TEMA 3 – APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE RADIOINMUNOANÁLISIS

CONCEPTOS Y FUNDAMENTOS TEORICOS DE RADIOINMUNOANÁLISIS

El RIA permite el análisis cuantitativo de sustancias biológicas que se encuentran en muy baja
concentración en diversos fluidos biológicos como sangre, orina o saliva.

El RIA combina la especifidad de las reacciones inmunes (reacción Ag-Ac) y la sensibilidad de

los métodos radioisotópicos.

*Para la cuantificación de Ag o Ac en una muestra problema.

CONCEPTO Y FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LOS INMUNOANALISIS

El radioinmunoanálisis (RIA) consiste en una técnica de laboratorio de análisis clínico. Usa

isótopos radioactivos, es in vitro.

Cualquier sustancia del organismo puede ser considerada un antígeno, y podemos crear
anticuerpos que servirán para medir hormonas, vitaminas, marcadores tumorales o fármacos
del organismo.

Los inmunoanálisis pueden subdividirse en dos clases principales:

 Tipo I: se emplea un exceso de anticuerpo sobre el elemento analizado y se marca el

anticuerpo reactivo. Tras la reacción con la sustancia problema, la fracción que no ha
reaccionado es separada y se determina la actividad de la fracción restante.
 Tipo II: la cantidad de anticuerpo es menor que la del elemento analizado y se marca la
sustancia analizada.

Los inmunoensayos pueden ser:

- Homogéneos: el compuesto marcado se comporta de forma diferente según este libre o

ligado y, por tanto, no es necesaria la separación física de las dos fracciones.
- Heterogéneos: si es necesaria la separación de fracciones, al no comportarse de forma
diferente.

Existen además métodos inmunoanalíticos análogos al RIA.

- enzimoinmunoanálisis (EIA) o análisis inmunoenzimático (IEMA).

- fluoroinmunoanálisis (FIA).
- luminoinmunoanálisis (LIA).
- quimioluminoinmunoanálisis (QIA).

En el RIA existen dos categorías, ambos inmunoensayos heterogéneos:

- radioinmunoanálisis (RIA) competitivo.

- y ensayo inmunorradiométrico o IRMA.

FUNDAMENTOS TEÓRICOS DE LOS RADIOINMUNOANÁLISIS

*RIA: Los Ag del paciente competirán con los Ag marcados por ocupar un espacio en el Ac
específico.
El RIA competitivo, clásico o en equilibrio: una unidad desconocida de sustancia, denominada
ligando nativo (L) que en RIA se corresponde con la sustancia antigénica presente en la
muestra que hay que determinar, y una cantidad conocida de la misma sustancia antigénica
pero marcada con el radioisótopo, denominada, ligando marcado (L*) o trazador, compiten
por una limitada cantidad de anticuerpos.

Después de una incubación, ligando nativo, no marcado (L), ligando marcado (L*), ligando
nativos unidos a anticuerpos (L-Ac) y ligandos marcados unidos a anticuerpos (L*-Ac) y
anticuerpos libres (Ac) según muestra la reacción siguiente:

L + L* + Ac  L + L* + Ac + L-Ac + L*-Ac

Una vez se separan los ligandos que están unidos (L-Ac + L*-Ac) de los ligados libres (L+L*), se
determina la relación existente entre ellos (B/F).

Por comparación con diferentes estándares (curva de calibración) puede determinarse la

cantidad desconocida de la sustancia problema.

Como variantes del RIA competitivo encontramos los RIA de no equilibrio: RIA secuencial y RIA
de desplazamiento.

En el RIA clásico, la radiactividad presente en el complejo Ag*-Ac (B) es inversamente

proporcional a la cantidad de ligando nativo (L) o Ag de la muestra.

En el caso del IRMA, el ligando nativo (L) reacciona con dos anticuerpos (Ac1 y Ac2) que se fijan
a distintas partes (epítopos) del antígeno. Uno de los Ac está fijado a un soporte sólido (tubo,
bolita) (Ac1) para facilitar la posterior separación de la fase unida o ligada, y el otro es el que
está marcado (Ac2*). Después de una incubación se produce la reacción siguiente:

L + AC1 + AC2*  AC1-L-AC2* + AC2*

*EN RESUMEN  En el RIA competitivo, el ligando nativo (L) compite con el ligando marcado
(L*) por unirse al anticuerpo (AC). En el RIA no competitivo (IRMA), el ligando nativo (L)
reacciona con dos anticuerpos (Ac1 y Ac2*).

