INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR DE IRAPUATO

ESTUDIOS CON RECONOCIMIENTO DE VALIDEZ

OFICIAL
NÚMERO 11-00065

USO DE MICROALGAS COMO FUENTE DE PROTEÍNA

ADICIONAL DE LOS DULCES DE LECHE
OPCIÓN V- PROYECTO DE INNOVACIÓN TECNOLÓGICA
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE LICENCIATURA EN
BIOLOGÍA
PRESENTA
FRAUSTO BARBOZA MARIA ELENA

DIRECTOR DE TESIS
ALEJANDRA HERNANDEZ BARRERA DRA. EN CIENCIAS

IRAPUATO, GTO. MAYO, 2023

1
Introducción
Las microalgas son microorganismos unicelulares, fotosintéticos, eucarióticos y
procarióticos que pueden crecer en una amplia variedad de condiciones, ya sean
aguas dulces, salobres, salinas o, incluso, residuales. Estos microorganismos
fotosintéticos tienen un ciclo biológico relativamente corto y una eficiencia de 3-5
veces mayor que las plantas terrestres para la captación de dióxido de carbono y el
aprovechamiento de la luz solar, por lo que tienen una mayor productividad en
términos de biomasa y metabolitos (Oswald 2003).
Debido a su alta tasa de reproducción y velocidad de crecimiento, tienen mayor
rendimiento en biomasa por unidad de superficie que las plantas, y el potencial de
estos microrganismos fotosintetizadores para la producción de una gama de
diferentes sustancias de interés químico-farmacéutico, además de sus aplicaciones
en la industria alimentaria y de la purificaron de aguas residuales.
En el presente trabajo se implementará el uso de microalgas como ingrediente base
en la elaboración de dulces de leche debido su alto contenido de: proteínas (60-
45%), grasas (20%), minerales (calcio, hierro, magnesio) y fibras (15% ) (Safi,
Zeibib, Merah, Pontalier, & Vaca), así mismo esta microalga es rica en vitaminas de
la gama B, así como vitamina C y E.
Chlorella vulgaris es una microalga que pertenece al phylum Chlorophyta, familia
Chlorellaceae. Se caracteriza por que sus células son circulares, su tamaño oscila
entre 2 y 10 micras y sus cloroplastos presentan como pigmentos fotosintéticos
principales clorofila a y b, los cuales tienen un pico de absorción máximo alrededor
de 430nm y de 675nm. (Ley, 2003) (Gonzalez, 2010).
La microalga Chlorella vulgaris ha sido ampliamente cultivada desde la mitad del
siglo XX precisando al término de la segunda guerra mundial, con la finalidad de
obtener una fuente confiable y económica de producción de proteínas y vitaminas.
De la cual se extraen β-carotenos, axatinas, y acido docosahexaenoico (DHA),
siendo estos compuestos de alto valor para las industrias alimentaria y
farmacéutica.
Las microalgas presentan grandes ventajas respecto a otras materias primas, como,
por ejemplo: no compiten con la producción de alimentos, no requieren del uso de
tierras fértiles y el empleo de superficie terrestre es mínimo, pueden crecer en
disímiles zonas adaptándose fácilmente a las condiciones medioambientales,
logran desarrollarse y crecer en aguas residuales utilizando los nutrientes de esta.
Además, que se considera una de las microalgas más estudiadas debido a su
versatilidad metabólica, que permiten su cultivo en condiciones mesotróficas.

2
De tal manera se implementarán en la elaboración de dulces de leche por su aporte
nutrimental permitiendo así la elaboración de un producto de valor comercial usando
la biotecnología e investigaciones adecuadas para que el producto sea de buena
calidad e inocuidad, así como los parámetros específicos en base a la normatividad
para que sea un producto benéfico para el consumidor.

