ELECTROFORESIS

Electroforesis
ELECTROFORESIS

Electroforesis de
Zona

Electroforesis
Capilar

Reacciones de
Inmuno
precipitacin

Inmunoelectro
foresis

Inmunofijacin

Inmuno
transferencia

Inmuno
turbidimetria

Inmuno
nefelometria

Electroforesis

Es la separacin de las distintas especies se

basa en sus diferencias de comportamiento

bajo la influencia de un campo elctrico
aplicado

Electroforesis
Reglas que describen los factores de la

electroforesis.

Los iones negativos tienden a migrar hacia el voltaje mas

alto (positivo) los iones positivos migran hacia el voltaje
mas bajo (negativo)

La velocidad promedio de migracin de una especie de

analito es proporcional a la carga promedio del in

La velocidad promedio de migracin de una especie de

analito es proporcional al voltaje promedio que se aplica

La velocidad de desplazamiento promedio de un in es

inversamente proporcional a su seccin transversal
promedio

Electroforesis
Reglas que describen los factores de la

electroforesis.

La electroforesis separa los iones segn sus diferentes

relaciones de carga con respecto al tamao

La calidad de las electroseparaciones en lquidos

mejora cuando se mantiene constante la temperatura
en el curso de todo el experimento

Los mtodos analticos en la clasificacin de

electroseparaciones se aplican para separar y
cuantificar analitos de 100 108 de peso molecular

Electroforesis
Reglas que describen los factores de la

electroforesis.

La primera informacin que se requiere antes de llevar a

cabo una separacin electrofortica es estimar las cargas
de la matriz

Las molculas adquieren diferente carga neta en funcin de

pH de la solucin amortiguadora.

Es probable que a un pH distinto las movilidades inicas se

modifiquen y se logre una mejor separacin.

Los puntos isoelctricos permite la separacin de una

mezcla de protenas

Movilidad electrofortica
Es un proceso en el que un gradiente de potencial

produce el transporte de las partculas cargadas

Felec = Froz
Z e WE = Fv
= v/E
= Z E/f
= movilidad electrofortica
Z = numero de cargas de unidad
E = valor del campo elctrico
V = velocidad de las partculas
F = coeficiente de rozamiento

Electroforesis
La movilidad electroforetica de una molcula

depende directamente de sus carga e

inversamente del coeficiente de rozamiento,
que depende directamente del tamao, forma
de la molcula y la viscocidad del medio.
La migracin de las partculas depende del

pH del medio en que estn, ya que su carga

neta depende del pH

Electroforesis
El amortiguador ejerce dos funciones

Lleva la carga elctrica

Determina la carga neta de las molculas

Cuanto mayor es la fuerza inica, mas

estrechas son las bandas de separacin

Electroforesis
Separacin electrofortica en gel
Los geles que se emplean son redes
tridimencionales de cadenas de polmeros y los
espacios entre las cadenas estn llenos de lquido.
Las redes polimricas actan como tamices que
retrasan e inclusive bloquean la migracin de analitos
de gran tamao, sin embargo, los iones pequeos
pueden moverse con libertad

Electroforesis

Geles de agarosa
Geles de poliacrilamida

Electroforesis
Gel de agarosa

es un polisacarido de alta pureza, polmeros

de azucar que se refina a partir del agar.
Se prepara a una concentracin de 0,4 a 2 %
p/v gelifica a 40 C
Concentraciones mas bajas presentan
canales de mayor tamao. Estos geles son
bastantes frgiles.

Electroforesis
Gel de poliacrilamida

La poliacrilamida es ms resistente que la

agarosa y se forma irreversiblemente por un
proceso de polimerizacin de radicales libres
El monmero de acrilamida se enlaza
covalentemente para formar cadenas
Con la N,N- metilen-bis- acrilamida, la cual
enlaza a dos cadenas de polmero

Gel de poliacrilamida

Electroforesis
Los geles de agarosa y poliacrilamida tienen

caracteristicas comunes
Son fciles de moldear, en tubos de diametro
de 5 mm (geles de tubo o de disco).
En capilares de 0,5 mm
En placas
Los geles estn libres de carga inicas

Electroforesis

La fabricacin de geles de buena calidad es

una destreza muy apreciada, hay que
controlar tantos detalles al fabricar el gel que
se requiere mucha prctica, adems, deber
utilizarse estnderes internos en los anlisis
por electroforesis en gel.

