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Técnicas de inmunodiagnóstico
secundarias.
Aplicación de
en reacciones
técnicas basadas
antígeno-anticuerpo 3
TÉCNICO SUPERIOR EN LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO Módulo | Técnicas de inmunodiagnóstico.
Módulo | Técnicas de inmunodiagnóstico.
Sumario de la lección 1
1. El sistema inmune: nociones básicas....................................................... 5
2. Técnicas de aglutinación .......................................................................... 8
3. Técnicas de inhibición de la aglutinación ................................................. 12
4. Técnicas de precipitación en medio líquido ............................................. 13
.................................... 17
..................................................... 21
7. Diagnóstico y seguimiento serológico de enfermedades infecciosas ..... 22

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Objetivos
TÉCNICO SUPERIOR EN LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO
Estudiar las técnicas de aglutinación y las técnicas de la inhibición de la aglutinación.
Estudiar las técnicas de precipitación en medio líquido y las técnicas de precipitación

en gel.
Estudiar el diagnóstico y seguimiento serológico de las enfermedades infecciosas.

1. El sistema inmune:
nociones básicas
1.1. ¿Qué es el sistema

inmune?
El sistema inmune del cuerpo humano está formado por células y tejidos que son utilizados
para defender el cuerpo de elementos extraños, ya sean nocivos o no.
El sistema inmune (SI) protege al individuo de las agresiones de otros seres vivos que
provienen del medio ambiente exterior, como microorganismos, parásitos, etc., o del propio
medio interno, como células neoplásicas.
La estructura del SI es una red de células distribuidas por todo el organismo que se inter-
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comunican y se coordinan, formando nuestro sistema defensivo. Estas células disponen de una
gran movilidad y se localizan en la sangre o en tejidos como el bazo, o también en órganos
como el ganglio.
En esencia, el SI está integrado por dos grandes sistemas funcionales o mecanismos defensivos:
constituye un sistema defensivo con el que todos
nacemos y que nos protege contra los antígenos, sin previamente haber estado expuestos

a ellos. Además, existen otras barreras que no permiten la entrada de los materiales
dañinos en el cuerpo (lágrimas oculares, tos, moco, piel, ácidos gástricos, etc.).
se desarrolla con la exposición previa a varios
antígenos. El SI desenvuelve una defensa concreta contra ese antígeno mediante la
producción de anticuerpos, dirigidos contra los nuevos antígenos aparecidos en el
sistema. Los anticuerpos son inmunoglobulinas secretadas por los linfocitos B que se
producen como respuesta a un antígeno extraño.
Las células linfoides o linfocitos son la base celular de la respuesta inmunitaria.
Los linfocitos se dividen en tres tipos funcionales, que no pueden distinguirse con el microscopio
óptico, pero que presentan en su superficie distintos marcadores y receptores. Estos tres tipos
de linfocitos son:
humoral.
celular.
Células NK (del inglés natural killer, agresores naturales): participan en la respuesta
inmunitaria innata.
1.2. La respuesta de
anticuerpos
Los anticuerpos (Ac), también conocidos como inmunoglobulinas, son glucoproteínas que
circulan por la sangre y detectan a los antígenos que dañan el organismo.
La función básica de los anticuerpos es neutralizar elementos externos, antígenos (como
bacterias, parásitos o virus) que puedan dañar al organismo.
El término antígeno (Ag) proviene del griego y significa “opuesto” o “que genera oposición”. En
medicina, se denomina antígeno a cualquier sustancia que provoca una respuesta inmunitaria,
estimulando la producción de anticuerpos. Las sustancias pueden ser reconocidas por el
sistema inmunitario adaptativo, ya sean propias o ajenas.
El organismo responde ante un agente extraño mediante sus mecanismos inespecíficos de

defensa; si estos no son suficientes, se activa la inmunidad adaptativa, con la producción de
anticuerpos. Este nivel de inmunidad es:
Tiene memoria, ya que se generan linfocitos B de memoria, capaces de dar una respuesta
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rápida ante una nueva entrada de ese mismo antígeno.
Esto implica que el estudio de los anticuerpos séricos (nivel de anticuerpos en suero)
proporciona información sobre los antígenos presentes, o que han estado presentes, y también
sobre la evolución de la infección. Por tanto, es una herramienta que facilita un diagnóstico
definitivo.
En general, la respuesta de anticuerpos implica una sucesión de cuatro fases:

1. Fase de latencia. Es el periodo comprendido entre la entrada del antígeno y la detec-
2. Fase exponencial. La concentración de anticuerpos en suero aumenta de forma loga-

rítmica.
3. Fase de meseta. Se mantiene el nivel de anticuerpos mientras que persiste la estimula-

ción antigénica.
4. Fase de disminución. Consecuencia de que los anticuerpos van neutralizando al antí-

geno, y los inmunocomplejos formados van siendo retirados de la circulación.
Así pues, el estudio del nivel de anticuerpos en suero permite valorar la fase de la enfermedad
y observar su evolución.
Fases de la respuesta de anticuerpos.
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Debido a la generación de linfocitos B de memoria, se producen diferencias cualitativas y
cuantitativas en la respuesta, dependiendo de si hay presencia o no de estos linfocitos. Hay
dos tipos de respuesta:
Respuestas primarias, que se deben a la activación de linfocitos B vírgenes, cuando no
ha habido contacto previo del paciente con el antígeno.

Respuestas secundarias, que se deben casi exclusivamente a la estimulación de clones
expandidos de linfocitos B de memoria.
2. Técnicas de
aglutinación
2.1. La reacción de
aglutinación
La aglutinación es un fenómeno que consiste en agrupar a los antígenos por la acción de los
anticuerpos, formando una red visible a simple vista.
Las reacciones de aglutinación se producen entre partículas que están en suspensión. General-
mente, es el antígeno el que está presente en la superficie de las partículas (aglutinógeno) y se
enfrenta a un anticuerpo específico de él (aglutinina).
Las partículas pueden ser vitales o inertes. Como partículas vitales se suelen emplear hematíes
y bacterias. Las partículas inertes pueden ser de carbón vegetal, látex (polímero de poliestireno),
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bentonita (arcilla), gelatina, etc.

Proceso de aglutinación entre antigenos y anticuerpos.
Si la partícula utilizada en la aglutinación es un hematíe, se conoce como una reacción de

hemaglutinación.
El aglutinógeno debe estar presente en la partícula de una forma apreciable y tiene que estar
situado superficialmente. Además, debe poseer múltiples epítopos, es decir, varios sitios de
unión del anticuerpo.
Para que la reacción de aglutinación se produzca correctamente, es preciso que la concentración

del aglutinógeno no sea excesiva con respecto a la de la aglutinina, y viceversa. En caso
contrario, tendrá lugar el fenómeno de zona y se obtendrá un resultado falsamente negativo.
Cuando existe un exceso de anticuerpos respecto a la concentración de antígeno, se suele
producir el fenómeno de prozona, en el que no hay una aglutinación visible.
Con el fin de evitar este error, conviene diluir los sueros para alcanzar una concentración de
aglutinógeno y aglutinina equivalentes y apreciar una reacción positiva correcta.
Las reacciones de aglutinación presentan ciertos beneficios, como su alto grado de sensibilidad
y, también, que una gran cantidad de antígenos y anticuerpos se puede detectar mediante
pruebas y técnicas.
Sin embargo, el principal inconveniente es que no proporcionan la capacidad de cuantificar,

como se detallará más adelante. Cuantificar significa determinar la concentración de la
sustancia investigada en la muestra problema.
Así pues, generalmente, las pruebas de aglutinación son simplemente cualitativas: solo
establecen la presencia o la ausencia de la sustancia buscada en la muestra problema (y no las
cantidades de concentración).
Sobre la aglutinación:
- El medio en que ocurre la unión debe poseer viscosidad y fuerza iónica

adecuadas.
Características
- La sensibilidad y la especificidad de los resultados depende del grado de
pureza de los antígenos; no puede haber intrusos que dificulten la unión.
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- La facilidad y la rapidez de la técnica.
- El grado de sensibilidad permisible y la detección de gran diversidad de

Ventajas
anticuerpos.
- La temperatura no influye prácticamente en las pruebas.

- La técnica es semicuantitativa, por lo tanto, poco reproducibe.

- Si hay exceso o déficit de anticuerpos o antígenos, no habrá agregación.
En caso de exceso, los receptores de la superficie se saturan e impiden la
Desventajas formación de agregados.
-Si se trata de exceso de antígenos, tampoco se forman, porque cada

partícula se ocupa de capturar a los pocos anticuerpos existentes
individualmente.
En materia de utilidad clínica, la aglutinación se suele emplear en enfermedades infecciosas,

para trasfusiones, autoanticuerpos en pacientes con enfermedad autoinmune, etc.
2.2. Las técnicas de

aglutinación
Las técnicas de aglutinación se basan en la capacidad que tienen los antígenos particulados
multivalentes (los que tienen varios epítopos o puntos de unión al anticuerpo) para unirse a
sus anticuerpos complementarios dando lugar a inmunocomplejos o agregados observables
a simple vista.
Hay dos formas de realizar las técnicas de aglutinación, de manera directa o indirecta, en
función del antígeno. En la directa, el antígeno es particulado per se. Esto significa que los
antígenos que son reconocidos por los anticuerpos forman parte de una partícula, las bacterias
o glóbulos rojos (la tipificación de grupos sanguíneos se hace con aglutinación directa).
En el caso de la aglutinación indirecta, el antígeno no forma parte de una partícula; lo que se

hace es fijarlo a una, concretamente a una partícula de látex o hematíes.
También existe la aglutinación indirecta reversa, que es lo contrario: se trata de fijar el

anticuerpo a la partícula de látex o hematíes (hay aglutinación si el antígeno está presente en
el suero).
2.2.1. Aglutinación directa o activa

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Tal y como hemos apuntado en la sección anterior, el antígeno es particulado, es decir, es

reconocido por los anticuerpos específicos.
Las pruebas de aglutinación directa o activa son aquellas en las que la aglutinina reacciona
con un aglutinógeno presente de una forma natural en la superficie de un tipo de células.
Tras esta reacción, se forma una especie de puente de unión entre las células, produciéndose
la aglutinación.
Esta es una reacción que se debe llevar a cabo en el medio empleando una fuerza iónica
adecuada y con anticuerpos que tengan dos o más sitios de unión.
Si la prueba es correcta, solo se necesitarán los controles positivo y negativo, así como el control
de aglutinación inespecífico para la determinación cualitativa.
Algunos ejemplos de uso son el tipado de grupos sanguíneos, el serotipado de bacterias

intestinales para brotes de gastroenteritis, el diagnóstico de brucelosis, etc.
2.2.2. Aglutinación indirecta o pasiva

El antígeno no se localiza de forma natural dentro de una partícula. En este caso, entonces, lo
que se hace es fijarlo a una. Esta aglutinación se produce por partículas de mayor diámetro en
suspensión, creando una malla grande y visible.
Las pruebas de aglutinación indirecta o pasiva son aquellas en las que la aglutinación
reacciona con un aglutinógeno que ha sido transferido pasivamente a la superficie de una
partícula vital o inerte.
Un ejemplo de este tipo de pruebas es la aglutinación que se genera al poner en contacto

un suero que contiene aglutininas antitoxoplasma, con hematíes de cordero que han sido
recubiertos con aglutinógenos procedentes de un lisado de toxoplasma.
Se denomina sensibilización al proceso mediante el cual las partículas son recubiertas de

aglutinógenos que no les son propios.
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3. Técnicas de inhibición
de la aglutinación
Las técnicas de inhibición de la aglutinación son una modificación de las técnicas de aglutina-
ción que permiten detectar antígenos solubles, es decir, que no van unidos a ninguna
partícula de modo directo o indirecto.
Consisten en una incubación previa del antígeno (aglutinógeno) estudiado con su anticuerpo
(aglutinina) correspondiente. Así, quedan cubiertos los sitios de unión del anticuerpo.
Posteriormente, se añade el mismo antígeno, pero sobre la superficie de una partícula.
Si el anticuerpo está saturado con el antígeno soluble presente en la muestra no se producirá

aglutinación.
Por el contrario, si el antígeno soluble no se encontraba en una concentración suficiente como

para saturar todo el anticuerpo, quedarán sitios de unión libres y se producirá aglutinación
con el antígeno particulado.
Se puede cuantificar el antígeno soluble mediante la realización de diluciones seriadas del

suero problema y valorando el grado de inhibición de la aglutinación.
Cuando la técnica emplea hematíes como partículas aglutinantes, se denominan reacciones

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de inhibición de la hemaglutinación.
La hemaglutinación se debe a la capacidad que tienen algunos virus y bacterias de unirse a

receptores de membrana (formados por residuos de ácido N-acetilmurámico) de hematíes de
mamíferos y aves.
En microbiología se usan las técnicas de inhibición para detectar anticuerpos frente a

determinados virus con antígenos capaces de aglutinar los hematíes (hemaglutininas), como
el virus de la gripe o el de la rubeola.
Estas técnicas requieren un control cuidadoso de las concentraciones de anticuerpos para

evitar un exceso que invalide los resultados obtenidos o que contamine el procedimiento.
4. Técnicas de
precipitación en medio
líquido
Las reacciones de precipitación hacen referencia a que algunas uniones antígeno-anticuerpo
son complejos demasiado grandes para mantenerse en disolución y precipitan en el medio.
En particular, las técnicas de precipitación se basan en la reacción de la precipitación que

ocurre cuando un antígeno soluble multivalente se une con su anticuerpo específico,
produciendo inmunocomplejos que precipitan el medio de la reacción. Esto quiere decir que
dos componentes que, por separado son solubles, precipitan cuando se unen para formar un
inmunocomplejo.
Las reacciones de precipitación en medio líquido consisten en medir la turbidez que produce
la precipitación de inmunocomplejos en un medio líquido.
La medición de la turbidez se puede llevar a cabo a partir de dos técnicas analíticas, la

turbidimetría y la nefelometría, que se basan en la dispersión de un haz de luz incidente.
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Se pueden utilizar para determinar anticuerpos, factores del complemento, proteínas de fase
aguda y otras proteínas séricas.
Para ello, se pondrán anticuerpos y antígenos y se dejarán que difundan sin forzarlos. Si este
procedimiento se realiza en medio líquido, se conoce como técnica de difusión doble.
Esta técnica, sin embargo, no se recomienda para cuantificar debido a que su capacidad de

precisión es baja. Existen otras dos técnicas de difusión pasiva, que en lugar de emplearse en
medio líquido, se utilizan geles semisólidos. Estos también necesitan un tiempo de incubación.
Cuando mezclamos cantidades suficientes de antígeno soluble con anticuerpos específicos, la

interacción antígeno-anticuerpo puede dar lugar a una red capaz de ser visualizada como un
precipitado. Esta red está constituida por complejos inmunes (CI), formados a su vez por la
interacción antígeno- anticuerpo (Ag-Ac).
Tal y como se observa en la figura siguiente, al agregar concentraciones crecientes de antígeno

soluble a una cantidad fija de suero conteniendo anticuerpos específicos, a medida que la
cantidad de antígeno agregado aumenta, la cantidad de precipitado se incrementa hasta
alcanzar un máximo.
Etapas de precipitado de anticuerpos.
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Cuando agregamos pequeñas cantidades de antígeno en un extremo de la curva de

precipitación, los complejos inmunes se forman en exceso de anticuerpo.
En el otro extremo, al agregar grandes cantidades de antígeno, los complejos inmunes se forman
en exceso de antígeno siendo pequeños y probablemente constituidos por una molécula de
anticuerpo y dos de antígeno.
Entre estas dos situaciones extremas se encuentra la zona de equivalencia, en que la relación
antígeno-anticuerpo posibilita la formación de grandes redes de complejos inmunes que
precipitan.
La reacción de precipitación depende de la valencia del anticuerpo y del antígeno. La valencia

del anticuerpo da idea del número de sitios que posee para reconocer el antígeno. De esta
manera, un anticuerpo bivalente posee dos sitios capaces de reconocer al antígeno. Del mismo
modo, la valencia de un antígeno nos habla del máximo número de epítopos que posee.
Para que se pueda producir la interacción secundaria antígeno-antígeno con la consecuente

formación del precipitado, tanto el antígeno como el anticuerpo deben ser, al menos, bivalentes.
4.1. Inmunoturbidimetría e
inmunonefelometría
Cuando un haz de luz choca contra una partícula en suspensión, una parte de la luz se dispersa,
otra parte se refleja y otra parte se absorbe.
La dispersión de la luz depende de la longitud de onda de la luz, del tamaño de la partícula y

del índice de refracción de la partícula en relación con el medio que la rodea.
Hay dos tipos de técnicas para realizar la cuantificación del antígeno. Se trata de unas técnicas
analíticas basadas en la dispersión de la luz, y son la turbidimetría y la nefelometría. Ambas
consiguen el resultado de una concentración de proteína en suspensión.
4.1.1. Turbidimetría
La turbidimetría mide la disminución de la luz transmitida a través de una suspensión
de partículas utilizando un espectrofotómetro. Normalmente se emplea para soluciones
concentradas, por ejemplo, la determinación de proteínas totales en suero, líquido
cefalorraquídeo y orina.
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Como hemos dicho, cuando un rayo de luz colimado (sus haces son paralelos) atraviesa una
suspensión homogénea de partículas, una parte de esta luz es absorbida, otra es reflejada, otra
es transmitida y otra es dispersada en todas direcciones.
En la turbidimetría se mide la cantidad de luz absorbida, es decir, la cantidad de luz que no

es transmitida por la suspensión y no es capaz de emerger de esta en la misma dirección que

el rayo incidente.
Cuanto mayor es la luz absorbida (cuantificada en un espectrofotómetro en forma de

absorbancia), mayor es el número de partículas presentes en la suspensión y más alta es la
concentración de la sustancia problema que da lugar a las partículas y está presente en la
muestra.
Si las partículas detectadas por turbidimetría son inmucomplejos, esta técnica se denomina
inmunoturbidimetría.
4.1.2. Nefelometría
La nefelometría mide la luz dispersada por las partículas en suspensión, es decir, cuantifica
la cantidad de luz que es desviada por estas, con un determinado ángulo con respecto a la
dirección del rayo incidente.
En general, el ángulo para evaluar la cantidad de luz dispersada está comprendido entre los
30º y los 90º, y normalmente se utiliza el nefelómetro como instrumento para concentraciones
más diluidas.
La nefelometría, entonces, se fundamenta en la medición de radiación dispersa; en cambio,

la turbidimetría parte de la medición de la intensidad de un haz disminuido.
Cuando las partículas en suspensión son agregados de inmunocomplejos, esta técnica se

denomina inmunonefelometría. El inmunocomplejo es la unión de antígeno-anticuerpo que
precipita.
La intensidad de la luz dispersada es directamente proporcional a la cantidad de agregados

formados y, por tanto, a la concentración del antígeno en la muestra.
Así pues, en el momento en que un antígeno y un anticuerpo específico entran en contacto

con ese antígeno, ambos reaccionan y forman un complejo antígeno- anticuerpo (Ag-Ac). Estos
complejos se constituyen rápidamente, aunque existe una segunda fase de crecimiento de
complejos más lenta. En particular, es en esta fase en que aparece la dispersión de la luz.
Tanto en la inmunoturbidimetría como en la inmunonefelometría se mide la dispersión de la

luz provocada por los complejos antígeno-anticuerpo.
En definitiva, estas técnicas permiten un gran automatismo, por ello es más sencillo procesar
un mayor número de muestras en menor tiempo. Se obtienen valores de cuantificación
muy precisos de la cantidad total de determinadas proteínas en suero. Algunos ejemplos de
determinaciones que se pueden cuantificar por ambas técnicas son la cuantificación de IgG,
IgA, IgM, C3, C4 y proteína C reactiva.
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5. Técnicas de
precipitación en gel:
En relación con las técnicas de precipitación, actualmente es más frecuente el uso de un

soporte semisólido que de un medio líquido.
Las técnicas de precipitación en gel también son denominadas técnicas de precipitación

en medio sólido. Requieren un soporte gelificado en el que se difunden el antígeno y el
anticuerpo.
El soporte en gel normalmente es de agar, que es un tipo de gel que se prepara a partir de algas
marinas.
Las técnicas se agrupan dentro de dos clases: técnicas inmunoelectroforéticas e

inmunodifusión, como veremos a continuación.
La velocidad de difusión de un antígeno o anticuerpo en el gel depende de varios factores:
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La concentración.
La temperatura: el calor favorece la difusión.
El tamaño de las moléculas: la velocidad de difusión es inversamente proporcional al
peso molecular.
La viscosidad del medio: una viscosidad elevada hace disminuir la velocidad de difusión.

La inmunofijación es una técnica que sirve para identificar en la sangre unas proteínas llama-
das inmunoglobulinas. Si hay demasiada cantidad de la misma inmunoglobulina puede ser
objeto de desarrollo de alguna enfermedad cancerosa. Las inmunoglobulinas son anticuerpos
que ayudan al cuerpo a combatir infecciones.
5.1. Técnicas
inmunoelectroforéticas
Las técnicas inmunoelectroforéticas consisten en la separación y la caracterización de
proteínas, basada en la separación electroforética y la reacción con anticuerpos específicos
ante las mismas.
Para ello, se utiliza un medio con un pH cercano al 8,6 y un gel de agarosa (uno de los
componentes del agar) del 1% de grosor, no más de 1 mm. Se aplica este pH ya que manteniendo
los anticuerpos en estas condiciones son prácticamente inactivos.
El grosor de la base de agarosa y su porosidad permiten el paso de complejos antígeno-

anticuerpo y una separación adecuada de las proteínas. Estos complejos se tiñen con
colorantes como el azul Coomassie.
Estas técnicas permiten la unión de ligandos, la precisión de la actividad enzimática y la

separación electroforética.
Las proteínas se separan por electroforesis. Cuando están separadas, se deposita el suero de
anticuerpos y se forma un precipitado tras un periodo adecuado de difusión, para permitir que
las proteínas se encuentren con sus anticuerpos específicos.
La inmunoelectroforesis se utiliza para la detección de anticuerpos antinucleares (ANA), que

se encuentran en el suero de determinados enfermos. Prueba de aglutinación para artritis reumatoide.
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5.1.1. Inmunoelectroforesis cruzada

En la inmunoelectroforesis cruzada, o inmunoelectroforesis cuantitativa de dos dimensiones,
se lleva a cabo una separación de proteínas inicial. Después se vuelven a someter a una
segunda electroforesis, esta vez en un gel que contiene los propios anticuerpos específicos
contra la proteína.
Es en esta segunda acción que se forman los inmunoprecitados; así, cada precipitado tendrá
sus propias características migratorias, y cada banda que veamos corresponderá a un antígeno
diferente. De este modo podremos conocer la cantidad de proteína y la cantidad de anticuerpo
específico en gel, y se podrá realizar una relativa cuantificación de los componentes.
En esta técnica las proteínas no se incuban con anticuerpos después de su electroforesis inicial.
5.1.2. Inmunoelectroforesis en cohete

La inmunoelectroforesis en cohete debe su nombre a la forma característica del precipitado en
el gel.
Consiste en cargar diluciones seriadas en el gel con aumento progresivo de la cantidad de

antígeno, de forma sucesiva y en perpendicular a la dirección del campo eléctrico, al mismo
tiempo que el anticuerpo se encuentra dosificado por el gel.
5.1.3. Contrainmunoelectroforesis
La contrainmunoelectroforesis consiste en utilizar el principio de migración de las
inmunoglobulinas y proteínas; las primeras migran hacia el polo negativo y las segundas hacia
el positivo. En esta técnica se colocan de forma inversa a su migración para provocar su
encuentro.
Se coloca el suero con los anticuerpos en el polo positivo y se sitúan las proteínas cerca del
polo negativo. Estas migrarán hacia el polo positivo. De este modo, ambos se encontrarán a
una distancia intermedia, certificando así la interacción.
Ensayo de hemoglutinación.
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La inmunoelectroforesis de afinidad se basa en el cambio de conformación de una proteína

cuando existe una interacción con su ligando. Se emplea para hacer una estimación de las
constantes de unión.
Esta variación se ha usado en la identificación de alérgicos a través de su reacción con

inmunoglobulina E (IgE).
5.2. Técnicas de
inmunodifusión
Las técnicas de inmunodifusión se llevan a cabo usando un soporte de agar donde se propagan
los antígenos y los anticuerpos. Se establece un equilibrio entre las concentraciones de
antígenos y de anticuerpos.
La inmunodifusión radial es una técnica que puede determinar cuantitativamente la con-

centración de un antígeno, es decir, puede averiguar la cantidad de antígeno de la muestra.
20
Este es un tipo de método usado en la investigación clínica para detectar niveles de proteínas
plasmáticas. Se basa en incorporar un anticuerpo a una placa de agarosa solidificada. Se
cortan pocillos dentro de la agarosa y se llenan concentraciones conocidas de antígeno
correspondientes al anticuerpo que queremos estudiar. El objetivo es obtener una curva de
calibración.
Se colocan las muestras en los pocillos. Habrá complejo antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) en toda
la zona circundante al pozo dentro de la línea precipitina. Cuando se forma esta línea significa
que la proporción de antígeno-anticuerpo es equiparable. Esta es conocida como la zona de
equivalencia. Esta reacción tarda de 24h a 48h en realizarse.
La difusión radial del pocillo central permite conocer las muestras que tienen la concentración adecuada del
antígeno por la formación del frente de precipitación.
complemento
En estas técnicas se unen el antígeno y el anticuerpo de tal manera que forman un
inmunocomplejo que activa el complemento. Se añade un sistema indicador recubierto de
anticuerpos específicos.
Estos complejos pueden lesionar membranas celulares (eritrocitos y otras células). Si se lisan
los eritrocitos (hemólisis) significa que hay complemento libre que no se fijó en el primer
complejo y que, por tanto, no hay anticuerpos en el suero.
Se utilizan en el diagnóstico de la brucelosis, que es una enfermedad infecciosa que ocurre por
el contacto con animales portadores (si se tiene contacto con carne infectada o la placenta de
animales infectados, o si se bebe leche o se come queso sin pasteurizar) de la bacteria llamada
Brucella, que se manifiesta con síntomas similares a los de la gripe.
21
7. Diagnóstico y
seguimiento serológico
de enfermedades
infecciosas
El diagnóstico es la determinación de una enfermedad por los signos o síntomas que le son
propios.
El diagnóstico de las enfermedades infecciosas se efectúa en dos fases:

Se basa en el estudio de las
manifestaciones clínicas y de los antecedentes epidemiológicos. No proporciona un
Se basa en el descubrimiento del

agente etiológico en una muestra biológica, o bien de las alteraciones que su presencia ha
producido en el sistema inmunitario.
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El diagnóstico de certeza o de confirmación de enfermedades infecciosas, como se ha

mencionado, se puede establecer mediante la identificación del agente patógeno y utilizando
algunas técnicas que se comentarán a continuación, o bien mediante la detección de antígenos
o anticuerpos en el paciente, a partir de técnicas de inmunodiagnóstico.
Las técnicas de inmunodiagnóstico se pueden aplicar a distintas muestras biológicas, pero la

más frecuente es el suero. En este caso, se habla de diagnóstico serológico. Existen numerosas
técnicas para la detección en un suero de anticuerpos específicos frente a los antígenos
procedentes de patógenos.
Los datos para el diagnóstico clínico-epidemiológico y de laboratorio son:
• Datos clínicos (signos y síntomas): -

nomegalia, etc.
• Datos epidemiológicos: lugar de residencia, procedencia o viajes, alimentos consumi-
dos, características de la vivienda (provisión de agua, eliminación de excretas), presen-
cia de animales domésticos, antecedentes maternos, etc.
• Diagnóstico etiológico:
tejido.
• Diagnóstico inmunológico: determinación de antígenos o anticuerpos en muestras
biológicas; estudio de la respuesta celular.
Ilustración de un patógeno, bacterias y células bacterianas en microscópico.
El seguimiento de las enfermedades infecciosas se realiza a partir del seguimiento serológico,

que es un proceso infeccioso que tiene como finalidad no solo diagnosticar la enfermedad,
sino también conocer la fase de la enfermedad, su evolución, el pronóstico y el riesgo de
enfermedad congénita.
23
El seguimiento también aporta datos importantes en estudios epidemiológicos y tiene
En el seguimiento de pacientes sometidos a terapia con preparaciones de

inmunoglobulinas por hipogammaglobulinemias.

En el diagnóstico diferencial de gammapatías monoclonales idiopáticas benignas de las
paraproteinemias por mieloma.
Para hacer un correcto diagnóstico y un seguimiento serológico de las enfermedades infeccio-

sas se tendrá en cuenta una serie de técnicas metodológicas mediante las cuales se obtendrán
los resultados.
7.1. Inmunodifusión radial

Con la técnica de inmunodifusión radial es posible estudiar los niveles séricos de las
diferentes inmunoglobulinas (A; M; D; G), los déficits o aumentos de inmunoglobulinas en
el caso de hipo o hipogammaglobulinemias que podemos encontrar en ciertas enfermedades
hepáticas, autoinmunes, etc.
Esta técnica también permite analizar los niveles de las cadenas ligeras (kappa y lambda),
como en el caso de los mielomas (tipo de cáncer).
Además, permite determinar algunos componentes de la secuencia del complemento

como el C1q, C3, C4, C1 inhibidor, y el CH50.
La dosis del complemento, una hipocomplementemia, es importante en el caso del estudio

del lupus, por ejemplo. El C1 es útil para el diagnóstico de una enfermedad llamada edema
angioneurótico hereditario o familiar. En este caso, veremos que el C1 inhibidor o bien la enzima
que controla uno de los primeros pasos de su secuencia de activación estarán ausentes.
El edema angioneurótico o angioedema es una reacción de la piel, de las mucosas y de los

tejidos submucosos donde se produce una rápida tumefacción (edema) inducida por alergia
o medicamentos.
7.2. Inmunoelectroforesis
La técnica de inmunoelectroforesis es altamente útil en la determinación de bandas
monoclonales para ver su composición exacta. Se trata de una electroforesis que se revela con
antisueros específicos.
En el proteinograma (electroforesis de las proteínas en suero), la región de las gammaglobu-

linas se representa por una zona o banda terminal difusa que la situamos tras la beta2
24
globulinas. La aparición de bandas patológicas concretas podría centrarse en cualquier nivel,

siendo por ello necesario hacer el estudio inmunoelectroforético.
La inmunoelectroforesis será útil en la clasificación de los mielomas y también en la

detección de bandas monoclonales que podemos encontrar en determinados síndromes
linfoproliferativos, por ejemplo, la macroglobulinemia de Waldenström, también llamada
linfoma linfoplasmocítico, cuyo componente monoclonal es la inmunoglobulina M (IgM).
Otras patologías monoclonales se pueden observar en la leucemia linfática crónica (cáncer de

la sangre en el que la médula ósea y los órganos del sistema linfático producen demasiados
linfocitos B).
El 8% de los pacientes mayores de 60 años sanos pueden presentar bandas monoclonales

benignas.
Tipos de anticuerpos e inmunoglubinas.
para detectar anticuerpos
antinucleares
Los anticuerpos antinucleares (ANA) se encuentran normalmente en el suero de determinados
enfermos. Esta técnica emplea un sustrato que habitualmente es hígado de rata, del cual se
hacen cortes finos y se fija sobre un portaobjetos.
Se incuba junto con el suero que se va a estudiar, se lava y se añaden las antiglobulinas
humanas marcadas con fluoresceína o rodamina. Esta última es un colorante que se utiliza
en aplicaciones de biotecnología (microscopia de fluorescencia, citometría de flujo, etc.) y los
ELISA (ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas).
Volvemos a hacer una incubación y lavado. Las preparaciones están listas para observar al
microscopio de fluorescencia. Si el suero del paciente tenía ANA, estos se fijarán a nivel de estas
estructuras, apareciendo la fluorescencia positiva en los núcleos.
Para hacer un correcto estudio, hay que tener presentes dos parámetros: el título de positi-
vidad y el tipo de patrón.
25
El título de positividad no es más que la dilución del suero estudiado que aún posee
fluorescencia positiva.
En cuanto al tipo de patrón, destacan los siguientes:

equivale a un halo de positividad alrededor del interior del núcleo, no
por fuera. Este patrón traduce anticuerpos anti ADN de doble cadena.

Los anticuerpos ENA (antígeno nuclear extraíble) son los encargados de producir este
patrón. Estos antígenos tienen dos fracciones: una es la fracción resistente a la ribonuclesa
(SM) y la otra corresponde a la fracción ribonucleasa (NP), que es un enzima catalizador de
la lisis del ARN en componentes más simples.
por anticuerpos antinucleares dirigidos contra varias partes del núcleo de diferente
naturaleza.
anticuerpos anti ARN ribosomal.
Estás técnicas anteriores son las que se llevan a cabo para diagnosticar enfermedades
reumáticas y del tejido conectivo como:
Lupus eritematoso diseminado (LED): enfermedad autoinmune crónica, de diferentes
manifestaciones, que puede afectar a uno o varios órganos como la piel, las
articulaciones, las células de la sangre, los riñones y el corazón.
Síndrome de Sjoëgren: enfermedad autoinmune sistémica que afecta a las glándulas
exocrinas donde la manifestación sintomática principal es la sequedad de ojos y de boca.
Esclerodermia: enfermedad del tejido conectivo difuso que se caracteriza por cambios en
la piel, vasos sanguíneos, músculos esqueléticos y órganos internos.
Enfermedad media del tejido conectivo.
Poliomielitis: enfermedad contagiosa, también llamada polio y parálisis infantil, que se
produce por una infección del poliovirus, afectando principalmente al sistema nervioso.
Dermatomiositis: enfermedad autoinmune del tejido conectivo en que se produce una
La principal utilidad de las técnicas de fluorescencia es la exclusión del LED. Prácticamente

todos los pacientes con lupus disponen de anticuerpos antinucleares, es decir, si esta técnica
es negativa, excluye el LED.
Si los anticuerpos antinucleares son positivos, esto no indicará necesariamente que estamos
ante un lupus, debido a que otras enfermedades también pueden presentar anticuerpos
antinucleares positivos.
La característica más común del lupus es un título elevado y un patrón periférico o bien
homogéneo. Si el título fuera elevado y el patrón moteado, podría tratarse de un LED como
de una enfermedad mixta del tejido conectivo. El patrón nuclear es típico de la esclerodermia.
Si el título, en cambio, no es elevado, la diferenciación de esta alteración será mucho más

complicada y deberemos realizar otras técnicas más sofisticadas como son:
Técnicas de detección de los anticuerpos anti ADN.
Técnicas de determinación de anticuerpos anti ENA.
26
Técnicas de estudio de anticuerpos antitisulares.
7.3.1. Técnicas de detección de los

anticuerpos anti ADN
Se caracterizan por la utilización de radioinmunoanálisis (RIA), un método que emplea

isótopos radiactivos in vitro, y es analizada para observar sustancias.
Y también de flagelados. Concretamente, la Crithidia (flagelado Chrithidia lucilia), un flagelo

que en la base de su azote tiene una estructura llamada quinetoplasto con ADN de doble
cadena y, por tanto, si vemos que estas Crithidias presentan inmunofluorescencia a nivel del
quinetoplasto, podemos decir que estamos frente a anticuerpos anti ADN.
Estos anticuerpos anti ADN son más específicos en el lupus que los ANA.
7.3.2. Técnicas de determinación de

anticuerpos anti ENA
Los anticuerpos anti ENA se dirigen a los antígenos nucleares no histonas. Comprenden seis
tipos distintos, que son los siguientes: anti Sm, anti RNP, anti Ro/SSA, anti La/SSB, anti Scl
70 y anti Jo1.
Entonces, las técnicas de determinación de anticuerpos anti ENA resultan útiles en algunos
casos. Su problema radica en que son muy sofisticadas, como la inmunofijación (ver aparta-
do 5).
Los anticuerpos anti ENA podrán ser detectados por técnica de hemaglutinación o bien por
técnicas de contrainmunoelectroforesis. Estas ENA están formadas por dos fracciones (SM y
RNP); al encontrar anticuerpos anti SM es prácticamente diagnóstico de LED.
El problema es que tan solo el 20 % de los LED presentan anticuerpos anti SM. En cambio, se
observa la presencia de los anticuerpos anti RNP tanto en el LED como en las conectivopatías
mixtas, pero con la particularidad de que en las conectivopatías el título es mucho más elevado.
Las conectivopatías mixtas, también llamadas enfermedades mixtas del tejido conectivo
(EMTC), son un trastorno sistémico autoinmune que se presenta con algunas manifestaciones
clínicas sugestivas de colagenosis como fenómeno de Raynaud, fotosensibilidad, sequedad
ocular y otras.
Es posible que el patrón moteado aparezca en el LED y en las conectivopatías mixtas y,

cuando estemos frente a él, debemos realizar un tratamiento con ribonucleasa sobre el mismo
corte. Si desaparece, se puede concluir que era debido a RNP y, por tanto, se tratará de una
conectivopatía.
27
7.3.3. Técnicas de estudio de anticuerpos

antitisulares
- Un 94 % de cirrosis biliar primaria.
El sustrato es el riñón del individuo - Un 25 % de hepatopatías crónicas
Antimitocondriales
enfermo. activas.
- Otro 25 % de cirrosis criptogenética.
- De un 40-70 % de hepatopatías crónicas
activas.
Anti músculo liso El sustrato es el estómago de rata. - Un 50 % de cirrosis biliar primaria.
- Un 25 % de cirrosis criptogenética.
- Un 90 % de las anemias perniciosas.
- Un 33 % de las tiroiditis crónicas
(inflamación de la glándula tiroides por
Anti células parietales El sustrato es el estómago de rata. una reacción del sistema inmunitario).
- Un 25 % de los síndromes de Sjoëgren.
- Un 20 % de los uclus.
El sustrato son células
Anti suprarrenales - Un 40-60 % es enfermedad de Addison.
suprarrenales hiperplásicas.
28
Anti islotes de Langerhans El sustrato es páncreas humano. - Un 70 % es diabetes tipo 1.

