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Computación e ingeniería química 24 (2000) 2339–2350

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Uso de sistemas expertos para la síntesis de proteínas posteriores.

procesos
M. Elena Lienqueo *, Juan A. Asenjo
Departamento de Ingeniería Química,Centro de Ingeniería Bioquímica y Biotecnología,Uni6ersidad de chile,Beaucheff861,santiago,Chile

Abstracto

Este artículo describe los desarrollos recientes en el diseño de procesos racionales y su aplicación en biotecnología para procesos posteriores a gran escala. Para implementar un sistema experto, es necesario dividir el proceso de separación en dos partes:

recuperación y purificación, porque la información y el conocimiento heurístico disponible son diferentes en cada parte. En el caso del proceso de recuperación, la implementación de un sistema experto, llamado Prot –Ex, sólo utiliza reglas heurísticas de la literatura y

expertos humanos. Las secuencias sugeridas fueron probadas con un ejemplo real y dieron un resultado satisfactorio. Para el proceso de purificación se han definido dos criterios para seleccionar las secuencias óptimas, el criterio SSC y el criterio de pureza. Ambos

criterios se implementaron en un sistema experto, Prot –Ex–Purificación. Este sistema experto fue validado con ejemplos experimentales, en dos casos y las secuencias sugeridas fueron adecuadas y válidas. Sin embargo, las secuencias sugeridas por el criterio de

pureza tienen menos pasos que las secuencias sugeridas por el criterio SSC y el algoritmo de pureza consume menos tiempo y recursos computacionales que el algoritmo SSC, entonces el uso del criterio de pureza es más recomendable para la selección de secuencias

de purificación. Finalmente, consideramos las secuencias propuestas encontradas por el sistema experto como un muy buen punto de partida para la selección de procesos industriales, un claro caso de 'amplificación experta'. © 2000 Elsevier Science Ltd. Todos los

derechos reservados. las secuencias sugeridas por el criterio de pureza tienen menos pasos que las secuencias sugeridas por el criterio SSC y el algoritmo de pureza consume menos tiempo y recursos computacionales que el algoritmo SSC, entonces el uso del criterio

de pureza es más recomendable para la selección de secuencias de purificación. Finalmente, consideramos las secuencias propuestas encontradas por el sistema experto como un muy buen punto de partida para la selección de procesos industriales, un claro caso de

'amplificación experta'. © 2000 Elsevier Science Ltd. Todos los derechos reservados. las secuencias sugeridas por el criterio de pureza tienen menos pasos que las secuencias sugeridas por el criterio SSC y el algoritmo de pureza consume menos tiempo y recursos

computacionales que el algoritmo SSC, entonces el uso del criterio de pureza es más recomendable para la selección de secuencias de purificación. Finalmente, consideramos las secuencias propuestas encontradas por el sistema experto como un muy buen punto de

partida para la selección de procesos industriales, un claro caso de 'amplificación experta'. © 2000 Elsevier Science Ltd. Todos los derechos reservados. un caso claro de 'amplificación experta'. © 2000 Elsevier Science Ltd. Todos los derechos reservados. un caso claro

de 'amplificación experta'. © 2000 Elsevier Science Ltd. Todos los derechos reservados.

Palabras clave:Recuperación de proteínas; Purificación de proteínas; Procesamiento en bajada; Bioseparación; Experto en Sistemas

1. Introducción a gran escala, es necesario obtener el mayor rendimiento posible

minimizando los recursos utilizados y por tanto el coste (Asenjo,
En la industria biotecnológica moderna, después de una 1990). Los pasos principales en un proceso de separación de
fermentación exitosa o reacciones enzimáticas, el producto proteínas a gran escala generalmente no son más de ocho; se
deseado debe separarse y purificarse. Los pasos necesarios muestran en la Fig. 1. Las principales operaciones unitarias
para obtenerlos se conocen comúnmente como procesamiento utilizadas en DSP se muestran en la Tabla 1.
posterior (DSP), que puede representar hasta el 60% del costo En la actualidad, los mercados de bioproductos se están
total, excluyendo el costo de las materias primas compradas volviendo muy competitivos. Por lo tanto, es importante elegir
(Lee, 1992). El DSP suele estar compuesto por una secuencia de el diagrama de flujo óptimo lo antes posible, ya que una vez
operaciones de recuperación y purificación, cuyo objetivo final que el proceso ha sido aprobado por las agencias reguladoras,
es obtener la proteína requerida con un nivel de pureza sus características son fijas y su cambio es costoso. Por lo tanto,
predeterminado. El proceso de recuperación se caracteriza por se hace necesario utilizar herramientas de diseño racionales
el objetivo de obtener el producto en solución del sistema de para este propósito. Para lograrlo podemos reconocer dos
producción. La purificación toma la solución multiproteica y tareas diferentes:
purifica el producto proteico individual a un alto nivel de 1. Selección de secuencia de separación o generaciones de
pureza, que generalmente tiene una pureza superior al 90%. diagramas de flujo.
Además, sobre 2. Diseño de operaciones unitarias individuales.
En este artículo centraremos nuestra atención en la primera tarea. La
II Taller Panamericano en Ingeniería de Sistemas de Procesos y selección de secuencias de separación es un procedimiento complejo en
Catálisis, 2 y 3 de septiembre de 1999, Santa Fe, Argentina
el que un diseño evoluciona desde una etapa preliminar a una etapa
* Tel.: +1-405-3255811; fax: +1-405-3255813.
mi-Correo Electronico:bagajewicz@mailhost.ecn.uoknor.edu (M. final a modo de prueba y error, revisando y refinando repetidamente las
Bagajewicz). suposiciones iniciales y restringiendo.