Capítulo 1- Generalidades del proyecto

3
1.1 Objetivo general
Crear dulces de leche enriquecidos con proteína derivada de las microalgas
Chlorella vulgaris

1.2 Objetivos particulares

• Obtener la biomasa de la microalga Chlorella vulgaris
• Estandarizar una formulación de dulces de leche enriquecidos con proteína
derivada de las microalgas Chlorella vulgaris
• Analizar el contenido proteico de la biomasa de Chlorella vulgaris y el dulce
de leche y en la formulación
• Evaluar las propiedades organolépticas de la formulación
• Realizar análisis microbiológicos de la formulación

1.3 Justificación
Las microalgas, como una opción protéica con balance adecuado de aminoácidos,
vitaminas y minerales, y como fuente de colorantes, aditivos como espesantes,
combustibles, medicamentos, edulcorantes, aditivos alimenticios y de materia prima
para la fabricación de cosméticos y fármacos. En el caso de Chlorella vulguris, una
especie con un alto rango fotosintético puede fijar grandes cantidades de CO2, gas
que por sus altas concentraciones en la atmósfera está ocasionando lo que
conocemos como efecto invernadero. Debido a su alto contenido de proteínas,
vitaminas, minerales, fibras dietéticas, componentes antioxidantes y a sus
componentes desintoxicadores, se ha empleado como suplemento alimenticio y
también se emplea en el tratamiento de aguas residuales (Markou G & D
Georgakakis. 2011)

4
Capítulo 2 – Antecedentes

5
2.1 Historia de Chlorella vulgaris
En los últimos años se ha observado un incremento importante en publicaciones de
estudios sobre cultivos heterotróficos de diferentes especies de microorganismos;
como Spirulina platensis (Spirulina es una cianobacteria filamentosa, no es una
microalga (Cocoa, Barricak, Lucas, González, & Garcia, 2014), Tetraselmis suecica
(Azama, y otros, 2010), Auxenochlorella protothecoides (Wenguang, y otros, 2012),
Scenedesmus sp (Probir, y otros, 2016) y Chorella vulgaris (Qian, Wenguang, Min,
& Min, 2015).
Chlorella apareció en la tierra hace aproximadamente 1.5 o 2 mil millones de años.
Es un alga verde unicelular de agua dulce; de forma esférica, cerca de 2-10 micras
de diámetro que es extensamente encontrada en lagos y pantanos por todo el
mundo. El nombre Chlorella proviene del griego Chloros, que significa verde, y del
latín ella, que significa cosa pequeña, y fue descubierta y nombrada por el holandés
(M.W. Beyerinck en 1890).

2.2 Las Microalgas

Los cultivos de Chlorella vulgaris siguen siendo los más estudiados y partir de estos
se han logrado obtener, bajo condiciones de crecimiento heterotrófico, diversos
subproductos de interés tales como: proteínas, biodiesel, alimentos para animales,
emulsificadores, aditivos en las comidas, bioetanol, medicamentos, cosméticos,
nutracéuticos, antioxidantes y alimentos funcionales (Safi, Zeibib, Merah, Pontalier,
& Vaca, 2014). Las microalgas tienen un alto rendimiento por superficie cultivada,
diversifica el tipo de combustible a producir y no compite con la producción de
alimentos, siendo clasificado como un biocombustible de tercera generación.
Las microalgas presentan grandes ventajas respecto a otras materias primas,
como por ejemplo: no compiten con la producción de alimentos ,no requieren
del uso de tierras fértiles y el empleo de superficie terrestre es mínimo pueden crecer
en zonas adaptándose fácilmente a las condiciones medioambientales, logran
desarrollarse y crecer en aguas residuales utilizando los nutrientes de la
misma, aspecto muy importante debido a que reduce el uso de aguas frescas
tienen una alta eficiencia fotosintética y son grandes secuestradores de CO2 lo
que ayuda a reducir las emisiones de gas de efecto invernadero y crecen en un
amplio rango de temperaturas (entre -2°C y 50°C), (Safi, Zeibib, Merah, Pontalier, &
Vaca, 2014)

