APLICACIONES RMN

RESONANCIA

Gradiente de campo → Los protones resonaran en un gradiente de frecuencias según donde estén.

▪ El que este en una posición donde llega un campo pequeño resonara a una frecuencia más pequeña.
▪ El que este en una posición donde llega un campo grande resonara a una frecuencia más grande.

No se tienen una frecuencia única para estos protones, sino una frecuencia que depende de la posición. Y si la
frecuencia depende de la posición, se puede generar un mapa de limites:

1. A más frecuencia más distancia

2. A mayor área más señal

En imágenes se controlan los tiempos, es decir el T2 y el T1.

La alternancia de los gradientes de campo (B) a direcciones ortogonales permite asignar una intensidad a cada par de
coordenadas cartesianas del plano.

La resonancia se utiliza en ocasiones clínica donde se observan determinados compuestos:

• Cerebro → Lípidos
• Resto del cuerpo → Agua

Donde la señal depende tanto de la movilidad de estos compuestos como de su abundancia.

PROCESOS DE RELAJACIÓN

Tenemos el espectro del 31P-RMN al que se le añade un ion paramagnético:

ION PARAMAGNÉTICO → Es un ion con propiedades magnéticas, con

muchos niveles de energía, e interacciona muy fuertemente con algo que
posee también propiedades magnéticas. Este ion baja el tiempo de
relajación, debido a que se está orientando en la dirección del campo e
interacciona fuertemente.

El ion paramagnético → disminuye la T2 y aumenta la anchura de la banda

ION DIAMAGNÉTICO → Es un ion que no posee propiedades magnéticas.

Cuando trato algo con un ion diamagnético no ocurre nada, solo hay
interacción con la carga, pero no con la anchura de banda, no interacciona
con el nivel de relajación.

En el espectro del fosforo 31 → +Cr(v) paramagnético, y el -Cr (v) diamagnético.

ESPECTRO DIFERENCIAL → COJO DOS

ESPECTROS Y LOS RESTOS, OBSERVO LAS
DIFERENCIAS. Si yo restara al espectro más
desarrollado con cromo (Cr), el que no
posee cromo, observaría como resultado,
esas 2 bandas que no me salen en el sin
cromo y la diferencia de anchura de la
banda principal entre las dos.

En RMN es muy práctico el espectro

diferencial, debido a la dificultad de los
espectros, ya que esta diferencia permite centrar y concretar la información.
INTERCAMBIOS QUÍMICOS

• Compuesto A banda característica

• Compuesto B banda característica

En un intercambio químico, ambos compuesto A y B, posee una velocidad de interconversión, ya que uno puede
convertirse en el otro, y a la inversa. Y además poseen una velocidad de relajación.

Para poder cuantificar la constante de equilibrio de esa reacción (Keq):

1. Si el proceso de interconversión es más rápido que el tiempo de relajación, los núcleos se relajan a la vez que se
interconvierten, entonces observamos un único pico, y la constante de equilibrio se calcula como el cociente de
𝜟𝜹𝑩
desplazamientos químico → 𝒌𝒆𝒒 = → 𝜹𝒊 = 𝜹𝑨 + 𝒇𝑨 + 𝜹𝑩 ⋅ 𝒇𝑩
𝜟𝜹𝑨

Si el equilibrio esta desplazada hacia A, observare una banda intermedia más cerca de A, si ese equilibrio esta
desplazado más hacia B, observaré una banda intermedia más cerca de B.

Si la constante de equilibrio fuese 1 (Keq = 1), la banda intermedia estaría en el medio de ambos compuestos, es
decir tanto tiempo en forma de A como tanto tiempo en forma de B cuando se relajan, en este caso habría la misma
cantidad del compuesta A que del compuesto B (A=B)

2. En cambio, si la relajación es más rápida que el proceso de interconversión, observamos 2 picos separados, como
𝑨𝒓𝒆𝒂 𝑩
si A y B se relajasen de forma independiente, y la constante de equilibrio es → 𝒌𝒆𝒒 =
𝑨𝒓𝒆𝒂 𝑨

EJEMPLO: TAUTOMERISMO
ESTUDIOS DE ESTRUCTURA Y FUNCIÓN DE PROTEÍNAS

ASIGNACIÓN DE PICOS

Como el RMN no sirve para proteínas de gran tamaño, para conocer sus estructuras, la lógica que aplicamos es por
pasos:

