PEREZ

ARRIAGA
ANDREA
CCLC-VLMP-04/hl
GENOVEVA

Fecha de realizació n: 25 de Marzo de 2014

Espectrofotó metro utilizado: # EEE03227; Marca: Jenway; Modelo: 6305
Características de la micropipeta: Valor Nominal: ________ l. Marca: _________

Objetivos:

 Verificar la linealidad en mediciones mú ltiples con una micropipeta, por medio

del método fotométrico.
 Comparar los valores teó ricos y los experimentales.

Fundamento:
El estudio de la linealidad es importante en el diseñ o, selecció n y validació n de los
procedimientos de medida. Los fabricantes de los equipos de medida o reactivos para el
diagnó stico in vitro, deben informar sobre la linealidad del procedimiento de medida en unas
condiciones de uso determinadas.

Los procedimientos de medida deben ser lineales en todo el intervalo de medida. Por
linealidad se entiende que existe una correspondencia lineal entre valor obtenido y el valor
convencionalmente verdadero. El intervalo de medida queda definido por un límite inferior
(el valor crítico) y un límite superior denominado límite de dilució n o límite de linealidad.

La falta de linealidad es consecuencia de utilizar una funció n recta, cuando la relació n entre
señ al y concentració n sigue en realidad una funció n similar a una sigmoidal o hiperbó lica.
Otro caso frecuente es que la falta de linealidad ocurre ú nicamente en el tramo final del
intervalo de medida.

El laboratorio clínico debe verificar el límite de linealidad solo cuando se han modificado las
condiciones de uso o cuando existe sospecha de alteració n de la linealidad, bien sea por
resultados anó malos obtenidos con muestras pacientes, por los datos del control de calidad o
por otras verificaciones que se hayan realizado. Se requiere un estudio completo de la
linealidad en caso de que el procedimiento de medida haya sido diseñ ado en el propio
laboratorio clínico.

Para el cá lculo de la Linealidad fotométrica se deberá realizar un estudio de regresió n lineal

de la recta hallada: Y = a + b X
Donde b es la pendiente de la recta y a la ordenada al origen. La pendiente b representa la
Linealidad fotométrica. La recta ideal sería Y = X por lo cual la pendiente ideal es 1,00 que
indica que el instrumento responde linealmente en el rango de absorbancias estudiadas. Por
el método de cuadrados mínimos se deberá n calcular a y b. Hay calculadoras científicas o
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programas de computació n (tipo Excel) que permiten, incorporando los 4 datos de
absorbancias halladas y los 4 de absorbancias verdaderas realizar una regresióGENOVEVA
n lineal y
calcular dichos valores.
Límites de aceptabilidad: Pendiente ideal: 1,00 Pendiente ó ptima: entre 0,98 y 1,02
Pendiente aceptable: entre 0,97 y 1,03
En el ejemplo anterior, si se realiza el estudio de cuadrados mínimos la ecuació n obtenida es:
Y = 0,95X + 0,009
Por lo tanto la pendiente de la recta es 0,95 (error - 5%), y no se encuentra dentro de los
límites aceptables para el rango de absorbancias estudiadas (A1- A4). En dicho caso se podría
estudiar la Linealidad hasta el tercer punto, es decir considerando solo las absorbancias A, B y
C. La ecuació n obtenida es: Y = 0,975 X + 0,001
La pendiente se encuentra dentro de los límites aceptables. Conclusió n: El
instrumento se comporta linealmente hasta absorbancias aproximadamente iguales a 1.000
UA (C). Este instrumento no debería usarse para leer absorbancias mayores a este valor, ya
que pierde sensibilidad de respuesta ante aumentos en la concentració n.

BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:

 PROGRAMA DE EVALUACIÓ N EXTERNA DE CALIDAD. Espectrofotó metros y

FotocolorímetrosGuía prá ctica de actualizació n. Claudio Duymovich, Rosana Acheme,
Sandra Sesini, Daniel Mazziotta. Acta bioquím. clín. latinoam. v.39 n.4 La
Plata sept./dic. 2005.
 Metrolog%C3%ADaprocedimiento%20recomendado%20para%20el%20estudio
%20de%20la%20linealidad%20de%20los%20procedimientos%20de%20medida
%20en%20el%20laboratorio%20cl%C3%ADnicodocumento%20T%C3%A9cnico
%20(2011).pdf
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DIAGRAMA DE FLUJO

Verificación de la linealidad en la medición con

micropipetas

Valoración de la Linealidad

 Dicromato de potasio al 8% aq
 Fotómetro
 10 tubos de 13x100 mm

En cada tubo colocar 4 mL de agua grado

reactivo.