- Un 70-90 % de las tiroiditis crónicas.
- Un 60 % de los hipotiroidismos
primarios (hipofunción de la glándula
tiroides).
Anti microsomales El sustrato es el tiroides humano. - Un 50 % de las tirotoxicosis.
- Un 10 % de los bocios simples

(agrandamiento regular de la glándula
tiroides).
-Un 15 % de los tumos tiroideos.
- Un 75 % de las tiroiditis crónicas.
- Un 75 % de mixedema (alteración de los
El sustrato es la hemaglutinación tejidos por un mal funcionamiento de la
glándula tiroides).
Anti tiroglobulina utilizando hematíes de cordero
recubiertos de tiroglobulina. - Un 75 % de enfermedad de Graves
Basedow (enfermedad autoinmune que
estimula la glándula tiroides provocando
el aumento de tamaño y la hiperfunción).
La detección de anticuerpos antitisulares se fundamenta en las mismas técnicas que las que
emplean los anticuerpos antinucleares, con la diferencia de que utilizan sustratos diferentes.
En cuanto al diagnóstico y el manejo de la enfermedad infecciosa, las pruebas serológicas

basadas en la reacción antígeno-anticuerpo son una herramienta imprescindible.
Los procedimientos más comunes son la técnica de captura, para el estudio del antígeno, y la
técnica indirecta, para el análisis de los anticuerpos, como se describe a continuación.
Las técnicas de captura se utilizan para conocer si un paciente tiene circulante el antígeno
de superficie del virus de la hepatitis B (AgsHB). La casa comercial proporciona un sistema
de detención basado en una placa de multipocillos de poliestireno unido a un anticuerpo
monoclonal específico contra el AgsHB. Al poner en contacto el suero del paciente, si realmente
hubiera AgsHB, daría positivo.
Las técnicas indirectas, por otro lado, son utilizadas para ver la presencia de anticuerpos
IgG, IgM o IgA para un determinado antígeno, ya sea virus, parásito, bacteria u hongo. La casa
comercial proporciona las placas de poliestireno sensibilizadas con los antígenos respectivos.
Por ejemplo, si pretendemos investigar anticuerpos contra el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH), para establecer un diagnóstico de infección por VIH. Al poner en contacto el
suero del paciente, si realmente hubiera anticuerpos, daría negativo.
En definitiva, los resultados de las pruebas serológicas deben ser valorados dentro del
contexto de una correlación clínica para evitar falsos positivos o negativos.
Para ello, es imprescindible realizar interconsultas clínicas de los pacientes. La interacción

dentro del equipo clínico y el laboratorio justifica un estudio personalizado y focalizado que
evitará errores en el diagnóstico, consiguiendo, así, el mejor tratamiento para el paciente.
29
2
primarias.
Aplicación de
en reacciones
técnicas basadas
antígeno-anticuerpo 31
TÉCNICO SUPERIOR EN LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO Módulo | Técnicas de inmunodiagnóstico.
1. Inmunoensayos ........................................................................................ 33
2. Representación de datos y obtención de resultados ............................... 38
..................................................... 43
4. Enzimoinmunoensayos............................................................................. 44
5. Radioinmunoensayos ............................................................................... 51
6. Fluoroinmunoensayos .............................................................................. 54
7. Inmunoensayos quimioluminiscentes ...................................................... 58
.................................................................. 59
............................................................ 60
10. Técnica Western blot o inmunoblot ........................................................ 62

32
Objetivos
Analizar la representación de datos y obtención de resultados.
Conocer los enzimoinmunoensayos homogéneos y heterogéneos, los
Conocer la técnica Western blot o inmunoblot

1. Inmunoensayos
1.1. Características de los

inmunoensayos
Los inmunoensayos constituyen un conjunto de técnicas de laboratorio con base inmu-
noquímica. Se realizan a partir de la afinidad de la reacción antígeno-anticuerpo para la
cuantificación de un analito, que es uno de los componentes de dicha reacción.
En esta unidad desarrollaremos las técnicas básicas usadas en materia de inmunoensayos,

que se distinguen por el analito que se va a cuantificar y por el método empleado parar
detectar la reacción, que puede ser colorimétrico, radiológico o fluorescente. Estas diferencias
determinarán sus aplicaciones específicas.
Un inmunoensayo se caracteriza por la unión antígeno-anticuerpo, que da lugar a un complejo

reversible. El tiempo que permanezcan unidos irá en función del grado de adaptación entre las
moléculas, así como de la fuerza (afinidad) y de la estabilidad de los enlaces que los vinculan.
33
La afinidad es la fuerza que se ejerce cuando un antígeno y un anticuerpo se unen. Su valor
depende de la suma de todas las fuerzas que intervengan en esta vinculación.
Puede que un anticuerpo tenga varias zonas de unión a los antígenos (lo que se denomina un
anticuerpo multivalente), y un antígeno puede poseer varios determinantes antigénicos.

Cuando ocurre esta unión, puede haber una afinidad total (o avidez), que representa la suma
de todas las uniones individuales, o parcial, solo con algunos sitios de unión.
Además, la unión es de carácter reversible, por lo que el anticuerpo se une a un epítopo del
antígeno. El epítopo es un fragmento de la molécula de un antígeno que es reconocido por
el anticuerpo o una célula del sistema inmune. Normalmente son estructuras de superficie.
Cuando aparecen varios epítopos en regiones cercanas a la molécula de antígeno se denominan
determinantes antigénicos.
Para cuantificar una molécula mediante técnicas de inmunoensayo, se requiere un anticuerpo

que sea capaz de unirse específicamente a la estructura molecular. Esta unión debe ser lo más
específica posible: lo más recomendable es que el anticuerpo sea solo capaz de unirse a este
antígeno concreto.
Puede darse el caso de que un mismo anticuerpo se una a epítopos que son parecidos, pero
pertenecen a diferentes antígenos; este fenómeno recibe en nombre de reactividad cruzada.
En el diseño de un inmunoanálisis es importante tener en cuenta este fenómeno e intentar
evitarlo.
El inmunoanálisis es un conjunto de técnicas metodológicas con un fundamento común: la
afinidad entre un antígeno y un anticuerpo. Se utiliza para la cuantificación tanto de anticuerpos
como de una gran variedad de moléculas que actúan como antígenos, entre las que se incluyen
patógenos, hormonas, enzimas, etc.
Debemos tener clara la noción de enzima, que es una molécula proteica que cataliza una
reacción química. Se trata de una reacción que se da en la naturaleza y que genera un tipo
de sustrato, una sustancia producida en la reacción y se convierte en producto. Es decir:
SUSTRATO > ENZIMA > PRODUCTO.
1.2. Tipos de inmunoensayos

Existen dos tipos principales de inmunoensayos:
Inmunoensayos directos, en los que se mide directamente el complejo antígeno-
anticuerpo formado.
Inmunoensayos con reactivos marcados o indirectos, que requieren el uso de
La mayoría de técnicas son de tipo indirecto. Las clasificaciones más importantes derivadas
de este grupo dependen del fundamento de la técnica, el método de separación y la técnica
de marcaje.
1.2.1. Inmunoensayos según el

fundamento de la técnica
34
Hablamos de inmunoensayo competitivo cuando se usa un analito análogo marcado, que

compite con el que se quiere cuantificar por la unión al anticuerpo.
Por el contrario, hablamos de inmunoensayo no competitivo cuando se emplea un anti-

cuerpo marcado que se une específicamente al analito (que es su antígeno).
Para distinguirlos, es importante reconocer si se establece o no competencia en la formación

de inmunocomplejos, o si es necesario retirar o no las moléculas que no han formado
inmunocomplejos.
Los competitivos:
Para determinar un antígeno en una muestra problema, se añade el anticuerpo correspon-

diente, y una cantidad determinada del mismo antígeno (patrón). El antígeno de la muestra y
el antígeno marcado competirán por los anticuerpos.
Posteriormente, se mide la cantidad de antígeno marcado que no se ha conjugado, que será

inversamente proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra (cuanto más
antígeno haya en la muestra, menos antígeno marcado podrá formar inmunocomplejos).
Se puede proceder con el mismo mecanismo para determinar un anticuerpo, o sea, añadiendo
en este caso antígeno y anticuerpo marcado.
Los
Para determinar un antígeno en una muestra problema, se añade un anticuerpo marcado.

Cuanto mayor sea la cantidad de antígeno presente, más anticuerpos marcados se unirán a él.
La cantidad de anticuerpo marcado que ha formado inmunocomplejos es directamente
proporcional a la concentración de antígeno presente en la muestra problema.
Igual que sucede en el caso anterior, se puede aplicar el mismo principio para determinar un
anticuerpo, añadiendo el antígeno marcado.
Veámoslos más detenidamente.
Inmunoensayos competitivos
Esta técnica se fundamenta en la competencia de dos antígenos por un anticuerpo.
El analito que se quiere cuantificar es un antígeno que no presenta marcaje. También se utiliza
otro analito, que deberá estar marcado con una técnica concreta para facilitar su cuantificación.
Para que la reacción ocurra de forma competitiva, el epítopo debe ser exactamente el mismo,
aunque no es necesario que el resto de la molécula también lo sea. La unión antígeno-
anticuerpo no debe bloquear la capacidad del analito encargado marcadamente de emitir la
señal.
En un ensayo competitivo, el analito que se desea cuantificar compite con uno sintético, que
está marcado, y es homólogo al primero en cuanto al sitio de unión al anticuerpo.
En el inmunoensayo competitivo, medir una menor concentración de analito marcado

implica que en la solución haya mayor cantidad del antígeno sin marca (analito problema). La
35
concentración de antígeno está, por tanto, inversamente relacionada con la intensidad de la
señal emitida.
El inmunoensayo competitivo puede ser de un solo paso y de dos pasos.
En el inmunoensayo competitivo de un solo paso, la dilución de antígeno marcado (Ag*) y la

muestra sin marcar (o el analito de la muestra) se hacen reaccionar a la vez con una cantidad
limitada de anticuerpo. Según lo que hemos comentado respecto a los tipos de uniones,

pueden ocurrir las siguientes: Ag*-Ac y Ag-Ac.
Ambas tienen lugar al mismo tiempo; la proporción de una u otra unión se relaciona
directamente con las concentraciones de antígeno libre y marcado.
En el inmunoensayo competitivo de dos pasos, la concentración de anticuerpo del reactivo

se encuentra en cantidades excesivas en comparación con la concentración de antígeno. El
anticuerpo se incuba primero con la muestra que contenga el antígeno de interés. De esta
forma, todo el analito puede unirse específicamente.
Una vez que está unido, dado que el anticuerpo está en exceso, en un segundo paso se agrega
el antígeno marcado que solo llega a ocupar los anticuerpos que no se unieron al primero.
Inmunoensayo competitivo en un paso donde un analito se encuentra marcado.
Inmunoensayos no competitivos
Este es un tipo de técnica que generalmente proporciona un nivel mayor de sensibilidad

y especificidad. Se conoce como ensayo tipo sándwich porque el antígeno se une
específicamente a dos anticuerpos.
y otro para la detección de dicha unión.

36
El hecho de que sea el segundo anticuerpo el que presenta la señal, la intensidad de la misma
es directamente proporcional a la concentración del analito.
En este punto debemos recordar que la especificidad es la capacidad de un estimador para

dar como negativos unos resultados referentes a individuos sanos. Es decir, es el porcentaje de
verdaderos negativos o la probabilidad de que la prueba sea negativa si la enfermedad no está

presente.
Por otro lado, la sensibilidad se refiere a la capacidad del estimador para dar como positivos los
resultados de individuos enfermos, entendidos como enfermos correctamente diagnosticados
mediante las técnicas y las interpretaciones oportunas.
1.2.2. Inmunoensayos según el método de

separación
Según la técnica que se aplique, el resultado se puede interpretar de varias formas: bien
directamente (inmunoensayos homogéneos), o bien retirando del medio las moléculas que no
se han conjugado (inmunoensayos heterogéneos), cuando esto sea necesario.
Veámoslos con más detalle.

Inmunoensayos heterogéneos
Son inmunoensayos que requieren la separación de los inmunocomplejos y las moléculas

no conjugadas.
Estas técnicas normalmente usan un reactivo de fase sólida al cual se fijan los complejos: la
separación de las moléculas no conjugadas se suele realizar mediante lavados.
Este tipo de inmunoensayos permite determinar sustancias de alto peso molecular.
En concreto, el antígeno marcado unido (Ac-Ag*) debe ser físicamente separado del que
permanece libre en la disolución (Ag*).
Inmunoensayos homogéneos
Son inmunoensayos que no requieren la separación de las moléculas sobrantes, es decir, la

separación física del complejo unido y del Ag* libre no es necesaria.
Se trata de técnicas más rápidas y fáciles de realizar que los heterogéneos, ya que no requieren
una fase sólida y generalmente se basan en una inhibición o activación de una reacción
enzimática por parte del complejo antígeno-anticuerpo.
37
Son usadas principalmente para determinar sustancias de bajo peso molecular y de
concentración elevada, como pueden ser las drogas o algunas sustancias estupefacientes.
1.2.3. Inmunoensayos según el tipo de

marcaje

Existen varios métodos para marcar el complejo antígeno-anticuerpo. En función del marcaje
utilizado, los tipos de inmunoensayos son los siguientes:
Radioinmunoensayos.
métodos radiológicos.
Fluoroinmunoensayos. Para la realización de esta técnica, el anticuerpo se marca con un
Enzimoinmunoensayos.
los enzimoinmunoensayos, hay que señalar los quimioinmunoensayos, en los cuales la

enzima cataliza la oxidación de un sustrato.
2. Representación de
datos y obtención de
resultados
Existen dos medios a través de los cuales se obtienen los resultados de los inmunoensayos:
Expresando el valor medido a través de un formato normalizado. Se trata de
ensayos protocolizados en los que aparecen establecidos los criterios de obtención e
la prueba una solución patrón, cuyo valor para el parámetro que se mide es conocido.
Obteniendo el resultado por extrapolación en una curva patrón. En este caso, se
elabora una curva patrón de referencia utilizando unos sueros de control (calibradores). El
resultado de la muestra se obtiene, pues, extrapolando el resultado obtenido en la curva.
Los inmunoensayos comerciales incluyen calibradores ya preparados, que son soluciones
con valores conocidos que establecen la relación entre la cantidad de señal producida en
el ensayo y la concentración de analito.
de calibración (explicada en el apartado siguiente), bien a partir de datos captados

directamente por el sistema o bien a partir de datos introducidos manualmente.
38
Los resultados que facilita el laboratorio deben ser comparables a los de otros. Solo así se
podrán contrastar los datos e interpretar la información en la elaboración de estudios conjuntos
o complementarios. Esto también será garantía de que los métodos técnicos y los resultados
clínicos han pasado por un proceso correcto y normalizado.
Antes de continuar debemos tener claro que:

La intensidad de señal y la concentración de analito/antígeno son dos parámetros que

presentan una relación mantenida pero no lineal, debido a que la reacción experimenta un
proceso de saturación.
La saturación de una reacción se entiende como el punto en el que la reacción ya no admite

más sustrato. Aplicado a los inmunoensayos, uno de los componentes (ya sea antígeno o
anticuerpo) está completamente unido, de forma que, aunque se aumente la cantidad del otro,
no ocurre más reacción.
Cuando la unión antígeno-anticuerpo es total, en los inmunoensayos existe un reactivo

limitante. Por mucho que aumente la concentración del analito, la intensidad se mantiene.
Como hemos comentado, para determinar en qué concentración de analito corresponde un

valor de intensidad se utilizan las curvas de calibración.
2.1. Curva de calibración
Este método utiliza una serie de diluciones en las que el analito se encuentra a una
concentración conocida y creciente. Estas soluciones reciben el nombre de calibradores y
pueden ser comerciales o crearse manualmente.
El calibrador es una mezcla que contiene una cantidad conocida del analito a cuantificar. Su
utilización permite generar la curva de calibración.
Se procesa por el ensayo y se determina la intensidad de la señal. Los valores obtenidos

establecen los puntos de una función. Así, se genera la ecuación matemática que establece la
correlación entre los parámetros.
Dicha ecuación se usa posteriormente para interpolar los valores de intensidad de la muestra y
obtener la concentración del analito problema.
La curva de calibración permite extrapolar los valores de intensidad de la señal obtenidos

de una muestra, gracias a la utilización de calibradores de concentración conocida. Este
procedimiento se puede automatizar en los análisis, y el aparato correspondiente proporciona
de inmediato el dato de concentración del analito.
Es imprescindible que el material de calibración se trate adecuadamente de acuerdo con el

inserto de fabricación, y que el criterio de aceptación sea el apropiado.
39
Los calibradores líquidos, refrigerados y listos para usar aseguran una menor posibilidad de
error por parte del operador comparados con aquellos que requieren ser reconstituidos o
descongelados manualmente.

2.2. Controles
Como es lógico, durante la ejecución de cualquier técnica analítica puede darse el caso de que
ocurran errores, ya sean de naturaleza humana (errores de manipulación) o errores sistemáticos
del aparato (por daño en los canales, trabajo en temperaturas inadecuadas, etc.).
A pesar de la fiabilidad de las técnicas, que cada vez son más eficaces y optimizadas, estos
errores pueden no ser detectados por el aparato, en cuyo caso se obtienen unos resultados
incorrectos. Para evitar esta situación, se tiende a utilizar controles cuando se realiza una
medición.
Los controles son muestras que contienen concentraciones de analito conocidas. Monitorizan,
así, la exactitud y la precisión del ensayo y también del analizador.
Para ello, el control debe situarse dentro de un rango. Una vez que se han efectuado estos
pasos previos, el análisis del paciente se puede iniciar.
En cada análisis, se utilizan dos controles:

El primer control contiene una concentración de analito muy baja o ausente; el aparato
dará este primer control como negativo.
El segundo control contiene una alta concentración; este segundo control debe dar
positivo.
Normalmente se introducen controles en cada análisis, pero los procedimientos pueden variar
en función de las especificaciones del fabricante.
2.3. Blanco de calibrado

En un inmunoanálisis resulta crucial la especificidad de la unión antígeno-anticuerpo.
La situación ideal para la cuantificación de un analito sería un anticuerpo que se uniera
únicamente al antígeno problema.
Sin embargo, esto no siempre ocurre así. Se ha demostrado que existe un cierto grado de
vinculación de los anticuerpos a moléculas de forma inespecífica. Teniendo en cuenta que esto
podría alterar los resultados, en algunos ensayos se utilizan blancos.
Los blancos son soluciones que contienen todos los componentes de la disolución que se va
a cuantificar excepto el analito problema. Si hay reacción en ellos, será únicamente debido a
40
la unión inespecífica.
El valor obtenido se restaría al resultado logrado de la solución completa. La diferencia

corresponde a la unión específica entre antígeno-anticuerpo.
Un blanco cuantifica la unión inespecífica producida en la reacción.

2.4. Interpretación de los

resultados
Teniendo en cuenta que en la cuantificación de un determinado analito el aparato tiene un
valor de concentración, la respuesta que se obtiene del instrumento debe convertirse a
respuesta binaria (tipo SÍ/NO), lo que conlleva un tratamiento de los datos obtenidos.
La presencia o la ausencia de un determinado analito depende del nivel al que interese

detectarlo.
Hay ciertos analitos cuya presencia, aunque sea en muy baja concentración, es suficiente para
determinar la prueba como positiva. En este caso, la interpretación de los datos es más sencilla.
Generalmente, esto no ocurre así. Lo normal es que un determinado analito esté presente
a bajas concentraciones en el cuerpo de un individuo. Pero solo si aumenta mucho resulta
característico de alguna patología. Un ejemplo de esto podrían ser algunos marcadores
tumorales.
Las moléculas que actúan como marcador en reacciones antígeno-anticuerpo primarias se

deben producir al antígeno o al anticuerpo complementario al que se desea determinar, sin
alterar su capacidad de unirse al anticuerpo o al antígeno de muestra.
También podemos encontrarnos con la situación a la inversa: alguna sustancia que aparece
a una alta concentración en condiciones normales, se vea muy disminuida, siendo causa o
consecuencia de alguna patología, como sucede con las hormonas.
Debido a esto, se requiere la fijación de un límite que ayude a distinguir lo que es un valor
normal de uno alterado. Estos límites se denominan punto de corte.
2.4.1. Punto de corte

Generalmente, existen unos valores que determinan la cantidad máxima y la cantidad mínima
de contenido de un determinado analito.
Para que un valor resulte positivo, la concentración debe ser muy alta. Entonces, dependiendo
de lo restringido que sea el punto de corte, para dar un resultado positivo, se calculan los
parámetros de sensibilidad y especificidad del análisis.
41
El punto de corte, cut off en inglés, es un valor cuantitativo a partir del cual el resultado que
se obtiene es positivo.
Ponemos por ejemplo un marcador tumoral. Si determinamos un punto de corte demasiado

alto, aseguramos que todo valor que esté por encima de él indicará muy probablemente que la

persona está afectada de un tumor; estos casos se denominan verdaderos positivos.
Esto, sin embargo, conlleva la posibilidad de dar como negativos valores también significativos,
lo que puede conducir a que se escapen personas que asimismo están afectadas del tumor
pero que no tienen un valor tan alto del analito; esto sería un caso de falso negativo.
Por el contrario, si determinamos un punto de corte demasiado bajo, obtendremos el efecto

opuesto. Los pacientes afectados serán diagnosticados como positivos, pero puede haber
sanos que también lo sean.
Los valores del punto de corte vienen registrados por el fabricante y determinados por
la legislación vigente. Para su determinación, además, se han llevado a cabo importantes
investigaciones estadísticas.
2.4.2. Resultados indeterminados

Otra posible situación que podemos encontrarnos es obtener resultados indeterminados.
Cuando realizamos dos determinaciones de una misma muestra, nunca o casi nunca lograremos
el mismo resultado. La variabilidad de estos resultados es una característica intrínseca del
análisis denominada precisión.
Si el resultado se sitúa muy cerca del punto de corte, ocurre que, dependiendo de la precisión,
puede resultar positivo o negativo en diferentes determinaciones. Estos se denominan
resultados indeterminados.
Dado que son resultados inconcluyentes, suele requerirse la repetición del análisis transcurrido
un tiempo.
Un resultado puede variar ligeramente en diferentes determinaciones según la precisión. Por

tanto, al efectuar un inmunoensayo, obtenemos tres posibles resultados:
resultado que está por debajo del punto de corte.
muy cercano al valor del punto de corte.
valor que sobrepasa el punto de corte.
42
3. Sistemas de
señales
Una de las problemáticas más frecuentes de los inmunoensayos es la detectabilidad de la
reacción. La detectabilidad es la capacidad que tiene un test de medir valores próximos al cero,
que es el punto de referencia.
El objetivo es aumentar la capacidad de detectar la reacción. En este caso, hay tres estrategias
que se llevan a cabo para aumentarla:
Optimización de los sistemas de detección del marcador.
Como ya comentamos, hay varios métodos para marcar el complejo antígeno-anticuerpo. La

elección del marcaje determinará la metodología para amplificar su señal:
Los enzimoinmunoensayos tienen que ver con el marcaje en enzimas, donde son de
gran utilidad las moléculas que actúan de conexones. Este concepto se explica con el
43
ejemplo de la biotina-avidina.
La biotina y la avidina son moléculas con una capacidad muy alta de agregación y pueden
llegar a formar grandes polímeros. La biotina tiene una elevada facilidad de unión a
macromoléculas biológicamente activas, sin alterar su función. Se usa esta capacidad
para crear amplias redes de biotina-avidina-enzimas marcadoras que se acoplan a un solo
anticuerpo.

Las técnicas de radioinmunoensayos han quedado muy restringidas para la
la señal.
Los contadores beta de centelleo disponen de un sistema en forma de tubo
fotomultiplicador, de manera que por cada electrón que incide, se obtienen entre 5-10
8
.
En los
bastante similar al caso anterior.
el detector.
Los tubos fotomultiplicadores se acoplan, a su vez, a los sistemas de detección de señal y
4. Enzimoinmunoensayos
Los enzimoinmunoensayos son inmunoensayos que utilizan enzimas como marcadores.
En este apartado vamos a analizar los dos tipos de enzimoinmunoensayos: los homogéneos y
los heterogéneos.
4.1. Enzimoinmunoensayos
homogéneos
En un enzimoinmunoanálisis, la cuantificación del conjunto antígeno-anticuerpo se realiza por
la actividad catalítica de una enzima. El producto de la reacción es un complejo antígeno-
enzima-anticuerpo.
Se considera como inmunoanálisis homogéneo el de tipo competitivo, que se corresponde al
44
Así, el analito problema (Ag) compite con el marcado por la unión a una cantidad limitada de
anticuerpos.
No debemos olvidar que, para cuantificar una señal por un enzimoinmunoanálisis, el producto
de la reacción debe estar coloreado o debe poder ser cuantificado por alguna otra técnica.
4.1.1. Inmunoensayos enzimáticos

multiplicados
Los inmunoensayos enzimáticos multiplicados (Enzyme Multiplied Inmunoessay Technique
o EMIT) utilizan una enzima conjugada con el analito de interés como marcador en una
reacción enzima-sustrato.
Su principio se basa en la idea de que se puede determinar la cantidad de interacción entre el

analito y el antígeno o anticuerpo complementarios utilizando un marcador enzimático. No es
necesario tampoco realizar ningún paso de lavado.
Se emplea habitualmente para la determinación de drogas y de ciertas proteínas en el suero y

en la orina.
La reacción inmunológica tiene lugar en un medio líquido (ensayos homogéneos) y se basa

en una reacción de enlace competitivo entre el antígeno de la muestra y el mismo antígeno
marcado con una enzima:
Cuando el antígeno marcado forma un inmunocomplejo, la enzima que lleva unida
Cuando el antígeno marcado no se combina, la enzima se mantiene activa y reacciona
con su sustrato, generando un producto coloreado.
Si en la muestra hay poca cantidad de analito, muchos antígenos marcados podrán formar
inmunocomplejos, lo cual provocará la inactivación de las correspondientes moléculas
de enzima. Y a la inversa, si hay mucha cantidad de analito en la muestra, serán pocos los
antígenos marcados.
La actividad de la enzima se modifica a partir del momento en que el complejo se ha unido,

lo que hace innecesarios los pasos de lavado. Esto es debido a que la actividad de la enzima
es significativamente diferente en ambas situaciones. Este hecho ocurre porque la actividad
catalítica de la enzima se ha visto modulada por la formación del complejo.
En general, la actividad enzimática disminuye cuando el complejo se une. Mayoritariamente,

la inhibición de la enzima se debe a un bloqueo físico de sitio de unión del sustrato al centro
activo. En ciertos casos, también se ha observado un cambio en la conformación de la propia
enzima.
Por otro lado, cuando existe una concentración baja del ligando problema, el antígeno marcado
(Ag*) se une predominantemente al anticuerpo. Esto implica una reducción de Ag* libre y, por
tanto, el anticuerpo resultaría saturado por una elevada cantidad de antígeno problema.
El primer antígeno ensayado mediante este método fue la morfina y se utilizó lisozima como
enzima marcadora. En el conjugado morfinalisozima, la enzima mantiene su actividad.
Cuando los anticuerpos específicos para morfina se unen al conjugado, la enzima pierde su
actividad. El agregado de morfina libera una mezcla de conjugado y anticuerpos antimorfina, y
45
reduce la inhibición de la enzima en forma proporcional a la cantidad de morfina libre presente.
Una variante de este método conllevaría marcar el ligando con una forma inhibida de la
enzima. La unión del anticuerpo al ligando marcado provocaría la desaparición de esta
inhibición, y un aumento de la señal. En este caso, la actividad catalítica sería inversamente
proporcional a la concentración del analito problema.

4.2. Enzimoinmunoensayos
heterogéneos
Los enzimoinmunoensayos se realizan cuando el marcador (la enzima) mantiene su actividad,
tanto si el antígeno está libre como cuando se une al anticuerpo.
Debido a esto, es necesario separar las dos fracciones después de la reacción. Si se introduce
un paso de lavado, se requerirá buscar otros métodos que nos permitan eliminar solo el reactivo
que queda libre, conservando el resto de componentes.
Además, también suele ser necesario emplear un segundo anticuerpo con especificidad por el
primero, aunque también pueden utilizarse otros métodos, como la absorción física a tubos de
poliestireno o placas, etc.
En los enzimoinmunoensayos heterogéneos es imprescindible eliminar específicamente el
reactivo no ligado.
Toda sustancia (antígeno o anticuerpo) puede ser determinada por enzimoinmunoensayo

heterogéneo si cumple los siguientes requisitos:
Capacidad de inducir una respuesta inmune. Al ser inyectada a un animal de
experimentación, debe inducir una respuesta inmune en el mismo, permitiendo obtener
elevados.
Capacidad de unirse a una enzima. Debe ser capaz de unirse a una enzima para
conseguir un rendimiento de conjugado aceptable y estable, sin alterar las propiedades
inmunológicas ni enzimáticas del sistema.
Compatible. La medición de la actividad enzimática debe ser compatible con las
características de la unión antígeno-anticuerpo.
Dependiendo de lo que se pretenda cuantificar, hay varios métodos para realizar los ensayos. A
continuación, vamos a analizarlos por tipos.
4.2.1. Ensayo de inmunoadsorción ligado

a enzimas (ELISA). Ensayos
competitivos
Este tipo de ensayo se clasifica dentro de los enzimoinmunoensayos competitivos para la
46
determinación de antígenos.
Los ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (Enzyme Linked Inmunobsorbent Assay

o ELISA), utilizan antígenos o anticuerpos conjugados con una enzima, de forma que tienen
actividad enzimática además de mantener su actividad inmunológica.
Para la determinación de antígenos, el antígeno

marcado con una enzima compite con el antígeno

sin marcar, presente en la muestra por los lugares
de unión de una limitada cantidad de anticuerpo.
sustancia con el método ELISA o un ensayo

inmunosorbente ligado a enzimas.
El sistema antígeno-anticuerpo se separa del

antígeno libre, ya sea usando el anticuerpo unido
a fase sólida o por un segundo anticuerpo con
especificidad por el primero.
La actividad enzimática en la fracción libre o en

la unida a anticuerpo se determina midiendo
espectrofotométricamente y es inversamente
proporcional a la cantidad de antígeno presente
en la muestra. Este método es análogo al clásico
radioinmunoensayo.
Determinación de antígenos usando anticuerpos marcados
En este caso, el antígeno reacciona con un exceso de anticuerpo marcado. Después de un

periodo en incubación, se agrega un exceso de antígenos unido a fase sólida, lo que reacciona
con el residuo de anticuerpo libre marcado.
Tras separar la fase sólida, se mide la actividad enzimática asociada al anticuerpo en la fracción
soluble. Método de ensayo inmunológico en laboratorio médico, ensayo
de inmunosorbente vinculado a las enzimas o placa ELISA.
47
Método sándwich para la determinación de antígenos
Para este procedimiento, se requiere que el antígeno posea por lo menos dos sitios de unión.
El antígeno reacciona con un exceso de anticuerpo unido a una fase sólida. Tras esta
incubación, todo el antígeno problema debe haberse unido.
Se lava y se trata con un exceso del segundo anticuerpo marcado con la enzima correspon-
diente. Posterior a esto, se procede a una segunda incubación y un segundo lavado. Se agrega
el sustrato específico cuya desintegración es una medida directa de la cantidad de antígeno
presente en la muestra.
48
Enzimoinmunoensayo para la determinación de anticuerpos
En este caso, el procedimiento es igual que el anterior, pero con la diferencia de que la
cuantificación de un anticuerpo ocurre por la unión del antígeno específico a una fase sólida.
Tras la incubación y el lavado, se agrega un segundo anticuerpo marcado con la enzima y que
tiene especificidad por el primer anticuerpo. Después del segundo lavado, se agrega el sustrato
correspondiente y se determina la actividad enzimática, obteniéndose así una medida de la
cantidad de anticuerpos específicos presentes en la muestra.
El segundo anticuerpo posee una especificidad por la región constante del primero.
Este es un método muy práctico, ya que solo con un tipo de anticuerpo antiglobulina humana
conjugada a una enzima, se puede reconocer cualquier clase de anticuerpos humanos sin
importar el tipo de enfermedad que se quiera investigar.
4.2.2. Aplicaciones del
enzimoinmunoensayo heterogéneo
Teniendo en cuenta el carácter sensible, de alta especificidad, simplicidad y estabilidad de los
reactivos utilizados, se han desarrollado numerosas metodologías que ofrecen la posibilidad
de determinar antígenos y/o anticuerpos en fluidos biológicos. Esto se consigue usando
diferentes enzimas según el estudio.
Las actividades enzimáticas más comúnmente utilizadas en los ensayos ELISA son:
Enzima Sustrato Producto

Fosfatasa alcalina Nitro fenil-fosfato Nitrofenol
Peroxidasa Agua oxigenada Agua + Oxígeno
Glucosa 6P deshidrogenasa Glucosa 6P 6P-gluconato
ß-Galacosidasa Galactósidos Monosacáridos
Cabe destacar que pueden reconocerse anticuerpos contra los agentes causantes de:
Parasitosis: enfermedad de chagas, toxoplasmosis, leishmaniasis.
49
Triquinosis, malaria.
Micosis: candidiasis, aspergilosis.
4.2.3. Interferencias de los

enzimoinmunoensayos
En ocasiones, se ha visto que las técnicas y los procesos metodológicos no siempre son
infalibles y existen ciertas limitaciones según el método empleado. Es muy importante quitar
el antígeno libre, usando diferentes técnicas.
Los diferentes métodos usados para limpiar el exceso de reactivo en un ELISA son:
Método Material
Adsorción del antígeno libre Carbón vegetal
Precipitación del complejo:
Sulfato sódico
- Método químico
Anticuerpo precipitante
- Método inmunológico
Fase sólida Celulosa, vidrio, etc.
No obstante, pueden observarse interferencias a causa del propio análisis, como por ejemplo
la saturación de alguno de los componentes y el efecto prozona.
El efecto prozona es un fenómeno que se desarrolla cuando las concentraciones de los

componentes ya son muy elevadas; cuando se aumenta la concentración de alguno de los
componentes, se ocasiona una disminución en la formación de los complejos.
Las interferencias en los análisis, pues, en la gran mayoría se deben a la presencia de compuestos
que alteren el resultado.
Sin embargo, a veces las interferencias son consecuencia, no tanto de la técnica, sino de los
componentes del suero del paciente. Debemos tener presente que estas son más difíciles de
detectar y cuantificar, ya que las características de la sangre de los pacientes pueden variar
significativamente.
Además, hay que tener en cuenta los siguientes puntos:

Presencia de factores reumatoides.
región constante de otros anticuerpos humanos. Son homólogos al segundo anticuerpo
que se añade en los enzimoinmunoanálisis heterogéneo y provocan una disminución
de la señal con respecto a lo real. Se encuentran en pacientes con enfermedades
reumatoides.
Competición entre anticuerpos. Se produce cuando el paciente desarrolla anticuerpos
frente al antígeno que se quiere medir.
Reacción cruzada con antígenos endógenos. Existen componentes del organismo
50
humano que pueden ser similares a, por ejemplo, ciertos fármacos. Estas moléculas
pueden reaccionar de forma cruzada con anticuerpos dirigidos a los medicamentos.
Interferencias por las enzimas. En la sangre a veces pueden aparecer inhibidores
enzimáticos y sustratos o productos derivados de la reacción. Otras veces la propia enzima
incluyendo en los análisis blancos de la reacción.