0098-1354/00/$ - ver portada © 2000 Elsevier Science Ltd. Todos los derechos
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2340 METRO.mi.Lienqueo,j.A.Asenjo / Informática e Ingeniería Química24 (2000) 2339–2350
ciones. Para los procesos de recuperación de proteínas, las
generaciones de diagramas de flujo siempre tienen el mismo
tipo de operaciones unitarias (ver Tabla 1). El problema que hay
que resolver es, por ejemplo, elegir entre operaciones
alternativas. Por ejemplo, para la disgregación celular es
necesario seleccionar entre un homogeneizador y un molino de
lecho o para la separación celular entre microfiltración de flujo
cruzado y centrifugación. Esta selección se realiza más o menos
utilizando heurísticas, es decir, utilizando reglas generales para
llegar a una especificación rápida y fiable del tipo de equipo
(Leser y Asenjo, 1992). Otra forma de diseñar es utilizar
correlaciones y modelos matemáticos apropiados para
optimizar la tarea.
Por otro lado, para los procesos de purificación de
proteínas el diagrama de flujo consta de una secuencia
cromatográfica (ver Tabla 1). Esta secuencia debe cumplirse.
Fig. 1. Diagrama de flujo general para el procesamiento posterior de proteínas.
tabla 1
Principales pasos y operaciones unitarias utilizadas en el procesamiento posterior.
Etapas Paso
Recopilación de proteínas6ery
Separación celular
Disrupción celular (solo para proteínas
intracelulares)
Separación de desechos (solo
para proteínas intracelulares)
Concentración
Purificación de proteínas
Pretratamiento o aislamiento primario
Purificación de alta resolución
Pulido del producto final.
con máximo rendimiento y un mínimo número de
pasos (1, 2 o 3). Esta parte del proceso se lleva a cabo
en la ingeniería de procesos químicos clásica,
encontrando una solución rigurosa utilizando
métodos numéricos como técnicas de optimización
matemática (Jennings, Teo, Wang & Yu, 1995) o
utilizando un enfoque de sistemas expertos (Eriksson,
Sandahl, Brewer & Osterlund, 1991; Forslund, 1995).
Para la selección de una secuencia óptima, las
técnicas puramente matemáticas tienen un uso
limitado en biotecnología debido a la falta de bases
de datos y ecuaciones de diseño útiles. El enfoque de
sistemas expertos es más atractivo porque permite el
uso de conocimiento empírico que no es de
naturaleza rigurosa y es típico del utilizado por
expertos (Asenjo y Maugeri, 1992). En este papel,
Operaciones unitarias
Centrifugación, proceso de membrana (filtración, microfiltración), partición acuosa de
dos fases
Homogeneización, molienda de perlas, lisis y permeabilización química y enzimática.
Centrifugación, procesos de membrana (microfiltración, ultrafiltración), partición acuosa de
dos fases.
Ultrafiltración, precipitación
Adsorción por lotes, cromatografía de intercambio iónico, adsorción por afinidad,
cromatografía de interacción hidrófoba, partición acuosa de dos fases
Cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de intercambio iónico de alta
resolución, cromatografía de afinidad, cromatografía de quelatos metálicos (IMAC),
cromatografía de colorante-ligando HPLC
Filtración en gel (GF) HPLC, cromatografía de intercambio iónico
 METRO.mi.Lienqueo,j.A.Asenjo / Informática e Ingeniería Química24 (2000) 2339–2350
Tabla 2
Limitaciones potenciales
Restricciones Observaciones
Rango de pH El producto sólo es estable en un rango de pH (por
ejemplo, 4-9)
Gama de El producto es estable sólo hasta cierta
temperatura temperatura.
proteasas Eliminación de proteasas, porque podrían
degradar el producto proteico.
Cuerpos de inclusión Los cuerpos de inclusión deben solubilizarse y
replegarse.
2. Aspectos generales para el diseño de un proceso de separación de
proteínas.
El diseño de un proceso de recuperación y purificación de
proteínas comparte muchas características con otras actividades de
diseño de ingeniería. Para diseñar un proceso o una operación se
requiere:
1. Satisfacer una serie de limitaciones, como pureza,
calidad, temperatura y pH del proceso, rendimiento
deseado, etc.
2. Conocer las propiedades de los materiales, por ejemplo
propiedades químicas y bioquímicas, propiedades
termodinámicas y de fluidos del material de proceso.
Utilizar la información y el conocimiento de (1) y (2) para
proponer una secuencia de equipos interconectados en un
orden particular.
3. Información básica para diseñar un proceso de separación
El diseño de un proceso para purificar económicamente una
proteína, manteniendo un alto rendimiento y aún así obteniendo un
producto prácticamente puro y minimizando el costo, requiere
cuatro consideraciones principales:
1. Definición de producto final.
2. Caracterización del material de partida.
3. Definir posibles pasos y restricciones de separación.
4. Evaluación de posible integración de procesos.
3.1.Definición del producto final
Es necesario definir el producto final y tener
información sobre su uso. Por ejemplo:
1. ¿Cómo se va a utilizar el producto?
Industrial.
Diagnóstico.
Reactivo de laboratorio.
Terapéutico.
Las preguntas sobre el uso y la pureza son vitales (p. ej.
80, 99 o 99,98 % de pureza), así como rangos permitidos de
concentraciones de impurezas específicas. Con las proteínas
terapéuticas se debe minimizar cualquier impureza, mientras que
2341
Para la producción de enzimas industriales a granel este no es
el caso.
1. ¿Qué tamaño tiene el
caudal? Más grande que
3m3/h. Menos de 3m3/h.
3.2.Caracterización del material de partida.
El segundo punto importante es la caracterización del
