UNIDAD I

ESPECTROSCOPIA
1.1 Espectrometría UV-Visible.

La espectroscopía UV-Vis está basada en el proceso de absorción de la radiación

ultravioleta-visible (radiación con longitud de onda comprendida entre los 160 y 780
nm) por una molécula. La absorción de esta radiación causa la promoción de un
electrón a un estado excitado. Los electrones que se excitan al absorber radiación
de esta frecuencia son los electrones de enlace de las moléculas, por lo que los
picos de absorción se pueden correlacionar con los distintos tipos de enlace
presentes en el compuesto. Debido a ello, la espectroscopía UV-Vis se utiliza para
la identificación de los grupos funcionales presentes en una molécula. Las bandas
que aparecen en un espectro UV-Vis son anchas debido a la superposición de
transiciones vibracionales y electrónicas.

La espectroscopia ultravioleta-visible (UV-VIS) es una potente técnica para diversas

aplicaciones de distintas industrias y segmentos de mercado.

Cuando una sustancia absorbe el máximo de luz a una determinada longitud de

onda, se da una relación única entre la sustancia y su espectro UV-VIS. Esta
relación puede servir para:

 Análisis cualitativos, es decir, determinar la presencia de ciertas

sustancias.
Por ejemplo, la determinación del contenido de DOBI y caroteno en aceites
y grasas comestibles, la identificación de contaminación, como el cromo y el
hierro en el agua,la identificación de la cianocobalamina y la comprobación
de la pureza del ADN/ARN.
 Análisis cuantitativos, es decir, determinar las cantidades de ciertas
sustancias.
Por ejemplo, la determinación de la concentración de sustancias en el agua,
como la DQO o el amoníaco, la determinación de la unidad de amargor de
 las bebidas alcohólicas, la medición del contenido de azúcar en las bebidas
y la cuantificación de las proteínas.

1.2 Espectroscopia de resonancia magnética-nuclear.

La espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica

empleada principalmente en la elucidación de estructuras moleculares, aunque
también se puede emplear con fines cuantitativos.
Algunos núcleos atómicos sometidos a un campo magnético externo absorben
radiación electromagnética en la región de las frecuencias de radio o
radiofrecuencias. Como la frecuencia exacta de esta absorción depende del entorno
de estos núcleos, se puede emplear para determinar la estructura de la molécula en
donde se encuentran éstos.

La espectroscopia de RMN fue desarrollada a finales de los años cuarenta para

estudiar los núcleos atómicos. En 1951, los químicos descubrieron que la
espectroscopia de resonancia magnética nuclear podía ser utilizada para
determinar las estructuras de los compuestos orgánicos. Esta técnica
espectroscópica puede utilizarse sólo para estudiar núcleos atómicos con un
número impar de protones o neutrones (o de ambos). Esta situación se da en los
átomos de 1 H, 13C, 19F y 31P. Este tipo de núcleos son magnéticamente activos,
es decir poseen espín, igual que los electrones, ya que los núcleos poseen carga
positiva y poseen un movimiento de rotación sobre un eje que hace que se
comporten como si fueran pequeños imanes. En ausencia de campo magnético, los
espines nucleares se orientan al azar. Sin embargo cuando una muestra se coloca
en un campo magnético, tal y como se muestra en la siguiente figura, los núcleos
con espín positivo se orientan en la misma dirección del campo, en un estado de
mínima energía denominado estado de espín α, mientras que los núcleos con espín
negativo se orientan en dirección opuesta a la del campo magnético, en un estado
de mayor energía denominado estado de espín β.

1.3 Espin nuclear origen de la señal

Es una práctica común, representar el momento angular total de un núcleo por el
símbolo I, y llamarlo "espín nuclear". En los electrones de los átomos se hace una
clara distinción entre el espín del electrón y el momento angular orbital del electrón,
y luego combinarlos para dar el momento angular total. Pero los núcleos, a menudo
actúan como si fueran una sola entidad, con un momento angular intrínseco I.
Asociado con cada espín nuclear hay un momento magnético nuclear, que produce
interacciones magnéticas con su entorno.

Los espines nucleares de los protones y neutrones individuales, tienen un

tratamiento paralelo al espín del electrón, tienen espín 1/2 y un momento
magnético asociado. El momento magnético es mucho menor que el del electrón.
En una combinación de neutrones y protones en los núcleos, la situación se vuelve
más complicada.