1. Buscamos espectros específicos en la proteína, como por ejemplo espectros de aminoácidos.

2. Comparación con espectros de RMN de aminoácidos. Buscamos aminoácidos que asignar a la proteína.
3. Intercambio H-D (precursores o en disolución)
4. Fragmentación proteolítica
5. Perturbación local con iones paramagnéticos
6. Perturbación local con iones paramagnéticos marcadores de espín
7. Modificación química y secuenciación
8. Comparación con espectros de mutantes
9. Empleo sistemático de desacoplamiento espín-espín

1. COMPARACIÓN CON ESPECTROS RMN DE AMINOÁCIDOS

“En el caso de la imagen, los H del NH3, no acoplan porque

forman parte del enlace amida de la proteína”

COSY

Un COSY es cuando en la transformada de Fourier se aplica un

pulso cercano a otro, es decir, muy cerca del inicio del pulso
anterior. Lo que muestra son las interacciones de los átomos
más cerca entre ellos, son las interacciones más rápidas. En el
COSY se observa lo mismo que en un monodimensional por
acoplamiento espín-espín, las interacciones por enlaces
covalentes. (TIEMPO CORTO)

NOESY

Cuando un pulso se aplica hacia el final del anterior pulso, en este caso
se muestran las interacciones a distancia. (TIEMPO LARGO)

2. INTERCAMBIO H-D

El intercambio de H con Deuterio permite observar el desplazamiento de los espectros. Se realizado un espectro
diferencial y se obtiene el resultado.

3. FRAGMENTACIÓN PROTEOLÍTICA

Utilización de compuestos como las PROTEASAS para fraccionar una cadena larga de proteína que da un espectro
complejo, para obtener una representación fraccionaria más fácil.
4. PERTURBACIÓN LOCAL CON IONES PARAMAGNÉTICOS → EJEMPLO DE LA VALINA

ASIGNACIÓN DE LAS RESONANCIAS DEL METILO DE LA VALINA 190 DE LA LISOZIMA

A través de la resonancia del metilo esencial de la Valina se intenta situar a este aminoácido en la
lisozima (proteína).

La valina posee un metilo acoplado a 6 protones iguales (2 CH3), y en el espectro este metilo sería el
único septuplete (7 bandas en el espectro)

Los valores que se nos presentan para el acoplamiento, es que en disolución hay dos resonancias debidas a los
protones de los grupos metilo con valores de 𝜹 de 0.96 y 1.02 ppm, y un doblete con J = 0.06

Con estos datos hay que conseguir saber dónde está la valina en el espectro, pero como se sabe que la lisozima une
metales, una aproximación para facilitar la “búsqueda”, seria introducir iones paramagnéticos en el centro activo que
favorecerían la relajación transversal, disminuyendo el tiempo de relación (T2) y produciendo un ensanchamiento
de las bandas de resonancia de los núcleos afectados.

Al introducir un ion paramagnético, siempre se debe realizar un control. Debido a que el

ion paramagnético posee 2 efectos, el de la carga que no observamos y que es
irrelevante para RMN, y el efecto debido al propio metal. Por tanto, se realiza un control
con un ion diamagnético, que posee la misma carga, pero no posee efecto magnético,
permitiendo a través de un espectro diferencial, descartar el efecto de las cargas y
observar únicamente el efecto magnético.

a. Ion no paramagnético (ion diamagnético)

b. Ion paramagnético
c. Espectro diferencial

La conclusión que obtengo son los dobletes que me identifican la resonancia de la

valina. → Desacoplamiento de los dos dobletes del espectro de diferencia (abajo)
irradiando para saturar la resonancia indicada por la flecha

5. PERTURBACION LOCAL CON IONES PARAMAGNÉTICO MARCADORES DE ESPÍN

Los marcadores de espín son principalmente radicales libres. Un radical libre es un electrón desapareado, que posee
un espín neto y son muy reactivos, afectando a muchas propiedades magnéticas del entorno. Esta técnica introduce
los radicales en la molécula y actúan de forma similar a los metales, como el caso
anterior.

Como control, se utilizan compuestos lo más similares

posibles al radical, pero que no contengan ese electrón
desapareado. En el ejemplo, el radical es NO·, pues como
control se utilizaría la misma molécula, pero con NOH, o
con NH (quito el O y pongo un H).
6. COMPARACIÓN CON ESPECTROS DE MUTANTES

EJEMPLO → Localización de un pico de His (*) en MIOGLOBINA por comparación con un

mutante

- Proteína mutante → A
- Proteína no mutante → B

La proteína mutada tendrá todos los picos menos aquellos mutados, por tanto,
comparando picos en cada espectro pueden encontrarse aquellos que no coinciden y que
por tanto son mutados. Así se asignará la posición de los aminoácidos.

