GLOSARIO:

SENSIBILIDAD: capacidad para una metodología de dispendio o diferenciar pequeñas

variaciones en la concentración de un analito.

ESPECIFICIDAD: es la probabilidad de que un sujeto sano tenga un resultado negativo en la

prueba es decir, la especificidad caracteriza la capacidad de la prueba para detectar la ausencia de
la enfermedad en sujetos sanos.

PRECISIÓN: la dispersión del conjunto de resultados que se obtiene a partir de las realizaciones
repetidas de una misma prueba: a menor dispersión mayor precisión.

TEMA 6: INTRODUCCIÓN AL INMUNOANÁLISIS

Es una prueba que utiliza inmunocomplejos cuando se unen los anticuerpos y los antígenos. Utiliza
complejos de anticuerpo y antígeno como medio para generar un resultado fácilmente medible.

Se utilizan anticuerpos específicos para detectar analitos ( presentes en el cuerpo naturalmente

como las hormonas o no presentes naturalmente como los antígenos frente al cáncer o los que no
existen en el cuerpo como las drogas ).

PRINCIPIO: se basa en la reacción de unión que se da entre la sustancia que actúa como antígeno
y un anticuerpo específico contra dicha sustancia.

Se pueden utilizar dos tipos de anticuerpos los policlonales y los monoclonales.

En función del tipos de sustancia para el marcaje se clasifican en : radioinmunoanálisis,

enzimoinmunoanálisis, fluroinmunoanálisis y luminoinmunoanálisis.

HETERÓGENO: medir el grado de reacción inmunológica separando los complejos antígeno-

anticuerpo formados del resto de los componentes.

HOMOGÉNEOS: se realiza la media en la matriz original de reacción aprovechando que dicha

unión afecta a la actividad catalítica del conjugado.

En función de las disponibilidad del reactivo se clasifican en competitivos y no competitivos.

En función del marcador empleado se puede generar una reacción colorimétrica, ultravioleta,
fluorescente, quimioluminiscente…

INMUNOANÁLISIS HOMOGÉNEOS: no requiere la separación física de las sustancias

reaccionantes en fracción ligada y fracción libre. Son de fácil automatización y se usan
preferentemente en la detección de drogas y hormonas.el compuesto marcado se comporta de
manera distinto si esta unido a un anticuerpo o si no lo esta.

INMUNOANÁLISIS HETEROGÉNEO: el complejo marcado se comporta de semejante forma

si esta o no unido a un anticuerpo, por lo que se deben separar las fracciones ligadas y libre.
Presentan mayor sensibilidad y especificidad. Requieren un mayor tiempo de análisis y tienen
menor precisión.

MÉTODOS PARA SEPARAR LAS FRACCIONES LIGADA Y LIBRE:

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ADSORCIÓN: con carbón activo, dextrano o resinas, los cuales unen la fase libre pero no a los
Ag-Ac que quedarían en solución, los cuales quedan en el sobrenadante después de la
centrifugación, sedimentando el compuesto.

PRECIPITACIÓN QUÍMICA: el etanol, propilenglicol o el sulfato amónico alteran la solubilidad

de las proteínas provocando la precipitación de el complejo ligado.

PRECIPITACIÓN INMUNOLÓGICA: se utiliza un anticuerpo contra el anticuerpo primario.

Tiene gran tamaño y carácter insoluble, y precipita fácilmente. Al centrifugar lo la fracción ligada
permanece en el sedimento. Se utiliza en RÍA.

FASE SÓLIDA: se inmoviliza el anticuerpo en un soporte sólido, la separación se da aspirando el

medio de incubación. Es sencillo, rápido y automatizable.

En función de la disponibilidad de reactivo hay competitivos y no competitivos. La medición del

analito se logra usando ambos.

COMPETITIVO: se utiliza una cantidad limitada de anticuerpos, el antígeno compite con otro Ag
marcado por unirse a los Ac. Cuanto mayor sea la cantidad de Ag de la muestra, menor será el Ag
ligado.

Se emplean un antisuero con anticuerpos específicos no marcados, una muestra del paciente con
el antígeno a valorar no marcado, y unos antígenos marcados con capaz de unión al Ag.

o UN SOLO PASO: el reactivo del antígeno marcado y el antígeno de la muestra compiten

por una cantidad limitada de anticuerpo.

o DOS PASOS: la concentración de anticuerpos se encuentra en exceso respecto a la

concentración de antígenos, esto se incuba y en un segundo paso se agrega el antígeno
marcado. Tiene mayor sensibilidad.