Una característica de la colección de protones y neutrones (que son fermiones), es

que un núcleo de número de masa A impar, tiene un espín semi-entero, y un núcleo
de masa A par, tiene un espín entero. La sugerencia de que los momentos
angulares de los nucleones tienden a formar parejas, está apoyada por el hecho de
que todos los núcleos con Z par y N par, tienen espín nuclear I=0. Por ejemplo, en
la tabla de datos nucleares de abajo para el hierro, todos los nucléidos con A par,
tienen espín I=0, ya que hay un número par de ambos neutrones y protones. Los
espines semienteros de los nucleidos con A impar, sugieren que este es el espín
nuclear presentado por el neutrón impar.

1.4 División de la señal: Acoplamiento espin-espin

La fuente de división de la señal es un fenómeno llamado acoplamiento espín-espín,

un término que describe las interacciones magnéticas entre núcleos vecinos no
equivalentes activos en NMR.

Los espectros 1H de RMN que hemos visto hasta ahora (de acetato de metilo y 1,4-
dimetilbenceno) son algo inusuales en el sentido de que en ambas moléculas, cada
conjunto de protones genera una única señal de RMN. De hecho, los espectros
1H de RMN de la mayoría de las moléculas orgánicas contienen señales de
protones que se 'dividen' en dos o más sub-picos. Sin embargo, en lugar de ser una
complicación, este comportamiento de división es realmente muy útil porque nos
proporciona más información sobre nuestra molécula de muestra.

Considera el espectro para 1,1,2-tricloroetano. En este y en muchos espectros a

seguir, mostramos ampliaciones de señales individuales para que los patrones de
división de señal sean reconocibles.

La señal a 3.96 ppm, correspondiente a los dos Ha protones, se divide en dos

subpicos de igual altura (y área) —esto se conoce como doblete. La Hb señal a 5.76
ppm, por otro lado, se divide en tres subpicos, con el pico medio más alto que los
dos picos externos -si tuviéramos que integrar cada subpico, veríamos que el área
bajo el pico medio es el doble que la de cada uno de los picos externos. Esto se
llama triplete.

La fuente de división de la señal es un fenómeno llamado acoplamiento espín-espín,

un término que describe las interacciones magnéticas entre núcleos vecinos no
equivalentes activos en NMR. (Los términos 'división' y 'acoplamiento' a menudo se
usan indistintamente cuando se habla de RMN). En nuestro ejemplo de 1,1,2
triclorometano, los Hb protones Ha y se acoplan por giro entre sí. Así es como
funciona, mirando primero la Ha señal: además de estar blindado por electrones de
valencia cercanos, cada uno de los Ha protones también está influenciado por el
pequeño campo magnético generado por la puerta de Hb al lado (recuerde, cada
protón giratorio es como un pequeño imán). El momento magnético de se
Hb alineará con Bo en poco más de la mitad de las moléculas en la muestra,
mientras que en las moléculas restantes se opondrá a Bo. El Beff 'sentido' por Ha
es un poco más débil si Hb está alineado en contra Bo, o ligeramente más fuerte si
Hb está alineado con Bo. En otras palabras, en la mitad de las moléculas Ha está
blindado por Hb (por lo tanto, la señal de RMN se desplaza ligeramente campo
arriba) y en la otra mitad Ha se deshicede por Hb (y la señal de RMN se desplaza
ligeramente campo abajo). Lo que de otro modo sería un solo Ha pico se ha dividido
en dos subpicos (un doblete), un campo arriba y otro campo abajo de la señal
original.

1.5 Espectros protónicos por resonancia magnética nuclear

La espectroscopia por resonancia magnética (ERM, en inglés MRS) que analiza

protones en el cerebro humano fue demostrada inicialmente en la década de los
ochenta. En los últimos años, esta técnica ha ganado en forma paulatina, la
aceptación como método diagnóstico en diversas enfermedades neurológicas.

La ERM utiliza los principios de la espectroscopia, la cual se desarrolló inicialmente

para el análisis de muestras químicas puras, generando posteriormente información
en relación con los diferentes constituyentes químicos del cuerpo humano.