material de partida. El diseño del proceso dependerá
principalmente de las propiedades físicas, químicas y
bioquímicas de los materiales contaminantes del caldo
original y de las proteínas que constituirán el producto
final. Las propiedades del material de partida estarán
parcialmente determinadas por:
1. Su fuente de fermentación.
Bacteriano.
Levadura.
Célula de mamífero.
2. ¿Qué tan grande es la concentración de células?
3. El tipo de medio de cultivo utilizado.
Presencia de albúmina.
Suero de ternera.
Presencia de proteasas.
Cuerpos sólidos como células enteras o restos de células.
4. Localización del producto.
Intracelular.
Extracelular.
5. Propiedades fisicoquímicas del producto y de las
proteínas contaminantes en la mezcla proteica final en
solución.
Carga superficial a diferentes pH y pI.
Hidrofobicidad superficial.
Peso molecular.
Bioespecificidad hacia ciertos ligandos.
6. La estabilidad del producto final también es de suma
importancia, ya que afectará los tipos de operaciones que
se pueden utilizar, así como los tiempos de
acondicionamiento y procesamiento que se pueden realizar.
3.3.Definir posibles pasos y restricciones de separación.
Es necesario tener una base de datos con todos los pasos de
separación posibles (Tabla 1) y considerar todas las limitaciones
potenciales (Tabla 2).
3.4.mi6Evaluación de la potencial integración del proceso.
Finalmente, el proceso de producción debe intentar integrar
en la medida de lo posible el proceso upstream, la fermentación
y el downstream. Asenjo y Leser (1996) han descrito posibles
áreas y niveles de integración de procesos. La integración de
procesos puede involucrar todo el proceso, partes específicas
del mismo u operaciones unitarias particulares como se
muestra en la Fig. 2. En la Tabla 3 se muestran ejemplos de
integración de procesos entre fermentación y operaciones
posteriores y entre operaciones posteriores.
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Fig. 2. Las posibles áreas de integración de procesos.
El conocimiento mostrado en las secciones anteriores se
puede utilizar para definir un sistema experto para la selección
racional de procesos proteicos posteriores.
4. Sistemas expertos
Los sistemas expertos son programas que intentan
resolver problemas de forma similar a como los resolvería
un experto humano. Incorporan "reglas generales" que los
expertos en el campo han desarrollado a lo largo de años
de experiencia. Los problemas abordados no
necesariamente se resuelven de manera procedimental, a
menudo son vagos, complejos y pueden contener
información incompleta o inexacta (Nebendahl, 1988).
Los sistemas expertos contienen tres elementos básicos:
una base de conocimientos, un motor de inferencia y una
interfaz de usuario. La arquitectura de un sistema experto
se muestra en la Fig. 3. La base de conocimientos contiene
la información que el programa utiliza para tomar
decisiones. El motor de inferencia es el programa que
manipula la base de conocimientos para llegar a estas
decisiones. Finalmente, la interfaz de usuario permite que el
programa y el usuario se comuniquen entre sí de manera
efectiva (Harmon & King, 1985). Existen sistemas de
software, llamados shells, que se utilizan para la
manipulación de heurísticas, bases de datos y ecuaciones
algebraicas (como ecuaciones de diseño). Por ejemplo,
Nexpert Object™ y Clips. Existen muchos ejemplos del uso
de sistemas expertos en ingeniería química y bioquímica
(Siletti, 1989; Mulholland, Walker, Manis, Hinriks, Buydens,
Blaffer & Schoenmaker, 1991; Jakus, 1992; Forslund, 1995).
Tabla 3
Ejemplos de posible integración de procesos
Nivel de integración
Fermentación-aguas abajo (el diseño adecuado de la fermentación
paso puede proporcionar condiciones para facilitar el proceso aguas
abajo) Dentro aguas abajo (recuperación y purificación)
Fig. 3. La arquitectura básica de un sistema experto.
5. Implementación del sistema experto.
La implementación de un sistema experto para procesos de
separación de proteínas se dividió en dos partes diferenciadas:
1. Un primer sistema experto, denominado Prot–Ex, para la selección de
procesos de recuperación.
2. Un segundo, Prot-Ex-Purificación, para selección del
proceso de depuración.
Esta división se realizó porque ambos sistemas necesitan
diferente tipo de información y el conocimiento heurístico
disponible también es diferente (Asenjo, Herrera & Byrne,
1989). Prot-Ex utiliza sólo conocimiento heurístico mientras
que Prot-Ex-Purificación necesita una cantidad importante
de datos cuantitativos para hacer una buena selección.
En una consulta, ambos sistemas expertos están integrados
y controlados por el sistema experto principal. El principal
sistema experto:
“Recibe la información del usuario, base de datos o
otras fuentes.
“Organiza y da la información que cada sub-
necesidades del sistema experto para sugerir una secuencia.
“Recibe las secuencias sugeridas por cada subexperto
sistema
“Da las secuencias globales sugeridas al usuario o
otro programa.
Acción
Inmovilización celular, reciclaje celular mediante membranas, uso de
cromatografía en lecho expandido después de la fermentación.
Uso de separación líquido-líquido, uso de lecho expandido para
recuperación de proteínas, uso de cromatografía de interacción
hidrofóbica después de precipitación con sulfato de amonio
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Fig. 4. Diagrama del sistema experto principal y relación con los sistemas subexpertos de purificación Prot Ex y Pro Ex.