Como variantes del IRMA tenemos el IRMA competitivo o de inhibición y el IRMA no

competitivo tipo sándwich.

*IRMA: Los Ag del paciente serán puestos en la mitad de 2 Ac, uno marcado y otro no.

Reactivos principales. Antígenos, anticuerpos y trazadores. Soluciones patrón o estándares.

Tubos de control. Tampones. Curva de de calibración o estándar.

En la ejecución práctica de un RIA necesitamos una serie de reactivos, aparte de la muestra,

como son el trazador, el anticuerpo, los estándares que constituyen la curva de calibración y
los reactivos para efectuar la separación de la fracción libre de la unida, una vez que se ha
producido la reacción.

El ligando nativo (L)

Nos referimos, por un lado, a la sustancia que queremos determinar en la muestra (Lm) y, por
otro, a los patrones o estándares (Lp) que nos van a permitir construir la curva de calibración
del ensayo y, por tanto, conocer la cantidad de sustancia analizada presente en la muestra.
En relación con el ligando nativo presente en la muestra (Lm), conviene añadir que, en
ocasiones, las muestras (suero, plasma, orina) no pueden ser utilizadas directamente en el
ensayo y deben ser sometidas a unos procesos previos.

Los patrones o estándares (Lp) son soluciones de concentraciones conocidas frente a las que
se van a comparar las muestras.

El ligando marcado (L*)

En el RIA clásico el L* es una sustancia similar a la que se quiere determinar, salvo que está
marcada con un radioisótopo, mientras que en el IRMA es el anticuerpo frente a la sustancia a
determinar la que está marcada con el radioisótopo. En ambos casos, lo denominamos
trazador o marcada.

Los marcadores radioisótopos más utilizados son el 125I *buscar proteínas (para antígenos
proteicos) y el 3H (para antígenos no proteicos y sobre todo hormonas esteroideas), aunque
para ensayos concretos pueden utilizarse otros.

El ligando marcado (ya sea el Ag o el Ac marcados) debe ser de gran pureza y tener una alta
actividad específica (Bq/g).

El anticuerpo (Ac)

El anticuerpo empleado en RIA clásico se suele denominar antisuero) debe ser altamente
específico y ser incapaz de discriminar entre el ligando nativo y el ligando marcado, además de
tener alta afinidad de combinación.

La producción de los mismos debe ser minuciosa. Pueden ser producidos in vivo (inmunizando
a un animal de experimentación y obteniendo los anticuerpos generados por el sistema
inmune del animal) o in vitro (la más empleada). Permite obtener gran cantidad de anticuerpos
monoclonales y de gran especificidad.

Los antisueros o Ac deben reunir unas características:

 Título de anticuerpo: es aquella dilución del anticuerpo que liga el 50% del antígeno
marcado (L*) bajo unas condiciones determinadas.
 Afinidad del anticuerpo: es la fuerza con la que el anticuerpo liga al antígeno.
 Especificidad del anticuerpo: es la capacidad de un anticuerpo de distinguir entre varios
antígenos de estructuras similares.

Recepción, conservación y almacenamiento de muestras biológicas. Manejo básico del

laboratorio.

Todo proceso analítico se compone, en principio, de tres fases: (1) toma de muestra, (2)
proceso analítico propiamente dicho y (3) comprobación de los resultados analíticos.

En los análisis de RIA la toma de muestra será, habitualmente, la extracción de sangre, que se
hará y, en algunas ocasiones, la recogida de orina; y la muestra, la mayor parte de las veces,
debe ser de suero o plasma.

La conservación del material de examen es difícil. El suero y el plasma pueden conservarse

hasta 24h a 4ºC y con el recipiente cerrado. Si se pretende conservarse más de 24h se deben
congelar.
Una vez que las muestras han sido preparadas y almacenadas quedarán congeladas hasta que
se vaya a realizar el proceso analítico. Para realizar este habrá que descongelar las muestras
para que estén en estado líquido y a temperatura ambiente en el momento de su utilización.

EL PROCEDIMIENTO ANALÍTICO. LAS FRACCIONES DE UN ENSAYO. UNIDA Y LIBRE.