 La espectroscopia protónica por resonancia magnética (o ERM-H1) tiene tres

ventajas fundamentales e importantes:
 La abundancia de los protones en forma 100% natural evita la necesidad de
utilizar sustancias radiactivas para su realización.
 Puede utilizarse en la mayoría de las máquinas de resonancia magnética
utilizadas para la evaluación clínica de pacientes.
 Es altamente sensible debido al gran rango giromagnético de los protones
naturales.
1.6 Espectroscopia en el infrarrojo: Región en el espectro electro-magnetico

Esta espectroscopia se fundamenta en la absorción de la radiación IR por las

moléculas en vibración. Una molécula absorberá la energía de un haz de luz
infrarroja cuando dicha energía incidente sea igual a la necesaria para que se de
una transición vibracional de la molécula. Es decir, la molécula comienza a vibrar
de una determinada manera gracias a la energía que se le suministra mediante luz
infrarroja.

Pueden distinguirse dos categorías básicas de vibraciones: de tensión y de flexión.

Las vibraciones de tensión son cambios en la distancia interatómica a lo largo del
eje del enlace entre dos átomos. Las vibraciones de flexión están originadas por
cambios en el ángulo que forman dos enlaces. En la siguiente figura se representan
los diferentes tipos de vibraciones moleculares.

El espectro cubre la energía de ondas electromagnéticas que tienen longitudes de

onda diferentes. Las frecuencias de 30 Hz y más bajas pueden ser producidas por
ciertas nebulosas estelares y son importantes para su estudio. Se han descubierto
frecuencias tan altas como 2.9 * 1027 Hz a partir de fuentes astrofísicas.

La energía electromagnética en una longitud de onda particular λ (en el vacío)

tiene una frecuencia asociada f y una energía fotónica E. Así, el espectro
electromagnético puede expresarse en términos de cualquiera de estas tres
variables, que están relacionadas mediante ecuaciones.

De este modo, las ondas electromagnéticas de alta frecuencia tienen una longitud
de onda corta y energía alta; las ondas de frecuencia baja tienen una longitud de
onda larga y energía baja.

Siempre que las ondas de luz (y otras ondas electromagnéticas) se encuentran en

un medio (materia), su longitud de onda se reduce. Las longitudes de onda de la
radiación electromagnética, sin importar el medio por el que viajen, son, por lo
general, citadas en términos de longitud de onda en el vacío, aunque no siempre
se declara explícitamente.

Generalmente, la radiación electromagnética se clasifica por la longitud de onda:

ondas de radio, microondas, infrarroja y región visible, que percibimos como luz,
rayos ultravioleta, rayos X y rayos gamma.

1.7 Interpretación del espectro Infrarrojo

Esta espectroscopia se fundamenta en la absorción de la radiación IR por las

moléculas en vibración. Una molécula absorberá la energía de un haz de luz
infrarroja cuando dicha energía incidente sea igual a la necesaria para que se de
una transición vibracional de la molécula. Es decir, la molécula comienza a vibrar
de una determinada manera gracias a la energía que se le suministra mediante luz
infrarroja.

Pueden distinguirse dos categorías básicas de vibraciones: de tensión y de flexión.

Las vibraciones de tensión son cambios en la distancia interatómica a lo largo del
eje del enlace entre dos átomos. Las vibraciones de flexión están originadas por
cambios en el ángulo que forman dos enlaces. En la siguiente figura se representan
los diferentes tipos de vibraciones moleculares.
En principio, cada molécula presenta un espectro IR característico (huella dactilar),
debido a que todas las moléculas (excepto las especies diatómicas homonucleares
como O2 y Br2) tienen algunas vibraciones que, al activarse, provocan la absorción
de una determinada longitud de onda en la zona del espectro electromagnético
correspondiente al infrarrojo.

De esta forma, analizando cuales son las longitudes de onda que absorbe una
sustancia en la zona del infrarrojo, podemos obtener información acerca de las
moléculas que componen dicha sustancia.

¿Qué información nos da la IR?

La espectroscopia infrarroja tiene su aplicación más inmediata en el análisis

cualitativo: detección de las moléculas presentes en el material.

En la zona del espectro electromagnético IR con longitudes de onda del infrarrojo

medio (entre 4000 y 1300 cm-1) se suelen observar una serie de bandas de
absorción provocadas por las vibraciones entre únicamente dos átomos de la
molécula. Estas vibraciones derivan de grupos que contienen hidrógeno o de
grupos con dobles o triples enlaces aislados.