Electroforesis en tabique en gel

Electroforesis
Electroforesis de acetato de celulosa
Las membranas de acetato de celulosa tiene
la ventaja de ser qumicamente ms
homogenea y poder transportarse, una vez
teida o reveladas las sustancias que se
separan, podrn cuantificarse por
densitometria de transparencia

Electroforesis
Electroforesis capilar
La velocidad de separacin como la resolucin de los
componentes mejora a medida que se incrementa el
campo elctrico aplicado.
La seccin transversal de la solucin en el aparato
de electroforesis capilar se reduce drsticamente
efectuando dicho proceso en el interior de un tubo
capilar de un dimetro de 0,1 mm y longitud de 50
cm hasta 1 metro. EZC

Electroforesis capilar

Electroforesis
Electroforesis capilar
La tcnica tiene un alto poder de resolucin

se han desarrollado mtodos que permite

efectuar electroforesis de molculas neutras
no inicas
Eficiencia
Resolucin

Electroforesis capilar

Aplicacin de la muestra

Se aplica la muestra por.

Inyeccin de alto voltaje

Inyeccin de presin

Electroforesis capilar
Inyeccin de alto voltaje

Con el voltaje desconectado, se cambia el

recipiente del amortiguador en el electrodo
positivo por otro que contiene la muestra y se
introduce este aplicando brevemente el
voltaje. A continuacin, tras desconectar de
nuevo el voltaje, se sustituye el recipiente del
amortiguador, se aplica otra vez el voltaje y
comienza la separacin

Electroforesis capilar
Inyeccin a presin

En la inyeccin de presin, se separa el

capilar del recipiente positivo del amortiguador
y se inserta en la muestra. Este se introduce
en el capilar aplicando presin y luego se lleva
el capilar al recipiente positivo del
amortiguador y se aplica el alto voltaje.

Electroforesis capilar
Detectores

Los detectores principales que se utilizan son:

Absorcin en el ultravioleta/ visible

Fluorescencia
Conductividad
Espectrometria de masas

Electroforesis capilar

Los lmites de deteccin son de unos

0.00000001 M en el Ultravioleta y visible.
Utilizando la fluorescencia se obtienen limites
mejores, y con lseres a lmites de10-16 M

Electroferograma

Aplicaciones
ELECTROFORESIS DE ZONA
Las protenas son separadas casi exclusivamente sobre la base
de su carga elctrica superficial
Electroforesis
de zona

Fase estacionaria
Es inerte y no impide
ni estimula el flujo
de las molculas en
el campo elctrico

Fase mvil

Solucin
amortiguadora
(alcalino)

Muestra

Suero humano

Aplicaciones
PERFIL ELECTROFORETICO
Acetato de celulosa
Agarosa
Poliacrilamida

Las protenas migran

entre 60 a 90 minutos
con una diferencia
potencial de de 2-3 V/cm

Albumina
Alfa 1 globulina
Alfa 2 globulina
Beta globulina
Gamma globulina

Aplicaciones
INMUNOELECTROFORESIS
Es una tcnica que combina la especificidad de las reacciones
de inmunoprecipitacin con la separacin de molculas por
electroforesis en un medio de cribado molecular
Lleva el antigeno desde el posillo de aplicacin en una suspencin
homogenea del anticuerpo en el gel
Produce una migracin unidireccional del antigeno esto
proporciona una sensibilidad mayor
Se utiliza como procedimiento cualitativo cuantitativo para
identificar protenas

Aplicaciones
Fases de la inmunoelectroforesis IEP
Primera fase.- Se separan por electroforesis, de

acuerdo a su carga, las sustancias antignicas en el

medio que se analiza.
Segunda fase.- Caracterizacin inmunolgica de

cada una de las protenas separadas, se deja que se

difunda un antisuero, general o especfico para la
proteina que quiera identificarse

Aplicaciones
PERFIL ELECTROFORETICO
Al difundirse el suero por el gel, se produce la reaccin antigeno
anticuerpo, produciendose el precipitado de complejos inmunitarios

Aplicaciones
HIPERGAMMAGLOBULINEMIA

HIPOGAMMAGLOBULINEMIA

MACROGLOBULINEMIA

SUERO NORMAL

Aplicaciones
Inmunoensayos competitivos
Inmunoensayos no competitivos
Hormonas endocrinas
Inmunoensayos homogeneos y heterogeneos
Indicadores de lesin cardiovascular
Hepatitis

Aplicaciones
Marcadores tumorales
Indicadores de lesin cardiovascular
Monoclonales
Policlonales
Inmunoanalisis mediadas por enzimas
Determinacion de plasmidos
Aislamiento de plasmidos quimericos
Construccion de genes anti sens

Aplicaciones
Amplificacin por PCR
Amplificacin por RTPCR
Hibridaciones
Secuenciacin de genes
Western blot
Hibridacin in situ
Determinacin de acidos nucleicos