Analista de laboratorio, Diplomado en Microbiología clínica , Desarrollo

en Bio Tec Centro de Entrenamiento

Biólogo de la U.N.F.V Diego Ramos Torriccelli
• Una forma de como poder
identificar a los
microorganismos y
reconocerlos, será mediante
la observación de su
crecimiento en sustancias
nutritivas artificiales llamadas
MEDIOS DE CULTIVO ,
donde al crecimiento del
microorganismo se le conoce
como cultivo.
Agar : Gelidium, Euchema y Gracilaria
 Esterilidad Consistencia

Agentes Humedad
reductores

Inhibidores Indicadores

Factores de
crecimiento pH
Nutrientes
• Presencia de O2
• Presencia de CO2
• Humedad
• Temperatura
SEGÚN SU CONSITENCIA :
• LIQUIDO
• SEMISOLIDO
• SOLIDO

POR SU ORIGEN :
• NATURAL
• SINTETICO
• SEMISINTETICO

SEGÚN SU USO :
• NO SELECTIVOS
• SELECTIVOS
• DIFERENCIALES
• ENRIQUECIMIENTO
• TRANSPORTE
• Es un proceso de gran importancia.
• Se pesara la cantidad del medio en un
volumen de agua destilada adecuada a una
temperatura adecuada.
• Se esterilizara ( 121 °C por 15 minutos en
autoclave )
• Se distribuye en placas o tubos
( el medio debe de estar a una temperatura
de 40 -50 °C para evitar la condensación del
vapor)
• La agregación de suplementos como :
sangre , huevo se realizara a una
temperatura indicada. (40 -50 °C )
ISO 7218:2007(E) Microbiology of food and animal feeding stuff-
General rules for microbiological examinations
• Se agregara en placas de 90 mm
15 – 20 ml de volumen del medio.

• Secado de placas estufa 25-55 °C

(20 min.) o en flujo laminar.

ISO 7218:2007(E) Microbiology of food and animal feeding stuff-General rules for microbiological
examinations
• El almacenamiento de los medios ya
preparados será a 2 y 8 °C , en un lugar
oscuro y envueltos por 1 semana.
• Las placas de grupos de 10 placas ya
abiertos pueden usarse durante una
semana siempre que se almacenen en un
lugar limpio a una temperatura entre 2 y 8
°C.
• La refrigeración favorece la deshidratación
del medio 2 – 8 °C
• Evitar la condensación y la congelación

Se considerara las indicaciones del fabricante

• El recalentamiento del medio se debe hacer poniendo
el frasco o tubo con la tapa cerrada en baño maría,
microondas o en autoclave en vapor fuerte y debe ser
el mínimo para evitar que el medio pierda calidad.

• Los medios refundidos tienen una cierta tendencia al

oscurecimiento o precipitación.

• Evitar el sobrecalentamiento

• Nunca refundir el agar más de una vez.

 Siempre considerar las condiciones de
almacenamiento de la casa comercial

Fuente:http://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a2834ae226e6.pdf
 CAPACITACION
DEL PERSONAL

Proceso continuo, destinado a la formación,

entrenamiento y actualización o
perfeccionamiento especifico del personal

FORMACION ENTRENAMIENTO
• Se debe mantener un
registro de cada frasco de
medio de cultivo, con el
nombre del producto,
nombre de la casa
proveedora, fecha de
recibo, fecha de
expiración, número de
lote y fecha en que se
abrió el frasco
• Cada lote preparado de medio de cultivo se debe probar
antes de su uso rutinario, mediante el uso de cepas
ATCC (American Type Culture Collection),tanto para
crecimientos positivos y negativos. Se debe guardar un
registro de los resultados obtenidos.

• Las pruebas básicas de control de calidad de los medios

preparados deben incluir: medición del pH, pruebas de
esterilidad, capacidad de crecimiento y reacción,
aspecto, dureza y profundidad del agar.
• Medición del pH : Antes de autoclavar y se ajustara con NaOH 1M ó
HCl 1M (ISO 11133:2014)

• Profundidad del agar : 4mm para placas de 90 mm (vol.15– 20 ml)

• Control de esterilidad: Incubar al menos el 5% de las placas

preparadas por lote a 35 C durante 24 a 48 horas.