NO COMPETITIVO O DE SÁNDWICH: existe un exceso de anticuerpos que se encuentra

ligado a una fase sólida. El Ag de la muestra reacciona con dos anticuerpos diferentes de forma que
queda unido a modo de sándwich entre ambos.

Se emplean un antisuero de captura, con anticuerpos no marcados específicos del Ag a determinar

unidos a una fase sólida; una muestra del paciente con el Ag no marcado; y un antisuero señal con
anticuerpos marcados y libres, capaces de unirse a un segundo lugar antigénico del Ag.

El marcaje que se obtiene en este tipo de ensayos es directamente proporcional a la concentración

de Ag.

Si es a dos pasos se emplean etapas de lavado en las que se aísla y se lava el complejo sándwich
para eliminar el exceso del reactivo marcado no unido y cualquier otra sustancia que interfiera. Este
tiene mayor especificidad y sensibilidad.

MARCADOR O TRAZADOR: es una molécula que reacciona como parte del ensayo, produce
un cambio en la señal de la misma. Se usa para medir la concentración del analito.

Las características básicas son : ser inmunológicamente similares al compuesto problema, para que
compitan por los sitios de unión de los Ac; y ser detectados sin que haya interferencias por parte
de la matriz biológica.

o RADIOINMUNOANÁLISIS: incluyen compuesto radioactivo.

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 o ENZIMOINMUNOANÁLISIS: enzimas que hacen que cambie el color de una solución.
o FLUOROINMUNOANÁLISIS Y LUMINOINMUNOANÁLISIS: sustancias que
producen luz.

RADIOINMUNOANÁLISIS: es posible la detección de moléculas a baja concentración como

no/ml y pg/ml. Se puede cuantificar cualquier sustancia que se comporte como Ag, es decir, que
sea capaz de desarrollar la producción de Ac. Son métodos heterogéneos, es decir, se separa la
fracción libre de la ligada.

RIA COMPETITIVO: reacción Ag-Ac en el que se va a producir una competición de dos

sustancias antigénicas iguales. Los Ac son específicos contra la sustancia que queremos determinar
y tener una gran afinidad.

La cantidad de anticuerpos añadida al análisis es limitada e inferior a la cantidad de Ag total, por lo

que la mezcla va a quedar saturada con el.

Además del Ag presente en la muestra, el cual es Ag frío o no marcado, se añade una cantidad
constante y conocida de antígeno marcado, también llamado Ag caliente, los cuales compiten por
unirse con el Ac disponible.

La concentración del Ag no marcado es variable, cuanto mayor sea más desplazara al Ag caliente
fijándose menores cantidades de este.

MARCADORES RADIACTIVOS: los isótopos utilizados poseen las características de actividad

específica elevada, producción de energía alta, vida media adecuada, fácil obtención y que no se
acomplejen durante su acoplamiento a la molécula de ligado.

Las radiaciones usadas en ecografía y resonancia magnética son no ionizantes.

Los emisores utilizados para el radioinmunoanálisis son los de tipo ß, como el tritio (3H) o los
emisores de radiaciones gamma como el yodo. Los Ag marcados se forman sustituyendo algunos
de los átomos normales del Ag por los isótopos radiactivos.

SEPARACIÓN DE LAS FASES LIGADA Y NO LIGADA: par calcular la concentración del

analito hay que separar las dos fases.

o FRACCIÓN LIBRE: constituida por Ag frío y Ag marcado.

o FRACCIÓN LIGAD: formada por complejos Ag-Ac y antígeno marcado-anticuerpo.

La radiactividad permanece constante, por eso se separan las fases.

INSTRUMENTOS DE MEDIDA: se mide en cuentas por minuto, CPM.

o DETECTORES DE IONIZACIÓN: tienen una cámara donde existe un gas inerte, que
en presencia de la radiación se ioniza y se transforma en corriente eléctrica cuya intensidad
es proporcional a la energía de las radiaciones.
o DETECTORES DE CENTELLEO: formado por un cristal de yoduro potásico o yoduro
sódico, el cual al llegar la radiación desprende fotoelectrones.