5. Radioinmunoensayos
El radioinmunoensayo (RIA) usa radiactividad para detectar las moléculas y cuantificarlas.
Desde que se desarrolló, ha sido una técnica ampliamente utilizada en los ensayos de
laboratorio, pero actualmente ha sido sustituida en gran parte por los enzimoinmunoanálisis.
La radiactividad es una característica de los núcleos de ciertos elementos, los cuales emiten
un tipo de energía susceptible de plasmarse en placas fotográficas, y también de ionizar gases
o producir fluorescencia (es decir, radiación).
Es muy importante recordar que la radiactividad es peligrosa. Su uso requiere personal

preparado y debe aplicarse bajo medidas de seguridad estrictas.
Esquema de radioinmunoensayo RIA.
51
Los isótopos, aunque aparecen en nuestro entorno de manera natural, tienen propiedad

reactiva. Son inestables, mantienen un estado excitado y deben perder esta energía para volver
a su estado fundamental.
Existen varias modalidades de radiación emitida, pero las más relevantes en relación con los
radioinmunoensayos son la gamma, la radiación X y la beta.
Durante las pruebas, resulta útil marcar el antígeno con radiactividad. Para ello hay que
disponer de una muestra pura de antígeno, y marcarlo con el isotopo adecuado. Los isótopos
más utilizados habitualmente son el carbono 14 (14C), el tritio (3H), y el yodo 125 (125I).
Conviene resaltar que el yodo 125 es emisor de rayos gamma, y para su cuantificación se usa
un detector de centelleo sólido. Carbono 14 y tritio son emisores de partículas beta que se
detectan con contadores de centelleo líquido.
Normalmente, las emisiones de radiación se plasman en una placa fotográfica, pero también
pueden revelarse por emisión de gases.
Las ventajas de esta técnica son su elevada sensibilidad y especificidad:
concentración.
Gracias a esto, los radioinmunoensayos son una técnica que ofrece una cuantificación de
moléculas en cantidades del orden de picogramos (10-12g). Es decir: 1 gramo equivale a 106
microgramos, 109 nanogramos y 1012 picogramos.
Entre las principales desventajas de la técnica, encontramos:

Los isótopos tienen una vida media limitada; transcurrido cierto tiempo, dejan de ser
detectables.
La radiactividad implica cierto peligro y su uso resulta económicamente elevado.
Requiere equipos especiales para medir la radiación.
Debido al riesgo personal que implica esta técnica, se ha restringido sobre todo para la
cuantificación de moléculas en muy baja cantidad o muy mezcladas.
5.1. Radioinmunoensayo
competitivo
Históricamente, la técnica de marcaje radiactivo para cuantificar antígenos por competencia
ha sido muy utilizada.
52
En este caso, el anticuerpo se añade en una cantidad limitada. Al introducirlo en la solución,

el antígeno no marcado establece una competencia con el marcado, en su unión a los
anticuerpos.
Existen dos formas de materializar este ensayo. Por un lado, se pueden mezclar al mismo tiempo
el antígeno marcado y el no marcado con el anticuerpo; constituyendo el ensayo competitivo
simultáneo.
Por otro lado, también puede hacer que reaccione el antígeno no marcado con un exceso de
anticuerpo. A continuación, se añadiría el antígeno marcado, habiendo eliminado previamente
el exceso de anticuerpos. Tras la separación de la fracción unida de la libre, se determina el
marcaje de la fracción unida, y esta se usa para calcular la concentración del antígeno no
marcado.
El punto más crítico de esta técnica es la separación de las fracciones de antígeno unido al
anticuerpo, del antígeno que queda en forma libre.
5.1.1. Métodos de separación

Existen varios métodos de separación. Cuando se combina la adsorción del antígeno libre con
carbones vegetales, el antígeno presenta una elevada especificidad: atrapa la mayor parte de
los antígenos, dejando libres los conjugados y los anticuerpos libres.
Respecto a la precipitación del complejo antígeno-anticuerpo, es una precipitación que se pue-

de realizar con métodos químicos, con compuestos como el sulfato sódico y el polietilenglicol.
Estos producen la precipitación inespecífica de los complejos y de las proteínas. Tras una
centrifugación, los complejos quedan en el sedimento y la fracción libre en el sobrenadante.
La precipitación también puede realizarse con un segundo anticuerpo que lo una al complejo.
Al formarse un conjugado de mayor tamaño, este se hace insoluble.
Otra opción, que ya se ha comentado en técnicas anteriores, consiste en adherir uno de los
componentes a una fase sólida.
En conclusión, el método radioinmunoensayo competitivo es usado frecuentemente para
cuantificar sustancias en muy baja concentración, como por ejemplo ciertas hormonas.
5.2. Ensayo
inmunorradiométrico
Más recientemente, el avance científico-tecnológico ha contribuido a la optimización de
técnicas y el desarrollo de métodos eficaces para marcar los anticuerpos, aunque se sigue
usando la radiación.
Estos ensayos se denominan inmunorradiométricos (IRMA) y son eficaces porque cuentan con
un marcaje de anticuerpos estable y en los que no se altera su función.
Este tipo de técnicas incluyen formas competitivas y no competitivas, y su aplicación es
53
prácticamente similar a las que se han descrito en los apartados anteriores.

6. Fluoroinmunoensayos
Los fluoroinmunoensayos son inmunoensayos que utilizan como marcadores sustancias
capaces de emitir fluorescencia cuando son excitadas con energía radiante. Estos marcadores
se unen a antígenos o anticuerpos estables.
Las sustancias fluorescentes se caracterizan por absorber la energía electromagnética a

una determinada longitud de onda, y emitir parte de esta energía en forma de radiación
electromagnética con una longitud de onda diferente. Otra parte de esta energía se emite
siempre en forma de calor.
Hay dos fenómenos que debemos conocer:

Fosforescencia: cuando el periodo de tiempo entre la absorción de la luz y la emisión de
la nueva luz es mayor de 1/10.000 segundos.
Fluorescencia: cuando el periodo de tiempo entre la absorción de la luz y la emisión de la
nueva luz es menor de 1/10.000 segundos.
Reciben el nombre de fluoróforos las sustancias capaces de emitir luz, y son las que se usan
para marcar las moléculas en esta técnica. Los marcadores más utilizados son los compuestos
orgánicos derivados de la fluoresceína y la rodamina.
No obstante, no todas las sustancias emiten fluorescencia. Y la longitud de onda a la que emiten
es característica de cada una de ellas.
54
Además, cuando estas sustancias se fijan a los anticuerpos, disminuye la fluorescencia de

los fluorocromos de tal manera que los conjugados solo muestran del 15 % al 30 % de la
fluorescencia del colorante libre.
El pH también afecta a la fluorescencia. Por este motivo se debe trabajar a un pH estable y

apropiado en función del colorante, que normalmente son fluoresceína (pH 8) y rodamina (pH
7).
Tal y como sucede con la radiación, estas sustancias permanecen en estado excitado durante un
periodo de tiempo limitado, que debe aprovecharse para la cuantificación. La cuantificación,
entonces, se realiza por espectrometría de fluorescencia molecular.
A parte, también existen los fluoroenzimoinmunoensayos (Fluorescence Enzyme InmunoAssay

o FEIA), que se basan en la formación, a partir de especies no fluorescentes, de un producto
enzimático capaz de emitir fluorescencia que será detectada en un equipo denominado
fluorímetro.
Hay varios tipos de fluoro-

inmunoensayos, y los estudia-
remos a continuación.
Fluoroinmunoensayo.
6.1. Fluoroinmunoanálisis
heterogéneo
La técnica de fluoroinmunoanálisis heterogéneo requiere la separación de la fracción unida
de la no unida antes de la cuantificación. Normalmente este paso se realiza por precipitación
del complejo, o fijación de alguno de los componentes a una fase sólida.
Una de las posibles problemáticas con las que nos podemos encontrar en este punto es que
la fluorescencia presente un ruido de fondo, esto es, que algún componente de la muestra
biológica emita fluorescencia por sí mismo. Los procesos de lavado del fluiroinmunoanálisis
heterogéneo favorecen la eliminación de este ruido de fondo.
La técnica se basa en la competencia de dos fracciones antigénicas por una cantidad limitada
de anticuerpo. Frecuentemente, el antígeno es el que se marca, aunque también puede
marcarse el anticuerpo, estableciéndose la competencia entre el antígeno de la muestra y un
antígeno unido a la fase sólida.
La vinculación de uno de los componentes a una fase sólida es un método muy usado
actualmente en la aplicación de esta técnica. Las fases sólidas que se emplean son discos de
papel, tubos de plástico, bolas de cristal, etc.
55
Recientemente se está desarrollando el uso de microesferas de polisacáridos, poliacrilamida
o partículas de celulosa magnéticas, que facilitan la separación de los componentes por
aplicación de un campo magnético.
Después de la separación del componente no ligado, la fluorescencia se interpreta mediante

técnicas de espectrofotometría.

6.2. Fluoroinmunoanálisis
homogéneo
Para la técnica de fluoroinmunoanálisis homogéneo, como hemos observado en casos
anteriores, no se necesita la separación de la fracción unida de la no ligada. Este tipo de
técnicas, pues, resultan más rápidas y sencillas.
No obstante, existen límites de detección más altos porque la fluorescencia que se mide puede
representar no solo la que se busca cuantificar, sino ruido de fondo de la muestra y de la
dispersión de la luz.
El fluoroinmunoanálisis homogéneo es una técnica poco sensible y de tipo competitivo, como

casi la mayoría de los procedimientos. En estos casos, el anticuerpo se une a un antígeno
marcado y provoca un cambio en las propiedades fluorescentes de su marcador.
Dentro de este conjunto de técnicas, destacan algunas por su importancia. Las vemos a
continuación.
6.2.1. Fluoroinmunoanálisis de sustrato

marcado
El marcador que se utiliza aquí es un fluorógeno, una molécula que solo se hace fluorescente
cuando se modifica por un proceso enzimático o químico.
En este tipo de análisis, el antígeno se marca con el sustrato fluorogénico, de forma que cuando
se produce la unión antígeno-anticuerpo, este sustrato resulta inaccesible para la enzima.
Cuanto más antígeno marcado se una, menos fluorescencia presenta la muestra. Por tanto,
menor cantidad de antígeno no marcado se habrá unido previamente, ya que la cantidad de
anticuerpos es limitada.
Un ejemplo de una sustancia fluorogénica es la beta-galactosil-umbeliferona. Sobre ella actúa

la enzima beta galactosidasa, separando la umbeliferona, que sí presenta fluorescencia cuando
está en forma libre.
6.2.2. Fluoroinmunoanálisis de protección

56
Esta técnica también es conocida como fluoroinmunoanálisis de doble receptor o de atenuación

indirecta. Como su nombre indica, aquí se produce una atenuación de la fluorescencia que
emite el marcador cuando se une un anticuerpo específico contra él.
Es útil para la cuantificación de anticuerpos. A tal efecto, se requiere la presencia del antígeno
específico marcado. Se desarrolla una competencia entre el anticuerpo específico contra dicho
antígeno, y el anticuerpo frente al marcador, ya que la unión de uno de ellos incapacita la unión
del otro.
6.2.3. Fluoroinmunoanálisis de
resolución tardía
Esta técnica es una modalidad de las anteriores y consiste en optimizar la detectabilidad y
evitar el ruido de fondo, por la fluorescencia endógena de la muestra.
Se usan marcadores especiales como quelatos de lantánidos. La emisión fluorescente no
Los fluoroinmunoanálisis de resolución tardía permiten estudiar la fluorescencia emitida

durante un periodo mayor de tiempo.
6.3. Inmunoensayo enzimático
microparticulado
El nombre de esta técnica proviene del inglés Microparticle Enzyme Immunoassay (MEIA)
representa un tipo específico de fluorenzimoinmunoensayo. Se basa en el aislamiento de los
complejos antígeno-anticuerpo sobre la superficie de fase sólida de unas esferas de pequeño
tamaño denominadas micropartículas.
Incluye micropartículas submicrónicas como medio de captura de la sustancia que se va

analizar, y utiliza partículas de látex submicroscópicas recubiertas con antígeno o anticuerpo.
La técnica tiene un formato sándwich no competitivo y produce resultados que son directamente
proporcionales a la concentración de analito presente en la muestra problema.
Así pues, el inmunoensayo enzimático microparticulado se ha adaptado ampliamente para

automatizar la medición de moléculas grandes como marcadores asociados al análisis
cardiaco, de fertilidad, de cáncer, metabólico, de hepatitis y de tiroides.
6.3.1. Componentes de la técnica MEIA y

procedimiento básico
57
Los componentes son:
Fase sólida
analito (molécula problema que se desea detectar).
Conjugado

fosfatasa alcalina.
Sustrato: 4-metil-umbeliferilfosfato.
El procedimiento básico se compone de

1. -
lito.
2.
antígeno-anticuerpo.
3. Añadir el conjugado. Si el analito está presente en la muestra problema, estará formando

parte del complejo de micropartículas, y los anticuerpos marcados con fosfatasa alcali-
na se unirán al complejo.
4. Añadir el sustrato. La enzima hidroliza el 4-metil-umbeliferilfosfato (MUP), produciendo
5.
7. Inmunoensayos
quimioluminiscentes
Los inmunoensayos quimioluminiscentes (Chemiluminescent Microparticle Immunoassay
o CMIA), utilizan sustratos quimioluminiscentes que emiten luz cuando ocurre la reacción
enzimática.
La emisión quimioluminiscente se mide mediante un espectrofotómetro de quimio-

luminiscencia molecular o iluminómetro.
Los marcadores quimioluminiscentes son compuestos químicos que emiten luz cuando son
oxidados por peróxidos en presencia de algunos catalizadores (peroxidasas, catalasas, etc.).
Un compuesto quimioluminiscente genera luz al combinarse con un reactivo, lo que produce

una emisión alta fácilmente detectable.
Una marca quimioluminiscente se conjuga con el anticuerpo o antígeno y produce luz cuando
se combina con su sustrato. Podría decirse que su procedimiento es muy similar a la técnica
MEIA, con la diferencia que la reacción quimioluminiscente facilita la medición por su alcance
más sensible.
58
Las técnicas MEIA y CMIA se sirven de tecnología de ensayo sándwich no competitiva para
medir analitos. En estos dos inmunoensayos no competitivos, la concentración de señal
medida es directamente proporcional a la concentración del analito presente en la muestra, tal
y como se expresa a continuación:
Micropartícula
Tecnología Separación Marcaje Detección
sólida
MEIA Látex Fibra de vidrio Fosfatasa alcalina Fluorescencia
Reactivo
CMIA Magnética Imán Quimioluminiscencia
quimioluminiscente
8. Tests inmunocro-
Las inmunocromatografías son un conjunto de técnicas basadas en la migración de una
muestra a través de membranas de nitrocelulosa. Se usan, por su rapidez y sencillez,
mayoritariamente en pruebas como el del VIH y el del embarazo.
Los tests inmunocromatográficos se revelan sin lavados, lo que ha extendido mucho su uso.
Para cuantificar los antígenos, se hacen reaccionar con anticuerpos específicos, de manera que
la migración del complejo resulta diferente a la del analito sin conjugar.
En efecto, la inmunocromatografía está formada por una membrana de nitrocelulosa en la que

se distinguen tres zonas: la de conjugado, la de captura y la de control.
Las reacciones que tienen lugar durante el transcurso de esta técnica siguen este proceso:
el cual
detectar, y también por un reactivo para la detección.

En el caso de que la muestra contenga el antígeno problema, al introducirlo en la
inmunocromatografía este se unirá al conjugado formando un complejo inmune, y el
59
complejo migrará a través de la membrana de nitrocelulosa.
La muestra llega a la zona de captura. La zona de captura está constituida por un
unión del antígeno y conjugado quedarán retenidos, de manera que se revela mediante la
coloración de una línea, lo que se denominan muestras positivas. En caso contrario, las
muestras resultan negativas.

La muestra llega a la zona de control. La zona de control está formada por un tercer
anticuerpo, el cual reconoce el reactivo de detección. Cuando el resto de muestra llega a
esta zona, el anticuerpo se une al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona
de captura.
correctamente, porque queda coloreado y con muestras positivas o negativas.
Así pues, la interpretación de los resultados debe proceder de esta forma:

solo se detecta la línea de control, lo que implica que no aparece
antígeno en la muestra.
se detecta tanto la línea de muestra como la de control.
no aparece línea de control, esté presente o no la de muestra. Esto
indica que la técnica debe repetirse.
Los controles permiten comprobar los resultados a lo largo de una evaluación que indica si ha
habido errores de ejecución o de planteamiento metodológico.
Los beneficios de la inmunocromatografía son su sencillez y rapidez, como ya se ha comentado.

Es una técnica que puede ofrecer resultados en un tiempo aproximado de 15 minutos.
9. Técnicas de
La inmunofluorescencia representa un procedimiento especializado que se basa en la reacción
antígeno-anticuerpo y se hace visible cuando se le incorpora un colorante fluorescente.
Cuando la reacción tiene lugar, se expone a la luz ultravioleta que emite un microscopio para
revelar la fluorescencia.
En concreto, el microscopio de fluorescencia consta de una fuente de luz (lámpara de

mercurio o halógena), que emite la mayor cantidad de luz ultravioleta.
Además, cuenta con los siguientes sistemas de filtros:

Filtro de excitación o selección de luz. Está ubicado entre la fuente de luz y el
que el preparado se alcance exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz
Filtro de calor.
de luz transmitida, y entre la fuente de luz y el espejo dicrómico en los microscopios de luz
incidente.
60
Filtro de barrera. Se sitúa antes del ocular para prevenir daños en el ojo humano que
podrían ser causados por rayos ultravioleta.
Todos estos filtros sirven para proteger al técnico de laboratorio y disponen de opción para
seleccionar las longitudes de onda específicas.
directa e indirecta
Hay dos tipos de inmunofluorescencia, directa e indirecta.
La inmunofluorescencia directa es una técnica que consiste en demostrar la presencia de

un antígeno causando su reacción directamente con un anticuerpo específico, marcado con
colorante fluorescente.
La inmunofluorescencia indirecta es una técnica con doble capa. Primero se aplica el

anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido. Y después se visualiza por
tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con fluorocromo.
En las técnicas indirectas suelen requerirse etapas de lavado, y para facilitar el proceso se unen
compuestos a un soporte. Al introducir la microscopía en la técnica, el soporte suele ser el
portaobjetos.
En general, para los dos tipos de técnica el proceso sigue dos etapas:
Primera etapa.
complejo antígeno-anticuerpo, no visible por el momento, ya que el anticuerpo no estaba

marcado.
Segunda etapa.
Este anticuerpo marcado se unirá al anticuerpo humano no marcado de la primera etapa,
primera etapa se había unido el anticuerpo de suero humano al antígeno del sustrato.
La principal ventaja que presenta la inmunofluorescencia indirecta con respecto a la directa es

que varios anticuerpos marcados se pueden unir a un mismo complejo, lo cual constituye una
importante fuente de amplificación de la señal.
Así pues, la inmunofluorescencia indirecta expone manifiestamente la presencia de anticuerpos.
Como las otras técnicas, destaca la sensibilidad y la rapidez del método, aunque tiene un coste
económico muy elevado y dispone de una especificidad menor.
Por último, cabe decir que la inmunofluorescencia tiene múltiples aplicaciones en diagnóstico
e investigación como en estudios bacteriológicos, virales, parasitológicos, etc. Se ha utilizado
también en investigaciones sobre la distribución intracelular de las moléculas.
61
10. Técnica Western blot

o inmunoblot
El Western blot es una técnica pensada para detectar la presencia de una proteína específica
dentro de un conjunto, que normalmente es una mezcla compleja de proteínas, como un
suero.
Una vez que se han separado las proteínas, se revela la presencia de una en particular por su
afinidad a los anticuerpos. Esta técnica se utiliza para cuantificar los antígenos proteicos.
62
En otras palabras, este método consiste en detectar las proteínas tras su fijación sobre
membranas de nitrocelulosa y posterior revelado mediante la adición de anticuerpos marcados
con enzimas.
Para la obtención de resultados positivos, los sustratos que se empleen deben ser capaces de
generar productos finales coloreados insolubles que precipite.
10.1. Separación mediante
electroforesis en gel
La separación de proteínas se hace mediante electroforesis en geles de poliacrilamida con
dodecil sulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulfate Polycrylamide Gel Electrophoresis o SDS-
PAGE). Separa las proteínas en función de estos criterios:
Carga eléctrica.
Punto isoeléctrico.
Peso molecular.
La naturaleza de la separación depende del tratamiento de la muestra y del gel que se use. Ten
en cuenta, también, que, para separar las proteínas en función de su peso molecular, estas
tienen que estar desnaturalizadas. Así, la estructura que adquieren por el plegamiento no
modificará su tamaño.
En la electroforesis en SDS-PAGE hay que incorporar, además, patrones de comparación de

pesos moleculares conocidos para determinar los pesos moleculares de las muestras.
10.2. Transferencia
63
Tras la separación por electroforesis en gel, las proteínas deben ser transferidas a una
membrana de nitrocelulosa. Este paso es una condición indispensable para que puedan ser
accesibles a los anticuerpos.

Estas membranas que hemos mencionado se caracterizan principalmente por su capacidad
para unir proteínas de manera inespecífica. Esto significa que se adhieren a todas las proteínas
que tengan una afinidad idéntica. En el caso de la nitrocelulosa, la adherencia se debe a
interacciones no covalentes de naturaleza hidrofóbica.
Las proteínas que estaban sobre el gel se transfieren a una membrana para continuar con el
procesamiento.
La transferencia se puede efectuar por tres métodos distintos:
proceso, se ponen encima objetos pesados. Este montaje se sitúa sobre un tampón,
Cuando llega a la membrana, quedan retenidas.

se utiliza una bomba conectada a un sistema de secado de
consiste en la aplicación de una corriente eléctrica para llevar

las proteínas desde el gel hacia la membrana, igualmente mediante un tampón de
transferencia. Se apilan los siguientes elementos, con este orden (desde el polo negativo o
buffer
Este montaje recibe el nombre de sándwich. La magnitud de la corriente que se aplica

estará determinada por los materiales empleados, al tiempo disponible, etc. Las proteínas
del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.
La electrotransferencia es la técnica más utilizada ya que la velocidad del proceso es alta y

resulta eficaz en su aplicación.
10.3. Bloqueo
Como ya hemos mencionado, las proteínas se unen a la membrana de manera inespecífica.
Es necesario bloquear los lugares de unión para que no ocurra lo mismo con los anticuerpos
que se utilizan en el siguiente paso, porque los anticuerpos tienen también esta naturaleza
proteica.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas, generalmente en albúmina

de suero, leche en polvo o caseína, mezclado con una pequeña cantidad de detergente.
Las proteínas en solución se unen solo a los sitios de la membrana que no hayan sido ya
ocupados por las transferencias desde el gel.
De este modo, el anticuerpo solo podrá unirse a su antígeno específico (proteína a proteína),
reduciendo así el ruido de fondo y los falsos positivos.
64
10.4. Detección
En este punto del procedimiento, se comprueba en la membrana la presencia de la proteína
determinada. El anticuerpo al que se une le proporciona la especificidad. La presencia de la

proteína se revela con alguno de los métodos descritos anteriormente.
El proceso de la detección se realiza normalmente en dos pasos, pero es posible hacerlo en un

único paso.
El proceso de detección en dos pasos requiere la utilización de un anticuerpo primario

contra la proteína y un anticuerpo secundario que lleva el marcaje. Teniendo en cuenta que
la proteína está desnaturalizada, el anticuerpo tiene que reconocerla específicamente de esta
forma.
Esta incubación tiene una duración mínima de 30 minutos y una duración máxima
indeterminada (se recomienda unas 8 horas como mucho). La temperatura de la incubación es
variada, aunque es mejor que sea elevada porque favorece las uniones más específicas.
Después se lava la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, y se

expone al anticuerpo secundario. Este reconoce de forma específica al primario. Varios de
estos anticuerpos se unirán a cada anticuerpo primario, amplificando la señal.
El proceso de detección en un paso solo requiere un anticuerpo que reconozca al mismo

tiempo la proteína de interés y además presente el método de marcaje.
En definitiva, las técnicas para detectar la presencia de proteínas en el inmunoblot se
fundamentan principalmente en la aparición de un producto coloreado por acción enzimática.
En la actualidad, el Western blot representa una de las técnicas más usadas en el estudio de la
biología molecular. Con esta técnica se efectúa la prueba confirmatoria del VIH, el diagnóstico
de la enfermedad de Lyme, etc.
Técnica Western.
65
3
Detección de
autoanticuerpos.
TÉCNICO SUPERIOR EN LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO 67

1. Sistema inmunitario y enfermedades autoinmunes ................................. 69
...................................... 75
3. Enfermedades autoinmunes sistémicas................................................... 80
................................................................ 85
........................................................... 89
.......... 93
7. Determinación de anticuerpos mediante ELISA ....................................... 102

68
Objetivos
Estudiar las enfermedades autoinmunes y anticuerpos asociados.
determinación de anticuerpos mediante ensayos de inmunoadsorción ligados a

enzimas.
1. Sistema inmunitario
y enfermedades
autoinmunes
El sistema inmunitario cumple dos funciones básicas en el organismo:
La elaboración de una respuesta protectora ante todo lo “extraño”.
El reconocimiento como tal de lo “propio” (tolerancia). Cuando se pierde esta capacidad
de reconocer lo propio, se desencadena una respuesta autoinmune.
La tolerancia inmunológica es la falta de respuesta frente a un antígeno inducida por la

exposición previa a ese antígeno. Por mecanismos inmunológicos muy especializados, nuestro
sistema inmune enseña a las células encargadas de la respuesta a tolerar todos los antígenos
propios.
En esta unidad estudiaremos las características más importantes de las enfermedades

autoinmunes, que son aquellas en las que existe una respuesta anómala por parte del sistema
inmune, el cual reconoce como “extraños” a los propios componentes del organismo.
69
También repasaremos los autoanticuerpos asociados a estas enfermedades y las distintas
vías que se utilizan para su determinación.
Células del sistema inmune.

1.1. Enfermedades
autoinmunes y
autoanticuerpos
En las enfermedades autoinmunes hay antígenos del propio organismo que desencadenan
una respuesta inmune, es decir, pasan a ser inmunógenos, a diferencia de los que inducen
tolerancia, que serían los tolerógenos.
El organismo dispone de mecanismos que controlan la aparición de células autorreactivas,

involucradas en el desencadenamiento de la respuesta anómala.
El mismo organismo tiene la capacidad de detectarlas y eliminarlas tanto en el proceso de

formación y maduración (tolerancia central), como cuando salen a circulación (tolerancia
periférica).
Si alguno de estos mecanismos de control falla, las células autorreactivas salen a la circulación
donde se activan y proliferan, lo que favorece la aparición de fenómenos autoinmunes.
Como inciso, las células autorreactivas son capaces de reconocer como extraños a los
70
componentes propios que han “escapado” de los mecanismos que regulan el mantenimiento
de la tolerancia. Por otro lado, las células mononucleares de sangre periférica son células
sanguíneas que poseen un único núcleo redondo, como los linfocitos, monocitos, etc.
Dependiendo de la vía afectada, pueden observarse alteraciones celulares (linfocitos

autorreactivos), humorales (autoanticuerpos), o ambas simultáneamente.
Los autoanticuerpos son los anticuerpos que reaccionan frente a determinados componentes
del organismo, los llamados autoantígenos.
La detección de autoanticuerpos es fundamental en el diagnóstico, pronóstico y seguimiento

clínico y terapéutico de la mayoría de enfermedades autoinmunes. En otras palabras,
detectar su presencia es de gran ayuda para los profesionales de la salud, que podrán mejorar
el diagnóstico, controlar la evolución de una enfermedad y hacer el seguimiento al paciente.
La principal técnica empleada en la determinación de las enfermedades autoinmunes es la

inmunofluorescencia indirecta (IFI), de elevada sensibilidad y, por tanto, capaz de detectar
anticuerpos a concentraciones muy bajas.
Debido a esta sensibilidad, muchas muestras positivas por IFI deben analizarse posteriormente
mediante otras técnicas más específicas como el ELISA (ensayos de inmunoadsorción ligados
a enzimas) y el Western blot (inmunoblot).
Los diferentes autoanticuerpos que pueden encontrarse en un individuo no siempre

desempeñan la misma función. Así, existen tres posibles situaciones:
La enfermedad es de base inmunológica, y en este caso sí están implicado en el daño
tisular y patogénesis.
Otro agente etiológico causa el daño tisular, lo cual provoca la aparición de
autoanticuerpos (sin implicación patogénica).
Un agente etiológico induce la producción de anticuerpos independientemente del
daño tisular.
Línea celular T y la actividad inmune diferente.
71
1.2. Factores desencadenantes

y rasgos comunes
La frecuencia y la naturaleza de los procesos autoinmunitarios están influenciadas por los
factores siguientes:
Esto es debido al mimetismo molecular (semejanza entre antígenos

Factores ambientales del patógeno y antígenos propios). Entre los factores destacan: luz
ultravioleta, traumatismos, determinados fármacos, etc.
Estudios realizados en gemelos han demostrado la influencia genética
en la susceptibilidad a desarrollar enfermedades autoinmunes. La región
Factores genéticos
más implicada es la del complejo principal de histocompatibilidad
(MHC).
Las hormonas sexuales, diferentes entre hombres y mujeres, parecen
Factores hormonales
jugar un papel importante en el desarrollo de la autoinmunidad.
Las enfermedades autoinmunes tienen

Asociación familiar o antecedentes.
Predominio en mujeres.
72
Aparición en edades tempranas (tercera década).

Alta frecuencia de individuos que desarrollan varias enfermedades autoinmunes
simultáneamente.
Asociación con antígenos del complejo de histocompatibilidad (MHC). Este complejo es

humano.
1.3. Tipos de enfermedades

autoinmunes
En función del tejido diana (el que deja de ser “contemplado” como propio y tolerado por el
sistema inmune), se puede establecer una clasificación de las enfermedades autoinmunes. En
otras palabras, se clasifican dependiendo de la región donde se localicen los autoantígenos
reconocidos.
La respuesta patológica puede centrarse en células determinadas de un órgano. Las reacciones

autoinmunes se dirigen contra uno o más constituyentes específicos de esas células, ya sean
componentes citoplasmáticos, estructura de la membrana plasmática o productos secretados
por ellas. Esto se denomina autoinmunidad específica de órgano.
Sin embargo, la reacción autoinmune también puede dirigirse contra estructuras o compo-
nentes inmunes a muchos tejidos distribuidos por nuestro organismo, como componentes
nucleares, proteínas mitocondriales o componentes del músculo. En este caso, el proceso se
denomina autoinmunidad no específica de órgano.
Las enfermedades autoinmunes órganoespecíficas son aquellas en que la respuesta pato-

lógica del sistema inmune se centra en determinadas células o antígenos de un órgano en
particular.
Trastorno autoinmune, ejemplo con los antígenos de la bacteria Neisseria gonorrhoae.
73
Entre las más frecuentes figuran:

Afectación endocrina: diabetes mellitus tipo 1, tiroiditis autoinmunes.
Afectación hematológica: anemia perniciosa, anemia hemolítica, neutropenia
autoinmune y púrpura trombocitopénica.
Afectación neuromuscular: miastenia gravis, esclerosis múltiple.
Afectación renal y pulmonar: síndrome de Goodpasture.

Afectación hepática: hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria.
Afectación intestinal: enfermedad celiaca.
Las enfermedades autoinmunes sistémicas son aquellas en que la respuesta patológica

del sistema inmune se produce contra antígenos que no son específicos de ningún órgano en
particular.
Entre las más frecuentes figuran:

Lupus eritematoso sistémico.
Artritis reumatoide.
Síndrome antifosfolípido
Síndrome de Sjögren.
Dermatomiositis.
Esclerosis sistémica.
Vasculitis necrosantes sistémicas.
Enfermedad mixta del tejido conectivo.
Crioglobulinemia.
74
2. Enfermedades
autoinmunes
En este apartado profundizamos en algunas enfermedades autoinmunes organoespecíficas

frecuentes, en las que los órganos afectados son órganos de los sistemas endocrino,
hematopoyético y neuromuscular, la piel, los riñones y pulmones, el hígado y el intestino.
2.1. Enfermedades endocrinas

2.1.1. Tiroiditis autoinmunes
Son las enfermedades autoinmunes más prevalentes y tienen múltiples formas de manifes-
75
tación: hipertiroidismo, hipotiroidismo por atrofia tiroidea o estadios intermedios.
En esta enfermedad hay involucrados unos mecanismos celulares y humorales que reconocen
los antígenos de la glándula tiroides. Como resultado, se produce infiltración linfocitaria, que
produce la destrucción de la glándula, así como la aparición de autoanticuerpos (patogénicos
o no).

Aquí encontramos: enfermedad de Graves-Basedow, tiroiditis de Hashimoto, hipotiroidismo
primario, hiper e hipotiroidismo neonatal y tiroiditis posparto.
Los principales autoanticuerpos son anti-tiroperoxidasa (TPO), anti-tiroglobulina (Tg) y anti-

receptor de tirotropina (R-TSH).
2.1.2. Diabetes mellitus tipo 1

Afecta principalmente a niños y adolescentes. Consiste en la presencia de un defecto en la
producción de insulina, que es una sustancia necesaria para movilizar el azúcar de la sangre
a las células. Esta anomalía es provocada por linfocitos T autorreactivos que destruyen las
células ß pancreáticas productoras de insulina.
Aparecen autoanticuerpos séricos que tienen valor predictivo. Estos anticuerpos son: anti-
islotes pancreáticos, anti-descarboxilasa del ácido glutámico, anti-antígeno asociado al
insulinoma 2, y anti-insulina.
Medición de la diabetes.
2.2. Enfermedades
hematológicas
76
2.2.1. Anemia perniciosa

En este caso hay una disminución de la vitamina B12 sérica por un bloqueo en su absorción.
Este bloqueo puede producirse a nivel de las células parietales gástricas, cuya destrucción
implica que no se sintetice el factor intrínseco, necesario para la absorción de la vitamina, o
directamente por anticuerpos dirigidos contra el factor intrínseco.
2.2.2. Anemia hemolítica autoinmune

Se ocasiona una ruptura de los glóbulos rojos por parte de una serie de anticuerpos que
se unen a la membrana eritrocitaria junto con proteínas del complemento produciendo su
ruptura.
2.2.3. Neutropenia autoinmune

Existen anticuerpos que hacen frente a determinantes antigénicos de los neutrófilos,
produciéndose una disminución de estas células en el flujo sanguíneo.
2.2.4. Púrpura trombocitopénica
Se produce un déficit de plaquetas a causa de la aparición de anticuerpos antiplaquetarios,
mientras que el número de megacariocitos (precursores de plaqueta) en médula ósea
permanece estable.
2.3. Enfermedades
neuromusculares
2.3.1. Miastenia gravis
Se trata de una enfermedad neuromuscular con presencia de debilidad en los músculos
esqueléticos.
Se produce por un bloqueo o destrucción de los receptores implicados en la transmisión del

impulso nervioso, produciéndose debilidad muscular y fatiga de manera general.
77
Los anticuerpos más relevantes son: anti-receptor de acetilcolina y anti-músculo estriado.
2.3.2. Esclerosis múltiple

Es una enfermedad inflamatoria crónica y neurodegenerativa caracterizada por la presencia de
placas de desmielinización que ocasionan la incapacitación de transmisión nerviosa a nivel
axonal.
La desmielinización es un proceso
patológico en el que la capa de mielina
de las fibras nerviosas resulta dañada.
Cuando la mielina se destruye, se produce
una pérdida en la velocidad de conducción
del impulso nervioso y de la respuesta
inmunológica.
Los marcadores utilizados para el

diagnóstico de esta enfermedad son la
presencia de IgG e IgM en LCR.
Persona en
silla de ruedas por
esclerosis múltiple.
2.4. Enfermedades ampollosas

autoinmunes
Son un tipo de enfermedad dematológica autoinmune, que se caracteriza por la presencia de
ampollas en piel y en membranas mucosas.
Estas enfermedades son producidas por anticuerpos patogénicos dirigidos contra distintos
componentes de adhesión de las células epiteliales.
Dependiendo de la estructura que actúe como antígeno, se distinguen: pénfigo vulgar

(anticuerpos anti-desmosomas) o penfigoide (anticuerpos anti-hemidesmosomas).
2.5. Síndrome de Goodpasture

Se trata de una enfermedad severa, aunque de baja prevalencia, en la que se puede llegar a
establecer una insuficiencia renal fulminante y rápidamente progresiva con afectación
pulmonar.
Aparecen autoanticuerpos dirigidos contra el colágeno IV de la membrana basal glomerular.

78
2.6. Enfermedades hepáticas

2.6.1. Hepatitis autoinmune

Esta es una enfermedad poco frecuente que evoluciona con inflamación necrótica del
hígado y fibrosis de los hepacitos, y puede desencadenar una insuficiencia hepática grave,
con cirrosis y muerte.
Los principales anticuerpos presentes son: anti-músculo liso (ASMA) (HAI tipo 1), anti-liver
kidney microsomes (LKM) y anti-citosol hepático (LC-1) (HAI tipo 2).
2.6.2. Cirrosis biliar primaria

Es una hepatopatía crónica caracterizada por una lenta y progresiva destrucción inflamatoria
de los pequeños conductos biliares intrahepáticos. Las mujeres tienen 10 veces más proba-
bilidades de padecerla que los hombres, y se presenta más a menudo en persona mayores de
50 años.
Los principales autoanticuerpos asociados son: anti-mitocondriales (AMA), anti-envuelta

nuclear y anti Sp100.
2.7. Enfermedad celiaca
Es una alteración del intestino delgado y se caracteriza por malabsorción, atrofia de
las vellosidades intestinales e intolerancia al gluten. Se produce, pues, una respuesta
inmunológica a alimentos que contiene gluten.
Los principales autoanticuerpos que aparecen en esta enfermedad son: anti-transglutaminsas

tisular, anti-gliadina y anti-endomisio.
79
3. Enfermedades
autoinmunes
sistémicas
Prácticamente, en el total de las enfermedades autoinmunes sistémicas la respuesta que se
produce es de tipo humoral y aparecen autoanticuerpos frente a varias estructuras intracelulares.
A continuación, estudiaremos las principales enfermedades autoinmunes sistémicas y los

anticuerpos asociados.
3.1. Lupus eritematoso

sistémico (LES)
Es una enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza por periodos de remisión y
80
recaídas (brotes). Las manifestaciones clínicas de esta enfermedad son debidas a los fenómenos
inflamatorios que se producen y a la afectación de los distintos órganos en particular, casi
siempre por depósito de los anticuerpos.
Afecta sobre todo a mujeres y sus principales manifestaciones son fiebre alta, exantemas (es
característico el exantema en alas de mariposa, que afecta a las mejillas y al puente de la nariz),
artritis y glomerulonefritis, pero también puede haber problemas cardíacos y pulmonares, o

incluso trastornos neurológicos (convulsiones y psicosis) y trastornos hematológicos (anemia
hemolítica, pancitopenia).
En general, los anticuerpos presentes en esta enfermedad son los denominados anticuerpos
antinucleares (ANA) dirigidos frente a varios componentes situados en el núcleo celular.
Existe una gran variedad de moléculas en el núcleo celular que generan una respuesta
inmunológica. Sin embargo, en el caso del lupus erimatoso sistémico son relevantes los
siguientes autoanticuerpos: anti-ADN de doble cadena (anti-dsDNA), anti-antígenos nucleares
extraíbles (ENA), anti-nucleosoma/cromatina, y antifosfolípidos, aunque estos últimos en
menor medida.
3.2. Artritis reumatoide (AR)

Esta también es una enfermedad inflamatoria crónica que afecta esencialmente a las
articulaciones periféricas, con destrucción del cartílago, erosiones óseas y progresivas
deformaciones articulares. Además, puede afectar otros órganos, y por este motivo se clasifica
dentro del grupo de las enfermedades sistémicas.
La edad de los pacientes no influye en el desarrollo de esta enfermedad, ya que afecta a jóvenes
y adultos por igual, aunque las mujeres son más susceptibles de padecerla. Además, existe un
componente genético.
Los autoanticuerpos con mayor relevancia en este caso son: factor reumatoide y anti-péptido
citrulinado. Los anticuerpos anti-péptidos citrulinados cíclicos (ACCP) han demostrado ser
altamente específicos para el diagnóstico de la artritis reumatoide, y al igual que el factor
reumatoide, pueden ser detectados en estadios muy tempranos.
Los anticuerpos ACCP son el resultado de una respuesta autoinmune específica generada
contra péptidos citrulinados en la membrana sinovial de los pacientes.
81
Dibujo de una articulación en la que se señalan las partes relevantes en la artrosis.