6
La producción de biomasa microalgal se orientó en principio a las especies de agua
dulce que podrían servir como suplemento en las dietas o, posteriormente, para el
tratamiento de aguas residuales. El interés se dirigió también al cultivo masivo de
microalgas marinas y de estuarios para alimento de especies animales apreciadas
(Ukeles, 1980). Las microalgas son fundamentales en la acuicultura marina, en la
alimentación de larvas de crustáceos, moluscos y ciertos peces (Soeder, 1976;
Persoone y Claus, 1980; Ukeles, 1980; De Pauw y Persoone, 1988). En los sistemas
de acuicultura las microalgas se utilizan como alimento de moluscos, peces, larvas
de crustáceos y zooplancton. Incluso crustáceos y peces cuyos adultos son
carnívoros requieren microalgas durante las larvarias ( Yufera y Lubián, 1990).
El desarrollo de estos cultivos implica la producción diaria de sustanciales
volúmenes de determinadas especies de microalgas marinas, y, de hecho, el cultivo
masivo de estas especies representa un auténtico cuello de botella para el
desarrollo de los sistemas de acuicultura (Persoone y Claus, 1980). Durante un
primer periodo de cultivo algal masivo, la principal atención se dirigió a los avances
tecnológicos y a las evaluaciones nutricionales, considerándose la utilización de
microalgas como alimento o suplemento alimenticio.
Sin embargo, la idea inicial de que las microalgas podrían utilizarse para evitar la
escasez de proteínas no ha tenido el éxito esperado, y se ha extendido un amplio
escepticismo sobre la explotación de fuentes no convencionales de proteína en
general, y de proteínas microbianas en particular (Litchfield, 1983). Este cambio de
actitud es debido principalmente a los elevados costes de producción microalgal,
que hacen que no puedan competir con alimentos tradicionales (Behr y Soeder,1
981), aunque proporcionan mayores rendimientos en proteína por unidad de
superficie y tiempo que las cosechas tradicionales, incluida la soja.
Si bien su utilización como fuente de proteínas es actualmente muy controvertida,
numerosas investigaciones sobre diferentes aspectos de las microalgas, tanto
básicos como aplicados, demuestran que la biomasa microalgal puede ser utilizada
para otras aplicaciones, como biofertilizantes, en la purificación de aguas
residuales, como acondicionadores de suelo, como alimento en acuicultura
(Abeliovich, 1986; Venkataraman, 1986; Boussiba, 1988).
Asimismo, se ha puesto de manifiesto la potencialidad de las microalgas para la
producción de gran variedad de sustancias, algunas de ellas de elevado precio,
como ácidos grasos, pigmentos, vitaminas, antibióticos, productos farmacéuticos y
otros productos químicos de interés (o sus precursores), así como hidrógeno,
hidrocarburos y otros combustibles biológicos (Cohen, 1986; Arad, 1988;
Borowizka, 1988). En los últimos años se ha establecido asimismo la idea de la
utilización de cultivos de microalgas para ensayos biológicos y fisiológicos y se ha

