TECNICAS DE RADIOCOMPETICION PROTEICA

Nociones de Radioactividad Recordemos que los tomos estn formados por un ncleo, que contiene protones, neutrones y la energa de interaccin nuclear y por una zona extranuclear donde se mueven los electrones por caminos energticos definidos llamados rbitas. La radioactividad es un fenmeno nuclear, es el proceso por el cual un ncleo inestable se desintegra, perdiendo partculas o energa de excitacin para formar una especie nuclear ms estable. Los tomos poseen en su ncleo protones y neutrones, y su identidad la define el nmero de protones Z (un elemento de Z = 6 siempre va a ser C, no importa el nmero de neutrones). En la naturaleza podemos encontrar C con 6, 7 u 8 neutrones, pero siguen siendo C porque su Z = 6. A estos se los denomina istopos. Muchos de los istopos de los elementos representados en la tabla peridica de Mendeleiev poseen una inestabilidad en su ncleo, ya sea por exceso de masa, neutrones, protones o energa; en otras palabras son radioactivos. Para ganar estabilidad deben perder ese exceso emitiendo partculas o fotones (desintegracin). En el RIA, los elementos radioactivos frecuentemente utilizados para marcar los Ag son: 125I y 3H (tritio). El
125

I posee un exceso de energa y para ganar estabilidad desintegra emitiendo

fotones . Como los fotones no poseen masa, su interaccin con la materia es pobre, por lo que pueden recorrer grandes distancias antes de colisionar con molculas del medio circundante (tienen alta penetrancia). El nmero de desintegraciones que el
125

I emite en la unidad de tiempo puede medirse en un contador de centelleo slido.

Este instrumento de medicin lo que determina es el nmero de coaliciones que se producen entre los fotones emitidos y un cristal de NaI, en otras palabras determina cmo interacciona con la materia.

Muestra con 125I

Fotn

NaI
Contador de centelleo slido

El

125

I se utiliza para marcar molculas proteicas. La mayora de las protenas posee

en su estructura residuos de tirosina, y son precisamente los anillos aromticos los que se iodinan (as como ocurre con la tiroglobulina en la glndula tiroidea). Las hormonas esteroideas no pueden ser marcadas con
125

I, por lo que se debe recurrir

a otro elemento radioactivo mucho ms pequeo, el tritio: 3H. El 3H posee un exceso de neutrones en su ncleo y para ganar estabilidad emite una partcula cargada llamada -. Esta partcula posee cierta masa y rpidamente interacciona con la materia, por lo que su penetrancia es baja. El nmero de desintegraciones que el 3H emite en la unidad de tiempo no podra jams medirse en un contador de centelleo slido debido a su baja penetrancia. La partcula coalicionara primero con el tubo o con el aire antes de interaccionar con el cristal. Para ello, la materia que va a interaccionar con el 3H debe mezclarse con la muestra que posee
3

H. Dicha materia se denomina lquido centellante. El nmero de

coaliciones entre la partcula - y las molculas del lquido centellante se miden en el contador de centelleo lquido. Tanto para el contador de centelleo slido como lquido, la eficiencia de medicin no es del 100%, siempre pierde alguna que otra coalicin, por lo que la medida arrojada la da en cuentas por minuto (cpm) y no en desintegraciones por minuto (dpm). Para marcar las hormonas esteroideas lo que se hace es recurrir a una marcacin isotpica, reemplazando algunos de los tomos de H de la molcula por 3H. En la figura se observa como ejemplo la marcacin de la testosterona con 8 tomos de 3H.
H H H
3H 3H 3H 3H

H C

H C C C C H H C H H

C C

H C C C H C C
3H 3H

C C C C H

3H 3H

1,2,6,7-3H-testosterona

Introduccin a la radiocompeticin proteica La sangre y otros fluidos biolgicos son mezclas qumicas complejas. La determinacin en sangre de sustancias tales como glucosa, urea, lpidos, etc, que

estn presentes en concentraciones del orden de los mg% se puede llevar a cabo mediante ensayos de laboratorio convencionales, de baja sensibilidad. En cambio, existe un gran nmero de sustancias como hormonas proteicas y esteroides, vitaminas, etc, que tambin son de gran importancia clnica y que se hallan en muy bajas concentraciones, del orden de los nanogramos/ml (ng/ml) o picogramos/ml (pg/ml). 1 ng = 1 x 10-9 g 1 pg = 1 x 10-12 g