7. EMPLEO SISTEMÁTICO DE DESACOPLAMIENTO DE ESPÍN-ESPÍN

Se puede trabajar desacoplando uno a uno los protones. Esto nos llevaría a un COSY, ya
que realmente el COSY es un desacoplamiento espín-espín, porque va saturando las
frecuencias antes de que se acoplen. Proceso observado en una bidimensional.

CORRELACIÓN ENTRE PARÁMETROS DE RMN Y ESTRUCTURA SECUNDARIA DE PÉPTIDOS

1. CORRELACIÓN ENTRE DESPLAZAMIENTO QUÍMICO 𝛥𝛿 = (𝛿 − 𝛿𝑅 ) Y ESTRUCTURA SECUNDARIA

El desplazamiento químico depende del

entorno químico.

▪ Para los protones de alfa hélice lo esperado

es -0.39
▪ Para los protones de lámina beta lo esperado
es +0.40

▪ Los desplazamientos químicos se pueden utilizar para ver la estructura predominante (Alfa hélice o lamina
beta).
▪ Siempre resulta que la estructura secundaria de una posee un efecto opuesto a la otra

2. CONSTANTE DE ACOPLAMIENTO HOMONUCLEAR 3𝐽𝐻𝑁𝛼 PARA LOS ELEMENTOS DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA

El incremento de deltas y J dan

información sobre estructura
secundaria.

INFORMACIÓN ESTRUCTURAL DE RMN DE PROTEÍNAS

▪ DESPLAZAMIENTO QUÍMICO (𝜹) → INFORMA SOBRE ESTRUCTURA SECUNDARIA

▪ CONSTANTES DE ACOPLAMIENTO ESCALAR (J) → INFORMA SOBRE ÁNGULOS DIEDROS (ALFA o BETA)
▪ DISTANCIAS NOE → INFORMA SOBRE ESTRUCTURA TERCIARIA
o Distancias 1H-1H intrarresiduos
o Distancia 1H-1H secuenciales
o Distancias cortas 1H-1H en los elementos de estructura secundaria
DIFERENCIA DEL ESPECTRO DE COSY Y NOESY

• El COSY da información sobre lo cercano, sobre los enlaces covalentes, ahí están todos los enlaces→
MUCHAS MÁS SEÑALES (puntos más gruesos).
• EL NOESY da información sobre la interacción a distancia, ahí hay menos enlaces → MENOS SEÑAL,
espectros más limpios no tan acumulados (puntos más finos).

PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS

Histidina → Aminoácido con un anillo y un carbono esencial. En este ejemplo tenemos

una proteína que posee 4 histidinas, y se observa el espectro del carbono.

1. DESNATURALIZACIÓN

A pH 5 (condiciones nativas) → 4 picos de ese carbono, 4 histidinas

Si voy acidificando voy desnaturalizando y voy perdiendo la estructura,

hasta que todo este desnaturalizado, y pase de tener 4 señales a tener
una única señal intensa.

En el proceso de la desnaturalización se podrá observar que Histidinas

eran las más accesibles (externas) y las menos accesibles (internas). Las
mas accesibles son aquellas que pierden el espectro antes y la menos
accesibles son aquellas que mantienen el espectro hasta casi el final.

- Para el ejemplo, la H-1 es la que más tarda en perder el espectro, por

tanto, es la más inaccesible. En cambio, la H-4 es la más accesible, al
ser la primera que se desplaza, y la H-2 y H-3 son parcialmente
accesibles, pero la H-3 mas que la H-2, porque la H-3 se desplaza
hacia la H-2.
- De más externo a más interno → H4<H3<H2<H1

2. RENATURALIZACIÓN

Si hago la renaturalización se observa la recuperación del espectro, donde las

primeras señales que van apareciendo son las de las Histidinas más
inaccesibles, ya que se está plegando la proteína.

IMPORTANTE:

El pH afecta a la resonancia del carbono debido a que la histidina posee un

grupo desprotonable y tiene un valor de pka. En el caso de que no se pudiese
desprotonar el pH no afectara a la resonancia.
MECANISMO DEL EFETO BOHR DE LA HEMOGLOBINA

EFECTO BORH → La hemoglobina posee diferente afinidad por el oxígeno en función del pH. Esto es debido a que la
liberación de O2 por la hemoglobina va acompañado de la toma de un H+.