El diagrama general del sistema experto principal y del
sistema subexperto con su relación se muestra en la Fig. 4.
5.1.prot–ex para reco6cada proceso
El sistema experto para el proceso de recuperación se
implementó utilizando únicamente conocimientos
heurísticos. Las reglas heurísticas se obtuvieron de la
literatura y se consultó a renombrados expertos industriales
para aclarar puntos específicos sobre los cuales falta
conocimiento o hay información ambigua. Para ello fue
necesario facilitar a los expertos un cuestionario (Tabla 4).
Para los procesos de recuperación sólo es necesario
elegir entre dos o tres opciones. Por ejemplo, para la
separación de células si es necesario seleccionar entre
centrifugación y microfiltración de flujo cruzado. Esta
Se realizaron taciones para validar el sistema experto Prot –Ex.
La información básica utilizada para el sistema experto se
muestra en la Tabla 5. La Tabla 6 muestra una comparación
entre una secuencia sugerida por Prot –Ex y un buen proceso
para la recuperación de somatotropina producida en
Escherichia coli(Wheelwright, 1991).
Para este ejemplo, las secuencias de recuperación sugeridas
por Prot –Ex y el proceso industrial fueron muy similares. La
diferencia con el proceso publicado está en el paso 1, donde se
utilizó centrifugación en lugar de microfiltración. Para células
pequeñas comomi.coliLa microfiltración suele tener una clara
ventaja económica (Asenjo &
Tabla 4
Preguntas típicas presentadas a expertos en biotecnología para la implementación
del sistema experto en procesos de recuperación (Leser, 1996)