Para poder cuantificar estas sustancias se requiere un mtodo de alta sensibilidad y especificidad, como las tcnicas de radiocompeticin proteica. La sensibilidad es la capacidad de detectar un compuesto que se encuentra en muy bajas concentraciones. La especificidad es la capacidad de reconocer nicamente a una sustancia dada en una mezcla compleja. En el mtodo de radiocompeticin proteica, la sustancia que se quiere valorar en el suero del paciente es enfrentada en un tubo de ensayo con una protena ligadora que la une especficamente, que tiene alta afinidad por ella y que es saturable por ella (afinidad es la tendencia que presenta la sustancia ligadora de unirse al ligando, mientras que saturabilidad es la propiedad de la sustancia ligadora de unir una cantidad mxima fija de ligando). Las protenas ligadoras empleadas en este tipo de ensayo pueden ser: - Protenas plasmticas: por ejemplo transcortina srica, empleada para determinar glucocorticoides en fludos biolgicos; o la protena ligadora de esteroides sexuales, empleada para la determinacin de estradiol y testosterona en suero. - Receptores celulares: en este caso el mtodo recibe el nombre de radiorreceptor. Se emplea por ejemplo en la determinacin de estradiol en suero usando receptor estrognico uterino. - Anticuerpos (Ac): en este caso el mtodo recibe el nombre de radioinmunoanlisis (RIA). Los Ac, inmunoglobulinas o -globulinas aparecen en la sangre y en ciertos tejidos de vertebrados en respuesta a la inyeccin de un Antgeno (Ag), protena o macromolcula que le es extraa al individuo. Cada protena fornea (Ag) desencadena la formacin de un conjunto de diferentes anticuerpos que reconocen distintas porciones (epitopes) de su estructura. Los Ac se combinan con los epitopes del Ag para formar un complejo Ag-Ac.

En cuanto a la estructura de los Ac, estos son protenas que presentan forma de Y y estn constituidas por cuatro cadenas polipeptdicas. Tienen dos sitios de unin que son complementarios a los epitopes del Ag, llamados paratopes.

epitope Ag Ac

Paratope

Los Ac necesarios se obtienen en animales de laboratorio por inyeccin del Ag, que en nuestro caso es la sustancia a determinar. Las hormonas proteicas suelen tener buena capacidad antignica, en cambio las hormonas esteroides, por ser pequeas no dan buena respuesta y se las suele administrar conjugadas a protenas de gran tamao. Otra posibilidad es aumentar la antigenicidad empleando adyuvantes como el de Freund completo o incompleto, que consiste en una suspensin compleja de aceites minerales con o sin micobacterias. La preparacin antignica suele administrarse en repetidas ocasiones para obtener una mayor produccin de anticuerpos. Hasta aqu la reaccin que tendramos en el tubo de ensayo sera:

Ac + Ag

Ag-Ac

Pero qu pasara si al tubo de ensayo le agregramos una cantidad conocida de la sustancia a dosar, o sea el Ag, pero marcada radioactivamente (Ag*, tambin llamada trazador).

Las caractersticas inmunoqumicas del Ag* deben permanecer idnticas a las del Ag sin marcar, en otras palabras, la presencia del tomo radiactivo en la molcula no debe distorsionar ningn epitope. De esta forma, el Ag y el trazador competirn por su unin al Ac que no podr distinguir entre ellos. Existirn entonces dos equilibrios simultneos:

Ag + Ac + Ag* Ag*-Ac

Ag-Ac

Resumiendo: dentro del tubo de ensayo, en un medio de pH y temperatura adecuados, se establece una competencia entre las molculas marcadas y las no marcadas del Ag para unirse al Ac. Dado que la cantidad de Ac es limitante, luego de un tiempo de incubacin adecuado se llegar a un estado de equilibrio en el que parte del Ag se uni al Ac para formar el complejo Ag-Ac y otra parte del Ag qued libre en el medio de reaccin. Lo mismo sucede con Ag*. Por lo tanto, cuando se llegue al equilibrio en el tubo de ensayo habr: - complejos Ag-Ac - molculas de Ag libres - complejos Ag*-Ac - molculas de Ag* libres La interaccin de estas molculas est regida por la Ley de Accin de Masas: la unin del Ag o Ag* con el Ac se realiza mediante sitios reactivos especficos y las reacciones se desplazarn de acuerdo con la concentracin de estas especies. As, cuanto mayor sea la concentracin de Ag, mayor ser la cantidad del complejo AgAc formado y, por lo tanto, mayor ser la cantidad de Ag* desplazada.

Control

Muestra desconocida

Cantidad fija de Ag*

Ag* Ag Ac
Se aade la muestra que tiene una cantidad desconocida de Ag

Se aade una cantidad fija de Ac anti-Ag

Se aade agente precipitante (Ac antiinmunoglobulina)

cpm control

Se determina radioactividad en los precipitados

cpm desconocido

cpm desconocido x 100 = %.Ag* unido cpm control

Principio del radioinmunoanlisis - RIA En el ejemplo que se muestra las cantidades de Ag* son inferiores a las de Ag, lo que produce una reduccin del antgeno radioactivo unido (3 partculas en el tubo control versus 1 particula en el tubo muestra). Es de importancia mencionar que el Ac anti-Ag de inters se agrega en concentraciones limitantes con el fin de que se establezca la competencia entre Ag y Ag*. Podemos entonces hablar de una fraccin unida (complejos Ag-Ac y Ag*-Ac) y de una fraccin libre (molculas de Ag y Ag*). Si con un mtodo adecuado separamos la fraccin libre de la unida, podremos medir la radioactividad presente en cada una de estas fracciones. Cuanto mayor haya sido la cantidad de Ag presente en la muestra original, mayor ser la cantidad de complejos Ag-Ac y menor la de complejos Ag*-Ac formados, y mayor ser la cantidad de Ag* libre. La separacin de ambas fracciones puede efectuarse por alguno de los siguientes mtodos: - precipitacin con segundo anticuerpo: los complejos formados se precipitan con un segundo anticuerpo dirigido contra el anticuerpo utilizado en el ensayo. Este mtodo se usa principalmente cuando el Ag es una hormona proteica, ya que se forman complejos proteicos de alto peso molecular que precipitan fcilmente. - adsorcin de la fraccin libre: se emplean materiales de alto poder adsorbente como el carbn activado con o sin agregado de dextrano, talco, florisil, etc, que retienen, por el fenmeno fsico de adsorcin, las molculas de bajo peso molecular. Al centrifugar el carbn activado con las partculas adsorbidas se encuentran en el precipitado. Se emplea para hormonas esteroides.

Separadas ambas fracciones se mide la radioactividad en general en la fraccin donde se encuentran los complejos Ag-Ac, llamada fraccin unida. Si se us el mtodo del 2do Ac, la fraccin unida se encuentra en el precipitado; pero si se us el mtodo del carbn activado, la fraccin unida se encuentra en el sobrenadante. Pero cmo relacionamos la radioactividad con la concentracin de la sustancia a dosar presente en la muestra? Preparando simultneamente una curva patrn (o de desplazamiento) con cantidades conocidas y crecientes del Ag (patrn, es decir Ag de concentracin conocida). Evidentemente, todos los tubos, incluyendo los que contienen la muestra,

debern llevar la misma cantidad de Ac y de Ag* dado que la nica variable del ensayo debe ser el Ag de la muestra, y debern ser sometidos a las mismas condiciones de incubacin y separacin. Entonces, a mayor concentracin de Ag ms se desplaza el Ag* y menos complejos Ac-Ag*. Se construye entonces la curva de desplazamiento:

cpm unido/cpm total

[Ag]