CONSTRUCCIÓN DE CURVA PATRÓN: se aplica en tubos que contienen cantidades

conocidas de la hormona a determinar.

El primer tubo no tiene Ag no marcado, este punto de máxima unión de Ag marcado se llama B0
o Bmáx, representando la radiactividad máxima. El resto de tubos tienen concentraciones
conocidas cada vez mayores de Ag no marcado.

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Los resultados permiten constituir una curva patrón representando la radiactividad obtenida en
estos tubos frente a las concentraciones conocidas de Ag no marcado contenida en cada tubo. La
concentración de hormona en las muestras problema se calcula interpolando en esta curva patrón
la medida de radiactividad obtenida para cada tubo problema.

IRMA: marcar el Ac para evitar la pérdida de estabilidad y eficacia que sufre el Ag al ser marcado
radiactivamente.

IRMA COMPETITIVO O DE INHIBICIÓN: se incuba el Ag que se encuentra unido al tubo de

reacción con la muestra del paciente que contiene el Ag problema, añadiendo el Ac marcado. Se
darán dos complejos, el Ag problema-Ac marcado que se encuentra en solución y Ag en fase sólida-
Ac marcado que queda unido al tubo. Mediante el lavado se elimina la fracción soluble, midiendo
la radiactividad del complejo Ag-Ac* en la fase sólida, esto es inversamente proporcional a la
cantidad de antígeno presente en la muestra del paciente.

IRMA NO COMPETITIVO O DE TIPO SÁNDWICH: se incuba el Ac unido a una fase sólida

en exceso con el Ag problema. Se formara un complejo Ag-Ac que se incuba con un segundo Ac
marcado. Se obtiene un complejo Ac-Ag-Ac*. La separación del Ac marcado no unido se realiza
mediante decantación y lavado y posteriormente se realiza el contaje.

APLICACIONES: se usa para determinar hormonas, vitaminas, neuropéptidos… que se

encuentran en pequeñas concentraciones en los fluidos biológicos.

o VENTAJAS: especificidad, sensibilidad y reproducibilidad.

o DESVENTAJAS: equipos especiales, isótopos radiactivos.

TEMA 7: INMUNOENSAYOS

ENZIMOINMUNOANÁLISIS ( EIA ): técnica inmunoquímica cuantitativa basada en reacciones

Ag-Ac. El marcaje se realiza con una enzima, y su cuantificación es basándose en la medida de la
actividad de la enzima marcadora. Al añadir un sustrato que es catalizado por la enzima se forma
un complejo coloreado, el cual se mide en el espectrofotómetro. Se realiza una curva patrón para
poder calcular la concentración de la molécula problema.

Para aumentar la sensibilidad se utiliza el sistema biotina- estreptavidina, que actúa como
mecanismo multiplicador. El Ac está unido a varias moléculas de biótica, las cuales se unen a varias
moléculas de estreptavidina que a su vez se unen a la enzima.

Las ventajas es que no utilizan compuestos radiactivos, son procedimientos analíticos de gran
sensibilidad y especificidad, y son adaptables a las características de cualquier laboratorio. Detectan
concentraciones de nano gramos y picogramos, y se pueden automatizar.

Se usa una fase sólida que separa la fracción ligada y la fracción libre.

EIA HOMOGÉNEO: no se separan las fracciones ligada y libre. Los reactivos son Ac y Ag
marcado con la enzima. Cuando el Ag marcado se une al Ac, impide el acceso del sustrato al centro
activo de la enzima, por lo que anula su actividad. Cuanta mayor sea la concentración de la molécula
problema, menor será la cantidad de Ag marcado que se unirá al Ac, quedando mayor cantidad de

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Ag marcado libre produciendo mayor actividad. Un tipo es EMIT ( técnica enzimoinmunoanálisis
multiplicado ).

EIA HETEROGÉNEO: se separan las fracciones ligada y libre. Los reactivos son el anticuerpo y
el antígeno marcado con la enzima. Cuanto mayor sea la cantidad de Ag en la muestra mayor
cantidad de Ag marcado con la enzima quedara sin unirse al Ac. La actividad de la enzima no se
anula por la unión Ag-Ac. La actividad será inversamente proporcional a la cantidad de Ag en la
muestra.