selección se basa en las siguientes variables:

Aspecto Pregunta
“Sensibilidad térmica del producto.
“Responsabilidad de las células al corte. Terapéutico ¿Cuál sería su recomendación si la utilización
“Tamaño de las células. producto del producto fuera terapéutica?
“Rendimiento del proceso. Separación celular ¿Se utilizan los 'procesos de acondicionamiento del caldo'

“Diferencia de densidad entre fase sólida y líquida. comunes, como calentamiento, congelación, coagulación,
floculación, enzimáticos u otros, para facilitar la separación
“Concentración celular en el caldo. celular en
Dependiendo del valor de cada variable es posible ¿DSP recombinante o no?
elegir una u otra opción. Disrupción celular ¿Estaría de acuerdo en que la mejor sugerencia de
Considerando los puntos anteriores se implementó el método mecánico para romper células es el
"homogeneizador de alta presión" para la mayoría de
sistema experto Prot –Ex. Tiene más de seiscientas
situaciones reales?
reglas lógicas para emular el razonamiento humano. Su Precipitación de ¿Cuáles son los métodos preferidos para la
implementación se llevó a cabo en un programa ácido nucleico precipitación de ácidos nucleicos?
comercial, Nexpert Object™ de Neuron Data. Cónsul-
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Tabla 5
Información básica para diseñar un proceso de purificación de Somatotropina (Lienqueo et al., 1996)

Definición del producto final

nombre de la proteína somatotropina

Pi 7,86 (estimado)
Peso molecular 22,0 KDa (estimado)
Hidrofobicidad superficial 0,93 millones (estimado)
Concentración 25,0 mg/ml
Curva de titulación
pH 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
Carga (culombio/molécula)10−25 4.77 2.42 1.03 0,12 − 0,03
Localización del producto Intracelular, cuerpos de inclusión
Utilización Industrial
rango de estabilidad del pH 4–9
Nivel de pureza final 94%
Afinidad específica No conocida
Caracterización del material de partida.
Fuente de fermentación mi.coli

Patricio, 1990). Por lo tanto, consideramos que las El primero, el criterio SSC, fue desarrollado por Asenjo
secuencias sugeridas por Prot-Ex son adecuadas y pueden y colaboradores (Asenjo, 1990; Asenjo & Maugeri, 1992;
usarse como punto de partida para la selección de un buen Leser & Asenjo, 1992). El criterio SSC considera que el
proceso industrial. parámetro clave es SSC, que caracteriza la capacidad de
la operación de purificación para separar dos proteínas.
5.2.prot–Ex–Purificación para selección de procesos de
El valor SSC se define como:
purificación.
SSC=DFhUd.i (1)
La selección de un proceso de purificación eficiente es un
paso crítico en los procesos posteriores. Estos pasos Factor de desviación (DF), esta variable relaciona la
generalmente no se eligen de manera racional, siendo el diferencia entre una propiedad de la proteína objetivo (por
método común el de "prueba y error". Por tanto, se ha ejemplo, el tiempo de retención adimensional en una
propuesto el uso de algunas reglas heurísticas básicas para técnica cromatográfica específica) y la misma propiedad del
los procesos de separación. Estas reglas son: (Asenjo & contaminante.
Patrick, 1990; Prokopakis & Asenjo, 1990): (2)
DF=kProducto−kDcontaminante
1. Elegir el proceso de separación en función de las diferentes
propiedades fisicoquímicas, tales como: Tiempo de retención adimensional (kD), esta variable
1.1. Carga superficial en función del pH (curva de representa el comportamiento de las proteínas en una
titulación) y pIs. separación realizada por filtración en gel, intercambio
1.2. Hidrofobicidad superficial. iónico o cromatografía de interacción hidrofóbica.
1.3. Peso molecular. Relaciones matemáticas para predecirkDse han obtenido
1.4. Propiedades bioquímicas como la bioespecificidad con utilizando las propiedades fisicoquímicas de las proteínas
diferentes ligandos. (Lienqueo, Leser y Asenjo, 1996).
1.5. Estabilidad a diferentes temperaturas y pH.
Tabla 6
2. Eliminar primero aquellas proteínas y compuestos
Comparación entre secuencias sugeridas por Prot –Ex y procesos industriales
contaminantes que se encuentran en mayor porcentaje. para la recuperación de somatotropina (Lienqueo et al., 1996)
3. Utilice un paso de alta resolución lo antes posible.
Las técnicas cromatográficas clasificadas según su Pasos Proceso industrial Secuencia sugerida por
eficiencia son: Prot –Ex
3.1. Afinidad.
1 Centrifugación Microfiltración de flujo cruzado
3.2. Intercambio iónico.
2 Alta presión Alta presión
3.3. Interacción hidrofóbica. homogeneización homogeneización
3.4. Filtración en gel. 3 Lavado de pellets por Centrifugación de disco
4. Realizar el paso de purificación más arduo al final 4 centrifugación Solubilización solubilización
del proceso (pulido final). 5 Renaturalización Renaturalización
6 Microfiltración Ultrafiltración
Considerando esas reglas se han definido dos criterios de 7 Concentración y
selección: criterio del Coeficiente de Selección de diafiltración
Separación (SSC) y criterio de Pureza.
 METRO.mi.Lienqueo,j.A.Asenjo / Informática e Ingeniería Química24 (2000) 2339–2350 2345

Fig. 5. Algoritmo de criterio SSC.