En la zona del espectro electromagnético IR con longitudes de onda comprendidas

entre 1300 y 400 cm-1 (infrarrojo lejano), la asignación de las bandas de absorción
a vibraciones moleculares es más difícil de realizar, debido a que cada una de ellas
está generada por absorciones individuales sumadas (multiplicidad de las bandas).
Es la denominada zona de la huella dactilar (flexión de enlaces CH, CO, CN, CC,
etc..). En esta zona de longitudes de onda, pequeñas diferencias en la estructura
y constitución de las moléculas dan lugar a variaciones importantes en los máximos
de absorción.

1.8 Bandas de absorción características de los distintos grupos funcionales

de compuestos orgánicos
 Frecuencias características de grupos orgánicos poliatómicos
f = fuerte, m = medio, d = débil

Frecuencia
Tipo de vibración Intensidad
(cm-1)
Alcanos (tensión) 3000-2850 f
-CH3 (flexión) 1450 y 1375 m
-CH2- (flexión) 1465 m
Alquenos (tensión) 3100-3000 m
Alquenos (fuera del plano de flexión) 1000-650 f
C-H Aromáticos (tensión) 3150-3050 f
Aromáticos (fuera del plano de
900-690 f
flexión)
Alquino (tensión) ca. 3300 f
2900-2800 d
Aldehídos
2800-2700 d
No
C-C Alquenos
interpretable
Alqueno 1680-1600 m-d
C=C
Aromáticos 1600 y 1475 m-d
CC Alquino 2250-2100 m-d
Aldehído 1740-1720 f
Cetona 1725-1705 f
Ácidos carboxílicos 1725-1700 f
C=C Éster 1750-1730 f
Amida 1670-1640 f
Anhídridos 1810 y 1760 f
Cloruro ácido 1800 f
Alcoholes, éteres, ésteres ácidos
C-C 1300-1000 f
carboxílicos, anhídridos
Alcoholes, fenoles Libre 3650-3600 m
O-H Alcoholes, enlace H 3500-3200 m
Ácidos carboxílicos 3400-2400 m
Aminas y amidas primarias y
3500-3100 m
secundarias (tensión)
N-H
Aminas y amidas primarias y
1640-1550 m-f
secundaria (flexión)
C-N Aminas 1350-1000 m-f
C=C Iminas y oximas 1690-1640 d-f
CN Nitrilos 2260-2240 m
Alenos, quetanos, isocianatos,
X=C=Y 2270-1950 m-f
isotiocianatos
N=O Nitro (R-NO2) 1550 y 1350 f
S-H Mercaptanos 2550 d
Sulfóxidos 1050 f
S=O Sulfones, cloruros de sulfónidos 1375-1300 y f
Sulfatos, sulfoamidas 1200-1140 f
Fluoruro 1400-1000 f
C-X Cloruro 800-600 f
Bromuro, ioduro <667 f

Frecuencias características de grupos inorgánicos poliatómicos

f = fuerte, m = medio, d = débil, a = agudo

Grupo Frecuencia (cm-1) Intensidad

(BO2)- 1300-1350 f
975-1000 m
-2
(B4O7) 1050-1080 m
1330-1370 f
850-875 m
(CO3)-2 1425-1450 f
2400-2600 d
650-665 m
685-720 m
(HCO3)-2
820-850 m
990-1015 m
425-475 2 bandas, a
-
(SCN) 750-775 d
2000-2100 f
470-480 f
(SiO3)-2 560-585 d
940-1015 f
Silicatos 940-1050 f
 830-850 d
(NO2)- 1220-1250 f
1325-1375 d
800-850 m,a
(NO3)-
1350-1375 f
1390-1440 f
(NH4)+
3050-3350 m
(PO4)-2 1000-1050 f,f
830-900 m
930-980 m
(HPO4)-2
1010-1080 f
2200-2440 d
900-950 m
(H2PO4)-
1040-1085 f
620-670 a
(SO3)-2
915-980 f
585-660 m
(SO4)-2
1080-1130 f
570-600 f
850-880 m
(HSO4)-2
1050-1075 m
1150-1080 m
500-540 f
660-700 f
(S2O3)-2
960-1000 f
1100-1040 f
640-675 m
960-1000 f
(S2O4)-2
1060-1090 m
1175-1195 f
700-730 f
(S2O8)-2 1045-1075 f,a
1270-1300 f
720-740 d
(SeO3)-2
750-790 d
410-430 f
-2
(SeO4) 760-810 d
840-860 f
480-530 f,a
(ClO3)- 610-640 f,a
900-975 d,f
 610-640 f,a
(ClO4)-2
1060-1000 f
365-385 f,a
(BrO3)- 440-460 f,a
785-820 f
320-400 d,a
(IO3)-
740-780 f
775-800 f
-
(VO3) 820-840 f
910-950 f
360-440 d
(CrO4)-2 795-880 m,f
905-950 d
340-375 d
-
(Cr2O7) 725-760 m
840-890 m
320-350 d
(MoO4)-2 820-840 f
890-930 d
(WO4)-2 780-820 f
(MnO4)-2 890-915 f
-4
(Fe(CN)6 560-600 m
H2O
1600-1700 m
(agua de
3190-3550 m
cristalización)
1.9 Vinculación: determinación de muestras biológicas en bioquímica clínica
Las técnicas espectrales son ampliamente utilizadas en el laboratorio de análisis
clínico, dentro de la gran diversidad de técnicas que existen. Estas técnicas utilizan
la luz como el fundamento de la medida, aunque también se ha incluido la
espectrometría de masas. Para entender el funcionamiento de las técnicas
espectrales, hay que entender qué es la luz.