• Control de crecimiento : se usara al menos el 5 % de los medios

preparadas por lote . Uso de cepas ATCC
Fuente: http://www.ispch.cl/sites/default/files/PR%20CCI%20Bacteriolog%C3%ADa.pdf
• Para el agar Mueller-Hinton, empleado como medio de
soporte para realizar la prueba de susceptibilidad por el
método de difusión en agar (Método de Bauer and Kirby),
el control de calidad debe extenderse hacia la
determinación de las concentraciones de timina/timidina,
y la concentración de cationes.

• Controlarcantidad de cationes, pH y de timina/timidia

mediante cepas ATCC E. fecalis y E coli
• Control de pH. Cepa control ATCC Escherichia coli 25922.
Frente a: Gentamicina y Tetraciclina.

• PH. Ácido:
Menor actividad de: Macrólidos, Aminoglucósidos y Quinolonas.
Mayor actividad de: Penicilina, Tetraciclinas.
• PH básico: efecto contrario.

• Concentración de Cationes: Cepa control: P.aeruginosa ATCC 27853.

Frente a: Gentamicina = 16 – 21 mm.

• Concentración de Cationes Bivalentes:

Ca : 20 – 25 mg/L. Mg : 10 – 12,5 mg/L.
• Concentración mayor afecta a: Colistin, Tetraciclinas Aminoglucósidos
• Exceso de Zn afecta Carbapenemes

Fuente: http://www.ssucbba.org/_admin/pdf/CONTROL%20DE%20CALIDAD%20INTERNO%20BAUER.pdf
• Concentración de Timina-Timidina Cepa : E. faecalis ATCC 29212
frente a SXT

• Mayores concentraciones: FALSA RESISTENCIA de SXT,

trimetroprima y otras Sulfonamidas.

• Halo de inhibición >= a 20mm.

• Exceso: Corregir con plasma de caballo al 3% que contiene

timidina fosforilasa.
http://www.ispch.cl/sites/default/files/PR%20CCI%20Bacteriolog%C3%ADa.pdf
Fuente: CLSI (ver referencias bibliográficas)
Mayor profundidad FALSA RESISTENCIA.
Menor profundidad FALSA SENSIBILIDAD.
Sea esto por la difusión de los discos
http://www.ispch.cl/sites/default/files/PR%20CCI%20Bacteriolog%C3%ADa.pdf
http://www.ispch.cl/sites/default/files/PR%20CCI%20Bacteriolog%C3%ADa.pdf/
• Tamaño de las colonias
Pequeñas, medianas y grandes
• Forma de las colonias
Puntiforme, Irregular y Circular
• Borde las colonias
Redondeado Ondulado, Rizoide y
Lobulado.
• Superficie
Plana, Plano convexa, Convexa
• Color de las colonias
Morfología colonial bacteriana superficie. Morfología colonial bacteriana borde.

Morfología colonial bacteriana borde.

Klebsiella ,Enterobacter,Hafnia y Serratia
• Es un medio selectivo y
diferencial, para la diferenciación
de las Enterobacteriaceae
fermentadoras y no fermentadoras
de lactosa.
• Tiene como inhibidores a las sales
biliares y al cristal violeta
• Indicador al rojo neutro
El crecimiento en agar Mac
Conkey nos darán dos tipos B
de reacciones tanto las
bacterias lactosas + (A y B) A
como las bacterias lactosa –
(C ), La morfología de las
colonias que se observan nos
dará una sospecha de las
bacterias que podremos
identificar,
C
Fig. 2 : se observa crecimiento de bacterias lactosa positivo, colonias y
medio color rosadas , por una disminución del pH.
A B

Fig. 3 : A)se observa colonias rosadas y medio rosado lactosa +

B) colonias incoloras color beige y medio , lactosas -
 Fig. 4: A) Bacterias lactosa + B) Bacterias
lactosa negativa

Fuente: https://microbeonline.com/macconkey-agar-mac-composition-preparation-uses-and-colony-characteristics/
Medio nutritivo
,enriquecido y diferencial
, el cual esta
suplementado con 5 %
de sangre de cordero
para el crecimiento de
organismos exigentes
nutricionalmente y la
observación de la
producción de hemolisis
Incubación en condiciones
anaerobias (5% co2) para una
mejor producción de la hemolisis.