Factor de eficiencia (h)Este parámetro da cuenta de
la desigual capacidad de los diferentes procesos de
separación para separar diferentes proteínas. Su
valor es constante para cada tipo de separación y el
material cromatográfico utilizado y ha sido medido
experimentalmente (Lienqueo et al, 1996).
Factor de concentración (Ud.i)Su valor representa la
concentración relativa de cada contaminante. Lo hará
fectar los criterios de selección. De esta manera, primero se
deben eliminar los contaminantes que se encuentran en altas
concentraciones.
concentración de contaminantei
Ud.yo = (3)
concentración de todos los contaminantes
Se ha calculado matemáticamente la cantidad de
contaminante eliminado después de un paso cromatográfico.
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para diferentes situaciones (Lienqueo, Salgado & Asenjo,
1999)
Luego el criterio de SSC elige como mejor operación
cromatográfica aquella que tiene mayor valor de SSC (Leser,
Lienqueo & Asenjo, 1996). Después de determinar qué
técnica cromatográfica proporciona el valor máximo de SSC,
es necesario calcular la nueva concentración de todos los
contaminantes después de que se haya aplicado la técnica
cromatográfica seleccionada y
construir una nueva base de datos de concentración de
contaminantes. Con esta nueva base de datos el sistema
calcula el nivel de pureza y este valor se compara con el
nivel de pureza requerido. Se elige la secuencia óptima de
pasos hasta alcanzar el nivel de pureza requerido. El
algoritmo utilizado se muestra en la Fig. 5.
Considerando que el valor más importante es el nivel de
pureza final y que ahora hemos desarrollado un algoritmo para
calcular la pureza después de un paso de purificación,

Fig. 6. Algoritmo de criterio de pureza.

 METRO.mi.Lienqueo,j.A.Asenjo / Informática e Ingeniería Química24 (2000) 2339–2350 2347

Tabla 7 aquel que tiene el menor número de pasos totales.

Principales variables utilizadas para el SSC y criterios de pureza (Lienqueo et al.,
Considerando estos criterios se implementó un sistema
1999)
experto, Prot –Ex–Purificación, y su implementación se
Variable Símbolo Definición realizó en el mismo shell que Prot–Ex.
Para probar estos criterios, se llevaron a cabo consultas para
Criterio de CSS validar el sistema experto Prot –Ex–Purificación utilizando
Separación CSS SSC=DFhUd.i
ambos criterios. La Tabla 9 y la Tabla 10 muestran la
selección
coeficiente
información básica utilizada para la purificación de albúmina
factor de desviación DF DF=kDproducto-kDRelaciones sérica bovina (BSA) yb-glucanasa, respectivamente, y las Tablas
sin dimensiones kD contaminantes con propiedades 11 y 12 muestran una comparación entre las secuencias
tiempo de retención fisicoquímicas de las proteínas. sugeridas por Prot-Ex-Purification y la secuencia experimental
(Lienqueo et al., 1999)
para ambos ejemplos.
Factor de eficiencia h Valores para cada técnica cromatográfica
que se muestran en la Tabla 8 Valores
Ancho de pico S para cada técnica cromatográfica que se 5.3.Comparación entre SSC y criterios de pureza
muestran en la Tabla 8 Ud.i
Concentración Ud.i En ambos ejemplos las secuencias sugeridas son válidas y
factor
concentración de contaminantei adecuadas. Sin embargo, en el primer caso, la secuencia
=
Criterio de pureza
concentración de todos los contaminantes sugerida por el criterio de pureza tiene un paso menos que
Pureza pijama pijama
la sugerida por el criterio SSC, lo que significa menos costo
concentración de la proteína diana
de capital. Esta situación se da porque el criterio de SSC
= considera el contaminante que da el mayor valor de SSC
Sconcentración de las proteínas presentes
para una sola proteína. El criterio de pureza elige el paso
cromatográfico óptimo considerando todas las proteínas
contaminantes presentes. Por lo tanto, esta situación puede
Tabla 8
ocurrir cuando hay varios contaminantes presentes en
Expresiones y parámetros utilizados para los criterios de SSC y criterios de pureza cantidades similares como fue el caso en este ejemplo.
(Lienqueo et al., 1999)
Por otro lado, el criterio de pureza consume menos tiempo y
cromatográfico Factor de eficienciah Ancho de picoS
recursos computacionales que el criterio SSC, ya que el
técnicas
algoritmo de pureza proporciona las secuencias óptimas en
intercambio aniónico 1.00 0,15 menos tiempo que el algoritmo SSC.
intercambio catiónico 1.00 0,15
Interacción hidrofóbica 0,86 0,22 5.4.Comparación entre secuencias sugeridas y
Filtración en gel 0,66 0,46 secuencias experimentales.

