROBACTERIAS, S. AUREUS, ESTREPTOCOCOS FECALES
 Contaminación post tratamiento térmico

b) Organismos PATÓGENOS: aquellos que pueden encontrarse en el alimento en cuestión que pueden convertir al
alimento en un potencial vehículo de enfermedad a quien lo consuma.

MÉTODOS DE LABORATORIO
Los métodos de laboratorio utilizados para la detección o recuento de microorganismos forman parte del criterio
microbiológico. La elección del método a utilizar debe privilegiar a aquellos métodos estandarizados y de alta
sensibilidad que hayan sido validados por organismos internacionales o nacionales de referencia (Código Alimentario
Argentino, Art. 1413 y 1414).

Primeramente, para implementar cualquier método de detección, se requiere preparar las muestras del alimento, lo
que generalmente consiste en la elaboración de diluciones que permitan disminuir la concentración del
microorganismo en la muestra y poder observar mejor. Una vez que se han elaborado las diluciones se procede a la
utilización de cualquiera que sea el método seleccionado, por esta razón, abordaremos primeramente cómo
preparar estas diluciones.

Preparación de diluciones

Generalmente en el alimento o producto a analizar la bacteria que se quiere identificar está presente en cantidades
mucho mayores que otras con las que se encuentra mezclada. De tal manera que, se procede a elaborar una
solución madre que consiste en colocar una pequeña cantidad del alimento a analizar (1 gramo) en un tubo estéril
que contiene 10 ml de agua destilada estéril o agua peptonada bufferada 0.1% (dependerá del alimento con el que
se trabaja). A partir de la solución madre, se preparan diluciones en serie (10-1, 10-2, 10-3…) tal como se muestra en la
figura siguiente. La primera dilución (10-1) se obtiene transfiriendo con una pipeta estéril 1 ml de la solución madre a
un tubo que contiene 9 ml de agua destilada estéril, se agita. Luego tomamos 1 ml de esta suspensión y lo colocamos
en otro tubo de ensayo que contiene 9 ml de agua destilada estéril, obteniendo así la segunda dilución. Esta
operación se repite varias veces hasta lograr obtener una serie de diluciones (10 -1 a 10-6)

Como se ha visto anteriormente, se está tratando de reducir el número de microorganismos presentes en la muestra
de alimento, pero aún se desconoce cuáles son los microbios presentes, para esto suelen realizarse varios pasos, lo
que se conoce como etapa de aislamiento. El aislamiento es una etapa importante en el estudio de microorganismos
y comprende a la separación de aquél organismo de interés con respecto a otros que pueden estar presentes en la
misma muestra de alimento.

Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica del NMP
(Número Más Probable)

Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando como vehículo los
alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcionen como indicador de contaminación
fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia
similar a la de los patógenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo
coliforme constituye un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies
que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y
multiplicación fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como
indicador de contaminación fecal en agua; encontrándose que mientras mayor sea el número de coliformes en agua,
mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los
alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos
alimenticios han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), estos microorganismos
se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias.

Para su estudio, se dividen en dos grupos:

BACTERIAS COLIFORMES TOTALES El cual comprende a todos los bacilos Gram negativos aerobios o anaerobios
facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35 °C.
Este grupo está conformado por 4 géneros principalmente:

 Enterobacter

 Escherichia

 Citrobacter
  Klebsiella

COLIFORMES FECALES Está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con
producción de gas a las 48 h de incubación a 44.5 °C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la
más prominente es Escherichia coli. La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales.

La determinación de microorganismos COLIFORMES TOTALES por el método del Número más Probable (NMP), se
fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al
incubarlos a 35°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación
consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza
es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren
presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase
confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite
el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

La determinación del número más probable de microorganismos COLIFORMES FECALES se realiza a partir de los
tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y
producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5C por un periodo de 24 a 48 h. Finalmente, la
búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por
agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente
realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.

Microorganismos mesófilos aerobios

En este grupo se incluyen todos los microorganismos, capaces de desarrollar en presencia de oxígeno a una
temperatura comprendida entre 20°C y 45°C con una óptima entre 30°C y 40°C.

El recuento de microorganismos aerobios mesófilos, en condiciones establecidas, estima la microbiota total sin
especificar tipos de microorganismos.

Refleja la calidad sanitaria de los productos analizados, indicando además de las condiciones higiénicas de la materia
prima, la forma como fueron manipulados durante su elaboración. Un recuento bajo de aerobios mesófilos no
implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas, de la misma manera un recuento elevado no significa
presencia de patógenos. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables
recuentos elevados.