3.3. Síndrome antifosfolípido

(SAF)
Se caracteriza por la aparición de fenómenos trombóticos (trombosis venosas profundas,
trombosis arteriales cerebrales), abortos de repetición y trombocitopenia, todo ello ante
presencia de anticuerpos antifosfolípidos.
3.4. Síndrome de Sjögren

Es una enfermedad inflamatoria crónica que recibe la denominación de “síndrome seco”,
que afecta principalmente a las glándulas lacrimales y salivales. Como consecuencia, hay
una disminución de las secreciones glandulares, lo que conlleva la sequedad de mucosas.
La afectación puede ser únicamente glandular o llegar a un nivel extraglandular. Es muy

frecuente que el síndrome de Sjögren aparezca secundariamente a la presencia de otras
enfermedades autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide.
Los anticuerpos que tiene un papel importante en este caso son: ANA, anti-Ro/SS-A y anti-La/
82
SS-B (ENA).
3.5. Dermatomiositis (DM) /

polimiositis (PM)
También se las conoce como miopatías inflamatorias idiopáticas y se caracterizan por la

debilidad muscular proximal y simétrica, con aparición de lesiones cutáneas típicas en el
caso de la dermatomiositis.
Ambas presentan una estructura similar, pero los mecanismos inmunes involucrados son
diferentes; por esta razón los autoanticuerpos encontrados en estas patologías, denominados
autoanticuerpos asociados a miositis (AAM) y específicos de miositis (AEM) sean diferentes
en cada una de ellas.
Entre los AAM y AEM mencionados, figuran: anti-sintetasas, anti-SRP, anti-Mi-2 (AEM), anti-U1
RNP, anti-PM/Scl, anti-SSA, anti-Ku (AAM).
3.6. Esclerosis sistémica (ES)
También denominada esclerodermia. Es una enfermedad discapacitante crónica, caracterizada
por fibrosis de la piel, de los vasos sanguíneos y de órganos internos (pulmones, corazón,
tracto gastrointestinal y riñón). Puede afectar exclusivamente a las vísceras, preservando la piel.
Los autoanticuerpos asociados a esta patología son: anti-Scl-70, anti-centrómero, anti-U3

RNP/fibrilarina, anti-PM/Scl, anti-Ku, anti-U1 RNP, anti-SSA, anti-NOR-90.
3.7. Vasculitis necrosantes

sistémicas
En este caso, estamos ante un grupo de enfermedades en las que el sistema inmunológico
ataca a los capilares sanguíneos produciendo una inflamación de los vasos (vasculitis). Con
esto, cualquier parte del organismo puede verse afectada.
Las vasculitis con importancia desde un punto de vista inmunológico son las de vasos peque-
ños que incluyen: granulomatosis de Wegener, poliangeítis microscópica y síndrome de Churg-
83
Strauss.
Los autoanticuerpos asociados son: anti-mieloperoxidasa (anti-MPO) y anti-proteinasa 3

(anti-PR3).
3.8. Enfermedad mixta del

tejido conectivo TÉCNICO SUPERIOR EN LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO
Se trata de una enfermedad sistémica que comparte algunas de las características clínicas de
varias patologías autoinmunes como el lupus eritematoso sistémico (LES), polimiositis (PM) y
esclerosis sistémica (ES). Estas manifestaciones son: fenómeno de Raynaud, artritis, edema
e hipertensión pulmonar, sin afectación al área renal ni al sistema nervioso.
El fenómeno de Raynaud es un fenómeno producido tras bajas temperaturas o emociones

fuertes, en el que se ocasionan espasmos vasculares que bloquean el flujo sanguíneo en dedos
de las manos y los pies, orejas y nariz, etc.
Los autoanticuerpos presentes también son una combinación heterogénea de autoanti-

cuerpos de LES, PM y ES: anti-U1 RNP, anti dsDNA, anti-Sm y anti-SSA.
3.9. Crioglobulinemia
Esta enfermedad se produce cuando las crioglobulinas llegan a la sangre. Las crioglobulinas
son anticuerpos que se hacen poco solubles a bajas temperaturas y adquieren un aspecto
gelatinoso, lo que podría conducir a un bloqueo vascular generalizado.
La crioglobulinemia se asocia a fenómenos de hiperviscosidad sanguínea, vasculitis y

formación de inmunocomplejos (recordemos que un inmunocomplejo se forma por la unión
de un antígeno y un anticuerpo).
Existen tres tipos según el isotipo de crioglobulina: la de tipo 1 se asocia a neoplasias

hematológicas, y las de tipo 2 y 3 se asocian principalmente a infección por VHC y a otras
infecciones o enfermedades autoinmunes en menor medida.
Un isotipo es un tipo de inmunoglobulina que está presente o no en función de las pequeñas

variaciones en una parte de la estructura del anticuerpo.
84
4. Anticuerpos
En este apartado observaremos los autoanticuerpos organoespecíficos determinados en el

laboratorio más importantes y su relación con las distintas enfermedades.
4.1. Tiroiditis autoinmunes

son anticuerpos patológicos que producen el daño
tiroideo. Reconocen la peroxidasa tiroidea, enzima que participa en la síntesis de las
hormonas tiroideas.
son considerados anticuerpos no patogénicos y aparecen
secundariamente al daño por linfocitos T. Reconocen la tiroglobulina, glucoproteína que
forma parte del coloide e implicada en almacenar yodo y sintetizar hormonas tiroideas.
son anticuerpos con función patogénica y
existen tres variedades, que son: estimuladores, bloqueantes y neutros. Los anticuerpos
85
estimulan o bloquean la síntesis de las hormonas tiroideas.
4.2. Diabetes tipo 1

En este grupo, los autoanticuerpos presentes tienen valor pronóstico.
se detectan mayoritariamente por IFI. Se dirigen contra los
cuatro tipos de células que hay en los islotes pancreáticos, que son las células beta,
productoras de insulina.
se dirigen contra la ácido-glutámico descarboxilasa (GAD), que es una enzima
que participa en la síntesis del GABA (ácido gamma aminobutírico), el cual actúa como
neurotransmisor inhibidor.
se dirigen contra el antígeno asociado a insulinoma 2 (IA2), una enzima que
participa en la regulación de la síntesis de insulina.
son anticuerpos que reconocen directamente alguno de los epítopos de la
insulina, lo que incapacita la reacción del organismo.
4.3. Anemia perniciosa

se trata de anticuerpos dirigidos contra las células
gástricas, que son unas células del estómago cuya función es producir factor intrínseco y
ácido clorhídrico. La ausencia de factor intrínseco impide la absorción de vitamina B12.
hay dos tipos, los que bloquean la zona de unión con la vitamina
B12, y los que no afectan esta unión (consiguientemente, tampoco afectan al transporte).
4.4. Púrpura trombocitopénica

se dirigen contra varias glucoproteínas de la superficie plaquetaria. Su
valor pronóstico es dudoso.
4.5. Neutropenia autoinmune

reconocen determinados antígenos de la superficie de neutrófilos. Resultan
86
útiles para hacer seguimiento de la evolución y respuesta al tratamiento farmacológico en los

pacientes.
4.6. Miastenia gravis

van dirigidos contra el receptor de la acetilcolina,

neurotransmisor involucrado en el movimiento muscular. Son muy relevantes y valiosos
en el diagnóstico de miastenia gravis por la cantidad de información que aportan.
Anti-músculo estriado: su determinación se hace por IFI, y van dirigidos contra el
músculo estriado.
Los autoanticuerpos de este grupo están implicados en la patogénesis. Son útiles, además,
para la evaluación progresiva de la enfermedad del paciente y su respuesta al tratamiento
farmacológico. Son los siguientes:
se dirigen contra una proteína de unión entre células
(desmosomas).
se dirigen contra la unión dermoepidérmica (hemidesmosomas).
4.8. Síndrome de Goodpasture
El síndrome de Goodpasture se suele presentar entre los 16-30 años de edad. Se reconoce que
las manifestaciones pulmonares usualmente preceden a una enfermedad renal evidente.
Si bien han sido muchos los progresos que han permitido comprender mejor este síndrome,
sigue sin determinarse de forma concluyente su etiopatogenia, pese a que varios agentes, como
la inhalación de hidrocarburos volátiles o el virus de la gripe, están estrechamente implicados.
Los autoanticuerpos relacionados con esta enfermedad son: anti-membrana basal

glomerular, que resultan imprescindibles para su diagnóstico. Se dirigen contra la membrana
basal glomerular. Imagen de tejido pulmonar sangrante en el síndrome de Goodpastures.
87
4.9. Hepatitis autoinmune

son marcadores de hepatitis autoinmune tipo 1. Se unen contra el músculo
son marcadores de hepatitis tipo 2 (los LKM-1 son los más relevantes). Van
dirigidos contra microsomas de hígado y riñón, y se determinan en primer lugar por IFI,
demasiada información de la enfermedad, por lo que no resultan de utilidad en el

diagnóstico.
son marcadores de hepatitis autoinmune tipo 2. Van dirigidos contra una
enzima de citosol hepático. Estos sí que son útiles para evaluar la respuesta del paciente
al tratamiento.
4.10. Cirrosis biliar primaria

van dirigidos contra varios antígenos mitocondriales. Primeramente, se determinan
por IFI en portas de triple tejido, y después pueden confirmarse por ELISA o inmunoblot. No
son útiles para la evaluación pronóstica, pero sí para el diagnóstico de cirrosis biliar primaria.
4.11. Enfermedad celiaca

La determinación de los anticuerpos de esta enfermedad resulta de gran utilidad para hacer un
seguimiento controlado de la dieta sin gluten en los pacientes. Son los siguientes:
estos son los marcadores que proporcionan
información más útil de la enfermedad y se determinan con anti-IgA. Esta determinación
Anti-péptidos deamidados de gliadina (PDG): son los primeros en aparecer tras la

ingesta de gluten. Dependiendo de la edad del paciente, su nivel varía. Los individuos
menores de 2 años son los más importantes a la hora de analizar y detectar la
enfermedad.
dirigidos frente a la Tgt. Su determinación está siendo reemplazada por la determinación

88
de anti-Tgt por técnicas enzimoinmunoanalíticas.

5. Anticuerpos no
Los autoanticuerpos que se producen en la mayoría de las enfermedades autoinmunes

sistémicas van dirigidos contra determinados componentes presentes en el núcleo celular.
Estos anticuerpos reciben el nombre de antinucleares, pero también existen anticuerpos no

organoespecíficos como la anti-sintetasa, que identifica estructuras del citoplasma celular.
Dichos anticuerpos se consideran marcadores, aunque no siempre son útiles en cuanto al

diagnóstico.
5.1. Anticuerpos antinucleares

(ANA)
Representan anticuerpos dirigidos contra componentes del núcleo, como serían estructuras
89
nucleolares, nucleosomas y proteínas nucleares no histonas. Se clasifican según las estructuras
reconocidas en el núcleo celular (ver tabla siguiente).
CLASIFICACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES (ANA)
Estructura reconocida Tipo de ANA

Anti-DNA
Nucleosoma Antihistona
Anticromatina
Anticentrómero
Asociadas al ADN
Anti-Scl 70
Anti-Sm
Proteínas no histonas Anti-U1RNP
Asociadas al ARN
Anti-Ro/SS-A
(ENA)
Anti-La/SS-B
Antisintetasas
Anti-PM/Scl
Nucleolo
Anti-P ribosomal
Únicamente los anticuerpos anti-dsADN son útiles en el seguimiento del paciente, ya que
su valor se relaciona con la actividad de la enfermedad. El resto de anticuerpos tienen valor
solo en el diagnóstico y no en el seguimiento de la patología, por lo que una sola determinación
positiva es suficiente; posteriores repeticiones analíticas, entonces, no aportarían ningún tipo
de información adicional.
Así pues, el papel de estos autoanticuerpos tiene importancia dentro de un contexto

epidemiológico y clínico adecuado. Son útiles en el diagnóstico, pero no determinantes.
Debemos tener presente que existen ciertas situaciones en que se detectan ANA en el suero de
un paciente a título bajo sin estar asociados con procesos autoinmunes, como es el caso del
suero de pacientes sometidos a algún tratamiento, personas de edad avanzada o personas con
algún proceso infeccioso.
Tras la prueba, existen dos posibles resultados:

a. Si el suero es positivo (contiene ANA), el segundo anticuerpo (anti-anticuerpo hu-
mano) se une a los autoanticuerpos humanos; al observar el tejido o cultivo al mi-
b. Si el suero es negativo, no hay anticuerpos humanos unidos a los núcleos, y no se
microscopio.
Para la interpretación del resultado, hay que considerar:

puesto que puede indicar el tipo de anticuerpos presen-
90
tes.
puesto que la presencia de ANA no es diagnóstica de enfermedad

autoinmune. Normalmente se considera positiva una IFI para determinación de ANA
si el título es mayor de 160, aunque el punto de corte lo establece cada laboratorio.
5.2. ANCA
Son anticuerpos dirigidos contra antígenos lisosómicos, principalmente PR3 y MPO. Su
determinación se realiza primero por IFI y después se confirma por ELISA o inmunoblot.
Son de utilidad para prever posibles brotes por aumentos rápidos en su título, o positividad
tras un periodo de negatividad. Su título va paralelo al tratamiento.
5.3. Anti-aparato de Golgi

Son anticuerpos dirigidos a antígenos de las cisternas y membranas vesiculares del aparato
de Golgi.
Su detección es por IFI sobre células Hep-2.

El aparato de Golgi es un orgánulo presente en todas las células eucariotas y pertenece al
sistema de endomembranas. Una de sus funciones principales son la glicosilación de proteínas,
selección, destinación y glicosilación de lípidos, almacenamiento y distribución de lisosomas,
al igual que los peroxisomas, que son vesículas de secreción de sustancias.
5.4. Anti-ribosomales
Son dirigidos contra proteínas de ambas subunidades ribosomales.
Como el caso anterior, su detección se realiza por IFI en células Hep-2, pero su confirmación es
necesaria mediante ELISA o inmunoblot.
5.5. Anti-sintetasas
Se trata de varios anticuerpos que van dirigidos a alguna enzima sintetasa de ARN-t. Se
determinan primeramente por IFI y después se confirman por ELISA o inmunoblot.
5.6. Antifosfolípidos
91
Son anticuerpos dirigidos contra un grupo variado de fosfolípidos aniónicos.
En general, los que se determinan son los anti-cardiolipina y anti-beta-2glicoproteína

(determinación por ELISA), y son útiles para el diagnóstico de síndrome antifosfolípido en el

caso de que exista una clínica compatible, y también para evaluar el riesgo trombótico.
5.7. Crioglobulinas
No se consideran anticuerpos en sí. Son inmunoglobulinas que tienen modificaciones en la
solubilidad en función de la temperatura.
Como característica principal, precipitan a bajas temperaturas.

5.8. Factor reumatoide y

péptido citrulinado
El factor reumatoide es un conjunto de inmunoglobulinas de iso-tipo M. Van dirigidas contra
la tracción constante (Fc) de las IgG. Posee unas sensibilidad y especificidad elevadas en el
diagnóstico de la artritis reumatoide; su presencia es indicativa de un mal pronóstico de la
patología.
El péptido clínico citrulinado se une a la citrulina, que es un aminoácido no proteico originado

en un proceso que se da antes del desarrollo de la artritis reumatoide. Por este motivo se
considera un marcador altamente específico de la enfermedad.
92
6. Determinación de
anticuerpos por
indirecta
Como se deduce del apartado anterior, la naturaleza y la especificidad de los autoanticuerpos
en las enfermedades autoinmunes es muy variada, como también lo son las técnicas
inmunológicas aplicadas a su determinación.
Así, se utilizan reacciones de precipitación, aglutinación y fijación del complemento, aunque

actualmente las más habituales son la inmunofluorescencia indirecta y varias técnicas basadas
en enzimoinmunoensayos.
La inmunofluorescencia indirecta (IFI) es una de las técnicas más usadas para la investigación
y diagnóstico de procesos autoinmunes; sirve para valorar la presencia o la ausencia de
autoanticuerpos en el suero de un paciente.
93
Recordemos, antes de continuar, las principales diferencias entre las técnicas directas e
Directas.
directamente a la molécula diana. Esta técnica reduce el número de pasos y resulta más
de los anticuerpos.

Indirectas. Utilizan dos anticuerpos, el primario se une a la molécula diana, y el
de las ventajas de esta técnica es la elevada sensibilidad por la unión de más de un
En cuanto al IFI, estamos ante una técnica altamente sensible, pero poco específica, que es
capaz de detectar concentraciones de anticuerpos menores a 0,01 mg/ml. Los resultados se
informan como un título, el cual se corresponde al valor de la máxima dilución del suero del
paciente, en la que sigue habiendo presencia de fluorescencia.
Así pues, se considera una técnica semicuantitativa, teniendo en cuenta que no proporciona
un valor exacto de concentración de anticuerpo. La lectura debe ser realizada por un
profesional experto en este tema.
En el IFI, el anticuerpo o suero problema se aplica sobre el antígeno y se lava. Luego se añade a
un anti-anticuerpo fluoresceinado contra las inmunoglobulinas del primero, se lava otra vez y
se leen los resultados mediante observación en un microscopio de fluorescencia.
6.1. Sustratos para IFI y

procedimiento
Con el objetivo de determinar un anticuerpo por IFI, habitualmente se utilizan como sustrato
portaobjetos con cortes de tejidos de animales de experimentación, como son la rata o el
mono.
El procedimiento adecuado se ilustra en la siguiente imagen:

94
Las fases consisten en:

a. Se diluye el suero de paciente y se pone en contacto con el tejido.
b. -
pos que no se hayan unido, así como otras sustancias séricas que podrían interferir
en el resultado.
c. Se incuba con un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana que va conjugado con

-
unido los autoanticuerpos que estaban presentes.
d. Dependiendo de la zona del tejido que se marque, se puede concretar la naturaleza

de los antígenos frente a los que se dirige el autoanticuerpo.
El aticuerpo anti-inmunoglobulina humana mencionado puede dirigirse contra algún isotipo en

particular, o bien con todos. Esto dependerá de lo que se pretenda determinar. El fluorocromo
que más se conjuga al anticuerpo secundario es el FITC (fluoresceína isotiocianato).
Para la interpretación de los resultados obtenidos, es imprescindible utilizar siempre un

control positivo y uno negativo que actúen como referencia. Es recomendable utilizar una
fluorescencia basal en el control negativo con la finalidad de no informar resultados falsamente
positivos.
El tipo de tejido utilizado se elige en función de la sospecha diagnóstica del paciente (ver tabla
siguiente). Y dependiendo de la elección del tejido, la dilución de la muestra del suero también
será una u otra.
Isotipo al que se dirige el

Sospecha diagnóstica Sustrato Autoanticuerpo
segundo Ac
ANA, ENA, nucleolares,
EAS* Hep2 IgG
citoplásmicos
EC* Esófago de mono Anti-edomisio IgA
Hígado de mono, riñón de AMAs, anti-actina, LKM,
HAI*, CBP* IgG
rata, estómago de rata LC1
Anemia perniciosa Estómago de rata Anti-CPG IgG
Enfermedad Cerebelo, nervio sural,
Anti-neuronales IgG
paraneoplásica intestino de mono
Enfermedad de Addison Hipófisis de mono Anti-hipofisarios IgG
MG* Corazón de mono Anti-músculo estriado IgG
DT1* Páncreas de rata/mono Anti-islotes pancreáticos IgG
Anti-sustancia intercelular
Pénfigo/penfigoide Esófato de mono de la piel / anti-membrana IgG
basal de la piel
95
Vasculitis Neutrófilos Anti-MPO, anti-PR3 IgG
* EAS, Enfermedades autoinmunes sistémicas; EC, enfermedad celiaca; HAI, hepatitis

autoinmune; CBP, cirrosis biliar primaria; MG, Miastenia gravis; DT1, diabetes tipo 1.
Si se sospecha que en un paciente puede diagnosticarse una de las enfermedades

autoinmunes, el sustrato de elección son las células Hep2, que se obtienen de cáncer de
laringe humano. La elección de estas células se justifica por su gran tamaño y porque están
en constante división y proliferación, lo que permite observar simultáneamente multitud de
células en las distintas fases del ciclo celular.
Si se sospecha de enfermedad paraneoplásica, el sustrato que se utiliza es el cerebelo de

mono, intestino y nervio periférico (nervio sural). El objetivo aquí es determinar la presencia de
anticuerpos antineuronales.
Por otro lado, en pacientes con sospecha de vasculitis, los sustratos elegidos son neutrófilos
fijados con etanol y con formalina. El etanol produce la agrupación de los gránulos de MPO
alrededor del núcleo, donde se observa una fluorescencia perinuclear cuando hay anticuerpo
anti-MPO. Esto es útil para diferenciar la vasculitis con anti-MPO (tinción perinuclear en etanol
y citoplásmica en formalina) de anti-PR3 (tinción citoplásmica en etanol y formalina).
En este apartado se muestran los distintos patrones de IFI que se pueden observar en una
preparación sobre células Hep2 y otros tejidos (ver tabla siguiente).
Patrón IFI Características del patrón Enfermedad asociada

Nucleoplasma
dsDNA Nuclear homogéneo LES
Sm Nuclear moteado grueso LES
U1-RNP Nuclear moteado grueso EMTC, LES, Raynaud
SS-A/Ro Nuclear moteado fino SS, LES
SS-B/La Nuclear moteado fino SS, LES
PCNA Nuclear moteado pleomórfico LES
Nuclear moteado puntiforme.
Centrómero Scl, Raynaud, CBP
Centrómeros en metafase
1-6 puntos en interfase. Cromatina
Coilina p80 SS
negativa
Sp100 Más de 6 puntos en interfase CBP
Mi-2 Nuclear moteado fino DM-PM
Nucleolares
96
Fibrilarina Nucleoar “clumpy” Scl

NOR-90 Nucleoar moteado Raynaud
PM/Scl Nucleoar, nucleoplasma difuso Overlap Scl/PM, Raynaud
Ku Overlap Scl/PM, LES
Nucleolar granular, nucleoplasma
Scl-70 Scl, Overlap PM/Scl
y cromatina homogéneos
SRP Nucleolar y citoplásmico difuso PM/DM

Otros antígenos nucleares
Láminas Anillo nuclear LES, HAI
Poro nuclear Anillo nuclear CBP
NuMA Huso mitótico en interfase SS
Citoplasma
RNP Citoplásmico denso LES
Citoplásmico moteado en 30 %
Jo-1 PM
células
PL-7 y PL-12 Citoplásmico moteado PM
Puntos citoplásmicos en los
Centriolo / centrosoma polos opuestos a la cromatina en Scl, Raynaud
metafase
Golgi Aparato de Golgi SS
Microfilamentos Tipo actina HAI 1

Los patrones se clasifican en tres grupos: nucleares, nucleolares y citoplásmicos.
Cada patrón observado por IFI no siempre se asocia solamente a un antígeno (varios antígenos
muestran el mismo patrón). También es importante considerar que algunos anticuerpos
antinucleares presentan más de un patrón (nuclear, nucleolar, nucleolar y citoplásmico, etc.).
Ciclo celular.
97
6.2.1. Patrones nucleares
Patrones membrana nuclear
En células en interfase se observa una fluorescencia periférica de la membrana nuclear. Si

los anticuerpos están en títulos altos pueden ofrecer una imagen de tinción nuclear total. En
telofase se observa un patrón similar. En metafase, se localiza la fluorescencia en el citoplasma
de manera difusa, y la cromatina es negativa.
Patrones nucleoplásmicos
-
me del nucleoplasma, que podemos asociar con anticuerpos dirigidos a los compo-
nentes de la cromatina (ADM, histonas...). Se detecta una tinción más intensa en la
periferia nuclear. En metafase y telofase, la cromatina puede mostrarse con tinción
homogénea o periférica.
se pueden encontrar muchos patrones nucleares motea-

dos distintos, aunque distinguimos tres grupos principales:
en células en interfase se observan gránulos grandes, de tama-

ño variable, distribuidos por todo el nucleoplasma. Los nucleolos pueden apa-
98
recer con tinción negativa y también en positiva. En células metafase y telofase,

la fracción de citoplasma que está alrededor de la placa de cromatina presenta
condensaciones de granos.
-
tribución uniforme (este patrón puede pasar desapercibido si el observador es
inexperto o desconoce la estructura del patrón homogéneo).
(anti-PCNA = antígeno nuclear de proliferación celular):

diferentes patrones se observan dependiendo de la fase celular en la que se en-
cuentren las células. Esto es: los núcleos de células en fase S muestran puntos de
tamaño irregular en el nucleoplasma y en algunas células los nucleolos también
se tiñen; las células en fase G y en metafase son negativas.
puntos por núcleo) uniformemente distribuidos por todo el núcleo. Las células
-
mosómicas.
en células en interfase se muestran 5-10

puntos por núcleo. Los cromosomas de células en metafase y telofase son nega-
tivos.
en células en interfase se observan 2-6 puntos

por núcleo localizados en el nucleoplasma, normalmente muy próximos a los nu-
cleolos. Los cromosomas de células en metafase o telofase son negativos.
6.2.2. Patrones nucleolares
Patrón nucleolar homogéneo
Las células en interfase muestran una tinción homogénea de los nucleolos. Se aprecia una
tinción negativa de las regiones de NOR (Regiones de Organización Nucleolar) en células en
metafase y telofase.
Patrón nucleolar moteado
Las células en interfase manifiestan una tinción granular de los nucleolos, lo que se corresponde
a los centros fibrilares de los nucleolos. Las células en división tienen una tinción de la cromatina
positiva.
Patrón nucleolar punteado
En células en interfase se aprecian puntos discretos en el centro nucleolar. Las células en

metafase tienen 2-5 puntos correspondientes a tinción de las regiones por NOR.
Patrones asociados al aparato mitótico nucleolares
99
en células en división se aprecia un punto en casa uno de los polos del
huso metafísico, mientras que en células de interfase se aprecian uno o dos puntos
cerca del núcleo, en el citoplasma.
en células en metafase se aprecia una tinción de los polos

negativos.
acromático desde el polo hasta la placa cromosómica. En interfase hay ausencia de

tinción.
las células en profase y metafase presentan
la placa metafásica. En telofase se observa tinción en la zona se separación de las

células y en el cuerpo medio que une las células en división. En interfase se tiñen
mostrando un patrón moteado nuclear.
en profase se observa una tinción punteada densa en los cromosomas. La

tinción en metafase indica un patrón formado por dos grupos de granos densos y
grandes alrededor de la placa cromosómica, que tiene forma de una cremallera; se
tiñe el citoplasma de manera difusa. En telofase, las células presentan tinción débil
en el cuerpo medio y tinción intensa en el citoplasma. La cromatina es negativa.
6.2.3. Los patrones citoplásmicos
Se aprecian gránulos y puntos finos distribuidos por todo el citoplasma. Este patrón se conoce
como “polvo de estrellas”. Los núcleos y los nucleolos no se tiñen. Las células en división no
presentan tinción de la cromatina.
Patrón citoplásmico moteado difuso
Todo el citoplasma presenta una tinción granular densa homogénea en mayor o menor grado.
El núcleo no se tiñe, aunque los nucleolos pueden aparecer teñidos o no. En células en metafase
se observa tinción negativa de la cromatina.
Patrón citoplásmico granular tipo mitocondrial
Las células en interfase presentan gránulos irregulares y grandes por todo el citoplasma,
con mayor condensación en la zona perinuclear. Este patrón también tiñe el citoplasma de
hepatocitos, células renales y células parietales gástricas. Su observación resulta útil para
distinguirlo de otros patrones citoplásmicos.
100
Patrón citoplásmico tipo Golgi
En interfase se aprecia una tinción en gránulos irregulares y grandes localizados sobre todo en
la periferia del núcleo. En células en división hay una tinción difusa del citoplasma con refuerzo
alrededor del material cromosómico.
Patrón citoplásmico punteado tipo lisosomal
En células en interfase se aprecian múltiples puntos de tamaño variable distribuidos por todo
el citoplasma. No se tiñen ni el núcleo y los nucleolos. En células en división se observa una
tinción difusa del citoplasma.
Patrón citoesqueleto
plasmática, dispuestas de forma paralela y rectilíneas. En células en metafase el núcleo,

los nucleolos y los cromosomas son negativos.
es fácilmente confundible son el patrón tipo actina, si el
red radial, agrupadas alrededor del núcleo. Los núcleos y los nucleolos son negativos en
interfase.
Patrones citoplásmicos sobre triple tejido
Patrón LC-1. Solamente se aprecia tinción difusa en el citoplasma hepático, a excepción

de las células que están alrededor de las venas centrales hepáticas. La tinción es negativa
en riñón y células de estómago.
Patrón LMK-1. Hay tinción homogénea tanto en células hepáticas como en células de los
túbulos proximales del riñón (los túbulos distales no muestran tinción, de igual forma que
las células de estómago).
Patrón célula parietal gástrica. Se aprecia tinción citoplásmica granular solo en células
parietales gástricas, células presentes en la zona próxima al músculo liso del estómago.
No se detecta tinción en el citoplasma de células renales ni hepáticas.
Ante la sospecha de que haya una enfermedad autoinmune sistémica, el procedimiento marca
realizar una determinación de anticuerpos antinucleares (ANA) por inmunofluorescencia
indirecta (IFI).
Si se detectan anticuerpos positivos, se recomienda realizar otras técnicas para estudiar e

identificar los antígenos reconocidos por los autoanticuerpos. Entre estas técnicas destacan
esencialmente el enzimoinmunoensayo (ELISA) y el inmunoblot (IB).
101
7. Determinación de
anticuerpos mediante
ELISA
Aunque la IFI ha sido considerada durante mucho tiempo el estándar para detectar
autoanticuerpos, en la actualidad está siendo sustituida por las técnicas inmunoenzimáticas,
como es ELISA (ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas).
La técnica ELISA es altamente específica, lo que se traduce en la detección de muy pocos

resultados falsamente positivos, es decir, se reduce significativamente el número de muestras
informadas como positivas que realmente son negativas.
Entre las diferentes modalidades disponibles, el ELISA indirecto es la que ofrece la posibilidad
de detección de diferentes autoanticuerpos, siempre que se disponga del correspondiente
antígeno.
La base de la técnica es similar a la IFI, modificando el marcador incorporado al conjugado. Este

también está constituido por anticuerpos obtenidos en una especie animal, que reconocen los
dominios constantes de las cadenas pesadas de los anticuerpos humanos.
102
La reacción se efectúa aplicando la metodología del ELISA indirecto mediante el uso de

conjugado, sustrato y antígeno.
Para determinar los anticuerpos mediante la técnica ELISA, es oportuno fijar el antígeno en
placas de poliestireno. Tal y como se hace en la IFI:
La primera fase es la incubación con el suero del paciente.
En la segunda fase, se añaden anticuerpos anti-inmunoglobulinas humanos marcados

con una enzima, o bien un radioisótopo o una molécula luminiscente.
Finalmente, se mide la cantidad de producto coloreado, o luminiscencia o radiactividad,
de forma que obtenemos una medida cuantitativa de la cantidad de autoanticuerpo
presente en la muestra.
Para ese propósito, se requiere utilizar una curva estándar calibrada patrón usando sueros de
concentración conocida, para finalmente interpolar la medida del suero en la curva y conocer
la cantidad de anticuerpo presente en el suero.
En la mayoría de los casos, esta curva no es lineal y posiblemente existan variaciones en las
determinaciones sucesivas de un mismo suero; dichas variaciones pueden oscilar hasta un 15-
20 %. Por este motivo es mejor considerar los resultados como semicuantitativos.
Como en otras técnicas, también es importante incorporar un control positivo y uno negativo
de concentraciones conocidas con la finalidad de garantizar el correcto desarrollo del método.
La técnica ELISA es útil para determinar anticuerpos específicos. Cabe la posibilidad de

preparar los antígenos de forma poco purificada, recombinantes, o altamente purificados.
Los primeros se utilizan normalmente para pruebas de screening inicial, y su cuantificación
suele ser semicuantitativa, mientras que con los otros detectamos anticuerpos marcadores
específicos de la enfermedad, que se valoran en unidades de masa o unidades cuantitativas
arbitrarias.
4
estudio de
técnicas de
Aplicación de
hipersensibilidad.
1. La hipersensibilidad y su diagnóstico ...................................................... 107
2. Técnicas in vivo ........................................................................................ 111
3. Técnicas in vitro........................................................................................ 118
4. Evaluación de la hipersensibilidad retardada ........................................... 125

106
Objetivos
Analizar las técnicas para el diagnóstico de alergias.
Saber evaluar la hipersensibilidad retardada.

1. La hipersensibilidad y
su diagnóstico
1.1. Reacciones de
hipersensibilidad
Las reacciones de hipersensibilidad son otros grupos de enfermedades o trastornos
relacionados directamente con el sistema inmunitario.
Se denomina hipersensibilidad una reacción inadecuada del sistema inmune ante sustan-
cias que el propio organismo considera como nocivas, llamadas alérgenos.
En 1963, los inmunologistas británicos P. H. Gell y Robin Coombs establecieron una clasifica-
ción de los tipos de hipersensibilidad basada en cuatro grupos:
107
Hipersensibilidad I o alergia (medida por IgE): es una reacción secundaria a la ingesta,
inhalación o contacto con una partícula o una sustancia. Solo se da si el individuo ha sido
previamente sensibilizado, es decir, que el contacto con la partícula se haya realizado. La
reacción se produce en dos etapas:
en el primer contacto con un alérgeno, la persona no experimen-

ta ninguna manifestación sintomática, pero en su organismo se producen cambios

que desencadenarán una síntesis exagerada de IgE.
tras contactos posteriores, el alérgeno se unirá a la IgE liga-

da sobre los mastocitos, formando puentes que unen y entrecruzan la agregación de
receptores, a la activación y a la desgranulación celular, con la liberación de distintos
mediadores, que son los responsables de los síntomas alérgicos.
la reacción se produce por la interacción antígeno-anticuerpo
reacciones pueden ser responsables de varias enfermedades autoinmunes, y también

de reacciones de hipersensibilidad frente a medicamentos u otras sustancias capaces de
engloba reacciones por inmunocomplejos de anticuerpos IgG

e IgM que se localizan en los tejidos, desencadenando una respuesta inmunitaria con
activación del complemento. Algunos ejemplos de este tipo son la enfermedad del suero
o la reacción de Arthus.
Hipersensibilidad IV o retardada: la reacción se produce por contacto cutáneo y es
mediada por células, no por anticuerpos. Como su nombre indica, la respuesta no es
inmediata, sino que tarda más de 12 horas en producirse (en general, unos 2-3 días).
y puede llevar a la destrucción de las células afectadas por linfocitos citotóxicos o a

su aislamiento por acción de linfocitos colaboradores, que inducen la formación de
granulomas.
Mecanismo de la alergia.
108
Las reacciones de hipersensibilidad inmediata se desarrollan en menos de una hora desde el

contacto con el alérgeno; están mediadas por la IgE y se conocen como alergias.
Las reacciones de hipersensibilidad retardada se desarrollan varias horas después,

generalmente más de 12, y son desencadenadas por los linfocitos T activados.
1.2. Diagnóstico de reacciones
de hipersensibilidad
Con el fin de diagnosticar este tipo de patologías, especialmente las de tipo I y IV, se han
desarrollado técnicas y métodos que se realizan en el laboratorio, en este caso con la
participación in situ del paciente.
En esta unidad expondremos una visión detallada de estas técnicas para conocer más
profundamente los objetivos que persiguen y también las directrices para realizar una
interpretación adecuada de cada una de ellas.
En concreto, las técnicas de diagnóstico de alergias e hipersensibilidad se dividen en dos

grandes grupos:
son pruebas de laboratorio que se realizan sobre el propio paciente.
anteriores, o que se llevan a cabo ante la imposibilidad de hacer los test in vivo por
motivos particulares de los pacientes.
Ambas técnicas disponen de subtécnicas más específicas, según el tipo de alergia o la zona
anatómica afectada. De forma general, se clasifican de la siguiente manera:
109
Sensibilización de Prick test
Pruebas cutáneas
tipo inmediato Intracutánea
Espirometría
Test de
broncodilatación