7
demostrado que son un medio adecuado para ensayar los efectos de distintos
agentes químicos sobre organismos vivos (Becker, 1994).
En función de estas aplicaciones, actualmente se reconoce la importancia comercial
de distintas especies de microalgas; sin embargo, el desarrollo industrial en
biotecnología microalgal es escaso, debido fundamentalmente a los elevados
costes de producción, como se ha citado anteriormente; para que la tecnología algal
alcance su potencial final estos deberán ser reducidos significativamente,
incrementando los rendimientos para aumentar la rentabilidad (Richmond, 1990).
Chromochloris zofngiensis (anteriormente conocida como Chlorella zofingiensis;
Fucíková & Lewis 2012) es una microalga verde de agua dulce que se puede cultivar
de forma autótrofa, heterótrofa y mixotrófica tanto en condiciones interiores como
en exteriores (Campo et al. 2004; Feng et al. 2011; Liu et al. 2013) y una rica fuente
de carotenoides (Azaman et al. 2017; Gong y Huang 2020; Minyuk et al. 2020).
Chlorella zofngiensis puede producir una gama de carotenoides secundarios
incluyendo astaxantina, cantaxantina, y adonixantina en condiciones de crecimiento
desfavorables (Orosa et al. 2001; Minyuk et al. 2020).
Una mutante de Chlorella zofingiensis ,puede acumular una mayor concentración
de zeaxantina bajo deficiencia de nitrógeno y alta irradiación lumínica junto con la
producción de β-caroteno (7.1 mg g−1 o 34.6 mg L−1) y luteína (13.8 mg g−1 o 33.9
mg L−1) (Huang et al. 2018). Además, el modo de crecimiento rápido, la menor
susceptibilidad a los contaminantes y las condiciones ambientales adversas hacen
de Chlorella zofngiensis un posible productor alternativo de la astaxantina natural
bajo una condición heterótrofa con glucosa y fuente de energía (Sun et al. 2008; Liu
et al. 2013). Liu et al. (2014) también mostraron que la astaxantina se acumula
durante condiciones de estrés en Chlorella zofngiensis.
Otro estudio reveló que la mayor concentración de astaxantina (3.9±0.0 mg g-1)
estaba presente en Chlorella zofngiensis en condiciones de cultivo junto con la falta
de nitrógeno, mientras que una cantidad muy pequeña de astaxantina se produjo
en condiciones de crecimiento favorables (Mao et al. 2018). Además, la producción
de astaxantina en Chlorella zofngiensis también fue promovida por la técnica de
cultivo semicontinuo bajo limitación de nitrógeno, alcanzando 3.3 mg L−1 día−1 (Liu
et al. 2016).

8
2.3 Metabolismo en microalgas
Las microalgas son consideradas como los productores primarios de biomoléculas
sintetizadas a partir de energía lumínica que transforman en energía química. Existe
una gran diversidad de microalgas y dependiendo de su pared celular, clorofila y
pigmentos pueden variar sus procesos metabólicos (Liu et al. 2016).
La mayoría de las microalgas se clasifican como microorganismos fotótrofos porque
obtienen la energía de los fotones de la luz y como autótrofos ya que utilizan el CO2
como fuente de carbono para sintetizar ellos mismos las moléculas esenciales de
su metabolismo, sin embargo, las microalgas responden con alteraciones
fisiológicas a las condiciones ambientales en las cuales crecen (Orosa et al. 2001;
Minyuk et al. 2020).

2.4 Ciclo de vida de la chlorella vulgaris

El alga Chlorella vulgaris se reproduce muy rápidamente y de forma asexual. Para
eso necesita el carbono que obtiene de la fotosíntesis, agua, luz y pequeñas
cantidades de minerales que normalmente se encuentran en el medio donde se
desarrolla. Debido a su rápido crecimiento, se estudia la posibilidad de que sea
utilizada para producir dulces a base de leche (Brenan, M., Owende, P., 2010).

Esquema 1: Ciclo de vida de las microalgas (Brenan, M., Owende, P., 2010).