Esta hemoglobina posee una Histidina (His 146) en el centro de unión del hierro, encargada de la saturación, la cual
es fácil de identificar por RMN.

En cualquier curva de disociación acido base, se puede sacar el pKa, como la mitad que se encuentra entre el
desplazamiento químico máximo y el desplazamiento químico mínimo. (Para absorbancia, fluorescencia y RMN)

Para cuantificar el efecto Bohr, se ha de seguir el desplazamiento químico de la Histidina, tanto en presencia como
ausencia de oxígeno, para comprobar que las curvas son distintas y que realmente ha cambiado el pKa.

- El carbono de la histidina, por su desprotonación y protonación va a permitir que el pH afecte al desplazamiento

químico, y por tanto a la resonancia.

“En el caso de la Histidina se utiliza la resonancia de carbono

porque la hemoglobina posee muchos protones, y es una forma de
simplificar, además de que la Histidina es el único aminoácido con
ese carbono”.

Conclusión: El carbono de la histidina implicado en la saturación de

oxígeno, permite que dicha saturación afecte cambiando el pKa y
soltando un protón, cosa que se refleja en el desplazamiento
químico.

VALORACIÓN DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS

EJEMPLO: Conversión de piruvato a lactato.

• Absorbancia en función del tiempo → Pendiente = Actividad enzimática (velocidad)

• Fluorescencia en función del tiempo → Pendiente = Velocidad de reacción
• Variación del área de resonancia en función del tiempo → Pendiente = Velocidad de reacción

Para calcular la velocidad, se requiere moles:

- ABSORBANCIA → Ley de lamber (coeficiente de extinción molar)

- FLUORESCENCIA → Constante de proporcionalidad (K·q) (K del aparato por
rendimiento cuántico).
- RMN → En el ejercicio habrá un dato que permita relacionar área con
concentración, y de ahí se calcula la proporcionalidad. (A cuanta área le tocan
cuantos moles)

Seguimiento de la reacción de la lactato deshidrogenasa por detección

de la aparición de lactato.

En RMN lo importante son las

áreas.
MOVILIDAD DE LÍPIDOS EN MEMBRANAS

¿Qué parámetro del espectro me da movilidad? → ANCHURA DE BANDAS

▪ BANDAS ANCHAS → Nula movilidad (quieto), se relaja más rápido → (Lípido insertado en la membrana o en
estado rígido)
▪ BANDAS ESTRECHAS → Libre movimiento, se relaja más lento → (Lípido con libre orientación por el citoplasma)

• Las membranas poseen una transición cristalina-

semifluida, con una temperatura de fusión (Tm) de la
membrana.
• Las membranas a bajas temperaturas son muy rígidas, y
altas temperaturas son muy fluidas, propiedad que viene
dada por la temperatura de fusión.

MEDIDA DEL PH INTRACELULAR

En RMN se puede medir el pH intracelular, con compuestos que hay en las propias células (marrón) o con sondas
artificiales (azul).

En estos casos hay que buscar resonancias específicas que

cambien con el pH, y se seleccionan los patrones (curvas
de valoración) que mas cambien, para conocer realmente
el pH intracelular. Ejemplo: En el caso de la Carnosina, se
observa mejor el cambio cuando realiza el espectro de 13C-RMM

Las sondas artificiales son similares a las sondas

fluorescentes ya que se cambia un protón, por un Flúor
en este caso, y se debe introducir dentro de la célula
para poder observar el cambio de pH intracelular.

PREGUNTA EXAMEN

¿Que es mejor medir pH intracelular por fluorescencia o por RMN? ¿Qué esta menos interferido?

MEJOR POR RMN, ya que la fluorescencia a pesar de ser buena para medir variaciones/cambios mínimos de pH, la
fluorescencia esta interferida por muchas cosas (quenching, fotoblanqueamiento, transferencia inducida…) pero el
RMN no.

CÁLCULO DE pH INTRACELULAR

𝜹𝑯𝑨 −𝜹𝒊𝒏 𝒗𝒊𝒗𝒐

𝒑𝑯 = 𝒑𝑲𝒂 + 𝒍𝒐𝒈 ⋅ ( )
𝜹𝒊𝒏 𝒗𝒊𝒗𝒐 −𝜹𝑨
Para aplicar esta ecuación, se necesitan 2 especies, una ácida y una básica.