En ambos ejemplos, las secuencias sugeridas dan como

Implementamos el criterio de pureza como posible criterio
de selección. Este criterio compara el nivel de pureza final
obtenido después de que se haya aplicado una técnica
cromatográfica particular.
El concepto de pureza se define como:
concentración de la proteína diana
Pureza=
Sconcentración de las proteínas presentes
Después de determinar qué técnica cromatográfica
proporciona el nivel de pureza más alto, el sistema elige esta
como técnica a utilizar en este paso. Se elige una secuencia de
pasos hasta alcanzar el nivel de pureza requerido. Finalmente,
el sistema crea una lista con la secuencia de operaciones
definida. El algoritmo se muestra en la Fig. 6.
Los principales parámetros, variables y correlaciones
utilizadas para SSC y criterios de pureza se resumen en las
Tablas 7 y 8. Ambos criterios consideran que el costo de cada
opción cromatográfica es igual, excepto la cromatografía de
afinidad. Por tanto, el sistema óptimo es el
resultado secuencias experimentalmente válidas y son un buen
punto de partida para un proceso industrial. Existen diferencias
entre el nivel de pureza final estimado y el experimental, que
son inferiores al 20%. Estas diferencias podrían originarse en
diferentes causas:
“Interacción hidrofóbica entre la proteína, esto
El efecto no se consideró en el desarrollo de
(4) correlaciones para el tiempo de retención
adimensional estimado para la cromatografía de
interacción hidrófoba (HIC) (Tabla 8).
“Picos cromatográficos asimétricos, la forma del pico.
podría ser diferente a la forma de un triángulo.
Las diferencias entre el nivel de pureza estimado y
experimental podrían minimizarse:
“Mejorando la predicción de la retención adimensional
Es hora de HIC.
“Usando una aproximación gaussiana en la representación
ción del pico cromatográfico en lugar de simplificaciones
triangulares.
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6. Conclusiones sistema experto llamado Prot-Ex-Purificación. Ambos sistemas

Es posible utilizar herramientas de inteligencia artificial,
como sistemas expertos, para la selección de procesos óptimos
de separación de proteínas. Para implementar un sistema
experto es necesario dividir el proceso de separación en dos
partes, porque la información y el conocimiento heurístico
disponible son diferentes en cada caso. La primera parte para la
recuperación de proteínas utiliza sólo reglas heurísticas de
expertos humanos y literatura; el sistema experto se llamó Prot
–Ex. La segunda parte de un proceso de purificación es un
sistema experto híbrido, que utiliza reglas heurísticas y
correlaciones y modelos matemáticos para seleccionar las
secuencias óptimas de purificación de proteínas.
expertos, implementados en el shell Nexpert Object™, fueron
integrados por un sistema experto principal.
Considerando los casos estudiados, como la recuperación
de somatotropina, la purificación de BSA y la purificación de
b-glucanasa, las secuencias propuestas por el sistema
experto son un buen punto de partida para un proceso
industrial práctico. Sin embargo, existen diferencias entre el
nivel de pureza estimado y experimental; estas podrían
minimizarse mejorando las correlaciones para predecir el
tiempo de retención y la aproximación de la forma del pico.
En el caso específico de Prot-Ex-Purificación, las
secuencias sugeridas por el criterio de pureza tienen menos

Tabla 9
Información básica para diseñar un proceso de purificación de BSA a partir de mezcla artificial (Lienqueo et al., 1999)

Definición del producto final

nombre de la proteína Albúmina sérica bovina (BSA)

pagI 4,9
Peso molecular 67,0 KDa
Hidrofobicidad superficial 0,86 millones

Concentración 2,00 mg/ml

Curva de titulación
pH 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
Cargar 1.03 − 0,14 − 1,16 − 1,68 − 2,5
(Coulomb/molécula)
10−25
Localización de la extracelular
producto
Utilización Industrial
rango de estabilidad del pH 4–9
Nivel de pureza final 94%
Afinidad específica No conocida
Caracterización del material de partida.
Fuente de fermentación Mezcla artificial (BSA, ovoalbúmina, taumatina, inhibidor de tripsina de soja)

contaminante Concentración inicial mw (kda) hidrofobicidad Curva de valoración (coulomb/molécula)10−25