9
3 Proteína en Chlorella vulgaris
Las especies de Chlorella tienen un gran potencial para ser utilizadas como una
fuente de proteína valiosa, alternativa para los seres humanos, que no depende de
factores climáticos, estudios han logrado obtener de esta especie hasta un 78% en
peso de proteína, revelando que se trata de una proteína de alta calidad por su
contenido de aminoácidos esenciales.
Las especies de Chlorella tienen un gran potencial para ser utilizadas como una
fuente de proteína valiosa, alternativa para los seres humanos, que no depende de
factores climáticos, estudios han logrado obtener de esta especie hasta un 78% en
peso de proteína, revelando que se trata de una proteína de alta calidad por su
contenido de aminoácidos esenciales (Brenan, M., Owende, P., 2010).
La microalga Chlorella Vulgaris en medios heterotróficos, optimizan variables de
proceso para obtener la mayor producción de proteínas posible bajo diferentes
estrategias de cultivo, una de ellas, llamada “sobrecompensación de nitrógeno” ,
obtiene rendimientos de proteína del 44.3% de proteína en peso seco, muy
cercanos a los encontrados con cultivos autotróficos, que por naturaleza son los que
mayor acumulación de proteínas.
Esta estrategia de sobrecompensación consiste en poner a la microalga es un
medio de nitrógeno muy limitado para después de un periodo de tiempo ser puesta
en un medio de cultivo con sobrecompensación del nutriente, es decir exponerla a
un medio rico en nitrógeno, lo que indica que mediante diferentes estrategias y
condiciones en el cultivo es posible incrementar la fracción proteica de la biomasa
microalgal (Brenan, M., Owende, P., 2010).
Se concluye que con concentraciones de 0.25 y 0.75 g/L de nitrato de sodio en el
medio no se cumple con la demanda de nitrógeno para el crecimiento celular, pero
al utilizar concentraciones mayores (1 a 2 g/L) se permitiría un suministro adecuado
de NaNO3 para incrementar la biomasa de la microalga, sin que se desperdicie el
nitrógeno excedente pues no genera un aumento en la biomasa microalgal y si se
gasta mayor cantidad del nutriente (Liu et al. 2016).
Las proteínas se componen de diferentes aminoácidos y por lo tanto la calidad
nutricional de una proteína se determina básicamente por el contenido, la proporción
y la disponibilidad de sus aminoácidos. Al comparar las principales especies de
algas con respecto a otras fuentes de proteínas, algunos alimentos básicos
convencionales, y un patrón de referencia de una proteína bien balanceada,
recomendado por WHO / FAO . El patrón de aminoácidos de casi todas las al) gas
se compara favorable con el de la referencia y las otras proteínas alimentarias. (FAO
2015).

10
3.1 Biomasa
Uno de los factores más importantes para lograr una producción de microalgas a
escala comercial que sea económica y ambientalmente factible es el desarrollo de
sistemas de cultivos sostenibles y rentables (Richmond, 2004), a partir de
parámetros como el pH, la temperatura, la intensidad de la luz y la concentración de
nutrientes (Moreno-Galván, Rojas-Tapias, & Bonilla, 2012).
Una alternativa viable para algunas especies es el uso de cultivos mixotróficos, en
los que la cantidad de luz reduce la producción de CO2 en comparación con los
cultivos heterótrofos (Estévez, Barajas, Barajas, & Kafarov, 2013), además de
inducir la producción de macromoléculas de alto valor, gracias al efecto regulatorio
de la luz (Li, Xu, & Wu, 2007). Sin embargo, aunque este tipo de cultivo es
económicamente viable, se requiere de una fuente de carbono de bajo costo y del
conocimiento de las concentraciones de experimentación más favorables (Martins
et al., 2016), debido a que ciertos cambios en los nutrientes del medio pueden
aumentar o inhibir la tasa de crecimiento de las algas (Bhola et al., 2011; Estévez
et al., 2013).

3.2 Análisis microbiológicos norma de dulces de leche

NORMA Oficial Mexicana NOM-185-SSA1-2002, Productos y servicios.
Mantequilla, cremas, producto lácteo condensado azucarado, productos
lácteos fermentados y acidificados, dulces a base de leche.
Especificaciones sanitarias.
Esta Norma Oficial Mexicana establece las especificaciones sanitarias que deben
cumplir la mantequilla, las cremas, el producto lácteo condensado azucarado, los
productos lácteos fermentados y acidificados, y los dulces a base de leche.
Dulces a base de leche ; a los productos elaborados por tratamiento térmico de la
leche y edulcorantes, pudiendo ser adicionados de aditivos para alimentos e
ingredientes opcionales.
Embalaje; al material que envuelve, contiene o protege debidamente a los envases
primarios, secundarios, múltiples y colectivos, que facilite y resiste las operaciones
de almacenamiento y transporte, no destinado para su venta al consumidor en dicha
presentación
Esterilización comercial; al tratamiento térmico aplicado al producto para la
destrucción de todos los microorganismos viables de importancia en la salud pública
y aquéllos capaces de reproducirse en el alimento bajo condiciones normales de
almacenamiento y distribución, sin la condición de refrigeración.