Otra de las formas de calcular el pH, seria sacar la recta con los puntos que
da el problema (valor de pH frente a desplazamiento químico), para sustituir
el desplazamiento químico in vivo en la (y) y sacar el pH intracelular (in vivo)
MEDIDA DEL PH INTRACELULAR

Espectros 31P de una suspensión de E. coli creciendo anaeróbicamente

en medio con glucosa con adición de oxígeno, a tiempo 0 como se indica.

En el espectro se observa:

• Desplazamiento químico de la resonancia del 31P

• B y C son los picos de fosfato inorgánico intra y extracelular,
respectivamente

Se puede estimar que cuando hay oxigeno las condiciones cambian. En

este caso el pH intra y extracelular, es más bajo mientras no hay oxígeno,
y empieza a aumentar debido a las condiciones con oxígeno.

FERMENTACIÓN LÁCTICA/ÁCIDA → Aumento de pH en presencia de

oxígeno.

EFECTO DEL CONSUMO DE GLUCOSA SOBRE LOS COMPUESTOS FOSFORILADOS EN ESCHERICHIA COLI

Efecto similar a la de la medida de pH intracelular, pero ahora observando los

compuestos fosforilados.

A pesar de que en las células haya muchos compuestos fosforilados, como el RMN
no es muy sensible, solo podemos ver compuestos mayoritarios. Cuando se habla
de RMN in vivo, se indica que este puede seguir procesos metabólicos, pero solo
aquellos que estén a elevadas concentraciones, ya que solo se observaran los
compuestos mayoritarios.

El consumo de la glucosa indica que se está realizando la denominada GLUCÓLSIS,

una ruta metabólica encargada de oxidar la glucosa con la finalidad de obtener
energía para la célula, es decir, sobre todo produce ATP.

Para RMN, el ATP, posee adenina (base nitrogenada), ribosa (anillo de azúcar) y 3 fosfatos (cosa importante para
RMN)

Los 3 fosfatos del ATP son:

• Gamma → Posee un oxigeno cargado que los demás no tienen.

• Beta → Esta entre 2 grupos fosfato.
• Alfa → Esta entre un grupo fosfato y un azúcar.

Los 3 grupos fosfatos poseen resonancias distintas, al ser

diferentes en estructura.

Cuando tenga ADP → Posee solamente un alfa y una beta

Cuando tengo AMP → Posee solamente un alfa

• El alfa del AMP es parecido a la gamma del ATP

• La beta del ADP es similar a la gamma del ATP
• El alfa del ADP es similar al alfa del ATP
Por tanto, si queremos observar únicamente el ATP, el mejor fosfato para
seleccionar es el que da RESONANCIA PURA, es decir, el fosfato BETA, que
no es similar a ningún otro, y por tanto no permite su solapamiento con
los otros.

ADICIÓN DE GLUCOSA:

Cuando se añade glucosa se sintetiza ATP, y se verán las 3 resonancias del

ATP (alfa, beta y gamma), pero la que mejor se observará es la BETA, ya
que a esta no se le solapa ninguna otra resonancia. Por tanto, para seguir
el proceso metabólico, observamos la BETA, porque en las demás
podríamos estar observando ADP o AMP.

En el seguimiento in vivo OBSERVO LOS COMPUESTOS MAYORITARIOS,

debido a que el RMN no es muy preciso.

ESTUDIOS DE METABOLISMO ENERGÉTICO “IN VIVO”

• La creatina fosfato es un precursor fosforilado de la creatina, que permite al ser acumulada (en el musculo),
producir con mucha facilidad ATP.
• En el caso de realizar un ejercicio, se disminuiría la señal de creatina fosfato y aumentarían los picos de los 3 ATP.
• Si no hubiese de esta en el musculo almacenada, los picos de ATP disminuirían hasta desaparecer.

EFECTO DE LA HORMONA TIROIDEA SOBRE LAS CELULAS DE HIGADO DE RATA

Observación del hígado de la rata con tratamiento y el hígado de la

rata sin tratamiento.

Estos espectros son utilizados en casos clínicos, donde lo mismo que

se aplica para aminoácidos, se aplica para las hormonas, las cuales
poseen un papel que aumenta el metabolismo.

A través del espectro de 13C sin alanina, y con alanina, se puede

interpretar el efecto que posee la hormona realizando un espectro
diferencial.