ELISA: se usa una fase sólida como método de separación. Se usan Ag o Ac marcados con una
enzima. La reacción Ag-Ac queda inmovilizada en el soporte. La enzima es capaz de modificar a
un sustrato específico en presencia de un cromógeno, produciendo un color.

o ELISA DIRECTO:
1. Fijación al soporte insoluble («tapizado») de antígenos específicos del estudio.
2. Lavado para eliminar los antígenos no fijados.
3. Adición de anticuerpos marcados («conjugados») con una enzima.
4. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
5. Adición de un sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.

o ELISA INDIRECTO:
1. Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de
estudio.
2. Lavado para eliminar los antígenos no fijados.
3. Adición del suero problema y reacción de los anticuerpos con los antígenos fijados al
soporte.
4. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
5. Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con el
complejo Ag-Ac anterior.
6. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
7. Adición de un sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.

ELISA SÁNDWICH: se recubre el pocillo con el anticuerpo. Se aplica la muestra que contiene el
Ag y después un segundo Ac. Es muy específico y sensible debido a el segundo anticuerpo.

o DAS:
1. Fijación al soporte insoluble de los anticuerpos específicos del analito a detectar.
2. Lavado para eliminar los anticuerpos no fijados.
3. Adición de la muestra problema que contiene el antígeno.
4. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra
no fijados.
5. Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo
diferente al de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con
una enzima.
6. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
7. Adición del sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.

o HADAS:
1. Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del analito a detectar.
2. Lavado para eliminar los anticuerpos no fijado.
3. Adición de la muestra problema. El antígeno reaccionara específicamente con los
anticuerpos fijados al soporte.

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 4. Lavado.
5. Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo
diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte).
6. Lavado.
7. Adición de anticuerpos conjugados con una enzima, anti anticuerpos empleados en el
paso anterior.
8. Lavado posterior.
9. Adición del sustrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora.

ELISA COMPETITIVO:
1. Fijación al soporte insoluble anticuerpos específicos frente al analito.
2. Lavado.
3. Adición de la muestra problema con el Ag y ese mismo Ag marcado.
4. Lavado.
5. Adición de sustrato que actúe sobre la enzima marcadora.

LECTURA E INTERPRETACIÓN: es colorimetrica y se refleja mediante valores de absorvancia

o densidad óptica.

FLUOROANÁLISIS: se usan complejos fluorescentes para el marcaje de los inmunocomplejos.

Sus características son una intensidad fluorescente elevada que permanece inalterable tras su unión
a los Ag o Ac.

FPIA, POLARIZACIÓN FLUORESCENTE: es de tipo competitivo en fase homogénea, se usa

par la cuantificación de analitos que se encuentran en baja concentración. Consiste en poner en
contacto un Ac específico capaz de reconocer al Ag presente en la muestra, con una cantidad
conocida del mismo Ag marcado con fluorescencia. A menor cantidad de analito mayor es la señal.

o FLUORESCENCIA.
o ROTACIÓN DE MOLÉCULAS EN LA SOLUCIÓN: las más grandes rotan más lento
que las más pequeñas.
o LUZ POLARIZADA: distingue el Ag-fluoresceina del Ag-fluoresceiuna-Ac. Las moléculas
libres emiten luz no polarizada y las marcadas polarizada.

LUMINOINMUNOANÁLISIS: se emplean sustancias luminiscentes como marcadores para

detectar la formación del complejo Ag-Ac.

o ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA (MEIA): la emisión de luz es por la oxidación

de un compuesto marcador de tris de reteñía en la superficie de un electrón.

o INMUNOENSAYO MAGNÉTICO QUIMIOLUMINISCENTE (CMIA): se emplean

macropartículas magnéticas con anticuerpos de captura en su superficie para ligar el Ag a
determinar y los Ac marcados.

LIMITACIONES: los inmunoensayos deven ser exactos y precisos. Si un ensayo tiene la capacidad
de generar resultados con exactitud y en forma reproducible que no produzca falsos positivos,
entonces se considera específico. Si la calibración no es correcta los resultados del paciente
correspondiente no serán correctos. Efecto matriz el cual es el conjunto de alteraciones ocasionadas
por los diversos componentes de la muestra a excepción del analito a determinar. El efecto hook
o gancho se produce cuando la concentración del Ag a determinar es elevada y uno o ambos Ac
quedan saturados antes de que se forme el sándwich, induciendo resultados falsamente
disminuidos, este en concentraciones elevadas se denomina efecto prozona.