La luz como energía estaría conformada por fotones. La energía asociada con cada
fotón está relacionada con la frecuencia de forma directa y con la longitud de onda
de forma indirecta, tal y como expresa la constante de Planck. La luz del laboratorio
de análisis que se utiliza tiene una longitud de onda que oscila entre los 180 y los800
nm, desde el ultravioleta hasta la infrarroja.

La espectroscopia y la espectrometría son dos conceptos claves:

 La espectroscopia es el conjunto de métodos que se basan en la interacción

de la radiación electromagnética con la materia, que se traduce en absorción
y emisión de energía.
 La espectrometría es el conjunto de técnicas espectroscópicas que pueden
medir esa interacción. Por ende, permiten cuantificar sustancias en muestras
biológicas mediante la radiación que se absorbe o se emite.

Radiación electromagnética y su interacción con la materia

Una de las características esenciales de las radiaciones ionizantes (fotones,

neutrones, partículas cargadas, etc) es su capacidad de penetrar en la materia e
interaccionar con ella. En estas interacciones, la radiación pierde parte o toda su
energía cediéndola al medio que atraviesa mediante distintos mecanismos de
interacción. Dependen esencialmente del tipo de radiación, de su energía y de las
propiedades del medio material con el que interactúan.

Estos procesos de interacción de la radiación con la materia son la causa de los

efectos producidos por las radiaciones (en particular, los efectos biológicos
producidos en seres vivos) y determinan las condiciones de propagación de la
radiación en un medio material.

Absorción y emisión de la radiación

Cuando la luz incide con una determinada intensidad sobre una solución, la
intensidad del haz que sale será menor, ya que parte es absorbida por la
misma. Para poder utilizar este fenómeno en las técnicas espectrales, se usa la Ley
de Lambert Beer.

En esta ley hay que conocer qué es la transmitancia de una solución. Para una
longitud de onda concreta, es la fracción de radiación transmitida por la muestra.
También es importante la absorbancia, que es el logaritmo inverso de la
transmitancia. Cuando aumenta la concentración de un compuesto en una solución,
esta absorbe más luz. Por lo tanto, existe una relación directa entre absorbancia y
concentración. Además con la longitud del cuerpo que la luz atraviesa según la
fórmula de la ley de Lambert Beer. La ε de la fórmula corresponde al coeficiente de
extinción molar, de absorción o de absortividad y depende de la medida de la cubeta
de medición y de la muestra a analizar.

Pueden darse varios fenómenos cuando la luz incide en una molécula. Esto es
fundamental para entender el valor de estas técnicas en análisis clínico. Conociendo
estos conceptos de absorción y emisión, las técnicas espectrales pueden ser
diferenciadas en:

 Técnicas de espectrofotometría: una parte de la luz es absorbida por las

moléculas y una parte se transmite sin perder energía.
 Nefelometría y turbidimetría: la luz se dispersa por la partícula y cambia de
dirección, pero con la misma energía.
 Espectrometría de masas: no está influenciada por la luz, pero se basa en la
creación de espectros para la cuantificación.