Provocación con
ejercicio
Provocación
Técnicas in vivo Provocación
Pruebas con metacolina/
bronquial
respiratorias histamina
Pruebas de
Provocación
provocación
bronquial específica
Provocación
conjuntival
Provocación asal
Provocación oral
Determinación de IgE sérica total
Determinación de IgE antígeno específica
Test de activación de basófilos
Técnicas in vitro Test de liberación de histamina (TLH)
Proteina catiónica del eosinófilo
Determinación de triptasa
Determinación de leucotrienos
Las alergias, que son reacciones de hipersensibilidad de tipo I, inmediata o anafiláctica,

están mediadas por IgE; por tanto, el diagnóstico se basa en la determinación de este tipo de
inmunoglobulina.
La IgE es el isotipo de inmunoglobulina que se encuentra en menor concentración en el suero,
por lo que es necesario utilizar métodos muy sensibles para su cuantificación.
110
2. Técnicas in vivo
2.1. Pruebas cutáneas

Las pruebas in vivo cutáneas consisten en reproducir la reacción de hipersensibilidad en
la piel del paciente para demostrar que este está sensibilizado a una sustancia determinada.
El principal requisito para que el paciente pueda ser sometido a estas pruebas es que no debe
haber estado con tratamiento antihistamínico ni corticoideo en los 7-10 días anteriores a
la prueba. El motivo es porque estos medicamentos pueden inhibir la respuesta cutánea e
impedir la correcta lectura de los resultados.
Cuando se realicen estas pruebas cutáneas, se deben tener en cuenta las precauciones
siguientes:
Debe haber supervisión de un médico.
Los extractos utilizados deben ser estandarizados y estar en sus concentraciones
adecuadas.
111
Debe disponerse un control positivo y uno negativo.
La técnica se lleva a cabo sin causar ningún daño al paciente.
Debe conocerse la medicación que está tomando o haya tomado el paciente en las horas
o días previos a la prueba.
Deben registrarse todas las reacciones que ocurran al paciente, para dejar constancia en

su historial clínico (pueden ser de interés para futuras pruebas que se le realicen).
2.1.1. Sensibilización inmediata

Este test cutáneo está basado en la desgranulación de los mastocitos cutáneos al entrar
en contacto con el alérgeno, lo que produce la liberación de mediadores químicos como
histamina, triptasa, neuromediadores, etc., que son encargados de la respuesta inmediata.
El mastocito es una célula del tejido conjuntivo que contiene gránulos con mediadores de la
inflamación.
Prick test
También llamado test por punción, es la prueba alérgica más usada con diferencia. Resulta
rápida, sencilla, de elevada especificidad y sensibilidad, lectura inmediata y bajo coste. Es muy
útil y fiable para confirmar una sospecha diagnóstica de alergia. Además, las probabilidades de
reacción sistémica son muy bajas.
El modo de realización es: extender el antebrazo del paciente y colocar encima unas gotas de
control positivo (histamina), de control negativo (solución salina fisiológica) y de los extractos
que se deseen estudiar en ese paciente. Entre las gotas debe haber una separación de 2 cm
para evitar reacciones enmascaradas.
A continuación, con una aguja hipodérmica se hace una incisión en la epidermis con una
pequeña angulación (no perpendicular). Es fundamental utilizar una aguja diferente para cada
extracto.
Prueba de Prick test.
112
Intracutánea
Esta prueba también se basa en la inyección de extractos alergénicos, con concentraciones

de 0,05-0,07 ml, pero a nivel intradérmico del brazo, generando una pápula (lesión dérmica
elevada, con bordes definidos y contenido sólido) de 2-3 mm. Por tanto, es importante
mantener una distancia mínima de 2 cm entre cada alérgeno y evitar, así, errores en resultados.
Para los controles positivo y negativo se utilizan las mismas sustancias que el caso anterior.
Durante la prueba se requerirá la

presencia de un médico por si se Características Prick test Intracutánea
desencadena una reacción sistémica;
Rápida Sí Relativamente
la probabilidad es baja (solo ocurre
en el 0,5 de pacientes), pero hay que Sencilla Sí Sí
contemplar esta posibilidad.
Produce malestar No Sí
¿Cómo se diferencian las técnicas
Falso positivo Raramente Posible
prick test e intercutánea? La siguiente
tabla proporciona la información Falso negativo Posible Raramente
necesaria para diferenciarlas.
Segura Sí Relativamente
Detecta IgE Sí Sí
2.1.2. Lectura de las técnicas cutáneas
Tras la aplicación de las gotas en el antebrazo del paciente, aparece respuesta de la histamina
entre los 8-10 minutos siguientes, y entre 15-20 minutos para los alérgenos.
Para calcular la media entre los diámetros mayor y menor de la pápula se usa una regla
milimétrica. Posteriormente, se coloca un esparadrapo transparente sobre la reacción y se
marcan las pápulas con un rotulador. Una vez marcado, el esparadrapo se pega en una hoja
del historial clínico del paciente con la finalidad de constatar la realización de la prueba, así
como del resultado obtenido para futuras comparaciones. Este procedimiento se hace tanto
en prick test como en intercutánea.
A la hora de leer e interpretar los resultados, hay varias opiniones entre los expertos e
investigadores, quienes han establecido diferentes criterios sobre la positividad de una pápula.
Si bien la estructura es igual en ambas pruebas, no lo es el criterio de positividad.
En el prick test, una prueba se considera positiva cuando hay una reacción de 3 mm de pápula
y/o 10 mm de mácula eritematosa (una mácula es una mancha en la piel causada por aumento
del riego sanguíneo o alteración en la pigmentación).
En cambio, en el test intracutáneo se valora la respuesta en función de los criterios de

Norman, que son los siguientes:
Grado Eritema Pápula
113
0 < 5 mm < 5 mm
± 5-10 mm 5-10 mm
+ 11-20 mm 5-10 mm
++ 21-30 mm 5-10 mm

5-10 mm
+++ 31-40 mm
seudópodos
> 10 mm
++++ > 40 mm
seudópodos
Resultado positivo.
Es importante prestar atención a los pacientes lactantes, ya que a partir de los 3 meses de
edad se produce una pápula considerable con la histamina. Así pues, la interpretación de la
reacción ante a los extractos estudiados se valora comparándola con la pápula del control
positivo y no con los criterios arriba mencionados.
Aparte del antebrazo, las pruebas cutáneas también puede realizarse en la espalda del paciente,
puesto que la reactividad cutánea suele ser más pronunciada en la espalda. Además, el técnico
que se encargue de llevar a cabo la prueba debe emplear extractos estandarizados, ya que
los no estandarizados generan mayores reacciones que pueden no estar contempladas en el
proceso clínico en cuestión.
2.2. Pruebas respiratorias

El objetivo de las pruebas respiratorias es confirmar el diagnóstico del asma (enfermedad
crónica que produce inflamación de las vías aéreas), así como valorar el grado de gravedad,
hacer seguimiento clínico de la enfermedad y evaluar la respuesta del paciente al tratamiento.
Se realizan cuando se sospecha esa patología en los pacientes, siempre y cuando la edad lo
permita. Es más complicado en niños pequeños, ya que no comprenden las pautas para una
correcta realización de la prueba. En estos casos se utilizan otros tipos de técnicas que implican
sedación y que no trataremos en este módulo.
2.2.1. Espirometría
La espirometría es un estudio rápido e indoloro en el que se utiliza un dispositivo manual
denominado "espirómetro", que sirve para medir la cantidad de aire (volumen de aire)
que pueden retener los pulmones de un individuo y la velocidad de las inhalaciones y las
exhalaciones durante la respiración (velocidad del flujo de aire).
Para utilizar el espirómetro, el paciente respira en una boquilla. El médico puede pedirle que
respire con normalidad o que respire hondo y exhale el aire rápidamente, como si estuviera
114
inflando un globo.
Se entiende esta técnica como una maniobra de capacidad vital forzada. En otras palabras, se
trata de seguir estos pasos:
1. A partir de una espiración normal, se efectúa una inspiración máxima.
2. Aguantar unos segundos en apnea (sin respiración).

3. Y hacer una espiración forzada.
Para llevar a cabo estas maniobras respiratorias, el paciente se encontrará en una posición
sentada, con la espalda a 90º, utilizando pinzas nasales y boquillas de tamaño adecuado y no
deformables.
La mayoría de los espirómetros detectan si la prueba se ha realizado correctamente. Si no se

dispone de equipos actualizados, se recomienda hacer la prueba tres veces y escoger la mejor
de las curvas. Además, es importante calibrar los espirómetros diariamente o después de cada
uso para garantizar un mantenimiento adecuado.
A partir de esta técnica, podemos determinar:

indicador del volumen pulmonar.
indicador de volumen
del esfuerzo. No se debe evaluar este valor de manera aislada porque puede variar mucho
entre prueba y prueba.
El conjunto de parámetros anteriores permite clasificar las alteraciones de la capacidad
ventilatoria y establecer el grado de alteración funcional.
Por otra parte, en cuanto a los grados de insuficiencia respiratoria obstructiva, se valoran de
acuerdo a los criterios de la American Thoracic Society, y son los siguientes:
Grados FEV1 previsto

Normal
Leve
Moderada
Mod-Grave
Grave
Muy grave < 34
2.2.2. Test de broncodilatación
115
Si la prueba de la espirometría, descrita en el punto anterior, resulta positiva, no se considera
aceptable, aunque la obstrucción fuese mínima. Por esto, el siguiente paso es realizar el test de
broncodilatación. Sin embargo, en la actualidad no está definida ninguna metodología para
efectuar esta técnica.

El procedimiento que se aplica es la espirometría y posterior broncodilatación medica-
mentosa.
La Sociedad Española de Inmunología Clínica y Alergología Pediátrica recomienda dos dosis

inhaladas de salbutamol (0,2 mg); en algunas ocasiones es posible que la técnica resulte
negativa, en ciertas dosis, debiendo recurrir a 0,4 mg.
El salbutamol es una sustancia agonista de ß2 adrenegénico utilizado en asma y otras Esprirómetro.

patologías pulmonares en caso de broncoespasmo, que actúa dilatando la vía respiratoria.
2.2.3. Pruebas de provocación

Las pruebas de provocación tienen el propósito de reproducir la sintomatología clínica
relatada por el paciente después de la exposición al alérgeno, si mediante otras pruebas
diagnósticas no se puede demostrar.
En función del alérgeno que se pretenda estudiar, se llevan a cabo diferentes pruebas de
provocación, que vemos a continuación.
Pruebas de provocación bronquial

Estas técnicas revelan una sensibilidad anormal de la vía aérea y muestran un aumento de
la obstrucción al flujo aéreo debido a la exposición a diferentes estímulos (hiperreactividad
bronquial).
Algunas variedades de las pruebas de provocación bronquial son las siguientes:

habitualmente se aplica a niños para el diagnóstico del asma,
inducido por ejercicio. La técnica consiste en una espirometría basal, de una duración
entre 6 y 8 minutos de ejercicios, y se repite la espirometría a los 5, 10, 25, 20 y 30 minutos
tras los ejercicios.
en este caso, durante la realización de la
prueba estarán presentes una enfermera y/o un médico, y se solicitará al paciente
116
(o padre o tutor si el paciente es pediátrico) un consentimiento con la información

correspondiente.
En esta técnica, se realiza una espirometría basal y, tras administrar metacolina o
histamina por vía aerosólica en concentraciones crecientes, se hace una espirometría
a medida que aumentamos la concentración de la sustancia. La metacolina es una
sustancia química broncoconstrictora.
aquí se induce un broncoespasmo (estrechamiento

del espacio bronquial por contracción de la musculatura de los bronquios, produciendo
mismo procedimiento que la anterior, pero implica un riesgo mayor ya que se expone el
paciente directamente con el alérgeno que le produce la hipersensibilidad.
De igual modo que las pruebas anteriores, se inicia una espirometría basal repitiéndose
tras la inhalación por parte del paciente; el alérgeno está en concentraciones crecientes y
se evalúa la respuesta después de cada aumento.
Prueba de provocación conjuntival
El primer paso para realizar esta prueba es colocar en el fondo del saco conjuntival del ojo
(espacio entre el párpado y el globo ocular) el diluyente que se usará con el alérgeno. Si 15
minutos tras la aplicación la sintomatología es negativa, se deberá empezar con la dilución más
alta del alérgeno en estudio colocándolo en el mismo lugar que el diluyente.
El test se considera positivo si hay presencia de los siguientes síntomas: inyección conjuntival,
epífora (presencia de lagrimeo continuo), prurito ocular y/o fotofobia (intolerancia a la luz).
Es imprescindible asegurar previamente que el paciente no haya tomado medicamentos o
no se encuentre bajo ningún tratamiento farmacológico que pueda alterar los resultados o
interferir en el proceso.
Prueba de provocación nasal
Esta técnica consiste en realizar nebulizaciones al paciente con el alérgeno que se desee
estudiar. Las nebulizaciones son un método para administrar vapor y/o medicación por
vía respiratoria. Se trata, básicamente, de broncodilatadores. Las nebulizaciones por vapor
generan alivio en algunos casos de tos seca y despegan la mucosidad.
El nebulizador es un aparato pequeño, normalmente electrónico, que se usa con una mascarilla
de nebulizar y transforma un líquido en vapor para hacerlo llegar hasta los bronquios a través
de las vías respiratorias.
Para el caso que nos ocupa, se incluye el alérgeno en el nebulizador para ser inhalado, como
puede ser el polen, ácaros, hongos o epitelios. Los ácaros, en concreto, son una subclase de
arácnidos diminutos, terrestres o acuáticos, que pueden ser causantes de alergias. Los epitelios
(tejidos de una o varias capas de célula que recubren toda la superficie) que suelen generar
alergias son el epitelio de perro, gato o caballo.
La prueba se considera positiva si hay sintomatología de estornudos, rinorrea (flujo abundante

de líquido secretado por la nariz), prurito nasal o aumento de la resistencia de la vía aérea nasal.
117
Pruebas de provocación oral
En esta prueba también es necesaria la presencia de un médico, puesto que se administrarán

al paciente los alimentos o medicamentos sospechados de ser los causantes de la reacción
alérgica.

Esto supone cierto riesgo para el paciente, y si existiese algún tipo de contraindicación como
enfermedades cardiacas o neurológicas, esta prueba no debe realizarse.
Tras la administración de estos alimentos o medicamentos, la sintomatología se puede

manifestar de forma inmediata (cuando está mediada por IgE) o de forma tardía (en 24-48
horas), como el caso de la dermatitis atópica, y por este motivo se mantendrá el paciente
ingresado y controlado hasta la finalización completa de la prueba.
3. Técnicas in vitro
Las técnicas in vitro se llevan a cabo para confirmar el diagnóstico clínico obtenido en otras
pruebas o para situaciones en que los pacientes no pueden someterse a las técnicas in vivo por
algún motivo concreto.
En estas pruebas debe haber una sensibilidad alta para poder detectar la alergia en el suero
de un individuo que esté en contacto con un alérgeno específico. Si la reacción alérgica no se
manifiesta, el resultado será negativo. No obstante, antes de empezar cualquier test, se debe
solicitar el consentimiento informado del paciente.
Dentro de las técnicas in vitro podemos identificar dos grupos de subtécnicas encargadas de
diagnosticar o confirmar distintas enfermedades:
IgE sérica total, IgE antígeno-
que son liberados en una reacción antígeno
Muestras de
sangre para su
118
3.1. Determinación de IgE

sérica total
La proteína IgE está involucrada en las reacciones de hipersensibilidad tipo I. Se trata de la
inmunoglobulina que se encuentra sobre la superficie de mastocitos, eosinófilos y basófilos
que, tras el reconocimiento de un antígeno, ocasiona las desgranulaciones de las células
anteriores con liberación de histamina y otras sustancias químicas.
Su cuantificación se hace mediante un test de rutina en los laboratorios de alergia. En su
valoración se debe tener en cuenta que el género y la edad del paciente pueden influir en el
proceso alérgico, como se muestra a continuación:
Valor IgE según edad
Edad IgE (kU/l)
6 semanas 0,7
6 meses 2,7
9 meses 2,4
1 año 7
2 años 11
3 años 11
4 años 20
7 años 26
10 años 39
14 años 32
119
Los resultados se expresan en kilounidades internacionales por litro (kU/l). También se pueden
expresar convertidos a unidades de masa, teniendo en cuenta que 1 U equivale a 2,4 ng de
proteína.
Concretamente, la IgE es una proteína monomérica que circula en la sangre en una

concentración muy baja, y para estudiar otras inmunoglobulinas se usan métodos distintos,

como los inmunoensayos enzimáticos y los radioinmunoensayos. Estos tienen una alta
sensibilidad y son capaces de cuantificar cantidades pequeñas de esta proteína.
3.1.1. Inmunoensayos enzimáticos (EIA)

En los inmunoensayos enzimáticos (EIA) se utiliza como marcador la actividad enzimática de
una enzima unida de forma covalente al anticuerpo o antígeno.
Según el sustrato empleado, se diferencian varios equipos de detección:

detectan un incremento de color en la reacción enzimática.
valoran la aparición de la luminiscencia.
El EIA parte de un anticuerpo anti IgE pegado a la fase sólida y que reconoce la IgE presente en
el suero. Finalmente, un segundo anticuerpo se incorpora, y este reconoce otros epítopos de la
IgE con enzima unida de forma covalente, responsable de la actividad enzimática.
La interacción del antígeno con las moléculas de IgE en la membrana celular provoca que las células liberen
mediadores como la histamina.
Las enfermedades detectadas con la IgE alta son: infecciones parasitarias, enfermedades
atópicas, cirrosis hepática, mononucleosis, etc.
Como se ha comentado, en la determinación de IgE sérica total influyen los factores del género
y la edad de los pacientes y su estudio está indicado en la evaluación de la aspergilosis y el
estudio de inmunodeficiencias (como síndrome Hiper IgE).
3.2. Determinación de IgE
La IgE antígeno-específica se determina a partir del mismo método que la IgE sérica total. Sin
embargo, la proteína alergénica sujeta a estudio se encuentra en la fase sólida. Esto permite no
solo detectar la presencia de IgE específica, sino también cuantificarla.
120
A diferencia de la técnica anterior, lo que está pegado a la fase sólida es el antígeno específico
que reconoce la IgE presente en el suero. En función de la actividad enzimática que tiene el
anticuerpo anti IgE, se usan diferentes métodos de detección:
son ensayos competitivos con alta
sensibilidad y utilizan equipos denominados contadores de radiación beta y gamma.
tritio, carbono 14.
yodo 125, yodo 135.

en este tipo de inmunoensayo, la molécula que se une de forma
directamente proporcional al antígeno marcado:
a) Absorben la luz de baja longitud de onda (200 a 400 nm).
b) Emisión de longitud de onda mayor (400 a 700 nm).

se caracterizan por estar marcados por una enzima y tener un
coste económico bajo, así como alto nivel de pureza y muy baja interferencia.
En efecto, estas pruebas permiten detectar la sensibilización a un alérgeno específico y confir-

mar la sospecha diagnóstica y test cutáneos. Los resultados obtenidos se deben cuantificar y
contrastar conjuntamente con otras pruebas para interpretarlos adecuadamente, ya que, si
solo de cuantifica la específica, podríamos obtener resultados falsos positivos y/o negativos.
Asimismo, se consideran positivos los valores superiores a 3,5 kU/l.
Proceso alérgico en IgE.
3.3. Test de activación de
El test de activación de basófilos (TAB) por citometría es una técnica que tiene una
sensibilidad muy elevada y es específica por el uso de la citometría de flujo. Recientemente,
su aplicación clínica se ha focalizado en el estudio de alergias a medicamentos, alimentos y
procesos alérgicos con IgE específica.
121
El objetivo de la técnica es detectar sensibilización, y se basa en la medición del porcentaje de
basófilos que se activan en contacto con el alérgeno.
La citometría de flujo es una herramienta útil para el análisis de diferentes tipos de células.
Los granulocitos basófilos son los leucocitos circulantes menos comunes en la sangre y solo

representan del 0,5 al 1 % de la población total de glóbulos blancos.
Los basófilos de sangre periférica y los mastocitos de tejidos son las células primarias
desencadenantes de las reacciones inmediatas mediadas por IgE (rinitis, asma y anafilaxia),
aunque también se relacionan con otro tipo de reacciones alérgicas o pseudoalérgicas, en
las que están involucrados mecanismos de activación como la activación por complemento,
reacciones no mediadas por IgE o mecanismos no inmunológicos.
Para realizar el test de activación de basófilos es conveniente tener presente que las células
de activación se estimulan con un antígeno específico que actúa de alérgeno; estas células,
pues, son capaces de liberar el contenido de sus gránulos tras un proceso de activación en
función del estímulo antigénico.
El alérgeno en cuestión es divalente, provoca un puenteo de los receptores de IgE y, con ello,
una desgranulación.
Esto contribuye a la fusión intracitoplásmica de los gránulos, así como la fusión de la

membrana de estos con la membrana plasmática, lo que permite a las moléculas presentes en
la membrana de los gránulos (molécula CD63) expresarse en la membrana del basófilo, cuando
este se encuentre activado.
Las siglas CD (del inglés Cluster of Differentiation) hacen referencia a grupos de diferenciación,
que son moléculas de la membrana, del citoplasma o del núcleo celular que actúan como
antígeno; por tanto, pueden ser identificadas mediante anticuerpos monoclonales.
El agente reactivo determina cuantitativamente la desgranulación de basófilos en sangre

122
periférica heparinizada. El estudio determina el porcentaje de granulocitos basófilos que se

han desgranulado después de la incubación con el alérgeno. Estos resultados se comparan
con una estimulación inespecífica mediante el péptido quimiotáctico N-formyl-Met-Leu-Phe-
(fMLP) y con la estimulación basal del paciente.
Para realizar este procedimiento, la mayoría de los laboratorios disponen de un kit comercial
con dos controles:
El reactivo que contiene el péptido se utiliza como control positivo.

La solución limpiadora o tampón de lavado se utiliza como control negativo.
Si hay alérgenos en el medio, se unirán a la IgE presente en la superficie celular y se induce la

activación de los basófilos, fusión de los gránulos citoplasmáticos con la membrana plasmática
y nuevos marcadores de superficie como el CD63 comentado anteriormente.
El nuevo marcador, aquí, es reconocido por un anticuerpo monoclonal marcado con

fluorescencia, que utilizaremos para valorar la positividad mediante citometría de flujo.
El test de activación de basófilos (TAB) y el test de liberación de histamina (TLH) son las técnicas
in vitro más sensibles en cuanto a estimulación, siendo el TAB más sensible y específico.
Excepto en el caso de que existan contraindicaciones clínicas, el TAB está indicado para aquellos
individuos en que las pruebas cutáneas no pueden realizarse por alguna razón específica y
manifiestan los siguientes efectos alérgicos:
Alergia a inhalantes: polen, caspa de animales, ácaros del polvo o mohos, etc.
Alergia a venenos himenópteros (grupo de insectos que incluye hormigas, abejorros,
abejas y avispas).
Alergias alimentarias.
Alergia al látex.
Alergia o intolerancia a determinados medicamentos.
Por último, es importante recalcar que el TAB ofrece ventajas sobre las otras técnicas:
Reproduce in vitro los mecanismos de hipersensibilidad celular involucrados en una
reacción alérgica inmediata.
Permite detectar reacciones alérgicas y pseudoalérgicas, especialmente para
medicamentos que no son detectables mediante técnicas serológicas, tales como la
Los resultados son rápidos (se obtienen en unas pocas horas).

Se pueden testar simultáneamente varios alérgenos con una cantidad pequeña de sangre.
123
En muchos casos, evita la realización de la prueba de exposición al alérgeno.
3.4. Test de liberación

de histamina por
La unión del alérgeno de las IgE fijadas sobre los mastocitos y basófilos provoca la
desgranulación de éstos, y la liberación de los mediadores causantes de la reacción de
hipersensibilidad tipo I, entre los que destaca especialmente la histamina.
Recordemos que la histamina es una molécula que se fabrica dentro de las células del
organismo, como pueden ser las neuronas, las plaquetas, los mastocitos, los basófilos, las
células gástricas y las enterocromafines de la mucosa gastrointestinal.
Con el test de liberación de histamina (TLH) por fluorometría se evalúa la respuesta in vitro y
se observa la reactividad ante varios alérgenos. Es decir, mide la cantidad de histamina liberada
in vitro en presencia de un antígeno determinado.
Dicha determinación de histamina se hace mediante fluorometría o por ELISA, técnica

descrita en las unidades anteriores. La diferencia con la determinación de IgE específica es que
no solo mide la presencia de anticuerpos, sino que determina si el alérgeno es capaz de activar
al basófilo y producir la liberación de histamina.
Si bien se trata de un test funcional, y actualmente está siendo sustituido por el test de activa-
ción de basófilos por citometría que hemos visto en el punto anterior.
3.5. Otras técnicas

Además de TAB y TLH anteriores, que son las más importantes, también hay otras técnicas:
Es liberada cuando estas células se activan a partir de un daño tisular y producen

. Se utiliza para evaluar la respuesta al
tratamiento en paciente asmáticos, puesto que su diminución tiene que ver con la
reducción de las crisis y la mejoría de la función pulmonar.
la triptasa es una proteína que se encuentra en los
mastocitos, se detecta a partir de las 3 horas tras la reacción y se determina en reacciones
medicamentos o picaduras de insectos).

124
los leucotrienos son ácidos grasos derivados del

ácido araquidónico, el cual forma parte de los fosfolípidos de las membranas de varias
alérgicas mediadas.
4. Evaluación de la
hipersensibilidad
retardada
Las pruebas de hipersensibilidad retardada son desencadenadas por la hipersensibilidad de
tipo IV o hipersensibilidad celular.
Como ya hemos descrito anteriormente, se caracterizan por una manifestación sintomática

retardada, entre 24 y 48 horas después de que el individuo haya entrado en contacto con el
agente provocador de la sensibilización.
Hay una gran variedad de reacciones que pueden producirse sobre la piel del paciente. A
continuación, mostramos la valoración de cada tipo de reacción:
Grado Reacción
± Eritema mínimo
+ Eritema bien definido
125
+ + Eritema y pápulas
+ + + Eritema, pápulas y vesículas
+ + + + Eritema, pápulas, vesículas, ampolla y/o necrosis
El eritema hace referencia al enrojecimiento de la piel debido a un proceso inflamatorio que

genera exceso de riego sanguíneo. La necrosis es la muerte de un conjunto de células o de
tejido producida por un agente nocivo. Y la vesícula es una colección líquida de menos de 5
mm, sobre la piel.
Este tipo hipersensibilidad retardada también se presenta en algunas reacciones adversas a

medicamentos y en el rechazo a trasplantes. Entre las manifestaciones destacan:
la reacción se induce por un compuesto químico reactivo
(hapteno) que, tras acoplarse a proteínas epidérmicas, actúa como un inmunógeno
efectivo.
los granulomas son lesiones resultantes de agregados
de fagocitos mononucleares activados (principalmente macrófagos), muchos de los
cuales han fagocitado al agente responsable.
Para determinar y estudiar este tipo de reacciones se pueden realizar dos tipos de pruebas: las
epicutáneas y las intradermorreacciones.
4.1. Pruebas epicutáneas

Las pruebas epicutáneas aplican el extracto alergénico sobre la piel para determinar el
agente causante de las dermatitis por contacto.
Normalmente, los alérgenos responsables de este tipo de hipersensibilidad son metales

(níquel, cromo, cobalto), perfumes y otros cosméticos. Los alérgenos de contacto inducen
reacciones de hipersensibilidad retardada mediada por los linfocitos.
Cuando el paciente vuelve a tener contacto con esas sustancias, se liberan los mediadores
proinflamatorios causantes de los síntomas característicos de la dermatitis por contacto.
Se realizan también en el antebrazo o región paravertebral, en la piel sobre una zona sensible
sin lesiones y limpia.
Se aplica la sustancia con un algodón que se cubre con esparadrapo, manteniéndolo durante
48-72 horas, para evitar la exposición solar porque puede interferir en el resultado. Después de
este periodo de tiempo, se retira el esparadrapo o parche y se hace una primera lectura de los
resultados pasados 15-20 minutos tras la retirada. Se hará una segunda lectura entre 24-48
horas posteriores, por la posibilidad de alguna reacción tras una primera lectura negativa.
Recordemos que un falso negativo puede ser ocasionado por un fallo en la técnica, como una
mala oclusión del esparadrapo o parche, dilución errónea del alérgeno o porque el paciente se
encuentre bajo tratamiento cortidoideo.
126
4.1.1. Test del parche o Patch test
El procedimiento para el test del parche o Patch test es similar al Prick test. Se basa en exponer
al paciente a diversos antígenos para detectar si se produce o no una respuesta cutánea.
Aun así, existen dos diferencias importantes. En el caso del test del parche:
No se realiza punción, sino que se pone en contacto el alérgeno con la piel, mediante la
aplicación de un parche impregnado con el extracto alergénico.
La lectura es retardada; se realiza transcurridas 48-72 horas tras la aplicación.
Esta prueba es usada en el diagnóstico del eczema de contacto.
4.2. Intradermorreacciones
El objetivo de las intradermorreacciones es determinar si un individuo ha estado en contacto
con un determinado agente infeccioso, y se usan para hacer el seguimiento de algunas
inmunodeficiencias.
Estas pruebas consisten en evaluar la hipersensibilidad retardada y para ello se aplica el

alérgeno por vía intradérmica.
127
Para hacer el diagnóstico de una enfermedad infecciosa, lo que se inyecta por vía intradér-
mica es una pequeña cantidad de un extracto del microorganismo. Tras las 48-72 horas, se
observa si se ha producido una reacción local de induración en la piel (la piel se vuelve dura).
4.2.1. Prueba de la tuberculina

Una de las pruebas de intradermorreacción más frecuentes es la prueba de la tuberculina,
también denominada reacción de Mantoux.
En este caso, se utiliza un extracto proteico de cultivos de Mycobacterium tuberculosis, llamado

tuberculina o PPD (purified protein derivative), que se inyecta al paciente por vía intradérmica,
con la cantidad de 100 ml.
Transcurridas 72 horas, se examina el punto de la inyección para determinar si hay induración:

si la hay, se mide su diámetro. La prueba se considera positiva si hay induración y su diámetro
es mayor de 10 mm.
Hay que tener presente que un resultado positivo a la prueba de tuberculina no implica el
diagnóstico de tuberculosis activa, sino que indica una exposición previa al antígeno.
5
técnicas de
poblaciones
celulares por
Aplicación de

1. Técnicas de separación celular ................................................................ 131
................................................. 136
....................................................... 144
4. Otras técnicas de separación celular ....................................................... 150

130
Objetivos
Estudiar la preparación de suspensiones celulares.
Estudiar el fenotipaje de leucemias, linfomas y otras poblaciones celulares.
Estudiar las técnicas de inmunotoxicidad.

1. Técnicas de separación
celular
La citometría de flujo tiene una gran utilidad no solo como técnica de separación celular, sino
también como herramienta de identificación de poblaciones celulares para conocer su estado
de activación y funcionalidad. Esto se consigue mediante la determinación de la expresión de
diferentes marcadores de superficie, así como de moléculas intracelulares.
La citometría de flujo (CMF) es una técnica de análisis de poblaciones celulares en suspensión.

Su mayor aplicación es la caracterización de las distintas subpoblaciones de linfocitos.
En esta técnica se trata de forzar una suspensión de células incluidas en un flujo líquido
isotónico. Estas células pasan, alineadas y de una en una, por delante de uno o varios detectores
capaces de recoger y medir sus propiedades físicas y/o químicas, a la vez que se las ilumina con
un haz de luz láser.
En esta unidad estudiaremos cómo se deben tratar las muestras sujetas a estudio en las
citometrías de flujo, desde que llegan al laboratorio para obtener una suspensión celular
adecuada, hasta que se analizan los compuestos utilizados para el marcaje.
Los fluorocromos son un tipo de molécula química. Cada vez están más presentes en el
mercado y esto ha permitido una evolución rápida y progresiva de los análisis que se llevan
131
a cabo mediante esta técnica, tanto en la investigación como en el ámbito de laboratorios de
diagnóstico clínico.
Es imprescindible que, en la CMF, las muestras se encuentren en forma de una suspensión

celular que permitan analizar no solo las características celulares sino también relacionar o
extrapolar sus resultados a fenómenos in vivo.