Añadir cuidadosamente volúmenes de

dicromato de potasio desde 10µL hasta 100 µL

Mezclar por inversión y leer las absorbancias a

una longitud de onda de 500 nm, utilizando
agua como blanco.
A
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Calcular pendiente, intersección a eje-y y coeficiente
de correlación, relacionando
volumen de dicromato (“x”) y Absorbancia (“y”). A
Construya la gráfica #1 correspondiente
al correlacionar absorbancia vs volumen de
dicromato.

Calcular la absorbancia esperada multiplicando la

absorbancia obtenida en cada tubo por
la dilución y dividiendo entre100 que es la dilución del
estándar relativo. Obtener la media, la desvst. y el CV.

Construir la gráfica # 2 correspondiente al

correlacionar volumen obtenido vs volumen
teórico. El volumen obtenido = Absorb. esperada x el
de dicromato medidos/ Absorb.
estandar relativo. Calcular pendiente, intersección a
eje-y y coeficiente de correlación,
relacionando volumen de dicromato teórico (“x”) y
volumen obtenido (“y”).

Sacar conclusiones respecto a la linealidad de las

mediciones con la micropipeta.

FIN
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Procedimiento:
o Valoració n de linealidad GENOVEVA
a) Prepare una serie de 10 tubos con 4 ml de agua g.r. y añ ada cuidadosamente
volú menes de dicromato de potasio desde 10 l hasta 100 l.
b) Mezcle por inversió n. Lea la absorbancia a 500 nm contra blanco de agua.

Tubo Dicromato μl Absorbancia Abs. Esperada Factor de Volumen

(valor de “x”) (valor de “y”) dilución obtenido
1 10 0.057 0.228 401 11.29
2 20 0.095 0.191 201 18.91
3 30 0.180 0.242 134.3 35.94
4 40 0.224 0.226 101 44.75
5 50 0.257 0.208 81 51.48
6 60 0.336 0.227 67.67 67.42
7 70 0.390 0.227 58.14 78.66
8 80 0.425 0.217 51 85.94
9 90 0.492 0.223 45.44 99.36
10 100 0.550 0.225 41 111.39
r= 0.9978 Media = 0.2118 r= 0.9959

Pend. = 0.0055 Desv = 0.01722 Pend. = 1.1438

Inters.= -0.01 C.V. = 8.128% Inter. = - 2.6337

c) Calcular pendiente, intersecció n a eje-y y coeficiente de correlació n, relacionando

volumen de dicromato (“x”) y Absorbancia (“y”). Construya la grá fica #1 correspondiente
al correlacionar absorbancia vs volumen de dicromato.

absorbancia vs volumen de dicro-

mato.
0.3
0.25
f(x) = 0.0029 x − 0.0358
0.2 R² = 0.990186969905851
ABSROBANCIA

0.15
0.1
0.05
0
0.000 20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 120.000
DICROMATO µL
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d) Calcule la absorbancia esperada multiplicando la absorbancia obtenida en cada tubo
por la dilución y dividiendo entre100 que es la dilución del estándar relativo. Anótela en la
columna correspondiente (cuarta) del cuadro de resultados. Obtenga la media, la desv
st. y el CV para este procedimiento.

e)Construya la gráfica # 2 correspondiente al correlacionar volumen obtenido vs volumen

teórico. El volumen obtenido = Absorb. esperada x l de dicromato medidos/ Absorb.
estandar relativo. Calcular pendiente, intersección a eje-y y coeficiente de correlación,
relacionando volumen de dicromato teórico (“x”) y volumen obtenido (“y”).

f) Saque conclusiones respecto a la linealidad de las mediciones con la micropipeta.

La linealidad que se obtiene con las mediciones de la micropipeta que nosotros utilizamos
está dentro del rango de aceptación, ya que el coeficiente de correlación se encuentra
cercano al valor de 0.999. Aunque el valor de la micropipeta real sea muy diferente al
valor nominal de la misma, los valores que mide sí son lineales y se encuentran dentro del
patrón de la línea recta, habiendo sólo unos puntos que se salen de la linealidad.

Durante el desarrollo de la práctica, tratamos de cuidar todos los factores que puedan
afectar la linealidad del método, como el volumen del agua que medíamos. Ese pudo
haber sido un factor importante para que variara un poco la linealidad, ya que aunque
intentamos cuidarlo mucho, pudo haber variaciones. A pesar de ello, nuestra pipeta tiene
una linealidad aceptable para decir que se encuentra dentro del rango de calidad.
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__________________________ ______________________ GENOVEVA
Firma del maestro Firma del alumno