Los valores de radioactividad correspondientes a las muestras pueden entonces interpolarse en la curva para obtener las concentraciones del Ag. Dado que las interpolaciones sobre curvas no son precisas se recurre a un tratamiento matemtico de los datos que transforma la curva en recta para trabajar con menor error. Este procedimiento se conoce como mtodo LOGIT LOG.
Logit T = ln T 1-T T = cpm unido cpm unin mxima

Logit T

Log [Ag]

Por otro lado, cada vez que se realice un ensayo deben considerarse las uniones inespecficas. Las uniones inespecficas son las uniones del Ag* a otras sustancias que no sean el Ac. Para ello utilizamos tubos procesados de la misma manera que los restantes pero que carecen del Ac. Toda unin que se observe en estos tubos se

deber a la fijacin del Ag y Ag* a molculas distintas al Ac. El valor de esta unin inespecfica se sustrae a los tubos restantes, ya que se asume que en todos los tubos ocurre en la misma proporcin.

EJEMPLO UN ENSAYO RIA Se realiza un RIA para determinar la concentracin de LH en 2 muestras de suero (A y B). Los datos obtenidos se muestran en la siguiente tabla:

LH* LH* LH* LH1 LH2 LH3 LH4 LH5 LH6 LH* LH* LH* LH* LH* LH* LH* LH* Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac

Todos los tubos deben tener igual volumen final, lo que se consigue completando con solucin buffer. Calcule las concentraciones de LH en A y B (en mUI/ml) utilizando una representacin grfica. Resolucin: Primero hay que promediar los valores de radioactividad (cpm) para cada par de duplicados. La unin especfica de cada tubo se obtiene restando el promedio de la unin inespecfica [(396+418)/2=407]. Se hacen los cocientes entre el promedio de cada punto y el de la unin mxima, tanto para la curva como para las muestras a

determinar. A este cociente se lo denomina T = cpm unido / cpm unin mxima. Se calcula el valor de Logit T:
Logit T = ln T 1-T

y se grafica la curva de desplazamiento: Logit T en funcin de los logaritmos de la concentracin de LH (eje x: log [LH]; eje y: Logit T). Entrando a la curva con el valor de Logit de las muestras a determinar, se obtiene el valor del logaritmo de la concentracin de LH, a partir del que se calcula la concentracin de LH (antilogaritmo).
T

2.17

3 2,5 2 1,5 1 A

Logit T

0,5 0 -0,5 0 -1 -1,5 -2 -2,5

B 0,5 1 1,5 2 2,5 Log [LH] 3

Resultados exactos: [LH] A = 13.72 mUI/ml [LH] B = 41.58 mUI/ml ENSAYOS INMUNOMTRICOS 1) IRMA (ensayo inmunoradiomtrico)

A diferencia del RIA, que como se vi, es un mtodo competitivo, el IRMA es un ensayo de tipo NO competitivo utilizado en la cuantificacin de antgenos de alto peso molecular que presentan varios determinantes antignicos epitopes. El IRMA no puede emplearse en la determinacin de molculas pequeas (ej. esteroides) que poseen baja capacidad antignica, ya que en general se requiere que posean varios epitopes. Este ensayo requiere de dos anticuerpos especficos (mono policlonales) dirigidos contra epitopes diferentes del antgeno. Ambos anticuerpos deben encontrarse en altas concentraciones (en exceso). Uno de estos anticuerpos se adsorbe a una fase slida y el otro anticuerpo se marca radiactivamente, en general con 125I. Luego de incubar, se formarn complejos de anticuerpo adsorbido a la fase slidaantgeno presente en la muestra-anticuerpo marcado radiactivamente. Se lava, y se determina la radiactividad en un contador de centelleo lquido. La radiactividad obtenida ser directamente proporcional a la concentracin de antgeno presente en la muestra a dosar.