SISTEMAS DE SEPARACIÓN. TÉCNICAS DE ADSORCIÓN, INMUNOABSORBENTES,
PRECIPITACIÓN NO ESPECÍFICA, FILTRACIÓN EN GEL Y DOBLE ANTICUERPO ENTRE
OTRAS.
Los métodos de partición

Una vez que se ha establecido la reacción entre el ligando (L), el ligando marcado (L*) y el
anticuerpo (Ac) formando complejos, las fases libres (F) y ligadas (B) deben ser separadas para
contar su radiactividad. Mediante el proceso llamado partición.

El método ideal debe: (1) conseguir una completa separación de la fracción ligada (B) y libre
(F); (2) que no se vea influenciado por las diversas sustancias presentes en la reacción, (3) que
sea reproducible, sencillo, barato y técnicamente rápido y (4) que no interfiera en la reacción
Ag-Ac.

Los numerosos métodos que consiguen estos objetivos se basan en las diferentes propiedades
fisicoquímicas.

 Métodos de absorción del antígeno libre: consistente en la absorción del antígeno libre en
la superficie porosa de diversas sustancias como el carbón activo, silicatos (talco) y resinas
de intercambio iónico. La separación de ambas fases se produce mediante una posterior
centrifugación y decantación del sobrenadante.
 Métodos de precipitación inespecífica del complejo Ag-Ac: concentraciones elevadas de
sales inorgánicas, polietilenglicol o etanol, atrapan las moléculas de agua de la solución,
insolubilizando el complejo Ag-Ac y precipitando. La separación de ambas fases se produce
mediante una posterior centrifugación y decantación del sobrenadante.
 Métodos de precipitación específica del complejo Ag-Ac (método del doble anticuerpo y
método de la proteína A): el método del segundo anticuerpo es la técnica de separación
con mayor éxito en RIA. Consiste en la adicción de un segundo anticuerpo dirigido contra
el anticuerpo del antisuero de tal forma que se produce un complejo Ag*-Ac1-Ac2 que es
insoluble y precipita. La separación de ambas fases se produce mediante una posterior
centrifugación y decantación del sobrenadante.
El método de la proteína A utiliza una proteína adosada a la pared celular de la bacteria
Staphylococcus aureus que se une a la región Fc de la IgG humana formando complejos
que hacen que este precipite y se pueda separar mediante centrifugación y decantación.
 Métodos de separación en fase sólida: El anticuerpo esta absorbido o ligado
químicamente a una matriz sólida insoluble. Los sistemas más empleados son los tubos
revestidos de anticuerpo y los anticuerpos absorbidos a esferas o discos de plástico. La
separación física de las fracciones libre (F) y ligada (B) se hace mediante el lavado de los
tubos, las bolitas o los discos.
 Otros métodos: aunque actualmente menos usados, la separación de la fracción unida y
libre puede hacerse mediante filtración en gel, electroforesis, gel de poliacrilamida o
cromatografía.
 En definitiva, en la partición se separarán la fracción libre (F) de la unida (B) con objeto de
poder cuantificar una de ellas de forma individualizada.

El procedimiento analítico

Realización del ensayo

1. Preparación de la muestra y de los reactivos

Por lo general, antes de la realización del ensayo la muestra debe ser descongelada y puesta a
temperatura ambiente, los reactivos deben ser reconstituidos, ya que suelen venir liofilizados
(ultracongelados) para una mejor conservación.

2. Dispensación de los volúmenes de muestras y reactivos

En los tubos de ensayo en los que se ejecuta el RIA se dispensarán (pipetearán) los diferentes
componentes del ensayo:

Muestra problema (Lm) o de la curva patrón (Lp), antígeno marcado (L*) y antisuero (Ac).

Todas las determinaciones se harán por duplicado y, además, es imprescindible disponer de un

“blanco”.

La curva patrón se prepara al mismo tiempo que el análisis de las muestras problema,
aplicando la técnica a una serie de tubos que contienen cantidades conocidas de la sustancia a
determinar (antígeno no marcado patrón Lp) y las mismas cantidades de L* y de Ac que se
usan en el análisis: en el primer tubo no hay antígeno no marcado (L), por lo que todos los
centros de unión del anticuerpo serán ocupados por el antígeno marcado (L*). A este punto de
máxima unión del antígeno marcado se llama B0 o Bmáx, que representa la radiactividad
máxima que se puede unir. Los siguientes tubos tienen concentraciones conocidas cada vez
mayores de sustancia a determinar: a mayor concentración de antígeno no marcado (Lp),
menor formación de complejos L*- Ac, ya que ambos antígenos compiten por unirse al
anticuerpo.