1.1. Muestras analizadas por
En la práctica clínica se pueden analizar por CMF las siguientes muestras biológicas:
Sangre periférica.
tipo de tejido que se localiza en el interior de los huesos largos, vértebras,
costillas, esternón, huesos del cráneo, cintura escapular y pelvis.
un exudado es el conjunto de elementos extravasados por el
organismo. Provoca el edema, que se diferencia del trasudado por la mayor riqueza de
proteínas y células. Ambos pueden ser de procedencia ascítica (de la cavidad abdominal),
pleural (de la cavidad en la que en encuentran los pulmones) o pericárdica (procedentes
líquido incoloro que baña el encéfalo y la médula

espinal.
los
ganglios son agregados que forman un órgano pequeño con una morfología ovoide
o esférica. El MALT hace referencia a un tipo de agrupación de células linfoides sin
organización o estructura, que se asocia a la mucosa.
es una técnica
diagnóstica, ocasionalmente terapéutica, que consiste primero en una punción y después
para su análisis posterior.

un cultivo celular es el proceso mediante el
cual se generan células, ya sean procariotas o eucariotas, en un entorno controlado.
la aféresis es la técnica que separa los componentes de la sangre.
Solo son seleccionados aquellos componentes para su aplicación en medicina.
consiste en
broncoscopio enclavado en un subsegmento pulmonar.
Existen varios medios de transporte, así como anticoagulantes, en función de la naturaleza de

la muestra con la que se va a trabajar.
Las muestras que proceden de médula ósea, sangre periférica y los exudados de tipo pericár-
dico, pleural o ascítico es obligatorio recolectarlas en recipientes que contengan K3 EDTA,
132
que es una solución de sales de sodio y potasio del ácido etilendiaminotetraacético.
Las sales de sodio y potasio en este ácido actúan como anticoagulantes de la sangre. Es muy
habitual usar el K3 EDTA como coagulante para el trabajo de rutina y hematología porque
no afecta a la morfología de las células hemáticas y no altera la velocidad de sedimentación
globular.
Sin embargo, es aconsejable usar contenedores con heparina si posteriormente se desea hacer
una separación de las células mononucleares mediante granadientes de densidad (que
veremos en la unidad siguiente) o se quieren estimular las células de dicha muestra.
Las muestras sólidas procedentes de biopsias deben recolectarse en recipientes con un lí-
quido isotónico como BPS (Phosphate buffered saline o tampón fosfato salino), o suero salino.
Es importante no hacerlo en formol.
A causa de la baja presencia de leucocitos, tanto las PAAF como los BAL deben llegar al
laboratorio también en BPS o suero salino para evitar diluir demasiado la muestra. Los BAL
pueden llegar también en tubos de EDTA.
En las muestras con poca celularidad es recomendable una centrifugación previa de la

muestra a 3.000 rpm (revoluciones por minuto) durante 30 minutos.
Cuando se trabaja con un citómetro, la disponibilidad de una suspensión celular es un factor

limitante.
El citómetro es un aparato que mide varios valores celulares a partir de una suspensión celular
por medio de la interacción de las células con un haz de luz láser.
Así, se deben cumplir estos requisitos:
Que la muestra sea representativa del tejido y preserve las características celulares.
Que las suspensiones celulares sean de alta calidad y con pocos agregados.
En el caso de las muestras de médula ósea, pueden contener grasa y grumo medular. Para
eliminar la grasa, será necesario hacer dos lavados con PBS antes de iniciar cualquier técnica
de marcaje. Para eliminar el grumo medular, se puede pasar la muestra varias veces a través
de agujas de diámetro pequeño con la finalidad que suelte todas sus células.
Es importante realizar estos pasos ya que, de lo contrario, cabe la posibilidad de que se genere
la debris, que puede interferir en la lectura de los resultados y alterarlos. Por otra parte, el
grumo puede ocasionar obstrucciones en los contadores hematológicos.
1.2. Preparación de
suspensiones celulares
En las muestras sólidas (por ejemplo, tumores sólidos o muestras parafinadas) se debe
conseguir una disgregación relativamente intensa.
133
Existen tres métodos de separación y enriquecimiento celular basados en las características
físicas, químicas y funcionales de las células. Son los siguientes:
si bien las suspensiones celulares se obtienen gracias al uso de
enzimas como la tripsina, proteasas, colagenasas, hialuronidasas, DNAasa o una mezcla
de todas, este método tiene dos limitaciones:

antígenos presentes en las membranas de las células que se están estudiando.
b) La efectividad del método varía según el tipo de tejido sujeto a estudio.
Así pues, antes de aplicar este método se asegurará que los antígenos celulares sujetos a
estudio no sean alterados para un correcto estudio con todas las garantías procedimen-
tales.
con este método se obtienen los núcleos para el análisis de ADN
mediante detergentes como el Triton X-100 o Nonidet P-40, compuestos no iónicos que se
usan para la solubilización de las membranas celulares.
con este método se obtienen las suspensiones celulares mediante la
trituración de los tejidos.
En este tipo de estudios se requiere analizar, primeramente, las moléculas con capacidad
fluorescente y, en segundo lugar, la utilización de anticuerpos monoclonales conjugados con
fluorocromos como elementos indispensables en el desarrollo de las aplicaciones de la CMF.
1.3. Fluorocromos
La utilización de fluorocromos (es decir, compuestos fluorescentes) es imprescindible en
la técnica de la CMF. Se trata de moléculas químicas que absorben la luz a una determinada
longitud de onda y emiten a una onda superior de menor energía.
Se caracterizan por sus espectros de excitación o absorción, que es el rango sobre el que
un fluorocromo emite luz. Por tanto, su uso está condicionado por el tipo de láser del que
disponga el citómetro y también por la longitud de onda a la que se exciten ellos mismos.
Los fluorocromos más usados son la fluoresceína con excitación máxima a 495 nm y emisión
máxima a 520 nm, lo que permite utilizarlos simultáneamente con un láser de 488 nm.
La unidad Nm es el “newton metro”, también llamado nanómetro. Con esta unidad se mide la
longitud de onda de la radiación ultravioleta, de la radiación infrarroja y de la luz.
Color de emisión Excitación máxima Línea de excitación Emisión máxima

Fluorocromo
de fluorescencia (nm) del láser (nm) (nm)
Alexa Fluor© 405 Azul 401 360, 405, 407 421
Pacific Blue© Azul 405 360, 405, 407 455
AmCyan Verde 457 405, 407 491

134
Alexa Fluor© 488 Verde 495 488 519
FITC Verde 494 488 519
PE Amarillo 496, 564 488, 532 578
PE-Texas Red© Naranja 496, 564 488, 532 515

Texas Red© Naranja 595 595 615
APC Rojo 650 595, 633, 635, 647 660
Alexa Fluor© 647 Rojo 650 595, 633, 635, 647 668
PE-Cy5 Rojo 496, 564 488, 532 667
PerCP Rojo 482 488, 532 678
PerCp-Cy5.5 Rojo Lejano 482 488, 532 695
Alexa Fluor© 700 Rojo Lejano 696 633, 635 719
PE-Cy7 Infrarrojo 496, 564 488, 532 785
APC-Cy7 Infrarrojo 650 595, 633, 635, 647 785

Las propiedades de un fluorocromo son:
Elevada fotosensibilidad.
Corto estado de excitación.
absorber la luz).
Alto rendimiento cuántico (capacidad de emitir luz).
El espectro de excitación y emisión varía según los fluorocromos. Los que se utilicen deben
poder ser editadas por la longitud de onda del láser y, también, deben emitir en longitudes
lo más lejanas posibles entre ellas para que se puedan separar, con filtros selectivos, los dos
colores de la luz que provienen de la célula: la luz dispensada a 90º y la señal de la fluorescencia.
Cuando se usan varios fluorocromos simultáneamente, sus espectros de emisión deben tener
un solapamiento mínimo, de modo que cada uno de ellos pueda cuantificarse por separado.
1.4. Anticuerpos monoclonales

Un anticuerpo monoclonal es el principal reactivo utilizado en CMF cuando se encuentra
conjugado con fluorocromos.
135
Se trata de anticuerpos específicos para un solo antígeno. En CMF se utilizan para identificar
poblaciones celulares concretas, gracias a combinaciones de anticuerpos monoclonales
para antígenos presentes en células de la muestra estudiada.
Los anticuerpos monoclonales usados en CMF permiten

diferenciar poblaciones y subpoblaciones celulares con distinta
actividad funcional, en distintas etapas de maduración o estados

de activación o adhesión.
Recordemos que los anticuerpos son inmunoglobulinas (pro-

teínas) producidas por las células plasmáticas (linfocitos B
activados y totalmente diferenciados), capaces de combinarse
específicamente con el antígeno que causó su producción.
2. Funcionamiento de un
Con la citometría de flujo se obtiene información valiosa acerca de poblaciones celulares a

partir del estudio individualizado de un gran número de células, normalmente entre 50.000 y
100.000, lo que supone una muestra suficientemente representativa del tamaño poblacional.
El funcionamiento consiste en que la suspensión celular en solución isotónica se hace pasar a

través de un pequeño orificio, de modo que las células salen formando parte de una corriente
continua o flujo cilíndrico. Sobre esta corriente se hace incidir un haz de luz láser, y después
se describirán cada uno de los componentes por los que pasa una muestra en su paso por el
citómetro.
Si las células han sido incubadas con anticuerpos específicos de los diferentes marcadores
de membrana conjugados con fluorocromos, la luz láser excita los fluorocromos fijados a las
células y los tubos fotomultiplicadores detectan las señales lumínicas emitidas.
Los citómetros de flujo modernos utilizan distintos canales para la cuantificación de las
señales fluorescentes, por lo que permiten el análisis simultáneo de hasta cinco, seis o más
marcadores celulares.
Las desventajas y limitaciones de la citometría son los elevados costes de instrumentación y

136
la imposibilidad de visualizar las células analizadas.
2.1. Estructura de un citómetro

Los citómetros de flujo están formados por los componentes que detallamos a continuación.
2.1.1. Sistema de inyección de la muestra

Permite que las células se transporten a una corriente de flujo hidrodinámico. Hay dos tipos de
sistemas:
consiste en que un regulador de presión mantie-
ne una presión superior en el contenedor de la muestra respecto al contenedor de
-
del líquido envolvente y el de la muestra.

aquí, la muestra se carga en una jeringa que se conecta al in-
yector a través de una válvula. Un motor eléctrico permite que el pistón de la jeringa
se mueva a velocidad variable o constante. Este motor, además, permite el ajuste del
Es el espacio donde el líquido que contiene la suspensión celular entra en contacto con
el líquido envolvente, empujados por un sistema regulable de presiones. Las células se
introducen en el fluido envolvente gracias a un sistema de presiones, que resulta impulsado a
gran velocidad a salir por un orificio estrecho.
En esta cámara también se produce un flujo laminar de células que serán interceptadas
posteriormente por el rayo luminoso. Durante su recorrido, las células deben permanecer
en el centro del flujo líquido isotónico y, de una en una, deben atravesar el rayo luminoso
perpendicularmente y alineadas entre ellas.
La corriente de flujo con las células en suspensión abandona la cámara a través de una abertura
cuyo diámetro determina el diámetro de la corriente fluida resultante; esto permite conseguir
un flujo secuencial de células. Mediante un corte transversal, el flujo está constituido por:
a) Una porción interna con el líquido de la suspensión celular.
b) Una porción externa con el líquido envolvente.
137
La diferencia de presión entre los dos compartimentos hace variar la proporción de cada uno
de ellos en el área de la sección del flujo, lo que hace cambiar la velocidad de paso de las
células.

2.1.3. Fuentes de luz

Hay dos tipos de fuentes de luz: lámparas de arco y rayos láser.
Las lámparas de arco más utilizadas son las de mercurio de alta presión de 100 W, aunque
también existen lámparas de xenón de alta presión.
Sin embargo, en la mayoría de los citómeros se usa como fuente luminosa los rayos láser.
Vemos a continuación su funcionamiento.
Rayos láser
Los rayos láser forman parte de la mayoría de los citómetros de flujo. Generalmente son de
argón enfriado por aire con una potencia de emisión de 15 mW, pero también pueden ser de
helio-neón o kriptón.
La predilección por este tipo de fuente de luz se debe a que:

La luz que se genera es monocromática.
El diámetro es relativamente más pequeño que el de las lámparas de arco.
el tubo láser contiene argón, un gas inerte, y al aplicarle una corriente, este
gas se ioniza, lo que produce una absorción de energía por los electrones valencia, impulsándo-
los a un nivel energético mayor. Cuando estos electrones vuelven a su estado basal, se ocasiona
138
un fotón proporcional al nivel del que cae y que, a su vez, estimula a los iones de alrededor para
que emitan energía, y todos ellos poseen una longitud de onda igual.
Además, existen unos espejos reflectores colocados a ambos extremos del tubo que refuerzan
la estimulación del eje del tubo. Un prisma colocado frente al espejo selecciona una única
longitud de onda. En el tubo láser de argón, el rayo láser se halla ajustado a una longitud de
onda de 488 nm. El espejo del extremo frontal permite el paso del 2 % de luz total. Esta luz
transmitida aparece como rayo láser.
Los láseres llevan una lente de enfoque que hacen que el punto de incidencia de la luz sobre las
células que cruzan por delante de él, incluidas en el flujo, sea los más pequeño posible.
2.1.4. Sistema óptico

La mayoría de los citómetros de flujo disponen de cinco sistemas ópticos de medida, que son:
dos de dispersión de luz (uno hacia delante y el otro en ángulo recto) y tres de fluorescencia.
La interacción de las células con el haz de luz puede producir dos tipos de señales:
-
dos en base a la dispersión lumínica:
-
dos. Corresponde al tamaño de la célula.
-
-
recoge a ángulos cercanos a los 90º junto con la luz dispersada lateralmente.
este emite energía radiante; la longitud de onda emitida es mayor debido a que parte
de la energía se usa pasa la absorción. Los fotones con diferente longitud de onda se
-
Un espejo dicroico es un filtro óptico que refleja luz con una determinada longitud de onda y
deja pasar otra.
2.1.5. Detectores
Los pulsos de luz que llegan a los detectores contienen fotones, en cantidades desde unas
centenas hasta varios millones. Actualmente se emplean tres tipos de detectores:
se trata de detectores en estado sólido y se usan para recoger señales lu-
mínicas de intensidad relativamente alta, como la luz dispersada frontalmente.
b) Fotomultiplicadores: como su nombre indica, multiplican la señal recibida. Tenien-

do en cuenta que las placas se colocan de forma secuencial, el resultado es la multi-
plicación de la señal luminosa.
139
recogen la luz con una longitud de onda concreta.

Cada detector genera una señal electrónica, que es proporcional a la cantidad de luz
dispersada. Estas señales se amplifican multiplicándose por un factor lineal o logarítmico. El
pulso incrementado se lleva a un convertidor analógico o digital que convierte la altura del
pico, proporcional a la fuerza de la señal, en una señal digital que puede manejarse con un
ordenador.
Para la mayoría de las aplicaciones, la dispersión frontal y la lateral se analizan de forma lineal,
mientras que la fluorescencia se analiza logarítmicamente.
Los citómetros de flujo permiten la detección de señales fluorescentes que proceden de

complejos antígeno-anticuerpo marcados con un fluorocromo y que están situados en una
célula. La cantidad de señal de fluorescencia emitida es igual a la cantidad de componentes
fluorescentes de la partícula.
Así, el tamaño de la señal electrónica producida por una célula es medida cuantitativamente
en relación a la cantidad de compuesto fluorescente sobre su superficie, y refleja el número de
receptores/marcadores.
2.2. Puesta a punto del
láser
La obtención de resultados correctos requiere que el citómetro de flujo funcione correcta-
mente y esté bien calibrado. Para ello, se llevan a cabo distintos procedimientos: calibración
del láser, control de calidad diario y verificación de la alineación de cada láser respecto a la
celda de flujo.
La calibración del láser se realiza mediante estándares o patrones con valores concretos de
fluorescencia o dispersión de la luz.
Los objetivos de la calibración son:

Maximizar la resolución de imagen.
diferentes poblaciones celulares, disminuyendo las interferencias y aumentando la

reproductibilidad de los resultados.
140
Después de realizar las calibraciones pertinentes y antes de analizar cualquier muestra, hay
que ajustar los valores de color y compensación de fluorescencias para evitar solapamientos
producidos por los espectros de los fluorocromos.
La compensación de fluorescencias es la eliminación de la señal correspondiente a un

fluorocromo que no debe medirse en ese detector.
Hay cuatro colores de fluorescencia que pueden ser analizado a partir de un solo láser de
plasma de argón refrigerado por aire de 488 nm. Los citómetros se encuentran equipados con
láseres de estado sólido enfocados directamente sobre la cámara de flujo, con tres juegos de
lentes que conforman el foco.
Existen configuraciones de dos y tres láseres. Se debe realizar la compensación necesaria de las
señales digitalmente, mediante una única matriz de compensación digital de 4x4 colores, que
pueden ir de 0-100 % en incrementos de 0,1 %.
Esquema de un citómetro donde podemos apreciar la fuente de luz.
2.3. Control de calidad

Puesto que la citometría de flujo (CMF) es una técnica con un enorme potencial, es imprescin-
dible optimizar la preparación de muestras evitando uniones no específicas de anticuerpos a
141
las células.
Se requiere valorar todos los anticuerpos con la finalidad de asegurar la cantidad apropiada
para cada paso del procedimiento. El exceso anticuerpo podría aumentar las uniones no
específicas, mientras que el déficit de anticuerpo evitaría que se detectara la presencia del
antígeno diana. A pesar de que los anticuerpos se pueden titular por separado, es posible que
la concentración óptima sea diferente cuando el anticuerpo se utiliza integrado en un panel.

También es necesario establecer las configuraciones de los instrumentos, como el láser y
los filtros, y conocer los espectros de excitación y emisión de los fluorocromos que se estén
utilizando.
Un procedimiento erróneo es aquel que se inicia sin disponer de toda esta información.
Es conveniente recordar que hay antígenos que se expresan bajo distintos niveles de intensidad,
con lo cual se tendrá que configurar el brillo de las diferentes opciones, unos más brillantes y
otros más atenuados. Sin embargo, la elección del fluorocromo influye en la compensación y
se debe contemplar la posibilidad de que fluorocromos brillantes causen problemas debido al
solapamiento de los espectros de emisión.
Además, otra problemática derivada de la utilización de muchos fluorocromos es la

superposición espectral y la invasión de fluorescencias entre los diversos canales. En este
sentido, es preferible separar lo más posible los fluorocromos de la emisión lumínica utilizando
la excitación múltiple que ofrecen los láseres, con la finalidad de minimizar el solapamiento
espectral (compensación). Los controles de compensación se pueden configurar con
microesferas fluorescentes.
2.4. Mantenimiento preventivo

del citómetro
El citómetro de flujo no se puede utilizar sin un entrenamiento previo. Es necesario que exista
un responsable del aparato. También se deben realizar las verificaciones y los controles
establecidos, en los plazos y mediante los métodos descritos en la documentación del
fabricante.
Por ello, se deben llevar a cabo una serie de acciones antes de empezar el uso, durante la
realización de las pruebas y tras la última determinación analítica.
Y, por supuesto, siempre prestando atención a las recomendaciones de uso, mantenimiento,

limpieza y control para asegurar un buen funcionamiento y alargar la vida útil del aparato.
El control de los láseres se hace desde un ordenador. Los obturadores mecánicos, encargados
de optimizar su utilización según la técnica empleada, también permiten su apagado completo
con un sistema de encendido y estabilización rápida. Con esto se evita el consumo innecesario
de horas útiles de trabajo. Además, se consigue una importante reducción de los gastos de
mantenimiento del equipo.
2.5. Análisis de datos

142
Los citómetros de flujo analizan las suspensiones celulares. Todos los parámetros que registra
el sistema son integrados mediante un ordenador que emplea programas específicos de
captura y análisis. Los datos pueden reflejarse de manera numérica y también gráfica.
Cabe señalar que todas las señales de luz que transmiten información sobre las características
de las células (dispersión, intensidad, fluorescencia, etc.) son convertidas en impulsos
eléctricos, es decir, son amplificadas y transformadas en códigos digitales para que puedan ser
procesadas y analizadas por un ordenador.
Se siguen tres etapas en el proceso de análisis de los resultados:

1.
2.
3.
En CMF, se denomina población celular a un conjunto homogéneo de puntos.
Cuando se analiza la reactividad de una célula para un determinado anticuerpo monoclonal

específico conjugado con un antígeno, la información que se obtiene es si hay o no presencia
del epítopo y cuál es su nivel de exposición (número de moléculas por célula).
Así, los programas informáticos ofrecen la posibilidad de visualizar directamente las poblacio-
nes celulares y obtener información numérica, valores y medidas como la dispersión, la
desviación, el coeficiente de variación y otros parámetros.
Dependiendo de las necesidades del operador, el procesador elaborará histogramas con
información relativa a uno o varios de estos parámetros. Un primer histograma con dos
parámetros se construye con la intensidad de la dispersión de la luz en sentido frontal (FSC) y
lateral (SSC).
Un histograma es un modo de representación de datos para un parámetro en el que se coloca

la frecuencia de eventos en ordenadas.
Dentro de cada histograma se puede configurar lo que se denomina una “ventana electrónica”
(gate) que aísle la población celular que se desee analizar. Los histogramas restantes detectarán
solamente los eventos contenidos en dicha “ventana”, correspondientes al parámetro
configurado. En particular, una ventana hace referencia a una región de adquisición o análisis
de datos de citometría definida en uno o más parámetros. Histograma diploide normal.
143
El histograma de fluorescencia verde (FL1) permite la cuantificación del porcentaje de

células a las que se unió un anticuerpo monoclonal conjugado con un fluorocromo que emite
luz verde.
El histograma de fluorescencia naranja (FL2) permite la cuantificación de las células a las

que se unieron un anticuerpo monoclonal conjugado con un fluorocromo que emite luz de ese
color.
Y el histograma de doble fluorescencia permite conocer la proporción de células a las que se

unieron de forma simultánea ambos anticuerpos monoclonales.
Este tipo de análisis bidimensional es fundamental para la cuantificación de ciertas

poblaciones celulares que solo son definibles por la expresión de más de un antígeno en su
membrana plasmática.
3. Aplicaciones de la
La citometría de flujo (CMF) ofrece numerosas aplicaciones dentro del sector clínico. En este
apartado se realizará una visión general de las más relevantes. Además, el protocolo puede
variar en cada laboratorio.
Una de las aplicaciones más conocidas de la CMF es el estudio de inmunofenotipos, a partir

del cual se obtienen dos tipos de información para cada célula y para cada marcador: presencia
o ausencia del marcador, y cantidad de fluorescencia obtenida (este último representa el
número de moléculas de antígeno que están presentes).
Un inmunofenotipo es el conjunto de estructuras propias de la célula con funciones

distintas y que actúan como antígeno. Se encuentran en la membrana celular o pueden ser
intracitoplásmicas o nucleares.
A continuación, los apartados siguientes versarán sobre las estrategias de inmunofenotipaje

que se utilizan actualmente en función de la estructura que reconozca el fluorocromo unido o
conjugado con un anticuerpo.
144
3.1. Determinación de
poblaciones celulares en
sangre periférica
El inmunofenotipo de moléculas de superficie sirve para determinar la presencia y la

cuantificación de proteínas (antígenos) o de sus regiones (epítopos), localizadas en la
superficie de las células de distintas muestras biológicas; se usan combinaciones de anticuerpos
fluorescentes.
Así, el marcaje de antígenos de la membrana plasmática se efectúa con anticuerpos

monoclonales o bien policlonales conjugados con fluorocromos.
Una de las aplicaciones más importantes de la CMF en la práctica clínica es la caracterización

de las poblaciones de estirpe hematopoyética, ya sean sanas o tumorales. Esta técnica dispone
de sensibilidad, precisión y reproductibilidad muy elevadas, lo que permite una mejora
significativa en la detección de poblaciones normales y leucémicas.
Las combinaciones de anticuerpos monoclonales y técnicas de análisis permiten identificar

subpoblaciones específicas de células y determinar lo siguiente:
Linaje celular.
Grado de maduración y grado de activación.
Clonalidad de cadenas ligeras de inmunoglobulinas y del receptor TCR.
Expresión de proteínas de fusión en translocaciones cromosómicas.
3.2. Fenotipaje de leucemias y

linfomas
El diagnóstico de laboratorio en pacientes con una malignidad hematológica tiene tres
aplicaciones principales: establecer el diagnóstico, hacer una clasificación pronóstica, y evaluar
la efectividad del tratamiento. Toda esta información la proporciona el inmunofenotipaje.
Entre las aplicaciones del inmunofenotipo de superficie en hematología podemos encontrar:

Diagnóstico y pronóstico de leucemias, linfomas, síndromes linfoproliferativos y
síndromes mielodisplásicos: dependiendo de la patología que se sospeche, se emplean
marcadores que expresen en el linaje presuntamente afectado para observar cuál o cuáles
de sus antígenos se encuentran alterados.
Detección de enfermedad mínima residual: se utilizan los marcadores que hayan sido
caracterizados para el diagnóstico. Se determina si la población que presenta esa
característica desaparece o se mantiene, pudiendo provocar una patología.
145
Otras aplicaciones: el recuento de celular CD34+ viables circulantes o en preparaciones
celulares.
Recuerda:
Las siglas CD hacen referencia a grupos de diferenciación. Son moléculas de la membrana, del
citoplasma o del núcleo celular que actúan como antígeno. Pueden ser identificadas mediante

anticuerpos monoclonales.
3.3. Fenotipaje de otras

poblaciones celulares
El recuento absoluto de CD4+ (positivos) y cociente CD4/CD8 también forman parte de
las aplicaciones de la CMF en la práctica clínica, en este caso en pacientes con virus de
inmunodeficiencia humana (VIH).
El VIH infecta a las células que en su superficie tienen la molécula CD4, que es una proteína que
se encuentra en algunas células del sistema inmunológico y que el VIH utiliza como receptor. La
replicación del VIH puede producir la muerte de los linfocitos T CD4 (uno de los tipos de glóbulos
blancos). Con esto, la destrucción de los linfocitos T CD4 altera el sistema inmunológico y da
lugar al diagnóstico del sida.
Hay varias formas de análisis para obtener el recuento total de linfocitos CD4 positivos, y una
de ellas es la que se describe a continuación:
En un histograma bidimensional se enfrentan el tamaño de las células frente a la
complejidad celular, ambos en escala lineal. A partir de ahí, mediante una ventana se
seleccionan aquellas células que presenten un tamaño pequeño y poca complejidad (esta
población coincide con los linfocitos) (imagen A).
En un segundo histograma se enfrentan el tamaño en escala lineal frente a CD45 en
escala logarítmica, y se realiza una ventana sobre aquellas células que tengan un tamaño
pequeño y sean muy positivas para el marcador CD45 (imagen B).
Sobre un tercer histograma se enfrentan CD3 con CD4, pero solo se tendrán en cuenta
aquellas poblaciones que estén dentro tanto de la primera ventana como de la segunda
ventana realizadas anteriormente (imagen C).
Y en un cuarto histograma se enfrenta CD3 con CD8 en las mismas condiciones que
logarítmica (imagen D); también en ambos, el cuadrante superior derecho corresponde

con las moléculas que en el primer caso son CD4 y CD3 altamente positivas, y en el
segundo caso, CD8 y CD3 altamente positivas.
En este proceso se emplean anticuerpos mononucleares que reconocen las distintas

poblaciones de leucocitos, cada una de ellas conjugadas con un fluorocromo distinto.
Así, el cociente CD4/CD8 se obtiene del porcentaje de los linfocitos que aparecen en los
cuadrantes superiores derechos de cada uno de los histogramas de la imagen anterior.
146
Sin embargo, para determinar un recuento absoluto del número de linfocitos CD4, se pueden
utilizar dos métodos:
se usa para calcular recuentos absolutos, combinando
los resultados de la hematología (un hemograma) y de la CMF. Para ello, emplea la
siguiente fórmula:
% de células teñidas positivamente ÷ 104
que se analizará mediante el citómetro, en un volumen indicado por el fabricante. La

fórmula es:
de fluoroesferas) x Concentración indicada de fluoresferas
Sumado a todo lo anterior, el inmunofenotipaje también permite la determinación de porcen-

taje y recuento absoluto de subpoblaciones y otras alteraciones de la respuesta inmunitaria,
como:
La detección de leucocitos activados en sangre periférica o en preparaciones celulares
estimuladas.
La detección de aloanticuerpos y autoanticuerpos circulantes o unidos a células.
La detección de la desgranulación provocada por alérgenos.

moléculas
La detección de antígenos intracelulares pretende determinar la presencia y cuantificar las
proteínas (antígenos) en la parte interna de la membrana plasmática.
Las células en suspensión son tratadas secuencialmente con medios de fijación y

permeabilización. Así, se consigue que los anticuerpos tengan acceso a las estructuras
intracelulares dejando intactas las propiedades de dispersión morfológica de las células. Esto
posibilita al investigador hacer un análisis preciso de marcadores intracelulares indetectables,
como pueden ser, por ejemplo, las enzimas nucleares o citoplasmáticas.
Las formulaciones optimizadas de estos reactivos disminuyen el marcaje de fondo y permiten la

adición simultanea del medio de permeabilización y anticuerpos marcados con fluorocromos.
Se puede realizar este procedimiento para análisis por citometría de flujo (CMF) de poblaciones
leucocitarias derivadas de muestras biológicas tales como sangre o médula ósea.
La CMF ofrece la posibilidad de determinar la presencia y cuantificar los niveles de ácidos

nucleicos (ADN y ARN) en células enteras, células permeabilizadas o suspensiones de núcleos
aislados a partir de sangre periférica, tejidos linfoides, líquidos biológicos, biopsias, etc.
En estos procedimientos, los fluorocromos más usados son el yoduro de propidio, el bromuro
147
de etidio, el naranja de acridina, el Hoechst 33342, el naranja de tiazol, la mitramicina y la
cromomicina A3. El yoduro de propidio y el bromuro de etidio se estimulan a una longitud
de onda de 488 nm y se unen de forma estequiométrica al ADN de doble cadena, donde se
intercalan entre la doble hélice.
La determinación de la ploidía (número completo de cromosomas en una célula) o el ciclo

celular requiere el acceso estequiométrico del fluorocromo al núcleo celular, por lo que se

deben usar células fijadas y/o permeabilizadas. Dependiendo de la aplicación el proceso de
preparación de la muestra puede ser a través de dos etapas, la fijación y la permeabilización.
Los fluorocromos permeables de ácidos nucleicos penetran en células en fresco y permiten

distinguir las células nucleadas en sangre entera u otras muestras hematológicas, o detectar los
ácidos nucleicos residuales en eritrocitos y plaquetas inmaduras.
Los fluorocromos impermeables de ácidos nucleicos sirven para detectar modificaciones en

la permeabilidad de la membrana, asociadas a apoptosis y necrosis.
Así pues, las técnicas analíticas fundamentadas en el uso de fluorocromos específicos de

ácidos nucleicos en células permeabilizadas permiten:
Determinar la poidía celular.
Detectar la presencia de células en proliferación.
Calcular la distribución en las fases del ciclo celular.
Determinar el pronóstico de leucemias, linformas y síndromes linfoproliferativos.

Calcular la ploidía en tumores sólidos y neoplasias hematológicas.
Por otro lado, el análisis de parámetros funcionales permite estudiar cuantitativamente y

cualitativamente cualquier alteración relacionada con situaciones fisiopatológicas de
relevancia clínica. Dicho análisis se realiza usando fluorocromos, sustratos fluorogénicos
específicos o partículas cuyas propiedades varían según los elementos siguientes:
Entorno celular: pH, iones, moléculas oxidantes o reductoras.
Transporte mediante la membrana plasmática o de orgánulos.

Acumulación selectiva en compartimentos intracelulares.
Cada microesfera tiene una intensidad de fluorescencia característica y está recubierta por
anticuerpos específicos frente a una determinada proteína.
Como las distintas microesferas emiten diferentes intensidades de fluorescencia, se pueden

combinar entre sí. Posteriormente, se añadirá un anticuerpo de detección que reconocerá otro
epítopo de la proteína que se va a analizar conjugado con ficoeritrina.
El esquema básico para la realización de la técnica es:

1.
se quieran determinar en la muestra problema.
148
2. Incubar las muestras problema y los controles para realizar la curva patrón.
3.
4. Adquirir las muestras en el citómetro.
5. Analizar los archivos con el programa informático adecuado.

Al igual que en la cuantificación de proteínas, la técnica permite la determinación simultánea
de la respuesta humoral inducida frente a diferentes agentes infecciosos en la misma muestra.
En este caso, se emplean microesferas recubiertas de antígenos purificados, donde cada

microesfera tiene una intensidad de fluorescencia distinta.
Los pasos a seguir son los siguientes:

1.
2. Incubar las muestras problema y los controles para realizar la curva patrón.
3. Incubar las muestras de sueros a la dilución adecuada con las microesferas. Si hay anti-
-
feras.
4. Lavar las microesferas.
5.
6. Lavar las microesferas.
7. Analizar los archivos con el programa informático adecuado.

Esquema de detección de anticuerpos utilizando microesferas.
149
4. Otras técnicas de
separación celular
En los últimos años, la tecnología aplicada al ámbito de la investigación clínica ha favorecido
la optimización de técnicas y recursos. Con ello, si bien han transcendido varios métodos
relacionados con la separación celular, en este apartado estudiaremos dos de ellos.
Su aplicación es válida para seleccionar células a las que previamente se les había unido un
anticuerpo.
4.1. Separación celular

inmunomagnética
La técnica de separación celular inmunomagnética se ocupa de separar una población celular
a partir de una suspensión celular. Para ello, se utiliza un antígeno diana que dicha población
expresa de forma exclusiva.
150
El proceso puede hacerse de dos maneras, ambas con la implicación de una

a. Por un lado, se marca la población celular con un anticuerpo monoclonal dirigido
contra un antígeno que exprese la población o poblaciones que se desea estudiar.
Después, se incuba la muestra con un anticuerpo conjugado con una bola magnéti-
ca.
b. Por otro lado, se marca la población linfocitaria directamente con el anticuerpo con-
jugado con la bola magnética. El anticuerpo va dirigido contra un antígeno que ex-
prese la población o poblaciones que se desea estudiar.
En este sentido, la aplicación de un campo magnético facilita la separación de las células

unidas a las bolas (selección positiva) de las células no unidas (selección negativa).
Este proceso inmunomagnético se considera fácil, rápido y no resulta costoso.
Representación
de la separación
celular empleando
la técnica de las
bolas magnéticas.
4.2. Técnicas de
inmunotoxicidad
Una de las grandes ventajas de la citometría de flujo es la capacidad de cuantificar objetiva-
mente la concentración de anticuerpos que son inmunotóxicos cuando se utilizan determinadas
técnicas de estudio.
Una sustancia inmunotóxica es dañina para el sistema inmunológico.
Para aplicar este tipo de técnicas, las células que se deseen eliminar se marcan con anticuerpos
monoclonales específicos de sus marcadores de membrana, para posteriormente adicionar
complemento de conjugo, cuya actividad será iniciada por la vía alternativa generada por la
formación del complejo antígeno-anticuerpo en la membrana de la célula diana.
Las células así preparadas se incuban durante una hora a 37 ºC, y después las células lisadas
por el complemento se eliminan mediante dos rondas de lavados.
La depleción por complemento es una técnica rápida y de coste económico bajo. Además, no
causa daños a las células y produce buenos rendimientos ya que elimina hasta el 95-100 % de
la población diana.
En función de la estrategia, la depleción por complemento se puede utilizar para:
151
El enriquecimiento de poblaciones celulares que posteriormente podrán someterse a

6
celular.
funcionalidad
Valoración de la
de la inmunidad
1. Separación de linfocitos por la técnica de Ficoll...................................... 155
2. Estudio de la funcionalidad de los linfocitos B......................................... 161
3. Estudio de la funcionalidad de los linfocitos T ......................................... 166
.................................... 168
5. Estudio de las células fagocíticas ............................................................ 169
6. Estudio de las alteraciones del complemento.......................................... 173

154
Objetivos
Estudiar las técnicas de separación de linfocitos por centrifugación en gradiente de

Ficoll.
Estudiar la funcionalidad de los linfocitos B.
Estudiar la funcionalidad de los linfocitos T.
Conocer las células fagocíticas.
Estudiar los ensayos de quimiotaxis y las alteraciones del complemento.

1. Separación de
linfocitos por la técnica
de Ficoll
Los linfocitos son las células responsables de la inmunidad específica o adquirida, y por
esta razón su estudio es tan importante en la investigación del sistema inmune. Estos estudios
incluyen pruebas de funcionalidad y de cuantificación de linfocitos.
La funcionalidad de los diferentes componentes del sistema inmunológico es de gran

importancia en el estudio de la respuesta inmunológica, puesto que gracias a ella se pueden
diagnosticar inmunodeficiencias, que son las enfermedades con un déficit de algunos de esos
componentes.
En esta unidad revisaremos el conjunto de procesos técnicos y metodologías que actualmente

se emplean en los laboratorios para tratar la funcionalidad de la respuesta innata, así como
el sistema fagocítico, la cascada del complemento y la respuesta adaptativa, en la que los
linfocitos B desarrollan un papel principal.
Para poder realizar cualquier prueba es necesario un paso previo: separar los linfocitos
155
de los demás componentes de la sangre. La técnica que más se utiliza es la separación por
centrifugación en gradiente de Ficoll, o técnica de gradiente de densidad continuo.
1.1. Centrifugación en

gradiente de Ficoll
Un gradiente de Ficoll permite la separación de leucocitos mononucleares en los que se
incluyen tanto los linfocitos como los monocitos, aunque mayoritariamente se extraerán los
linfocitos. Un monocito es un tipo de glóbulo blanco agranular que interviene en procesos de
fagocitosis.
El Ficoll 400 se trata de un polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina. Por otro lado, el
diatrizoato de sodio es un compuesto que, cuando se mezcla con el Ficoll, forma una solución
de baja viscosidad y alta densidad. Además, este compuesto ofrece viabilidad a las células,
mientras que el Ficoll proporciona al conjunto celular la aglutinación de los hematíes o
eritrocitos (las células de la sangre que se ocupan del transporte de oxígeno); con esto favorece
su sedimentación.
Centrifugación en gradiente de Ficoll.
Junto con los monocitos, los linfocitos son el tipo de células que menor densidad presenta en
la sangre periférica, y por este motivo se utiliza un gradiente de densidades para generar su
separación.
Así pues, el fundamento de esta técnica se basa en las diferencias de densidad. La particularidad
de las células mononucleares es que pierden densidad durante el proceso de centrifugación.
Entonces, tras el centrifugado se disponen en un halo blanco entre el plasma (fracción líquida y
acelular de la sangre) y la mezcla de Ficoll y diatrizoato, mientras que los granulocitos (un tipo
156
de glóbulo blanco que interviene en procesos de fagocitosis), debido a su tamaño y densidad,

sedimentan junto con los eritrocitos.
Esta técnica permite recuperar hasta el 50 % de los linfocitos de la muestra inicial y el 90 % de

la muestra recogida. Se calcula que la viabilidad puede llegar a ser hasta un 90 %, y se mide
con la utilización de azul de tripán (colorante que se utiliza en tinciones histológicas para
diferencias las células vivas de las muertas).
Los cultivos celulares deben conservarse en condiciones de esterilidad ya que podrían

contaminarse por agentes microbianos. Por esto es importante trabajar en una cámara de flujo
laminar y seguir las directrices de actuación para evitar la contaminación de nuestra estación
de trabajo.
La cámara de flujo laminar es una cámara en la que se proyecta un flujo de aire sobre la zona
de trabajo. Este aire procede del exterior o de un circuito externo y pasa a través de un filtro
denominado HEPA (High efficiency Particulate Arrestor). Este filtro está compuesto por una
fibra muy densa que no permite el paso de microorganismos y esporas, siendo estéril el aire
que deja pasar.
Para este tipo de estudio de cultivos celulares se aconseja usar una cámara de flujo vertical, y el
operador debe estar protegido por una pantalla de vidrio o plástico transparente.
Es recomendable encender el flujo de aire 15 minutos antes que se vaya a utilizar la cámara.
Todos los objetos requeridos para el proceso se deberán limpiar con etanol 70 % o con otra
solución antiséptica (se aplica una solución antiséptica a ciertas sustancias para evitar la
infección por microorganismos). Una vez terminado el trabajo, se recoge el material de la
cámara y se vuelve a limpiar con etanol. Se conecta la luz ultravioleta durante unas horas.
Las recomendaciones para un trabajo en condiciones asépticas son:
El material de uso debe ser esterilizado.
Solo deben mantenerse abiertos los recipientes estériles como puntas o frascos de cultivo
trabajo.
excesiva de personal.
Si se utiliza un medio de cultivo o aditivos es imprescindible cerciorarse de que no exista
que la muestra ha sido contaminada y sería necesario reemplazarla por una de nueva.
La viabilidad de las células es relevante en la mayoría de las técnicas inmunológicas. A

continuación, se explica la preparación del medio de cultivo necesario para mantener los
leucocitos extraídos en condiciones óptimas.
Primero, se descomplementa el suero de ternera fetal. Para ello, se descongela el frasco

comercial a temperatura ambiente; dependiendo del volumen, esto tardará unas 24 horas. Tras
la descongelación, se incuba a 56 ºC durante una hora y, posteriormente, lo alicuotamos en
tubos de 10 ml. La conservación de las alícuotas se hace a -20 ºC.
Para efectuar el medio de cultivo, se necesita un frasco de RPMI comercial (GibCo) de 100 ml al
que añadiremos: una alícuota de 10 ml de suero fetal descomplementado, 1 ml de glutamina a
una concentración de 200 mM y 1 ml de antibiótico (gentamicina o similar) a una concentración
157
de 2 mg/ml.
Recordemos que RPMI (Roswell Park Memorial Institute) es utilizado como medio de cultivo
celular.
La gentamicina es un aminoglucósido que se emplea como antibiótico para erradicar ciertas

infecciones, y la glutamina es un aminoácido que interviene en la formación de las proteínas.
1.2. Procedimiento de TÉCNICO SUPERIOR EN LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO
separación de linfocitos
Como hemos comentado, la técnica más habitual para obtener preparaciones de linfocitos
de sangre periférica purificadas o enriquecidas, necesarias para realizar pruebas in vitro, es la
separación de linfocitos por centrifugación en gradiente de Ficoll.
La sangre total desfibrilada se diluye en medio de cultivo y se vierte sobre un tubo lleno hasta
la mitad de un medio con Ficoll. En seguida se centrifuga y se logra, por los mecanismos que se
explican a continuación, la separación de los linfocitos.
A pesar de que esta técnica separa los leucocitos mononucleares, cuando las muestras
proceden de sangre periférica, son mucho más abundantes los linfocitos.
1.2.1. El medio de separación

El medio de separación presenta un gradiente discontinuo, formado por dos compuestos:
tal y como se ha avanzado antes, es un polímero sintético de sacarosa y
epiclorhidrina de 400 kDa, soluble en agua. El Ficoll tiene una densidad mayor que la
de los linfocitos, pero mayor que la de los eritrocitos y granulocitos; además, provoca la
aglutinación de los eritrocitos.
es un compuesto que, mezclado con Ficoll, forma soluciones de
baja viscosidad y alta densidad. Provee la densidad óptima de las células y la osmolaridad
necesaria para mantener su viabilidad.
El medio de separación se prepara siguiendo estos pasos:

Diluir la sangre anticoagulada, en un tubo de heparina, con solución salina a ½ (la
heparina es una sustancia que previene la coagulación sanguínea).
En el fondo de un tubo de precipitado en forma de U se ponen 3 ml de Ficoll por cada 6 ml
de la dilución anterior.
Se añade la dilución con una pipeta de Pasteur sobre la pared del tubo para evitar que se
formen turbulencias y/o burbujas sobre el Ficoll. El resultado serán dos fases inmiscibles.
Cuando dos sustancias tienen la capacidad de constituir una solución homogénea más
allá de las proporciones implicadas, se dice que son miscibles. En cambio, si no tienen
dicha capacidad, se consideran inmiscibles. Un ejemplo de sustancia inmiscible es el
agua.
158
Se centrifuga a 1.800 rpm durante 30 minutos, con la opción de parada lenta en la

centrífuga para conservar intacto el halo de interés.
Luego, aparecerá un halo blanquecino en mitad del tubo: es la fracción positiva (esto es, la
que contiene los linfocitos y monocitos). Se recoge en una pipeta de Pasteur.
Se deposita la fracción extraída en otro tubo en forma de U y se añade 6 ml de suero
salino para su lavado.