* * *

Ac especfico marcado radioactivamente

Ac especfico adsorbido a la placa

Ag
con 2 epitopes (pueden ser iguales o diferente)

Ventajas del IRMA: posee mayor sensibilidad que el RIA. Al utilizar anticuerpos en exceso, el IRMA es capaz de detectar antgeno en muy bajas concentraciones. es ms fcil marcar radiactivamente anticuerpos (como utiliza el IRMA) que marcar radiactivamente antgeno (como requiere el RIA). es un ensayo rpido y estable.

Desventajas del IRMA: requiere de mayor nmero de pasos, por ejemplo necesita lavados adicionales que el RIA no utiliza. utiliza generalmente anticuerpos monoclonales (Mab), que son ms laboriosos de obtener que los anticuerpos policlonales (Ac). Los Mab son anticuerpos que proceden de un nico clon de linfocitos B activados (plasmocitos), o sea que poseen la capacidad de reconocer un nico epitope en toda la molcula antignica y siempre es el mismo. Se obtienen por la tcnica desarrollada por Milstein y Khler. al utilizar sustancias radiactivas est sujeto a legislacin restrictiva (a diferencia del ELISA y el DELFIA que no emplean compuestos radiactivos).

Cuadro comparativo entre RIA e IRMA:

RIA Ensayo competitivo (se establece una competencia entre las molculas marcadas y las no marcadas por el ligando). Se alcanza un estado de equilibrio ( en el cual parte del antgeno marcado y no marcado se uni al anticuerpo para formar el complejo antgeno-anticuerpo, y parte del antgeno

IRMA Ensayo NO competitivo.

No se alcanza un estado de equilibrio.

marcado y no marcado qued libre en el medio de reaccin) El anticuerpo es utilizado en concentracin limitada (para que el antgeno no marcado y el antgeno marcado compitan por el Ac) Se determina antgeno marcado radiactivamente (libre formando parte del complejo antgeno-anticuerpo). El antgeno debe tener un determinante antignico. Se determina anticuerpo marcado radiactivamente (formando parte del complejo Ag-Ac). El antgeno debe tener por lo menos dos determinantes antignicos diferentes. En general utiliza anticuerpos policlonales En general utiliza anticuerpos mono y policlonales Para aumentar la sensibilidad del RIA debo colocar el anticuerpo y el antgeno marcado en bajas concentraciones. Para aumentar la sensibilidad del IRMA debo colocar los anticuerpos muy concentrados, de modo de atrapar todo el antgeno presente en la muestra. La radiactividad obtenida (en los complejos anticuerpo-antgeno marcado) disminuye a medida que aumenta la concentracin de antgeno presente en la muestra. cpm unido cpm total [antgeno] La radiactividad obtenida aumenta a medida que aumenta la concentracin de antgeno en la muestra. cpm unido cpm total [antgeno] Los anticuerpos son utilizados en altas concentraciones (en exceso).

2) ELISA

El enzimoinmunoanlisis es una de las tcnicas inmunoqumicas ms importante desarrollada en los ltimos aos. Los inmunoensayos sirven para detectar y cuantificar antgenos o anticuerpos y para estudiar la estructura de

los antgenos. Si el ensayo es el adecuado, son muy rpidos y fciles, rindiendo informacin que sera difcil obtener utilizando otras tcnicas. El enzimoinmunoanlisis es un mtodo objetivo y automatizable; a diferencia del RIA est exento de legislacin restrictiva y los reactivos usados se conservan durante un tiempo relativamente prolongado. Estas consideraciones unidas al hecho de que slo se necesita un equipo sencillo y econmico, han llevado al desarrollo reciente de numerosos enzimoinmunoanlisis, muchos de los cuales son especialmente adecuados para su utilizacin en laboratorios pequeos y en pases en desarrollo. Nos ocuparemos ahora de un tipo de enzimoinmunoanlisis conocido como anlisis por enzimas fijadas a inmunoadsorbentes (ELISA). Esta tcnica presenta como requisito que los anticuerpos o los antgenos se puedan ligar a una enzima y que este complejo retenga tanto la actividad inmunolgica como la enzimtica. En estos ensayos, el antgeno o el anticuerpo se une usualmente a un soporte de fase slida para facilitar la separacin de los reactivos libres y combinados. Se ha hallado que antgenos y anticuerpos se pueden unir covalentemente al material particulado, como celulosa, poliacrilamida, y que tambin se puede obtener una adsorcin pasiva satisfactoria a tubos, perlas, discos o microplacas de nylon, poliestireno, polivinilo o polipropileno. Como ya se ha mencionado una parte esencial del ELISA es la conjugacin del anticuerpo (o antgeno) con una enzima. Es necesario que la enzima tenga actividad elevada, sea econmica, fcil de obtener en forma pura, y que posea una reaccin con el sustrato fcilmente medible. Las enzimas consideradas hasta ahora ms satisfactorias son la peroxidasa del rbano picante, la glucosa oxidasa, la galactosidasa y la fosfatasa alcalina. Estas son fijadas generalmente a anticuerpos o antgenos por medio de glutaraldehdo o periodato. Los conjugados as obtenidos han demostrado ser estables durante muchos meses, incluso aos.