3. Incubación

Las condiciones en que se realiza la incubación dependen del ensayo en concreto aunque en
general la unión aumenta conforme la temperatura aumenta.

4. Separación de las fracciones libre y unida

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, las fracciones libres (F) y ligada (B) han de ser
separadas mediante el proceso de partición para poder cuantificarlas de forma individualizada.

5. Contaje de la radiactividad de las muestras

La fracción que se cuenta es la unida (B) y el resultado se expresa en cuentas por minuto
(cpm). Para leer la radiactividad de la fase ligada se utiliza un contador gamma si el isótopo
utilizado es 125I o un contador beta en el caso de que se utilice tritio (3H).

6. Cálculo de la curva patrón

Los resultados de las medidas obtenidas con los diferentes patrones se relacionan con las
concentraciones conocidas y reales de dichos patrones, con objeto de obtener una gráfica que
no es más que la representación de la relación matemática existente entre la variable
dependiente (concentración) y la independiente (radiactividad).

El cálculo de la curva patrón se puede hacer utilizando un ordenador ya que, tanto los
contadores gamma como los beta disponen de programas informáticos para hacer todos los
cálculos de forma automática, representar la curva patrón y leer en ella muestras problema,
mostrando directamente los resultados finales de análisis.

7. Lectura de los resultados

La lectura de la concentración de la sustancia determinada en la muestra se calcula

interpolando en la curva patrón la medida de radiactividad obtenida para cada tubo problema.

Es posible automatizar o semiautomatizar todo el proceso descrito del ensayo. Para ello se
utilizan equipos como el RIA-Mat®, que consta de diversos módulos que permiten la
dispensación automática de los reactivos y las muestras, la incubación, el lavado de los tubos,
el contaje de la radiactividad de cada uno de los tubos, la creación de la curva patrón y la
lectura de cada una de las muestras. Con ello, la labor del Técnico en Imagen para el
Diagnóstico es la de colocar los reactivos y muestras en unas posiciones predeterminadas,
programar el equipo, supervisar las tareas programadas y, finalmente, recoger los resultados.

8. Control del ensayo

En cada ensayo se debe realizar el control de la ejecución y de los resultados. Estos controles
pueden realizarse utilizando muestras de control y a través del análisis de la curva patrón.

En el primer caso se utilizan muestras de control obtenidas comercialmente (control externo) o

preparadas de sueros control en el propio laboratorio (control interno).

La evaluación de la curva control utiliza una serie de parámetros deben mantenerse constantes
en evaluaciones repetidas y son índices del estado y comportamiento de los distintos
reactivos, condiciones ambientales, equipos y técnicas usadas en los procedimientos.

CONTADORES DE POZO. CARACTERÍSTICAS. MANTENIMIENTO Y CALIBRACIÓN

Los equipos que permiten detectar y medir las emisiones radiactivas se denominan contadores
y la detección de la radiación se basa en los efectos que directa o indirectamente, produce ésta
al atravesar la materia. Es decir, no detectaremos la radiación, pero si sus efectos, y estos nos
permiten detectarla y medirla.

En RIA se utilizan los contadores centelleo que están basados en la propiedad que tienen
algunas sustancias de ser fluorescentes. Es decir, la propiedad de emitir en forma de luz la
energía absorbida procedente de la radiación.

Los detectores de centelleo pueden ser de dos tipos: de centelleo sólido o de centelleo líquido.

1. Detectores de centelleo sólido: contador gamma

El material fluorescente que se utiliza es un cristal de yoduro sódico activado con talio INa (T).

Está especialmente indicado para el contaje de emisiones gamma y por ello también se le
denomina contador gamma.
Para el contaje de la muestra radiactiva en este tipo de contador solo es necesario colocar la
muestra en el interior del cristal de centelleo que tiene forma de pozo, y de aquí que también
se denominen contadores de pozo. Para colocar la muestra en el interior del pozo se utiliza un
tubo de ensayo o tubo de contaje.

2. Detectores de centelleo líquido: contador beta

Dado que las emisiones beta β tienen escaso poder de penetración, el centelleo sólido no
permite detectarlas adecuadamente.

Para solventar este inconveniente se recurre a la utilización de sustancias líquidas

centelleantes y que, mezcladas con la muestra, permiten detectar la radiación emitida por
ésta. Se denominan contador beta o contador de centelleo líquido.