Se centrifuga de nuevo a 1.400 rpm durante 10 minutos. Se añade el sobrenadante y se
repite la operación dos veces más.
Se lava por última vez y se resuspenden las células en 1 ml de medio completo.
Finalmente, se cuentan las células en una cámara de Neubauer con azul de tripán para
visualizar la viabilidad celular.
1.2.2. Contaje de células
Después de seguir estos pasos, nos quedarán las diferentes fases definidas en el tubo tal y
como se aprecia en la siguiente imagen.
159
Ilustración del paso posterior a la centrifugación de la sangre durante 30 minutos en un gradiente de densidad
(Ficoll), donde aparecen las siguientes fases: plasma, leucocitos, fracción negativa, granulocitos y hematíes.

El plasma se localizará en la primera de las fases; una fase intermedia de coloración blanquecina
serán los leucocitos de interés (monocitos y linfocitos); a continuación, se visualizará de manera
transparente el Ficoll restante y, por último, sedimentando los granulocitos y los hematíes.
Se requiere la evaluación de las células obtenidas, porque la mayoría de los estudios necesita
un número aproximado de células viables para llevar a cabo la técnica.
En cuanto a la evaluación y contaje de células, se emplea la cámara de Neubauer.
iguales, de 1 mm2, y la altura de la cuadrícula hasta el

cubreobjetos es de 0,1 mm.
Las células vivas dejan pasar electrólitos (sustancias que llevan una carga eléctrica) a través de
su membrana, mientras que las células muertas no mantienen la integridad de la membrana
y dejan pasar cualquier tipo de sustancia; aquí, la célula presenta un aspecto coloreado,
característica que podemos utilizar para discriminar entre ambos grupos. Existen distintos
marcajes para visualizar las células. El más utilizado es el azul tripán.
Neubauer.
La cuadrícula de la cámara de Neubauer está compuesta por nueve áreas iguales, de 1 mm2,
y la altura de la cuadrícula hasta el cubreobjetos es de 0,1 mm. En el centro se observan 25
cuadrados cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrantes. Se realiza, mediante un
microscopio óptico, el contaje de 16 cuadrantes. El número de células por ml se expresa de la
siguiente manera:
Número de células por ml = número de células en los 16 cuadrantes x 2 x 104
El número dos hace referencia a la dilución de la muestra utilizada para contar células (2:1),
por esto se multiplica por dos. Y 104 remite al factor de corrección de la cámara de Neubauer,
puesto que el volumen comprendido entre un cuadrado grande, 16 pequeños y el cubreobjetos
es de 1/10.000 ml.
En el momento de contar el número de células, hay que tener en cuenta la dilución de la

muestra en el cómputo final de células. Se incluyen necesariamente, por tanto, aquellas que se
encuentran dentro de los 16 cuadrantes.
160
1.3. Factores a tener en cuenta

Para el correcto desarrollo de esta técnica conviene tener presentes una serie de factores y
características:
la sangre de la que partimos estará en proporción con el volumen
de Ficoll que utilicemos, ya que un aumento en el volumen de sangre aumentaría el
porcentaje de contaminación de eritrocitos en el halo blanquecino.
la técnica será más o menos pura dependiendo del
número de eritrocitos en la fase de recogida. La posible aglutinación de los eritrocitos
hace que puedan acumularse en la fracción de los linfocitos; esto puede ser problemático
y se soluciona con la dilución previa (2:1) de la sangre añadiendo suero salino.
la temperatura debe ser la adecuada. Las temperaturas
altas (37 ºC o superiores) aceleran la separación, pero también contribuyen a la
aglutinación de los hematíes; mientras que las temperaturas bajas (4 ºC o inferiores)
disminuyen la velocidad de aglutinación, pero también la duración del proceso. Así pues,
el rango óptimo está entorno a los 18 ºC.
en función del tipo de sangre, el
rendimiento de los resultados puede verse afectado, sobre todo si la sangre pertenece a
un paciente con algún tipo de enfermedad.
que se depositan junto
a los eritrocitos; para ello, tendremos que lisar los hematíes con cloruro amónico y
estemos empleando.
2. Estudio de la
funcionalidad de los
linfocitos B
Los linfocitos B son células pequeñas redondeadas con un núcleo prominente. Son las
encargadas de la producción de anticuerpos e intervienen en la respuesta adaptativa
participando activamente como un componente humoral del sistema inmune.
Existen varios clones de linfocitos B que se expresan según el tipo de receptor de linfocito
B (BCR). Cada tipo de inmunoglobulina tiene una función determinada. Por ejemplo, la
inmunoglobulina A se localiza mayormente en las mucosas y nos defiende contra los patógenos
que pudieran entrar por esta vía.
Las inmunoglobulinas, también llamadas anticuerpos, son producidas por las células
plasmáticas y se encargan de reconocer a los patógenos y de neutralizarlos. Por otra parte, un
clon es un grupo de células procedentes de la misma estirpe celular (célula madre).
Las diferentes clases de inmunoglobulina o isotipo que puede presentar un individuo son
cinco: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Se distinguen dependiendo de las propiedades estructurales y
161
antigénicas de sus cadenas pesadas y ligeras. Solamente pueden ser cuantificadas mediante
técnicas inmunoquímicas.
Para medir las inmunoglobulinas más abundantes en el plasma (IgG, IgA e IgM) se emplean
los métodos de la inmunodifusión radial y la inmunonefelometría.
Las indicaciones clínicas para la cuantificación de inmunoglobulinas en suero son: sospecha

de inmunodeficiencias relacionadas con una baja o ausente concentración de Ig, y

vigilancia de pacientes con una hipogammaglobulina que se encuentren en tratamiento con
inmunoglobulina intravenosa.
Recordemos que el suero es un componente perteneciente a la sangre tras eliminar los factores
de coagulación.
2.1. Inmunodifusión radial

La inmunodifusión radial consiste en la difusión de una muestra de suero en un gel
que contiene anticuerpos anti-Ig a detectar. La formación de los inmunocomplejos Ig-
anticuerpo anti-Ig precipita y forma un halo blanquecino a la concentración de la Ig. El tipo de
inmunodifusión radial más utilizada es la difusión completa, en la que se genera una difusión
máxima de la muestra a las 48-72 horas.
Si bien es una técnica sencilla de llevar a cabo, presenta algunas desventajas en comparación
con la inmunonefelometría, y es que el tiempo de la técnica es mayor y existe posibilidad de
lecturas erróneas en aquellas Ig anormales como son las poliméricas o incompletas que se dan
en ciertas patologías.
Procedimiento
El procedimiento de la inmunodifusión radial es el siguiente:

Extraer suero al paciente; si no se utiliza de forma inmediata, se debe congelar a una
temperatura de -20 ºC.
La placa de inmunodifusión radial debe conservarse a temperatura ambiente (TA),
abierta durante los minutos previos a la realización de la técnica para conseguir que
evapore el líquido de la condensación.
Aplicar 5 μl de muestra de suero en cada pocillo, y también en los reactivos del kit
comercial para la curva de diluciones.
Dejar la muestra a temperatura ambiente y a oscuras
asegurar su completa difusión.
Leer el diámetro de los halos de precipitaciones, preferiblemente con una lupa
milimétrica para mayor precisión.
(como se ilustra en la siguiente imagen)
en el que se represente el diámetro al cuadrado de los pocillos de la curva de calibración
en el eje Y frente a la concentración mg/dl de cada calibrador (estos últimos ya vienen
determinados por la casa comercial).
Con la curva elaborada, podremos extrapolar los resultados alcanzados en cada
pocillo (diámetro cuadrado) con la curva control, obteniendo el resultado de la
concentración de inmunoglobulinas.
162
1 2 3 4 5 6 7 8
A 20 ng 10 ng 5 ng 2,5 ng 1,25 ng 0,625 ng 0,313 ng 0,157ng
B 20 ng 10 ng 5 ng 2,5 ng 1,25 ng 0,625 ng 0,313 ng 0,157ng
C 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
D 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256

E 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
F 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
G 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256
son las filas de los sobrenadantes de la curva patrón; habrá que añadir las concentraciones a
las que se indican en cada pocillo.
fila del sobrenadante de los pocillos control.
sobrenadantes que se añadió cicloheximida.
sobrenadantes que se añadió PWD 1/2. Se harán diluciones en cada sobrenadante usando una
pipeta multicanal y traspasando al siguiente pocillo.
sobrenadante con PWD 1/4, diluciones de la misma forma que el caso anterior.
sobrenadante con PWD 1/8, diluciones de la misma forma que en los casos anteriores.
2.2. Inmunonefelometría
Actualmente disponemos de una amplia variedad de técnicas basadas en la luz dispersada,
denominadas nefelometría, tal y como estudiamos en unidades anteriores.
Estas consisten en la medición de la dispersión de la luz cuando incide sobre complejos

insolubles, como son la formación de antígeno-anticuerpo, y tienen ciertas ventajas respecto
a la técnica de inmunodifusión radial, porque es una técnica rápida y con ella se puede analizar
un gran número de muestras simultáneamente.
Por el contrario, el principal inconveniente es la posible interacción de los resultados en los

casos en que la muestra tenga turbidez, esté hemolizada o presente algún coágulo que pueda
entorpecer en la medición.
El nefelómetro mide la luz dispersa de un haz de luz (rayo láser a 670 nm) que incide sobre las
partículas suspendidas en una cubeta. El detector está posicionado a 90 º con respecto al láser
para medir la dispersión de la luz.
En relación con las lecturas, hay de dos tipos: las de punto final (que son las que ofrecen los
nefelómetros más antiguos), y las de cinética (que miden la formación de complejos, es decir,
el cambio de señal por unidad de tiempo; a mayor cantidad de Ig, mayor cantidad de forma-
ción de inmunocomplejos).
El procedimiento para usar el nefelómetro varía según el modelo. En general, todos miden
los códigos de barras de las muestras, realizan las diluciones y las ajustan a una curva de
163
calibración en función del lote de reactivos que se esté usando. Los controles deben revisarse
periódicamente.
suspendidas en una cubeta.

2.3. Determinar la producción

de inmunoglobulinas
Para determinar la producción de inmunoglobulinas por parte de los linfocitos B, llevare-
mos previamente el aislamiento de los linfocitos mediante un gradiente de densidad (Ficoll), y
estimularemos a los linfocitos con PWM (Pleweed Mytogen). Se trata de un mitógeno que excita
la diferenciación de los linfocitos B a células plasmáticas y, como consecuencia, la producción
de anticuerpos.
Un mitógeno es un factor que actúa en el ciclo celular y favorece la división de celular.
Tras la estimulación de los linfocitos, se realiza la técnica ELISA sándwich (ensayo de

inmunoadsorción ligado a enzimas) para visualizar cuantitativamente los niveles de Ig
producidas de cada tipo (IgG, IgM, IgA).
Para medir los niveles basales de Ig en el cultivo antes del estímulo, se emplea cicloheximida
(CHX), que inhibe la síntesis de proteínas por parte de la célula.
El ensayo se hace por triplicado, en una placa de 96 pocillos de fondo plano. El volumen final
cinco
grupos, siempre por triplicado:
Sin estimulación.
164
Se realiza la incubación en una estufa a 37 ºC en condiciones de 5 % de CO2 durante 7 días. Se

recogerá el sobrenadante con una pipeta Pasteur, y los sobrenadantes se congelarán hasta su
utilización para la técnica ELISA.
Procedimiento del ELISA
Para la realización de ELISA, los pasos que se deberán seguir son:

1. para ello, se utiliza IgM anticuerpo primario (Goat-Human
IgM) distribuyendo 400 ng por cada pocillo. Las diluciones se harán con PBS.
2. Un total de 6 lavados con PBS-tween 0,1 %.
3. Bloquear la placa
4. Diluciones seriadas
5. Incubar a 4 ºC durante toda la noche.
6. Nuevamente, 6 lavados con PBS-tween 0,1 %.
7. Añadir el anticuerpo secundario (anti-human IgM conjugado con peroxidasa): dilución

1:15.000. Se realizará con PBS.
8. incubar 1,5 h a 4 ºC.
9. Vaciar la placa y realizar seis lavados con PBS-tween.
10. 10 ml de agua destilada más una pastilla de OPD (o-fenilendiamina)
11. Cuando adquiere color, parar la reacción

al 5 %.
12. Leer la placa a 492 nm en un espectrofotómetro

newton metro, también llamado nanómetro, que es la unidad utilizada para medir la
longitud de onda de la radiación ultravioleta, la radiación infrarroja y de la luz).
2.4. Respuesta a la vacunación

Otra forma de cuantificar la función de los linfocitos B es estudiando la respuesta a la
vacunación.
Si las células plasmáticas muestran falta de producción de anticuerpos hacia los antígenos
artificiales, inyectados a un individuo en forma de vacuna, para conseguir linfocitos de memo-
ria, indicará que el individuo tiene un fallo en la respuesta humoral.
165
Para ello, es necesario evaluar dos tipos de respuesta:
es un tipo de respuesta efectiva que no produce linfocitos de
memoria, como es el caso de la vacuna de pneumococcus.
este tipo sí crea respuesta de memoria y se trata de antígenos
Haemophilus
influenzae B.

3. Estudio de la
funcionalidad de los
linfocitos T
Los linfocitos T son los productores de células activadas después de un estímulo antigénico,
que tiene la finalidad de desencadenar una respuesta inmune. Una vez desencadenada,
los linfocitos T modifican sus funciones y expresión de ciertas citocinas para proliferarse y
diferenciarse a más linfocitos T efectores.
Según su función y según las citocinas que se expresen, los linfocitos TCD4 (que expresan en
su superficie CD4) se dividen en células Th1 (T helper 1) y Th2 (T helper 2).
El linfocito T CD8, denominado linfocito citolítico, también está presente en el sistema

inmune. Es el encargado de eliminar células de su interior infectadas por patógenos mediante
el método de lisis. Puede necesitar en algún momento una coestimulación por parte de las
células Th1 para tener una mayor acción en la eliminación del patógeno.
Cuando los linfocitos T sensibilizados frente a un antígeno se cultivan en presencia de ese

antígeno o de un agente mitógeno, responden activamente.
166
La proliferación de los linfoblastos implica una síntesis de ADN, los cual se puede medir a través
de la tasa de incorporación de timidina tritiada a las células. Este fundamento se aplica para
estudiar la funcionalidad de los linfocitos T mediante estudios de proliferación de linfocitos en
respuesta a mitógenos.
3.1. Estudios de proliferación

de linfocitos en respuesta
a mitógenos
La forma más frecuente de analizar la función de los linfocitos es a través de la estimulación
con mitógenos. Son unas sustancias que tienen afinidad por la membrana del linfocito T y son
capaces de activar la proliferación y la activación de los linfocitos de una manera policlonal e
inespecífica.
Los mitógenos que más se utilizan en esta técnica son de la fitohemaglutinina (PHA),
concavalina-A (Con-A), mitógeno de la hierba carmín (PWM) y anti-CD3.
Así, mediante la estimulación de antígenos específicos también se puede conseguir la

estimulación de la funcionalidad de los linfocitos T de una manera oligoclonal y específica,
como son la utilización de toxina diftérica y tetánica.
La técnica basada en la proliferación de linfocitos en respuesta a mitógenos consiste en la
activación de los linfocitos con el mitógeno de elección. Para ello, se utiliza una microplaca de
cultivo, de 96 pocillos, donde se depositan 400.000 - 50.000 células en cada pocillo, y se realiza
la técnica por triplicado en cada caso.
Se estimula cada pocillo a diferentes concentraciones; por ejemplo, en el caso de PHA, a 0,12
sin estimular, que servirá de control para el estudio.
Posteriormente, la placa se incuba a 37 ºC en una estufa con ambiente húmedo y 5 % de CO2.
Tras 3 días de conservación, se marca con timidina tritiada, que se incorpora al ADN de las
células en proliferación.
Después de 12-16 horas, la suspensión de células se aspira con un cosechador o Harvest.
El tritio incorporado en las células emite radiación beta, que se puede leer como cuentas
por minuto (cpm) o desintegraciones por minuto (dpm) en un contador de centelleo beta.
Deberemos considerar que: cuanto mayor sea la radiación, mayor será la proliferación celular.
Finalmente, los resultados se expresan como el
Promedio de cpm en los pocillos estimulados

IE =
Promedio de cpm en los pocillos de control
167
El paciente no puede estar bajo tratamiento con ningún inmunomodulador o glucorticoide
porque podría afectar los resultados de estimulación linfocitaria.
Recuerda que, ante resultados de estimulación negativos, hay que descubrir si el paciente
estaba en tratamiento con algún fármaco que pudiera haber alterado el resultado.

subpoblaciones de
linfocitos T
Teniendo en cuenta que los linfocitos son morfológicamente indistinguibles, hay que utilizar
métodos de laboratorio para detectar proteínas marcadoras de membrana y poder diferenciar,
así, unos tipos de linfocitos de otros.
Como ya comentamos anteriormente, existen varias subclases de linfocitos T dependiendo de

las funciones y de las citocinas que producen.
La cuantificación de las diferentes poblaciones en el caso de una inmunodeficiencia es

importante para determinar cuál es el tipo de respuesta inmune (celular o humoral) en la que
el individuo puede verse comprometido.
La forma más fácil y precisa de determinar las poblaciones de linfocitos T es mediante el uso de
la citometría de flujo. El número y el porcentaje de células que presentan este tipo de molécula
en superficie se analiza con diferentes marcadores, como los anticuerpos monoclonales.
En efecto, la citometría de flujo ofrece amplias posibilidades de análisis y automatización,

168
aunque el elevado costo de los instrumentos y la complejidad técnica de su manejo y

mantenimiento la hacen inviable para la mayoría de los laboratorios pequeños y medianos.
A pesar de ello, esta técnica es de elección para la cuantificación de linfocitos B. Los linfocitos
B maduros expresan CD19, CD20 y HLA-DR, mientras que los inmaduros expresan moléculas
adicionales como CD10.
Como se aprecia en la imagen siguiente, donde se resumen los marcadores para cada
población de estudio, el linfocito T se diferencia con la molécula CD3+ que forma parte del
complejo receptor de LT y no está presente en otro tipo celular.
poseen una función innata y aparecen mayoritariamente en la mucosa intestinal.
celular.
Finalmente, cabe destacar que se puede definir el estado de activación de los LT marcando la
proteína de superficie CD45RO y CD45RA; en el primer caso se trataría de linfocitos sensibili-
zador (de memoria), y en el segundo caso, serían los linfocitos vírgenes los que no han sido
activados por el antígeno.
5. Estudio de las células
fagocíticas
El sistema fagocítico forma parte de lo que se denomina respuesta innata. Es la respuesta
primaria contra un cuerpo extraño por parte del sistema inmune, y es un tipo de respuesta
inflamatoria que condiciona una posterior respuesta adaptativa. Ambas respuestas funcionan
como un bucle retroalimentativo.
El sistema fagocítico lo conforman los fagocitos polimorfonucleares (basófilos, eosinófilos

y neutrófilos) y los fagocitos mononucleares (macrófagos). La evaluación funcional de estas
células incluye métodos que estudian la capacidad fagocítica, la activación del metabolismo
celular (que tiene lugar tras su activación), su actividad bactericida y su respuesta quimiotáctica.
Las células polimorfonucleares poseen gránulos con sustancias microbicidas para atacar y
destruir a los microorganismos. Los neutrófilos son los leucocitos circulantes más abundantes
del torrente circulatorio y, junto con lo macrófagos, son los encargados de fagocitar. Los
basófilos, por su parte, expulsan proteínas mediadoras de inflamación. En el caso de los
eosinófilos, liberan sus gránulos al exterior en respuesta a parásitos de gran tamaño difíciles
de fagocitar.
La respuesta innata se caracteriza por ser una respuesta no específica; se trata de receptores
169
que reconocen patrones con un componente proteico común a todos los patógenos de la
misma clase.
La unión de los receptores con el patógeno o partículas extrañas produce una cascada de
proteínas de activación que lo envuelve en el interior en una vesícula denominada fagosoma.
Posteriormente, al fagosoma se le une el lisosoma formando una fagolisosoma que posee
un pH ácido y adecuado para la actuación de diferentes enzimas microbicidas como son
proteasas, nucleasas, lipasas, etc.

Tras la unión por los receptores, se acrecienta la captación de oxígeno de los fagocitos para la
producción de agentes oxidantes dañinos para el microorganismo, lo que se conoce como
estallido respiratorio.
Hay tres complejos enzimáticos en un fagocito:

se localiza en la membrana del fagocito
y de la fagolisosoma, que reduce el oxígeno molecular a
superóxido (O2-).
emplea el peróxido de
hidrógeno formado en el estrés respiratorio para la
producción de compuestos con cloro.
es una
enzima capaz de catalizar NO (óxido nítrico) con el uso de
arginina y su paso a citrulina.
Fagocitosis.
5.1. Reducción del nitroblue

tetrazolium (NBT)
La prueba de reducción del nitroblue tetrazolium (azul de tetrazolio nitrado) es un método
sencillo para evaluar el estallido respiratorio de los fagocitos, que tiene lugar tras su
activación.
El estallido respiratorio es inducido por proteínas de membrana y citoplasmáticas (sistema

NADPH oxidasa); durante el proceso se genera anión superóxido que, gracias al superóxido
dismutasa, es transformado rápidamente en peróxido de hidrógeno.
El nitroblue tetrazolium (NBT) es un compuesto amarillo soluble que, al ser endocitado por
fagocitos que hayan generado ion superóxido, es reducido y precipita en forma de cristales de
formazán, que son de color púrpura o azul oscuro. Se expresa de la siguiente forma:
NBT (color amarillo y soluble) + O2 2
El procedimiento de la prueba consiste en:

Colocar una gota de sangre del paciente en un portaobjetos. La sangre debe estar
conservada en un tubo de heparina de litio o EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)
antes de su utilización.
170
superóxido.
Añadir NBT y apreciar el cambio de color, de amarillo a azul oscuro. En el caso de los
pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (EGC) este cambio de color no se
produce.
Paralelamente, se hace el mismo procedimiento con sangre de un paciente sano como
control.
Los falsos negativos pueden aparecer en pacientes que tengan déficit de moléculas de
la NADPH oxidasa, como p22, p67 y p47, debido a una producción parcial de radicales. En
esta situación, el método de análisis sería la secuenciación de la región del ADN, es decir,
determinar los nucleótidos de las regiones de interés para compararlas con una región
consenso; esto permitiría detectar posibles alteraciones en individuos que muestren una
deficiencia en la funcionalidad de las moléculas interventoras en el estallido respiratorio del
neutrófilo.
5.2. Uso de bacterias marcadas
para valoración de
actividad bactericida
Para recapitular, en los métodos que hemos estudiado en los apartados anteriores se medía
la fagocitosis por ingestión o por técnicas que combinan la fagocitosis y la muerte bacteriana.
El caso que se expone a continuación ofrece un enfoque alternativo ya que permite medir y
monitorizar la fluorescencia en un citómetro de flujo (CMF) o por un análisis fluorométrico,
además de utilizar partículas marcadas.
En los estudios por CMF se emplean muestras pequeñas con fluoresceínas en las bacterias
marcadas y son fácilmente distinguibles de las que ya han sido fagocitadas por neutrófilos.
Los estudios mediante el análisis fluorométrico proporcionan un método todavía más eficaz
para analizar la fagocitosis y otros procesos celulares.
La técnica fluorométrica para la evaluación de la fagocitosis, utiliza células fagocíticas

(macrófagos y partículas opsonizadas) marcadas con fluorescencia.
Consiste en realizar un laminado de macrófagos adherentes en placas de 96 pocillos. Se
171
les administran partículas fluorescentes (verde o rojo) y, con esto, las células fagocitan por
cantidades variadas de tiempo. Las partículas fluorescentes se internalizan y después se lavan
con azul de tripano (que tiene la capacidad de extinguir la fluorescencia) para que elimine la
señal fluorescente a partir de bacterias que no se internalizan.
Tras el lavado de tripano, las células se lavan con PBS y se fijan con DAPI (marcador fluorescente
azul nuclear) para teñir y tener etiquetados los núcleos de las células.

El índice de fagocitosis es la cantidad de bacterias fluorescentes internalizadas y se obtiene
mediante la lectura de la fluorescencia de la placa nuclear (azul) o de partículas (verde/rojo).
5.3. Ensayos de quimiotaxis

La quimiotaxis, también llamada migración de los neutrófilos y monocitos, representa una
respuesta aguda o crónica y se mide por difusión de leucocitos en un medio de agarosa.
Los ensayos de quimiotaxis sirven para cuantificar la locomoción direccional de los

neutrófilos atraídos por diferentes estímulos. Para llevar a cabo estos ensayos, se usan unos
dispositivos formados por dos cámaras aisladas y separadas por un filtro. En una de las cámaras
se sitúan las células y en la otra, un agente quimiotáctico.
El dispositivo más usado para el estudio de la quimiotaxis de los fagocitos es la cámara de

Boyden. Esta cámara tiene dos compartimentos separados por una membrana de filtro de
poro pequeño. En el compartimento superior se depositan las células, mientras que el inferior
contiene una sustancia quimiotáctica.
Los neutrófilos, atraídos por la sustancia del compartimento inferior, intentan desplazarse
hacia ella, pero quedan atrapados en la membrana. Tras un periodo de tiempo de incubación,
la membrana se tiñe y es visible al microscopio.
En el mercado hay disponibles varios modelos comerciales de cámaras de Boyden, que son
herramientas útiles para estudiar la migración celular. Consisten en celdas de cultivo
cilíndricas insertadas en un pocillo de una placa de cultivo. Los insertos contienen una
membrana de policarbonato en el fondo con un tamaño de poro determinado.
Las células se siembran en la parte de arriba del inserto en medio sin suero, mientras que en
la parte de abajo del pocillo se añade suero u otros quimioatrayentes. Las células capaces
de migrar se desplazan a través de los poros hacia el quimioatrayente pudiendo ser después
teñidas o cuantificadas en un lector de placas.
Para lograr unos resultados óptimos, el tamaño del poro de la membrana debe ser menor que
el tamaño de la célula con la que se vaya a ensayar.
172
6. Estudio de las
alteraciones del
complemento
El sistema del complemento está constituido por un conjunto de proteínas plasmáticas que
se activan en cascada como consecuencia de diferentes estímulos.
Su función principal es producir la lisis de las membranas de las células de los agentes
patógenos, aunque también promueve los procesos inflamatorios y contribuye a la fagocito-
sis y a la eliminación de los inmunocomplejos, cuyo depósito puede ser causa de enferme-
dad.
El sistema del complemento se puede activar por varias vías:

es iniciada por anticuerpos (IgM e IgG).
173
Sistema del complemento.

Sin embargo, las tres vías tienen un factor en común. Y es que, en lisis de la membrana del
microorganismo, llamada MAC (complejo de ataque a la membrana), las proteínas finales de la
cascada del complemento (C6, C7, C8 y C9) forman un poro en la membrana del microorganismo,
lo que produce la lisis por ósmosis (fenómeno físico relacionado con el movimiento de un
solvente a través de una membrana semipermeable). Esto se denomina fase lítica.
fracciones C3 y C4
Los componentes mayoritarios del complemento son C3 y C4, y su cuantificación puede
efectuarse con la técnica de la nefelometría, explicada anteriormente. Es un método que
parte del estudio de las inmunoglobulinas y la inmunodifusión radial, como sería el caso de la
determinación de C1inhibidor, que es una proteína reguladora de la vía clásica que bloquea el
inicio de esta vía.
Para estudiar cada componente del sistema del complemento se han desarrollado varias
técnicas. Una de ellas es la medición de la actividad hemolítica del complemento sérico,
también llamado CH50. Con este método, pues, se mide la función de la actividad lítica final
que converge de las tres vías del complemento.
174
El gran inconveniente de estas técnicas es que detectan tanto los complementos funcionales
como los inactivados y algunos fragmentos de degradación de estos.
6.2. Análisis de la vía clásica

Para el análisis de la vía clásica se puede utilizar la cuantificación de la actividad hemolítica

del complemento sérico, la técnica CH50. Otra técnica que puede aplicarse es la técnica de
hemolisis en gel de agarosa, que es una modificación de la anterior.
La técnica CH50 consiste en analizar el porcentaje de eritrocitos, que previamente han sido
sensibilizados con anticuerpos y se les añade complemento. Cuando se produce la lisis, liberan
hemoglobina, la cual se mide a 542 nm al espectrofotómetro.
El resultado del porcentaje de hematíes lisado frente a la cantidad de suero añadido forma
una curva sigmoide; la mejor zona para medir la cantidad de suero añadido es en la zona
media/central de la curva, precisamente el 50 % de los hematíes. Por este motivo se trata
de la cantidad de ml de suero completo que se necesita para lisar al 50 % de los hematíes
sensibilizados con inmunoglobulinas durante una hora de incubación a 37 ºC.
Se calcula que lisis total ocurre mediante la vía clásica del complemento sobre unos 5 x 108
eritrocitos sensibilizados, en un volumen final de 7,5 ml y en presencia de calcio y magnesio a
concentraciones adecuadas.
Para lograr este resultado es necesario 1/20 hasta

1/320 seriadamente con el fin de calcular la curva de lisis de eritrocitos frente a la activación
del complemento.
Se requiere en uno no se producirá la hemólisis, y en el otro sí que se
producirá en un 100 %. El resultado de todas las diluciones se medirá a 542 nm.
La expresión del porcentaje de hemólisis, donde DO hace referencia a densidad óptica, es:
DO problema − DO 0 % lisis x 100

% hemólisis =
DO 100 % lisis − DO 0 % lisis
Cuestiones a tener en cuenta:

Los resultados se expresan como unidades equivalentes/ml de anticuerpos frente al
complemento que lisan el 50 % de los hematíes.
El rango normal de los valores es: > 70 CH50 U Eq/ml.
El consumo probable es: < 70 CH50 U Eq/ml.
La en alguno de los componentes de la vía clásica es: 0 CH50 U Eq/ml.
Por otro lado, la determinación del CH50 también se puede realizar con la técnica de
inmunodifusión radial, en la que se sensibilizan los hematíes con inmunocomplejos en una
matriz sólida de agarosa. El proceso, en este caso, se detalla a continuación.
En los pocillos del gel se añaden las muestras de suero con la curva de calibración
correspondiente para extrapolar los resultados. Se mantiene la placa a 4 ºC durante 20 horas
para que la muestra se difunda y, tras una hora a 37 ºC, se produce la hemólisis. Al final se evalúa
175
el diámetro del halo, que es directamente proporcional al logaritmo de la concentración del
complemento en el suero.
En relación con el análisis del complemento, otro estudio que se realiza es la determinación
de los niveles del C1inhibidor (C1INH). Esta es una molécula reguladora de la vía clásica que
se une a dos moléculas iniciales de la vía: C1r y C1s, necesarias para que empiece la ruta.
Los individuos con déficit en esta molécula sufren de angioedema hereditario. Se trata de

enfermos con características clínicas de tumefacción no prurítica con varios órganos afectados.
La causa de muerte más habitual en estos casos es por asfixia, producida por la formación de
un edema laríngeo.
Son pacientes, concretamente, en los que los niveles de C3 son normales (porque la molécula
es producida mediante otras vías), mientras que los niveles de C4 son menores. Si se sospecha
de esta enfermedad y se confirma una disminución de C4, es recomendable determinar la
concentración de C1INH.
Para determinar los niveles de C1INH, normalmente se hace mediante la inmunodifusión

radial, en la que prepararemos un gel de agarosa sensibilizado con anticuerpos anti-C1INH.
En unos pocillos añadiremos muestras de suero a diferentes diluciones, junto con la curva de
control del kit comercial.
Dejaremos que difunda a temperatura ambiente durante los próximos 3 días y leeremos el radio
de precipitación, puesto que será directamente proporcional al logaritmo de concentración de
C1IHN de nuestra muestra.
7
estudios de
Aplicación de

1. Moléculas CMH ........................................................................................ 179
2. Estudios de histocompatibilidad .............................................................. 186
3. Aplicaciones de los estudios de histocompatibilidad .............................. 193

178
Objetivos
Estudiar las moléculas CMH.
Conocer los estudios de histocompatibilidad.
Conocer las aplicaciones de los estudios de histocompatibilidad.
Estudiar los trasplantes de órganos, los estudios de paternidad.
Analizar los estudios antropológicos.

1. Moléculas CMH
A lo largo de este módulo hemos aprendido que el sistema inmune protege a nuestro cuerpo
de agentes exógenos extraños, los antígenos. Debemos diferenciar, eso sí, antígeno de
inmunógeno.
Un antígeno es cualquier sustancia capaz de unirse específicamente a receptores del sistema

inmune, mientras que inmunógeno es aquella sustancia que induce una respuesta inmune. Así
pues, podemos decir que todos los inmunógenos son antígenos, pero no todos los antígenos
son inmunógenos.
La inmunidad innata se caracteriza por sus

lo que se traduce como descamación, sudores, mucosas,
secreciones, toses, etc. Aunque nosotros percibimos estos efectos como negativos, en
realidad representan las defensas que nuestro cuerpo activa contra los agentes extraños o
dañinos.
Defensa celular
respuesta innata, y los responsables de activarla son los leucocitos, especialmente los
fagocitos.
Si el antígeno consigue traspasar las primeras barreras y se encuentra con las células del sistema
innato, estas lo captan, lo procesan y lo presentan al exterior para que las demás células lo
reconozcan como extraño y lo eliminen si se dan con él.
179
Lo que trataremos en esta última unidad es la presentación del antígeno en la superficie celular.
Este proceso se lleva a cabo mediante el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), en
inglés MHC (Major Histocompatibility Complex).
De este modo, en los apartados que siguen revisaremos el CMH tanto a nivel molecular como
genético, y también detallaremos las diferentes técnicas para su estudio y utilidad en el

campo de la investigación médica.
Aunque el trasplante de órganos y tejidos es sin duda uno de los grandes logros de la medicina
moderna, durante siglos solo se lo concebía en el contexto de mitos, leyendas o milagros. No
fue hasta bien avanzado el siglo XX que se establecieron las bases inmunológicas del rechazo
y la tolerancia tisular, trabajando con implantes en la piel para tratar quemaduras cutáneas.
Además, durante la Segunda Guerra Mundial se descubrió que el sistema inmune diferenciaba
tejidos propios y ajenos y que era capaz de atacar o destruir injertos procedentes de individuos
genéticamente diferentes.
Inicialmente no se conocía el papel de las moléculas, cuáles eran tolerantes y cuáles no. Así
que el enigma se resolvió cuando se comprobó la función biológica de los antígenos CMH en la
presentación de antígenos al linfocito T para el inicio de la respuesta adaptativa.
El complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) es un conjunto de genes cuyos productos

(las moléculas que codifican) están implicados en la presentación de antígenos a los linfocitos,
y en la diferenciación de lo propio y lo ajeno en el sistema inmunitario, es decir, tienen la
capacidad de aceptar o rechazar los injertos de otros individuos.
Estos genes están dispuestos a lo largo de un segmento continuo y largo del ADN, en el
cromosoma 6 humano. Para la especie humana, el complejo se denomina HLA (antígenos
leucocitarios humanos o Human Leukocyte Antigen).
Imagen del cromosoma 6 humano, con una ampliación de su complejo mayor de histocompatibilidad.
Las moléculas HLA son glicoproteínas (proteínas conjugadas con componentes no proteicos,
como son los hidratos de carbono) que pertenecen a la familia de las inmunoglobulinas y se
dividen en dos clases:
en todas las células nucleadas.
Aunque una molécula de HLA puede unirse a varios péptidos diferentes, cada molécula
180
presenta solamente una hendidura para un único péptido (molécula formada por la unión
de varios aminoácidos mediante enlaces peptídicos). Esta propiedad es necesaria porque la
cantidad de antígenos que existen es mucho mayor que el número de moléculas HLA.
Estas moléculas hacen posible su unión a péptidos estructuralmente diferentes gracias a que
la hendidura de unión entre ellos es bastante flexible. La unión péptido-HLA es una interacción
saturable y no covalente, esto significa que se trata de uniones hidrófobas y de puentes de
hidrógeno.
Una de las funciones del sistema inmune es que comprueba constantemente la superficie de
las células. Y las moléculas HLA ayudan a las células inmunes a segregar las células normales
de aquellas alteradas o infectadas. En caso de que exista algún defecto en los genes de HLA
es cuando pueden desarrollarse enfermedades autoinmunes.
1.1. HLA de clase I
En este subapartado se exponen la estructura y la función de la clase I de HLA.
1.1.1. Estructura
La estructura molecular de HLA de clase I consta de:
antigénico para ser presentado.
un polipéptido que se asocia de manera no covalente a las moléculas CMH de clase I.
1.1.2. Función
Efectivamente, las proteínas HLA de clase I se encuentran en las células nucleadas del organismo
y presentan antígenos originados en el citoplasma. Estos antígenos incluyen proteínas propias,
181
además de proteínas exógenas, que son las que se generan dentro de la célula (por ejemplo,
las proteínas virales).
Cuando la proteína es procesada, se presenta en la superficie celular mediante HLA para que sea
reconocida por el sistema inmune. La clase I de HLA es reconocida por linfocitos T citotóxicos
(CTL), los cuales expresan la molécula CD8, que es capaz de unirse a HLA de clase I.