Un recuento elevado puede significar:

- Excesiva contaminación de la materia prima.

- Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración.

- La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos. - La inmediata alteración del producto.

En el uso o la interpretación del recuento de microorganismos aerobios mesófilos hay ciertos factores que deben ser
tenidos en cuenta:

- Este recuento es sólo de microorganismos vivos.

- La utilidad del indicador depende de la historia del producto y el momento de la toma de muestra. En
alimentos perecederos manipulados correctamente pueden desarrollar recuentos elevados y perder calidad si
son almacenados por un período de tiempo prolongado. En este caso, el recuento no se encontraría elevado por
la condición de higiene del producto, sino por la vida útil del mismo.

-Los procedimientos que sufre el alimento en su elaboración, por ejemplo un proceso térmico, pueden enmascarar
productos con altos recuentos o condiciones deficientes de higiene. Además, el almacenamiento prolongado en
congelación o con pH bajo puede producir una disminución del recuento.

- El recuento de mesófilos nos indica las condiciones higiénico sanitarias de algunos alimentos.

En la figura de abajo se muestra un esquema de la determinación de mesófilos aerobios en el laboratorio de

microbiología de alimentos. Comienza con la preparación de una solución madre en un medio buffer; luego se
realizan las diluciones correspondientes y se siembran 0.1 ml para poder hacer el cálculo de las unidades formadoras
de colonias (UFC). Es un método cuantitativo. Se siembra en superficie utilizando una espátula de Drigalsky en un
agar PCA (Agar para Recuento en Placa). Las placas sembradas se incuban a 35°C ± 1°C por 48 por más de 2 hs.

En la foto se puede observar el

desarrollo microbiano obtenido de
sembrar en superficie la muestra con
espátula de Drigalsky; en la placa de la
izquierda se nota abundante crecimiento
mientras que en la de la derecha, crecen
menor número de microorganismos.

FECHA DE VENCIMIENTO
La calidad de un alimento está determinada por aspectos sensoriales como el color, olor y sabor; por las
características nutricionales como la cantidad de vitaminas y minerales que contiene y por la seguridad alimentaria.

Podemos definir la vida útil de un alimento como el período de tiempo durante el cual ese alimento mantiene una
calidad adecuada siempre que se garanticen las condiciones de conservación que se indican en el etiquetado.

Para determinar la fecha de vencimiento se tiene en cuenta el proceso de degradación en el tiempo de un producto
alimenticio.

El criterio que se toma en consideración para fijar las fechas, en primer lugar, es la seguridad microbiológica dado
que la degradación está íntimamente relacionada con la estabilidad microbiológica que puede ser de corta duración
en alimentos frescos donde se puede observar directamente con un nivel de confianza determinado o de larga
duración en productos envasados y conservados donde la degradación debe ser acelerada bajo condiciones
experimentales como son las variaciones de la temperatura, la exposición al oxígeno o la presencia de la luz.

La fecha de caducidad y la fecha de consumo preferente son dos términos que hacen referencia a dos conceptos
diferentes.

 Fecha de caducidad: es aquella a partir de la cual un alimento deja de ser seguro para su consumo y puede
suponer un riesgo para la salud. El día que se indica en la fecha de caducidad aún se puede ingerir este producto sin
riesgos, pero deja de ser seguro al día siguiente.

Se determina en aquellos alimentos microbiológicamente muy perecederos que constituyen serios problemas de
salud después de un corto período de tiempo. En el envase debe figurar DÍA-MES-AÑO

 Fecha de consumo preferente: indica hasta qué fecha un alimento conserva todas sus propiedades (sabor,
textura…) siempre que se hayan seguido las indicaciones sobre su conservación y almacenaje y no se haya abierto. A
partir de esta fecha, el producto puede haber perdido alguna de sus propiedades, sin embargo, es perfectamente
válido para el consumo sin que ello suponga ningún riesgo para la salud. Normalmente, los productos también
indican en cuantos días se debe consumir una vez abierto y las condiciones de conservación.

En el envase deben aparecer las siguientes leyendas:

“Consumir preferentemente” antes de…………….  FECHA INCLUÍDO EL DÍA

“Consumir preferentemente” antes del fin de

Menos de 3 meses DÍA y MES. Entre 3 y 18 meses MES y AÑO. Mayor a 18 meses AÑO