Para el contaje de una muestra radiactiva se ha de preparar una disolución de la misma en un

disolvente apropiado y añadir uno o varios líquidos centelleadores (denominados fluoróforos
primario y secundario) para formar una mezcla (conocida con el nombre de cóctel de contaje o
de centelleo), que es el que realmente se introduce en el detector en el interior de un
recipiente que denominamos vial de contaje.

3. Valoración y consideraciones en la medida de la radiactividad

Cuando utilizamos un contador y efectuamos una medida de la radiactividad, nos proporciona

un valor o una actividad relativa, pero se trata de una actividad observada sobre la que inciden
una serie de factores.

 Canal de contaje: en cualquier detector la energía de la emisión radiactiva se convierte en

un impulso eléctrico denominado pulso. La intensidad de este pulso depende de la energía
de la emisión emitida y, como consecuencia de ello, el contaje de la actividad de una
muestra consistirá en la medida del número de pulsos registrados por unidad de tiempo,
que se expresará en cuentas por minuto (cpm).
 Actividad de fondo: medida de radiactividad que el contador detecta incluso en ausencia
de radiactividad. Se debe a la radiación ambiental, la inestabilidad de los circuitos
electrónicos o al ruido térmico del equipo contador. Para calcular la actividad neta de la
muestra habrá que restarla a la actividad bruta de la misma. Cuanto mayor sea la actividad
de la muestra, menos trascendencia tendrá la actividad de fondo.
 Tiempo muerto: todo contador necesita un tiempo mínimo para poder discernir entre dos
pulsos eléctricos consecutivos. Se denomina tiempo muerto y supone que si durante dicho
periodo de tiempo se produjese la llegada de una nueva emisión radiactiva, el contador no
la detectaría y, por tanto, la medida estaría afectada por un error que se denomina
pérdida de coincidencia.
 Estadísticas de contaje: dado que la desintegración radiactiva es un fenómeno
probabilístico (estadístico), la medida repetida de una muestra de radiactividad no siempre
arroja el mismo valor. Por ello, las muestras deben ser contadas durante un tiempo tal que
el error relativo entre ellas sea muy similar.
 Eficiencia del contador: es el número de cuentas registradas por el contador comparadas
con el número de emisiones de la fuente.
Cada contador se calibra inicialmente para cada uno de los núclidos mediante un patrón
que tenga un esquema de desintegración similar y una vida media larga. Esta calibración
quedara registrada y, con cada análisis, se medirá el patrón y se comparará con dicho
valor.
 Desactivación, autoextinción o quenching: se produce solamente en centelleo beta o
líquido y consiste en cualquier fenómeno que de alguna manera interrumpe la
transferencia de energía en la muestra de contaje y que supone una disminución en el
número de impulsos detectados y que estos sean de menor intensidad con el consiguiente
error en la medida.

EMISIÓN DE INFORMES. FICHEROS AUTOMÁTICOS.

Cada lugar tendrá su forma de emitir los informes y ficheros automáticos.

EL CONTROL DE CALIDAD DE RADIOINMUNOANÁLISIS. PROTOCOLOS

NORMALIZADOS DE TRABAJO
Existen tres tipos de errores: errores groseros, errores sistemáticos y errores aleatorios.

Error grosero: falta de atención al ejecutar un análisis, por ejemplo, confusión de especímenes
o de reactivos.

Error sistemático: los resultados se desvían del valor (hacia arriba o hacia abajo), por ejemplo,
pipetas mal graduadas, mala preparación de los reactivos…

La dimensión característica del error sistemático es la exactitud.

Error aleatorio: conduce a una mala repetibilidad del proceso analítico y es fruto de la
posibilidad de que se produzcan errores casuales. La dimensión característica de los errores
aleatorios es la precisión y se expresa como la desviación estándar (DS) y el coeficiente de
variación (CV).

El concepto de fidelidad incluye a su vez conceptos como precisión, exactitud, especificidad y

sensibilidad.

La precisión es el grado en que una serie de medidas de una misma muestra difieren de la
media. Se expresa como coeficiente de variación (CV).

La exactitud es el grado en que una cantidad medida corresponde a la cantidad presente en la

muestra.

La especificidad es la capacidad de discriminar entre estructuras similares.

La sensibilidad analítica es la más pequeña cantidad de Ag no marcado que puede ser

distinguida del estándar cero y es el límite de detección de ensayo. La sensibilidad funcional es
la menor concentración que un ensayo es capaz de detectar.