Los tipos de hemolisis a

observar: Alfa, Beta o Gamma
• Alfa :Lisis parcial de los
glóbulos rojos, con la
observación de un halo color
verdoso alrededor de la
colonia.
• Beta: Hemolisis completa de
los glóbulos rojos con la
observación de un transparente
alrededor de la colonia.
Hemolisis beta
• Gamma: no hay presencia de
hemolisis.
El uso de la sangre de carnero es de
gran importancia para la observación de
la producción de la hemolisis en los
medios , teniendo las siguientes
ventajas:

• Los glóbulos rojos son mas pequeños

• Son mas sensibles a las hemolisinas
• Se dará una reacción hemolítica
completa .(beta hemolisis)
• Al ser desfibrinada los glóbulos rojos
no se compactan tanto y se conversan
mejor
• La cantidad de glucosa en el suero es
baja , presentando halos de hemolisis
adecuados
Robin Kirby et al. 1995. J Clin Microbiol. 33: 1154-1157
• Se incrementan considerablemente las hemólisis de tipo
beta,
• Se evitan reacciones hemolíticas dudosas, pues en agar
sangre de carnero se diferencian perfectamente las
hemólisis verdosas de tipo alfa, de las reacciones de
hemólisis completa tipo beta.
• La sangre de carnero desfibrinada asépticamente, no
contiene anticoagulantes (como la sangre vencida de
Banco), ni anticuerpos contra las bacterias patógenas del
hombre o antibióticos, por lo que en general permite
mejores crecimientos

http://www.plosone.org/article/fetchObject.action…
http://jcm.asm.org/content/44/9/3346.full.pdf
http://www.eisrjc.com/…/Preparation_of_the_Blood_Enriched_A…
ESTUDIOS COMPARATIVOS

Fuente: http://www.scielo.org.ar/pdf/recyt/n14/n14a03.pdf
Colonias grandes con un
grado de pigmentación .
Identificación: S. auerus

Crecimiento de S. aureus en agar

sangre
• Medio selectivo
• Con presencia reducida de
electrolitos
• La cistina permite el
crecimiento de bacterias
exigentes (Colonias enanas)
• Tiene como carbohidrato
fermentable a la Lactosa
• Medio de gran importancia
para los urocultivos

Fuente : https://www.bd.com/resource.aspx?IDX=8758
• El uso del medio C.L.E.D. nos
permitirá diferencias entre bacterias
lactosas + y lactosas - .
• Un viraje al amarillo del medio nos
indicara una reacción + y un viraje
del color al azul nos indicara
lactosas –
• La deficiencia de electrolitos no le
permite a Proteus sp invadir el medio
por el fenómeno inhibido de
swarming.
• De gran importancia para un
recuento semicuantitativo
• Se da una recuperación de colonias Crecimiento de bacterias lactosa +
enanas .
A B

Identificación bacterias A) lactosa + y B) lactosa – EN AGAR C.L.E.D.

• Medio selectivo y diferencial
para cocos del grupo de
staphyloccocus.
• Presenta 7.5 % de ClNa como
inhibidor.
• Manitol como carbohidrato
fermentable .
• Bacterias que fermenten el
manitol disminuirán el pH dl
medio haciendo virar el
indicador a color amarillo ,
bacterias que no lo fermenten
se mantendrá el color original
La fermentación del manitol podrá ser para la especies de S. aureus y S. saprophyticus
.