1.2. HLA de clase II
En este subapartado se exponen la estructura y la función de la clase II de HLA.
1.2.1. Estructura
La estructura de HLA de clase II es parecida a la de clase I. También está compuesta por:
Estructura HLA de clase I y clase II.
1.2.2. Función
182
lo que ocurre con las de la clase I, ambas cadenas están codificadas por genes del HLA. Estas
moléculas se expresan solo en las células presentadoras de antígenos (macrófagos, células
dendríticas y linfocitos B).
La molécula HLA de clase II presenta proteínas exógenas de origen extracelular, como son
las bacterias.
Las proteínas de un patógeno se degradan cuando este se encuentra con moléculas de HLA. La
forma de degradación es en fragmentos de péptidos, y ocurre gracias a la acción de la CPA. Son
presentados a través del complejo CMH II en la superficie extracelular.
Los linfocitos T disponen en su membrana de miles de copias del receptor llamado (denomi-
nado TCR, T Cell Receptor) para el reconocimiento específico del antígeno.
Sin embargo, el TCR no puede reconocer directamente al antígeno, sino que este tiene que ser
previamente procesado y los péptidos resultantes presentados por una célula presentadora
de antígeno (célula dendrítica mieloide, macrófago o linfocito B) unido a una molécula CMH
(CMH-I o CMH-II).
El conjunto péptido/CMH-I es reconocido por los linfocitos Tc (CD8+). Se trata de
péptidos intracelulares procesados. Pueden ser péptidos procedentes de proteínas
propias, o de patógenos intracelulares si esa célula está infectada.
El conjunto péptido/CMH-II es reconocido por los linfocitos Th (CD4+). Se trata de
péptidos procedentes de antígenos exógenos de patógenos que han penetrado en la
célula por endocitosis.
Cabe destacar el papel de las moléculas de HLA clase I en la lucha contra las infecciones
vira-les, mientras que las de clase II son importantes para infecciones virales y también
bacterianas.
En el cuadro siguiente se resumen los rasgos definidores de cada tipo.
HLA-I HLA-II
En células presentadoras de antígeno:
Localización/células En todas las células nucleadas.
macrófagos, células dendríticas, linfocitos B.
Estructura
Antígenos originados en el citoplasma,

¿Qué presenta? Antígenos de origen extracelular (bacterias).
tanto propios como exógenos (virus).
Linfocitos T colaboradores y linfocitos T
Linfocitos T citotóxicos mediante la
¿A qué presenta? citotóxicos mediante la unión a la molécula
unión a la molécula CD8.
CD4.
Respuesta que activa Respuesta celular citotóxica. Respuesta humoral y/o celular.
1.3. Genética de HLA
183
En los humanos, todos los genes HLA se localizan en el brazo corto del cromosoma 6 (excepto
expresan en
codominancia.
La codominancia es la relación entre dos versiones de un mismo gen. Las personas recibimos
una versión de un gen, llamada alelo, de cada progenitor. Si los alelos son diferentes,

normalmente se expresará el alelo dominante, mientras que el efecto del otro alelo, llamado
recesivo, quedará enmascarado.
En otras palabras, la codominancia es un tipo de herencia en la que no hay ningún carácter

dominante sobre otro; ambos se expresan en igualdad de condiciones.
En esta región del cromosoma 6, el brazo corto donde se encuentran los genes de HLA, se
distinguen tres clases llamadas locus: clase I, clase II y clase III.
El locus (que es una palabra latina) representa el lugar específico de un cromosoma donde se
localiza un gen/alelo. El plural de locus es loci.
El conjunto de genes del HLA es el más polimórfico del genoma humano. Los genes
polimórficos son aquellos cuya secuencia de nucleótidos varía con relativa frecuencia entre
los individuos de la población. El concepto de polimorfismo refiere a la existencia de múltiples
alelos en un locus de gen.
La nomenclatura de todos los alelos debe estar estandarizada para que la información pueda
ser interpretada y compartida por los investigadores. Tras numerosas modificaciones, se
acordó que el nombre de los alelos se formara por el prefijo “HLA-”, seguido por el nombre del
gen, cuatro campos numéricos y, ocasionalmente, una letra, con distintos separadores entre
todos ellos.
La herencia del HLA
Los alelos del HLA que tiene un individuo concreto en un cromosoma constituyen un haplotipo.
Un haplotipo es un grupo de genes que se heredan en bloque, sin apenas recombinación.
Esto significa que cada uno de los progenitores aporta un bloque de haplotipo correspondiente
a un cromosoma. La herencia es:
Autosómica o no ligada al género (masculino o femenino), ya que el HLA está en un gen
autosómico (no se encuentra en el cromosoma X ni en el Y).
Monofactorial, porque la expresión de las moléculas depende de la transmisión de un
solo gen. Por ejemplo, si un individuo tiene el alelo B7 en un locus B, expresará la proteína
B7, independientemente del alelo que haya en el locus B del cromosoma homólogo.
Dominante. Los haplotipos de ambos progenitores se expresan en la membrana celular
del descendiente, lo que demuestra que existe codominancia entre ellos.
1.3.1. HLA de clase I

Los tres genes clásicos
Y los genes no clásicos son MIC-A, MIC-B, HLA-E, HLA-G, HLA-F y HFE. Estos codifican por
proteínas homólogas a HLA y también se relacionan con la presentación de antígenos.
184
La presentación de antígenos es el proceso durante el cual determinadas células del

organismo (células presentadoras de antígenos) expresan el antígeno sobre sus membranas de
forma que pueda ser reconocido por los linfocitos. En cambio, el procesamiento de antígenos
es un proceso de transformación que experimenta un antígeno para que pueda ser reconocido
por los linfocitos.
1.3.2. HLA de clase II

Dentro de la clase II, existen 3 regiones: HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR.
Sumado a todo lo anterior, debemos destacar que hay dos propiedades de las moléculas HLA
que hacen difícil a los patógenos evadir una respuesta del sistema inmune:
La molécula HLA es altamente poligénica. Es decir, que contiene varios genes para HLA
de clase I y de clase II, por lo que cada individuo posee un grupo de molécula HLA con
Debemos tener presente que poligénico hace referencia al rasgo fenotípico (o

enfermedad) causado por la acción conjunta de varios genes.
Esto quiere decir que existen múltiples
variantes de cada gen desde una perspectiva de la población global.
Por lo general, se contabilizan más de 3.000 alelos para los genes de HLA, tanto de clase I
como de clase II. Cada alelo se encuentra en la población en diferentes frecuencias; esto hace
que encontrar el mismo alelo en ambos cromosomas en un individuo (fenómeno llamado
homocigoto) sea poco común. Así pues, la mayoría de la población es heterocigota.
La expresión de los alelos de HLA es codominante. Ambos alelos, uno paterno y otro materno,
se expresan en la célula y tiene la capacidad de presentar los antígenos a los linfocitos T. Esta
variabilidad permite que un patógeno potencialmente letal para un individuo no pueda evadir
el sistema inmune a nivel poblacional.
1.3.3. HLA de clase III

Los genes de esta región codifican, además de otros productos, varias proteínas con funciones
inmunitarias, como los componentes del complemento C4, C2 y factor B, el TNF (factor de
necrosis tumoral) y otras citocinas proinflamatorias, y proteínas del estrés.
Las moléculas codificadas en esta región, aunque son críticas para la función inmune, no tienen
nada en común con las de la clase I ni con las de la clase II.
Regiones HLA clase I, clase II y clase III.
185
2. Estudios de
histocompatibilidad
Los estudios de histocompatibilidad son importantes en la determinación de la variación
genética y de fenómenos inmunológicos involucrados en varias patologías.
Dadas las funciones de las moléculas CMH, es evidente que su estudio es imprescindible en los
trasplantes, para evitar rechazos. Aun así, la histocompatibilidad también tiene aplicaciones en
otros ámbitos, como las pruebas de paternidad o ciertos estudios antropológicos, tal y como
veremos más adelante.
En este punto, recordamos que el término histocompatibilidad hace referencia a la semejanza

entre dos o más tejidos a nivel genético e inmunológico. Un ejemplo sería el sistema ABO
sanguíneo y HLA.
La tecnología de estudio del HLA ha avanzado considerablemente en los ámbitos serológico y

molecular. Algunas técnicas, como la reacción de la cadena de la polimerasa han hecho posible
tipificar el HLA a nivel de ADN, dejando de lado inespecificidades o reacciones cruzadas que
pueden aparecer cuando se utilizan otros métodos.
186
serológica HLA
Las más comunes son la técnica de la microlinfocitotoxicidad, las pruebas cruzadas y la

detección de anticuerpos anti-HLA.
2.1.1. Microlinfocitotoxicidad
Es una técnica desarrollada en 1964 por Paul Terasaki, un científico norteamericano experto
en tecnología de trasplante de órganos humanos.
Consiste en exponer linfocitos de la persona en estudio a un panel de antisueros

debidamente caracterizados, donde están incluidos los diferentes tipos de HLA. Seguida-
mente, se agrega suero de conejo como fuente de complemento, que se unirá y provocará lisis
en las membranas de linfocitos que hayan reaccionado con los antisueros.
El ensayo de Terasaki se aplica para las moléculas HLA de clase I siguiendo la técnica que se
expone a continuación. En el caso de las moléculas HLA de clase II existen métodos serológicos
similares, pero previamente hay que separar los linfocitos B de los T, dado que solo los LB,
como células presentadoras que son, expresan los antígenos HLA de clase II.
La técnica de microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki se basa en enfrentar linfocitos T
y B de la persona cuyo HLA hay que tipificar a una batería de sueros con anticuerpos anti-HLA
con capacidad para reconocer todos los antígenos HLA de clase I que se pretenda detectar.
Básicamente, sirve para detectar la compatibilidad de dos individuos, el donante y el receptor.
Procedimiento
El procedimiento se realiza en placas Terasaki de 60 pocillos, aplicando los siguientes pasos:

1. Dispensar cada uno de los sueros anti-HLA disponibles en pocillos independientes de
la placa.
2.
30 minutos a temperatura ambiente para que los anticuerpos (anti-HLA) se unan a los
3. Añadir el complemento (suero de conejo) e incubar durante una hora a temperatura

ambiente (o 20 minutos a 37 ºC). El complemento se unirá y activará en los pocillos en
que se hayan formado inmunocomplejos (Ag HLA-Ac anti-HLA), y no lo hará en el resto.
4. Añadir el colorante vital azul tripán y dejarlo actuar durante 10 minutos. El colorante
teñirá los linfocitos muertos porque las alteraciones que presentan en la membrana le
permiten penetrar en ellos; no teñirá los linfocitos vivos porque sus membranas están
intactas.
187
5. Realizar la lectura de células vivas y muertas al microscopio invertido. En los pocillos en
que se observen células teñidas, el resultado será positivo: el anti-HLA de ese pocillo
habrá reconocido el correspondiente antígeno HLA en la membrana de los linfocitos y
se habrá producido la lisis celular.
También se puede hacer la lectura con colorantes fluorescentes o sin colorantes, utilizando un
microscopio de contraste de fases.

Placa de Terasaki.
Es conveniente hacer varios controles durante el ensayo:

incluye linfocitos + complemento, para controlar la posible toxicidad
del complemento.
como control de la actividad del complemento.
Un resultado negativo es indicativo de que el receptor no tiene anticuerpos anti-HLA frente al

donante. La reacción se cuantifica en función del porcentaje de células muertas, por lo que la
viabilidad celular inicial es indispensable.
Es posible, sin embargo, que en la prueba ocurran reacciones débiles, de modo que no
lisan a todas las células positivas para el antígeno/molécula en cuestión. Al leer los pocillos
al microscopio se asigna una “puntuación” orientativa a cada uno de ellos a partir de estos
parámetros y consideraciones:
% células lisadas Puntuación Interpretación

0-10 1 Negativo
10-20 2 Negativo dudoso
20-50 4 Positivo débil
50-80 6 Positivo
80-100 8 Positivo fuerte
188
El tipaje HLA es el nombre que recibe la determinación de las especificidades HLA de una
persona. Se puede realizar por métodos serológicos (microcitotoxicidad en placa), bioquímicos
o genéticos (PCR).
2.1.2. Pruebas cruzadas (Cross-match)

El objetivo de estas pruebas es determinar la presencia de anticuerpos específicos contra

alelos del HLA en suero de pacientes en lista de espera para trasplante.
La presencia de estos anticuerpos séricos dirigidos específicamente contra los alelos HLA de un
posible donante es fundamental para decidir si el trasplante se realiza o no: su presencia puede
provocar un rechazo hiperagudo.
Por ello, antes de que se efectúe el trasplante, es obligatorio evaluar la presencia de anticuerpos
específicos respecto al donante, lo cual se hace mediante la prueba cruzada entre el suero del
receptor y las células del donante.
Si existen anticuerpos anti-HLA en el receptor del trasplante, estos se unen a células endoteliales
del órgano trasplantado y se produce la activación del complemento, lo que se traduce a
inflamación y trombosis, con destrucción del órgano (hipersensibilidad tipo II).
La presencia de estos anticuerpos anti-HLA se puede producir durante el embarazo, por

transfusiones sanguíneas o trasplantes anteriores. Por tanto, es necesario efectuar controles
periódicos sobre los sueros de los pacientes en lista de espera para trasplantes, especialmente
cada vez que reciben una transfusión o después de que hayan rechazado un injerto.
Esquema del rechazo.
Procedimiento
En las horas previas al trasplante se realiza una prueba cruzada, que consiste en el ensayo de
citotoxicidad que enfrenta el suero del paciente con las células del donante.
Se observa si se produce la lisis de las células mediada por complemento, entendiendo que:
Una lisis superior al 20 % se considera prueba cruzada positiva. En trasplante está
189
contraindicado.
Una lisis inferior al 20 % se considera prueba cruzada negativa. El trasplante es viable.
La detección de los anticuerpos anti-HLA puede realizarse por la técnica de microlinfocitotoxi-

cidad en placas de Terasaki, o por citometría de flujo.

Los falsos positivos
En los casos en que la prueba cruzada da un resultado positivo se debe descartar la presencia
de autoanticuerpos (no-HLA) porque pueden dar lugar a falsos positivos.
Para confirmar un positivo, se trata el suero del receptor con un agente reductor, como el
ditiotreitol, que inactiva las IgM. A continuación, se repite la prueba.
Si persiste el resultado positivo
de IgG anti-HLA y, por tanto, el trasplante estaría contraindicado.
Si se obtiene un resultado negativo, el positivo anterior se puede atribuir a los
autoanticuerpos (IgM). El trasplante es viable.
2.1.3. Detección de anticuerpos

citotóxicos anti-HLA (PRA)
La monitorización periódica de la presencia de anticuerpos anti-HLA en el suero de pacientes en
lista de espera para trasplante es uno de los grandes avances en los laboratorios especializados
en pruebas de histocompatibilidad.
Se efectúa evaluando el porcentaje de reactividad de los sueros frente a células de un panel

(PRA, panel reactivity antibody). Ese panel celular linfocitario es representativo de los antígenos
HLA de la población; en general, las células proceden de 20 individuos heterocigotos, de
manera que se dispone de 40 alelos de cada locus.
La presencia de anticuerpos anti-HLA linfocitotóxicos en el suero de un paciente en espera de

trasplante resulta en frecuentes positivos en las pruebas cruzadas. A mayor PRA, menores
oportunidades de ser trasplantado.
Es habitual que los pacientes que llevan tiempos prolongados en las listas de espera para
trasplante exhiban altos porcentajes en sus PRA, debido a que es frecuente que hayan
recibido varias transfusiones de sangre o incluso algún trasplante previo. Esto hace que las
oportunidades de encontrar un donante compatible se reduzcan notablemente para estas
personas.
La PRA también se denomina cross-match contra panel (como la prueba cruzada) y suele
realizarse en placas de Terasaki. Se enfrenta suero del receptor con células de sangre periférica
190
de diferentes individuos cuyos alelos del HLA sean representativos de la población. Después
de la incubación, se añade el complemento y se efectúa la lectura como en la técnica de
microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki explicada en el apartado anterior.
Mediante esta técnica se calcula el porcentaje de células que son lisadas en el ensayo, lo que
es equivalente al número de alelos contra los cuales el paciente posee anticuerpos específicos,
expresado como porcentaje respecto del número total de alelos analizados en el ensayo. Se
calcula así el PRA, que aporta información acerca de la probabilidad de éxito o fracaso de un
trasplante.
Otros métodos disponibles para la detección de anticuerpos citotóxicos anti-HLA, a parte de

los expuestos anteriormente, son:
en este caso, se requiere separar las poblaciones de
linfocito T y B.
determina la presencia de anticuerpos frente a moléculas presentes en los linfocitos.

Recuerda que un es una sustancia que tiene la propiedad de convertir en
ELISA: sirve para detectar anticuerpos presentes en un suero capaces de reconocer

2.2. Técnicas moleculares
El sistema HLA es uno de los sistemas genéticos más ampliamente utilizados y estandarizados.
En los estudios de histocompatibilidad, la tipificación de los genes debe realizarse de una forma
específica y concreta con el fin de contemplar todas las variantes alélicas conocidas.
Así, los estudios que más se llevan a cabo para los genes de las clases I y II son los moleculares,
que forman parte de la biología molecular.
Todas las técnicas moleculares se basan en la amplificación de fragmentos de ADN mediante

el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de modo que detectan polimorfismos
directamente en la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica dichos antígenos.
Con su aplicación de ha conseguido lo que se ha denominado la tipificación de alta resolu-

ción.
Dentro de esta disciplina, las técnicas de investigación más usadas son: SSP, SSOP y Luminex.
2.2.1. PCR-SSP
La SSP (Sequence Specific Primers) se trata de una amplificación enzimática, una variante
de otra técnica denominada PCR, la cual sirve para amplificar un segmento de ADN. La
191
metodología del SSP consiste en la amplificación enzimática del ADN mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), pero con primers específicos para cada alelo.
En otras palabras, corresponde una secuencia específica para cada alelo de un locus en
concreto, por lo que solo se aumentará y se detectará el alelo en cuestión. Así, los productos
amplificados se someten a electroforesis. Se tiñen con bromuro de etidio y se fotografían
bajo luz ultravioleta, de modo que se detecta la presencia o ausencia de un determinado alelo

a través de la presencia o ausencia de una banda visible. Es una técnica rápida, de resolución
mediana y cuyo resultado se obtiene en 24 horas.
Recuerda que primer, o cebador, es una cadena corta de oligonucleótidos específica a una
cadena de ADN. Es el punto de partida para la síntesis en la PCR.
Además, la razón por la que se usa bromuro de etidio es porque es una sustancia que
se intercala en el ADN; si se expone a luz ultravioleta, emite una luz roja anaranjada que se
intensifica unas 20 veces después de haberse unido a una cadena de ADN.
La polimerasa es una enzima capaz de transcribir o replicar ácidos nucleicos. Son

imprescindibles en la división celular (ADN polimerasa) y en la transcripción del ADN (ARN
polimerasa).
2.2.2. PCR-SSOP
La SSOP (Sequence Specific Oligonucleotide Probes) es una PCR de la región polimórfica
del locus y se hibrida con oligonucleótidos marcados con fosfatasa alcalina y revelado con
autorradiografía (denominada dot blot), lo que permite conocer los pacientes que son positivos
para los alelos estudiados.
Cabe señalar que los oligonucleótidos son una secuencia corta de ADN de cincuenta pares de
bases o menos.
El SSOP consiste en la amplificación del ADN por PCR de la región polimórfica del locus sujeto
a estudio. Se utilizan sondas de oligonucleótidos cortos; cada uno hibridará a la secuencia
complementaria, donde la diferencia de un simple par de bases hace que no exista hibridación.
Esto permite una mayor discriminación alélica para los alelos HLA en estudio.
La hibridación es el proceso mediante el cual se asocian dos moléculas con cierto grado de
complementariedad.
2.2.3. Luminex
Luminex: se trata de una técnica relativamente nueva. Está basada en SSOP y combina los
beneficios de los análisis múltiples con la sensibilidad del citómetro de flujo. Además, permite
estudiar el HLA de las clases I y II de hasta 96 pacientes a la vez.
192
3. Aplicaciones de
los estudios de
histocompatibilidad
A día de hoy, la tecnología ha permitido hacer investigaciones de histocompatibilidad muy
precisas en el estudio del ADN y de los alelos de clase I y II. Así pues, el objetivo de analizar los
anticuerpos en pacientes es evitar el rechazo por incompatibilidad inmunológica.
Además de la importancia vital que tiene la tipificación HLA en la medicina de los trasplantes
y en la evaluación de la asociación HLA-enfermedad, el alto polimorfismo del sistema se ha
convertido en un instrumento muy útil para campos tan dispares como la antropología y la
medicina forense.
Las aplicaciones de los estudios de histocompatibilidad tienen interés especialmente en varios

campos, entre los cuales figuran:
Estudios de histocompatibilidad en trasplantes.
Estudio de paternidad.
Estudios antropológicos para establecer relaciones entre poblaciones o grupos étnicos.
193
Estudio de asociación de alelos del CMH con enfermedades o susceptibilidad de padecer
ciertas enfermedades.

3.1. Trasplantes de órganos

En cuanto a los trasplantes de órganos, la compatibilidad HLA juega un papel fundamental. El
estudio de los genes HLA y de los anticuerpos presentes posibilitan el control de los mecanismos
inmunológicos en los trasplantes: si no hay tasas de anticuerpos anti HLA, la evolución del
injerto será mejor.
Hay varios tipos de trasplante:

el más predominante es el trasplante renal, en el que
uno de los grandes factores de riesgo inmunológico para la mala evolución del receptor
es la incompatibilidad HLA, así como anticuerpos citotóxicos elevados. En el resto de los
trasplantes (cardiaco, hepático pulmonar, pancreático) la compatibilidad de los genes HLA
se asocia a la supervivencia del injerto (evitándose el rechazo).
Trasplantes de médula ósea: este tipo de trasplantes solo se pueden hacer si el donante
y el receptor coinciden en la región HLA, es decir, si tienen iguales los genes de clase I
(HLA-A, B, C) y de clase II (DRB, DQA, DQB, DPA, DBP). Con esto, se evita el rechazo del
injerto o una posible reacción adversa del injerto contra el nuevo huésped.
194
3.1.1. El injerto
La principal limitación en el trasplante de órganos es el fracaso por rechazo, que implica la
destrucción del injerto del donante por parte del sistema inmune del receptor. Esto hace que
el órgano del donante acabe perdiendo su capacidad funcional en el organismo del receptor y
pone en riesgo la vida de éste.
Hay cuatro tipos de injertos:

el tejido procede del mismo individuo en el que se trasplanta. En este caso
no hay riesgo de rechazo porque las células trasplantadas expresan las mismas moléculas
HLA que las demás células del receptor.
el trasplante se realiza entre individuos con la misma información genética, es
decir, gemelos univitelinos. Ocurrirá lo mismo que el caso anterior.
el trasplante se realiza entre individuos de la misma especie, pero con
información genética distinta. En este caso habrá moléculas del injerto que serán
reconocidas como extrañas por el receptor (aloantígenos), cuyo sistema inmunitario
generará aloanticuerpos para que reaccionen con ellas. Para el sistema inmunitario del
rechazo.
el trasplante se realiza entre individuos de especies diferentes. Se aplica en
casos muy concretos. Por ejemplo, en odontología se usa membrana de colágeno porcino
biodegradable o hueso de bovino.
3.1.2. La compatibilidad
La mayor compatibilidad entre donante y receptor se asocia a una mejor supervivencia del
trasplante. Por tanto, es imprescindible seguir un protocolo adecuado que permita seleccionar
el receptor más compatible y minimizar el rechazo en lo posible.
Una mejor identificación de los alelos en comparación con la información que proporcionan
los métodos serológicos sirve para una mejor selección de las parejas donante-receptor
compatibles.
3.1.3. El rechazo
195
El rechazo de tejidos ocurre porque los linfocitos T del receptor pueden detectar y activarse
contra los antígenos de histocompatibilidad del donante, a través de dos vías: directa e
indirecta, dependiendo de si están implicas las células presentadoras de antígeno (CPA) del
donante o del receptor.
Recordemos que para la activación de un LT es necesario que una célula presentadora (CPA) le

haga la presentación del antígeno, como un péptido unido a una forma alélica determinada de
una molécula CMH.
En la activación (presentación normal) de linfocitos T, lo que reconoce el TCR es el conjunto

CMH propio/péptido extraño.
3.2. Estudios de paternidad

La genética forense utiliza la variabilidad genética como método de identificación de indivi-
duos para resolver, entre otros, casos de investigación biológica en parentesco y criminalística.
Las pruebas de paternidad se realizan gracias al estudio comparativo del ADN, lo que permite
conocer la relación genética que existe en dos individuos.
Tal y como hemos comentado anteriormente, cada uno de nuestros progenitores nos pasa una
serie de antígenos HLA únicos mediante el fenómeno de la codominancia.
En las primeras pruebas de paternidad que se realizaron, se podía descartar el padre biológico
con una probabilidad del 100 % si este tenía otros genes diferentes a los que había heredado
el hijo. Recientemente, se llevan a cabo técnicas de estudio no vinculadas a esta región del
genoma humano que ofrecen una probabilidad del 99,9999 % para afirmar la paternidad
entre individuos.
Actualmente, los polimorfismos de ADN de mayor utilización en medicina forense se basan en

el ADN repetido en tándem y se emplean los denominados minisatélites y microsatélites, que
consisten en repeticiones de fragmentos de ADN de número variable.
Las repeticiones en el ADN microsatélite son de pequeño tamaño (de 2 a 6 pares de bases) por
lo que suelen recibir el nombre de Short Tandem Repeats (STR).
3.3. Estudios antropológicos

El sistema HLA también se usa en el ámbito de la antropología genética, que se encarga del
estudio de hallazgos arqueológicos.
El motivo por el cual se estudian los genes en las muestras arqueológicas encontradas es
la individualización de las poblaciones, es decir, poder determinar diferentes caracteres
polimórficos de distintas etnias o grupos humanos con una gran precisión y especificidad.
Así pues, el HLA es ideal para los estudios poblacionales ya que se trata de un sistema
196
polimórfico con grandes diferencias de frecuencias alélicas entre grupos humanos.
Como ya se ha comentado, los antígenos se heredan como haplotipos completos en forma

codominante, por lo que la recombinación no es frecuente en estos alelos. Este patrón de
herencia favorece desequilibrios genéticos que provocan mayores frecuencias de un haplotipo
particular (desequilibrio de ligamiento) en una población, del que se esperaba teóricamente
por las leyes probabilísticas de la genética de poblaciones.
Los resultados de los estudios de distribución de frecuencias haplotípicas permiten conocer

cuáles son los alelos más frecuentes en determinados grupos de población, por ejemplo,
hispanos, latinoamericanos y caucásicos.
De igual modo, se sabe, mediante estudio HLA, que las poblaciones polacas, rusas, rumanas y
alemanas judías son más homogéneas que los europeos no judíos, o que las poblaciones de
Oriente Próximo constituidas por turcos, armenios, libaneses y árabes.
Los estudios haplotípicos también aportan información sobre las migraciones y el mestizaje.
Así, puede realizarse el seguimiento de las migraciones de un territorio estudiando la frecuencia
de determinados alelos en su población.
La amplia heterogenicidad en los haplotipos HLA confirma, pues, las mezclas genéticas con
las poblaciones inmigrantes a lo largo de la historia. Para la investigación de esta evolución
histórica de la humanidad, los estudios moleculares de frecuencias alélicas de HLA permiten
construir árboles filogenéticos que muestran la divergencia o las relaciones poblacionales a
partir de estas comunidades humanas particulares.
3.4. Asociación de alelos del
CHM con enfermedades
Por último, es conveniente destacar la importancia de estos genes en el estudio de la
susceptibilidad a determinadas enfermedades inmunológicas.
Las investigaciones muestran la predisposición genética sobre enfermedades autoinmunes.

Así, es posible clasificar las enfermedades en función de su asociación con los genes de clase
I o clase II.
En general, las enfermedades asociadas al HLA tienen cronicidad y se asocian a alteraciones

de procesos inmunológicos, especialmente del tipo autoinmune, o a procesos de etiología
desconocida (como la narcolepsia).
Dentro del grupo de enfermedades asociadas con HLA de clase I encontramos:
esqueléticos, que produce dolor axial y rigidez, dolor dorso-lumbar y reducción de la

movilidad. Se asocia al gen HLA clase I: HLA-B*27.
Psoriasis
de placas rojas en varias partes del cuerpo. Se asocia a genes de la región HLA- clase I:
HLA-C*06.
197
causa desconocida. Se asocia a los alelos HLA-B*51 y HLA-B*57.
Dentro del grupo de enfermedades asociadas con HLA de clase II encontramos:
provocada por la ingesta del gluten. Los alelos que presentan susceptibilidad de padecer

esta enfermedad son DQA1*0501 y DQB1*02:01 para HLA-DQ2; y DQA1*03:01 y DQB1*03:02
para HLA-DQ8.
también conocida como diabetes mellitus insulinodependiente
para mantener los niveles de glucosa. Los alelos de los diferentes locus con los que se
relaciona son DRB1*03, DQA1*05:01, DQB1-02:01 o DRB1*04, DQA1*03:01, DQB1*03:02.
Esclerosis múltiple
la desmielinización de las neuronas que afecta al sistema nervioso. Se asocia al alelo
DRB1*15:01.
es un desorden neuronal del sueño caracterizado por el exceso de sueño
diurno, entradas repentinas en la fase REM y, en la mayoría de los casos, cataplejía
(pérdida del tono muscular de manera repentina). Se asocia los genes HLA-DRB1*15:01 y
HLA-DQB1*06:02.
Además del elevado polimorfismo de algunos de estos genes y del fuerte desequilibrio de
ligamiento existente entre ellos, el carácter multifactorial de muchas de estas enfermedades
dificulta la determinación de la variante alélica implicada, así como su grado de participación
en la enfermedad.
De hecho, siempre existe la sospecha de que los factores responsables de estas patologías
puedan no residir en genes HLA, pero sí en otros directamente relacionados con ellos.
Finalmente, cabe destacar en los últimos años se está asociando el HLA con infecciones virales
y modificaciones de genes supresores de tumores como, por ejemplo, la asociación entre HLA-
DR1 y un tipo de carcinoma de tiroides, o entre el antígeno HLA-DQw3 y el carcinoma cervical
de células escamosas.
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Técnicas de inmunodiagnóstico

2. Técnicas de aglutinación .......................................................................... 8

3. Técnicas de inhibición de la aglutinación ................................................. 12

4. Técnicas de precipitación en medio líquido ............................................. 13

7. Diagnóstico y seguimiento serológico de enfermedades infecciosas ..... 22

Estudiar las técnicas de aglutinación y las técnicas de la inhibición de la aglutinación.

Estudiar las técnicas de precipitación en medio líquido y las técnicas de precipitación

Estudiar el diagnóstico y seguimiento serológico de las enfermedades infecciosas.

1.1. ¿Qué es el sistema

TÉCNICO SUPERIOR EN LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO

Las células linfoides o linfocitos son la base celular de la respuesta inmunitaria.

El organismo responde ante un agente extraño mediante sus mecanismos inespecíficos de

rápida ante una nueva entrada de ese mismo antígeno.

En general, la respuesta de anticuerpos implica una sucesión de cuatro fases:

2. Fase exponencial. La concentración de anticuerpos en suero aumenta de forma loga-

3. Fase de meseta. Se mantiene el nivel de anticuerpos mientras que persiste la estimula-

4. Fase de disminución. Consecuencia de que los anticuerpos van neutralizando al antí-

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bentonita (arcilla), gelatina, etc.

Si la partícula utilizada en la aglutinación es un hematíe, se conoce como una reacción de

Para que la reacción de aglutinación se produzca correctamente, es preciso que la concentración

Sin embargo, el principal inconveniente es que no proporcionan la capacidad de cuantificar,

- El medio en que ocurre la unión debe poseer viscosidad y fuerza iónica

- El grado de sensibilidad permisible y la detección de gran diversidad de

- La temperatura no influye prácticamente en las pruebas.

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-Si se trata de exceso de antígenos, tampoco se forman, porque cada

En materia de utilidad clínica, la aglutinación se suele emplear en enfermedades infecciosas,

2.2. Las técnicas de

En el caso de la aglutinación indirecta, el antígeno no forma parte de una partícula; lo que se

También existe la aglutinación indirecta reversa, que es lo contrario: se trata de fijar el

2.2.1. Aglutinación directa o activa

Tal y como hemos apuntado en la sección anterior, el antígeno es particulado, es decir, es

Algunos ejemplos de uso son el tipado de grupos sanguíneos, el serotipado de bacterias

2.2.2. Aglutinación indirecta o pasiva

Un ejemplo de este tipo de pruebas es la aglutinación que se genera al poner en contacto

Se denomina sensibilización al proceso mediante el cual las partículas son recubiertas de

Si el anticuerpo está saturado con el antígeno soluble presente en la muestra no se producirá

Por el contrario, si el antígeno soluble no se encontraba en una concentración suficiente como

Se puede cuantificar el antígeno soluble mediante la realización de diluciones seriadas del

Cuando la técnica emplea hematíes como partículas aglutinantes, se denominan reacciones

La hemaglutinación se debe a la capacidad que tienen algunos virus y bacterias de unirse a

En microbiología se usan las técnicas de inhibición para detectar anticuerpos frente a

Estas técnicas requieren un control cuidadoso de las concentraciones de anticuerpos para

En particular, las técnicas de precipitación se basan en la reacción de la precipitación que

La medición de la turbidez se puede llevar a cabo a partir de dos técnicas analíticas, la

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Cuando mezclamos cantidades suficientes de antígeno soluble con anticuerpos específicos, la

Tal y como se observa en la figura siguiente, al agregar concentraciones crecientes de antígeno

Cuando agregamos pequeñas cantidades de antígeno en un extremo de la curva de

precipitación, los complejos inmunes se forman en exceso de anticuerpo.

La reacción de precipitación depende de la valencia del anticuerpo y del antígeno. La valencia

Para que se pueda producir la interacción secundaria antígeno-antígeno con la consecuente

La dispersión de la luz depende de la longitud de onda de la luz, del tamaño de la partícula y

En la turbidimetría se mide la cantidad de luz absorbida, es decir, la cantidad de luz que no

TÉCNICO SUPERIOR EN LABORATORIO CLÍNICO Y BIOMÉDICO

Cuanto mayor es la luz absorbida (cuantificada en un espectrofotómetro en forma de

La nefelometría, entonces, se fundamenta en la medición de radiación dispersa; en cambio,

Cuando las partículas en suspensión son agregados de inmunocomplejos, esta técnica se

La intensidad de la luz dispersada es directamente proporcional a la cantidad de agregados

Así pues, en el momento en que un antígeno y un anticuerpo específico entran en contacto

Tanto en la inmunoturbidimetría como en la inmunonefelometría se mide la dispersión de la

En relación con las técnicas de precipitación, actualmente es más frecuente el uso de un

Las técnicas de precipitación en gel también son denominadas técnicas de precipitación