(mg/ml) (METRO)

pH 4,0 pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0

ovoalbúmina 2.0 43,8 0,54 1,40 − 0,76 − 1,65 − 2,20 − 2.36

SBTI 2.0 24,5 0,90 1.22 − 0,76 − 1,54 − 2.17 − 2.13
taumatina 2.0 22.2 0,89 1,94 1,90 1,98 1,87 0,91

Tabla 10
Comparación entre secuencias sugeridas por Prot –Ex–Purificación y proceso experimental para la purificación de BSA a partir de una mezcla de cuatro
proteínas (Lienqueo et al., 1999)

Paso Secuencia sugerida por Prot –Ex–Purificación Proceso de validación experimental

Criterio de CSS Criterio de pureza

paso de cromatografía Pureza paso de cromatografía Pureza paso de cromatografía Pureza

1 Intercambio catiónico pH 33% Intercambio aniónico pH 7,0 64% Intercambio aniónico pH 7,0 64%
2 6,0 Interacción hidrofóbica 49% Interacción hidrofóbica 95% Interacción hidrofóbica 80%
3 Intercambio aniónico pH 7,0 97%
 METRO.mi.Lienqueo,j.A.Asenjo / Informática e Ingeniería Química24 (2000) 2339–2350 2349

Tabla 11
Información básica para el diseño de un proceso de purificación deb-1,3-glucanasa (Lienqueo et al., 1999)

Definición del producto final

nombre de la enzima b-1,3-glucanasa (bgl IIa)

Pi 4.1
Peso molecular 31 Kda
Hidrofobicidad superficial 0,00 millones

Concentración 0,62 mg/ml

Curva de titulación
pH 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0
Cargar 1.46 − 0,62 − 1,02 − 2,33 − 2,52
(Coulomb/molécula)
10−25
Localización de la extracelular
producto
Utilización Industrial
rango de estabilidad del pH 4–9
Nivel de pureza final 70%
Afinidad específica No conocida
Caracterización del material de partida.
Fuente de fermentación B.subtiloToC46

contaminante Concentración inicial mw (kda) hidrofobicidad pH 4,0 Curva de valoración (coulomb/molécula)10−25

(mg/ml) (METRO)

pH 5,0 pH 6,0 pH 7,0 pH 8,0

1 2.74 41.0 1.5 1.46 0,26 − 0,87 − 1,65 − 2,04

2 2.74 32,9 1.5 0.00 − 2,70 − 3,51 − 3,51
3 0,25 35,5 0,2 − 0,55 − 0,22 − 0,73 − 1,82
4 0,42 62,5 0.0 − 1,06 − 1,17 − 2,79 − 3,32
5 0,09 40,6 0.0 − 0,55 − 0,22 − 0,73 − 1,82
6 0,09 69,6 0.0 − 0,55 − 0,22 − 0,73 − 1,82
7 0,25 40,6 0.0 1.46 − 0,47 − 1,06 − 1,04
8 0,25 69,6 0.0 1.46 − 0,47 − 1,06 − 104

Tabla 12
Comparación entre secuencias sugeridas por Prot –Ex–Purificación y proceso experimental para la purificación deb-glucanasa (Lienqueo et al., 1999)

Paso Secuencia sugerida por Prot –Ex–Purificación Proceso de validación experimental

Criterio de CSS Criterio de pureza

paso de cromatografía Pureza paso de cromatografía Pureza paso de cromatografía Pureza

1 Interacción hidrófoba 32% Interacción hidrófoba 32% Interacción hidrófoba 35%
2 Intercambio aniónico pH 6,5 70% Intercambio aniónico pH 6,5 70% Intercambio aniónico pH 6,5 60–70%

pasos que las secuencias sugeridas por el criterio SSC, para tal enfoque. Se debe hacer un esfuerzo para
entonces el criterio de Pureza es más recomendable. generar dichos datos.
Por otro lado, el uso de sistemas expertos para la síntesis
de procesos proteicos posteriores es un claro caso de
"amplificación experta". El conocimiento heurístico de los
expertos se complementó con bases de datos y ecuaciones Agradecimientos
de diseño.
Para implementar una solución de este tipo de manera más Asistencia financiera de Fundación Andes y
global, faltan bases de datos sobre las propiedades de las proteínas. Vicerrectoría Académica de la Universidad de Chile (Beca
Con los avances en el área de la proteómica y la ingeniería de PG/080/97). Este proyecto también contó con el apoyo
proteínas, en unos pocos años podría haber suficiente información del Proyecto Cátedra Presidencial en Ciencias.
2350 METRO.mi.Lienqueo,j.A.Asenjo / Informática e Ingeniería Química24 (2000) 2339–2350
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