S. aureus S. saprophyticus S. epidermidis

Fermentación del
+ +/- -
Manitol
• Medio selectivo para el
aislamiento de
Pseudomonas aeruginosa
• De gran importancia para el
uso clínico
• Se identifica la producción
de pigmentos como la
pioverdina. (Toxina)
• La cetrimida , es un agente
tensioactivo que daña la
membrana celular de la
microbiota acompañante.
• El uso del agar cetrimida , es
de gran importancia ya que
nos permite tener una
identificación altamente
presuntiva en la
identificación de
Pseudomonas aeruginosa ,
complementando esta con
una prueba de oxidasa +,
seria un buen complemento
Crecimiento de colonias verdes con
olor a uvas
 A B

A)Crecimiento de colonias sospechosas de P. aeruginosa

B) crecimiento de serratia sp con producción de pigmentos rojos – rosados
• Medio selectivo y diferencial
para la identificación de
enterococcus , mediante la
hidrolisis de la esculina a
esculetina la cual reacciona
con la sal férrica para formar
un complejo marrón – negro
• Presenta como inhibidor la
bilis , cantidad alta.
• También pueden crecer
cepas del grupo D: S. bovis
y S. equinus
 glucosa

Esculina
(Glucósido)

Acido
Esculetina

6,7 hidroxicumerina

Fe3+
B- Glucosidasa Compuesto
fenólico férrico
• Medio diferencial
• Se observara las siguientes
reacciones :
Fermentación de carbohidratos
Producción de gas
Producción de H2S
• Presenta dos zonas : pico y fondo
• Siembra por punción y estriado
• Importante en la batería de
identificación bacteriana
 Medida 3cm la
porción inclinada y el
fondo
CONDICIONES
AEROBIAS

Degradación
oxidativa de
peptonas
Degradación
carbohidratos

Es importante una
buena formación del CONDICIONES PARCIALES
pico de flauta y un ANAEROBIAS
fondo para generar
las dos condiciones
de reacción
• Reacciones de las
bacterias que crecen en
Glu -
medios diferenciales.
• La fermentación de los
carbohidratos en estos
medios se observara
mediante el viraje de
Glu +
color de este (TSI, Rojo
de fenol )
• Es muy importante la
concentración de los
carbohidratos para un
viraje total o parcial del Lac +

medio.
• Las bacterias que no fermenten los hidratos de carbono , usaran las
peptonas mediante un proceso de degradación oxidativa dadas estas en
condiciones aerobias , produciendo como resultados de esta reacción
aminas las cuales alcalinizaran el medio del cultivo aumentado el p.H. (mayor
a 7.2) y virando el medio a un color rojo intenso (Rojo de fenol p.H. 7.2 )

• Las bacterias que fermentan la glucosa , producirán compuestos acidos,

disminuyendo así el p.H. del medio (menor a 7.2 ) y virando el medio en su
totalidad a un color amarillo entre las 14 y 16 horas de incubación, al
terminar la cantidad minina de este azúcar (0.1gr) las bacterias utilizan las
peptonas las cuales producirán compuestos que aumentaran el p.H haciendo
virar el indicador a color rojo , al darse esta reacción solo en condiciones
aeróbicas es que el cambio de viraje será en e pico de flauta.observandoce
una reacción a las 24 horas roja en el pico de flauta y amarilla en la fondo

• La bacteria que fermenten la lactosa , mantendrá el p.H. bajo , haciendo

virar el medio por completo a color amarillo por mas de 24 horas.
Reacciones:

La lectura de las reacción

tendrán las siguientes iniciales
Reacción acida (A)
Reacción alcalina (K)

A: Las reacciones con viraje del

medio a color amarillo son
reacciones positiva para la
fermentación de los
carbohidratos(A) A C D
B
K: las reacción con viraje del
medio a un color rojo mas • B) Control sin inocular

intenso son reacciones • A ) reacciones negativa k/k

negativas para la fermentación
• C)Reacción positiva para glucosa K/A
de los carbohidratos
• D) Reacción positiva para lactosa , glucosa y sacarosa A/A
• Las producción de gas se
evidencia con la presencia
de una burbuja en el
medio o rompimiento con
levantamiento de este
mismo.
• El gas producido se
obtiene de las rutas
metabólicas por la cual la
bacteria fermento los
carbohidratos
• El sulfuro de hidrogeno producido
por las bacterias será del
tiosulfato de sodio el cual aportara
los átomos de azufre que
reaccionaran con iones H+
formando H2S el cual es incoloro.