La eleccin del sustrato es crtica en el ELISA. Los sustratos deben ser estables y solubles antes y despus de la reaccin enzimtica. Los sustratos cromognicos deben ser incoloros inicialmente y fuertemente coloreados despus de la degradacin. Los sustratos fluorognicos, que producen un compuesto fluorescente, pueden ser ventajosos para anlisis de alta sensibilidad.

ELISA INDIRECTO Si bien existen muchas formas de llevar a cabo un ELISA y se los puede clasificar segn varios criterios diferentes, describiremos el mtodo ms comnmente utilizado, denominado Elisa Indirecto. Este mtodo es

ampliamente utilizado para la determinacin de anticuerpos, ya que se necesitan slo unos pocos conjugados (ej. anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanas marcadas con enzimas) para analizar anticuerpos de una gran variedad de enfermedades. La tcnica es la siguiente: 1) El antgeno correspondiente se adsorbe a las placas de poliestireno, y luego se lavan. 2) Las muestras a ensayar se incuban en las concavidades y las placas se lavan nuevamente; el anticuerpo presente reacciona con el antgeno inmovilizado en la superficie de las concavidades. 3) El conjugado de antiinmunoglobulinas humana marcado con enzima se incuba en las concavidades; ste reacciona con cualquier anticuerpo "capturado en el paso anterior. El exceso de reactivo se lava. 4) Se agrega el sustrato enzimtico y las placas se incuban; la velocidad de la degradacin se indica por el cambio de color, que es proporcional a la concentracin de anticuerpo de las muestras del paso (2). 5) Se detiene la reaccin y el color se determina en un espectrofotmetro.

2) Se aade suero del paciente. Si hay Anticuerpos especficos anti-Ag estos se unirn.

LAVAR E E 3) Se aade anti -globulina humana marcada con una enzima. Esta se unir al Ac del paciente.

LAVAR
s s s

s s

4) Se aade el sustrato de la enzima.

La cantidad de producto que se obtiene es proporcional a la cantidad de anticuerpo presente.

Determinacion biolgica de hormonas: Bioensayo

Las hormonas se pueden determinar en el suero o plasma de acuerdo a diferentes criterios: se puede medir la cantidad de hormona que se encuentra circulante o se puede evaluar la capacidad que tiene sta de generar una accin, es decir que se puede medir su capacidad funcional. Para medir la concentracin de hormona circulante se utilizan por ejemplo, las tcnicas de radiocompeticin proteica o de enzimo-inmunoensayo. Para medir la actividad biolgica de una hormona se utilizan distinos tipos de bioensayos. El bioensayo tiene la caracterstica de estudiar la capacidad de la hormona de producir una respuesta, de manera tal que esta accin se pueda determinar o cuantificar midiendo el metabolito final producido por esta hormona. De esta manera se evala a la hormona de acuerdo a su actividad biolgica. Se recurre a esta metodologa en casos muy particulares donde los resultados de los niveles hormonales obtenidos en el laboratorio no son consistentes con los sntomas clnicos observados en el paciente. Para establecer una analoga, se puede pensar que es similar a cuando se determina la actividad de una enzima de acuerdo a la cantidad de producto que se forma en la unidad de tiempo y no a la masa de la enzima en determinado volumen. La metodologa del bioensayo, al igual que las otras tcnicas descriptas en esta unidad temtica, tiene tambin una alta sensibilidad y reproducibilidad. Actividad biolgica de la hormona luteinizante Daremos como ejemplo la medicin en el suero de un paciente de la actividad biolgica de la hormona luteinizante. Para estudiar esta actividad, se evala la capacidad que tiene el suero de producir una respuesta biolgica sobre una poblacin celular, por ejemplo, en este caso: clulas de Leydig de testculo de rata o ratn. La respuesta que se mide es la capacidad que tiene esa muestra de suero de estimular la produccin de testosterona en las clulas de Leydig. La metodologa consiste en la extraccin de los testculos del animal luego del sacrificio del mismo. El testculo est formado por dos compartimientos encerrados dentro de la cpsula o albugnea: el tubo seminfero y el tejido intersticial. Las clulas de Leydig se encuentran en el tejido intersticial. El tejido se decapsula y se trata con una enzima llamada colagenasa. Este tratamiento permite la liberacin de las clulas intersticiales que generalmente se encuentran en la conjuncin de varios tubos seminferos. Esta preparacin se filtra a travs de una gasa de nylon y de esta manera se aislan las clulas intersticiales. Una vez obtenidas las clulas, se procede a su conteo para conocer el nmero de clulas de Leydig obtenidas y as poder determinar el nmero de clulas que se distribuir en cada uno de los tubos. En cada tubo se coloca: # Una cantidad determinada de medio de cultivo. # La misma cantidad de clulas en cada uno de los tubos. # Una alcuota de la muestra incgnita o diferentes cantidades de hormona standard (curva de calibracin). Luego se incuban los tubos en un bao de agua a una temperatura y tiempo adecuados para que las clulas sean capaces de responder al estmulo hormonal sintetizando testosterona y segregndola al medio de incubacin. Para cuantificar la respuesta hormonal se debe cuantificar la testosterona sintetizada y secretada al medio de incubacin. Esto se puede realizar, por ejemplo, por la tcnica de radioinmunoanlisis (RIA). Si se realiza un grfico con las muestras de concentraciones crecientes de LH standard (curva patrn), se obtiene un grfico semejante al de la figura, en donde se

alcanza un mximo en la produccin de testosterona debido a la saturacin de la respuesta.

Para determinar la concentracin de hormona que produjo la estimulacin de las clulas se realiza una extrapolacin del valor de la concentracin de testosterona producida por la muestra incgnita y se averigua la concentracin de hormona luteinizante biolgicamente activa que contena esa muestra. Como en la tcnica de RIA, tambin se pueden realizar ajustes matemticos para obtener rectas en lugar de curvas en los grficos. Pueden existir discrepancias en el valor obtenido para una misma hormona por un ensayo biolgico y otro ensayo inmunolgico, ya que la misma masa de hormona puede tener distinta bioactividad en procesos patolgicos o en determinadas condiciones fisiolgicas. A continuacin daremos algunos ejemplos de bioensayos basados en metodologas muy similares a la descripta para el bioensayo de LH. a) Bioensayo para ACTH: se utilizan clulas de glndula adrenal de la zona fasciculata. Se determinan los niveles de glucocorticoides sintetizados por accin de ACTH. b) Bioensayo de angiotensina: en este caso se usan clulas de glndula adrenal de la zona glomerulosa, determinndose los niveles de mineralocorticoides sintetizados por accin de la angiotensina. c) Bioensayo de la hormona foliculoestimulante: Se utilizan clulas de Sertoli y se miden los niveles de estradiol sintetizados por accin de dicha hormona. Tambin se pueden usar clulas de la granulosa de ovario y medir la produccin de esteroides. d) Bioensayo de prolactina: se utilizan lneas celulares en cultivo que responden a prolactina, determinndose el incremento en el ndice mittico por accin de la hormona.
Ejercicio: Comparacin de tcnicas