• La presencia de sales de hierro

reaccionaran con el H2S para
producir así un precipitado negro
insoluble FeS. (sulfuro ferroso)

• Para la formación del sulfuro de

hidrogeno se necesita un
ambiente acido hidrogeniones los
cuales reaccionaran con los
átomos de azufre del tiosulfato de
sodio.
• Medio diferencial .
• Se observara las siguientes
reacciones :
Descarboxilacion de Lisina
Desanimación de lisina

• Producción de H2S
• Presenta dos zonas : pico y fondo
• Siembra por punción y estriado
• Importante en la batería de
identificación bacteriana .
• Purpura de Bromocresol vira:
menor a 5.2 amarillo y mayor a 6.8
morado.
• DESCARBOXILACION :
• Los organismos que
descarboxilan la lisina
producen una reacción
alcalina ( color morado) o
neutra en la base del medio. forman un compuesto rojo
• Enzima lisina descarboxilasa
• DESAMINACION :
• Los organismos que
desaminan la lisina producen
un compuesto acido (alfa-ceto-
carbonico ) que al reaccionar
con la sal de hierro + O2
(color rojo en el pico y base
amarilla)
• Enzima lisina desaminasa
 Bacterias como E coli Bacterias como Proteus sp y
descarboxilan la lisina generando Providencia desaminan la lisina
la siguiente reacción generando la siguiente reacción
AGAR MIO
• Medio diferencial .
• Semisólido
• Se observara las siguientes
reacciones :
Descarboxilacion de la ornitina
Movilidad
Indol

• Siembra por punción y estriado.

• Importante en la batería de
identificación bacteriana .

• Purpura de Bromocresol vira:

menor a 5.2 amarillo y mayor a 6.8
morado.
• La descarboxilacion de la ornitina se
dará en condiciones acidas , en donde
al degradas la ornitina se formara
putrescina la cual aumentar el valor
del p.H haciendo virar el medio a color
lila.
• Las reacciones neutras son aquellas
en donde la observación del medio en
la base se encuentra con un olor gris
considerándose estas +
La descarboxilacion de la ornitina se dará en un medio
acido, la formación de la amina, alcalinizara el medio
haciéndolo virar a color lila a las 24 horas de
incubación.
La tripteina aporta una gran
cantidad de triptofano para
la posterior degradación por
la enzima triptofanasa a
partir del cual se formara el
indol el cual podra ser
revelado con el reactivo de
kovacs (dimetil- ENZIMA CONSTITUTIVA

aminobenzaldehido) , dándonos
una reacción + una anillo
color fucsia o rosado
intenso.
Las triptofanasas catalizan la reacción de
desaminación, durante el cual se remueve
el grupo amino (NH2) de la molécula de
triptófano. Los productos finales de la
reacción son el indol, ácido
pirúvico, amoníaco (NH3) y energía
 La reacción para la producción de indol
se puede observar con el reactivo de
kovacs o con el de Erlich el cual es mas
sensible.
• Medio diferencial
• Identificación de uso de
citrato como única fuente
de carbono.
• Presenta como indicador
al azul de bromotimol el
cual vira azul en un
medio alcalino.
• Evidencia la presencia de
la citrato permeasa.
 USO DEL CITRATO

Oxalacetato

Citrato
Carbonatos

Genera
piruvato ácidos
orgánicos
Bicarbonatos
E. Coli – alcalinos
Klebsiella +
Enterobacter +
MEDIOS DE IMPORTANCIA
• Contienen sustratos que son
• degradados por enzimas
• bacterianas produciendo
• compuestos coloreados.
• β- glucoronidasas
• β-glucosidasas
• β- galactosidasas
• Ventajas:
• – Se pueden obviar la
• identificación en mas de 50%
• de los aislamientos urinarios.
• – Se detecta cultivos mixtos con
• mas facilidad.
IDENTIFICACION BACTERIANA

Klebsiella
pneumoneae
Proteus mirabilis (indol –)
Lic.TM: JSP
GRACIAS