11
Etiqueta; al marbete, rótulo, inscripción, marca, imagen gráfica u otra forma
descriptiva que se haya escrito, impreso, estarcido, marcado, en relieve o en hueco,
grabado, adherido, precintado o anexado al empaque o envase del producto.
Higiene; a las medidas necesarias para garantizar la sanidad e inocuidad de los
productos en todas las fases del proceso hasta su consumo final.
Inocuo; al que no hace o causa daño a la salud.
Materia extraña; a la sustancia, resto o desecho orgánico o no, que se presenta
en el producto sea por contaminación o por manejo no higiénico del mismo durante
su elaboración, considerándose entre otros: excretas, pelos de cualquier especie,
huesos e insectos que resultan perjudiciales para la salud.
Ultrapasteurización; al proceso al cual es sometido el producto a una adecuada
relación de temperatura y tiempo, envasado asépticamente para garantizar la
esterilidad comercial.
Los materiales, equipos, recipientes, moldes y utensilios que se empleen
durante el proceso deben cumplir con las especificaciones señaladas en el
apéndice normativo A de la NOM-093-SSA1-1994.
Las mesas de trabajo deben lavarse y desinfectarse después de utilizarse con
alimentos diferentes y al inicio de la jornada.
Almacenar la materia prima en recipientes cubiertos, cerrados o en sus envases
originales y en orden, etiquetados o rotulados con la fecha de entrada al almacén.
Microbiológicas
Los dulces a base de leche no deben exceder las siguientes especificaciones
microbiológicas tabla 1:

ESPECIFICACIONES LIMITE MAXIMO

Coliformes totales UFC/g 10
Staphylococcus aureus UFC/g <100
Salmonella spp ** en 25 g Ausencia

En la elaboración de dulces a base de leche se permite el empleo de saborizantes,

incluidos los naturales.

12
CAPITULO 4. METODOLOGIA

13
4.1 PRODUCCION DE MICROALGAS
Método del Biorreactor
La producción de microalgas en fermentadores (cultivos cerrados), bajo condiciones
de crecimiento heterotrófico, ha demostrado ser una ruta de comercialización muy
exitosa. En este modo de crecimiento, el carbono exógeno se descompone de la
misma manera que en otros microorganismos, donde las moléculas complejas se
metabolizan a través de la vía Embden-Mayerhoff-Parnas (vía EMP o glucólisis) o
vía de las pentosas fosfato (PPP) (Jareonsin & Pumas, 2021). Según Pérez-García
et al. (2011), cuando es posible el crecimiento heterótrofo se puede superar la mayor
deficiencia de los cultivos autótrofos, es decir, la dependencia de la luz que complica
significativamente el proceso.
La mayor ventaja del crecimiento heterótrofo es la posibilidad de utilizar casi
cualquier fermentador como biorreactor. A diferencia del crecimiento autótrofo, en
heterótrofos el oxígeno puede ser un sustrato limitante y su suministro es uno de los
mayores desafíos para la ingeniería de reactores debido a su baja solubilidad en
agua (Pérez-García et al., 2011). Según Griffiths et al. (1960), independientemente
del sustrato orgánico o de las especies de microalgas, la productividad de la
biomasa aumenta con mayores niveles de aireación. Además de la transferencia de
oxígeno, el crecimiento de microalgas en condiciones heterótrofas también presenta
requerimientos relacionados con el mezclado, suministro de nutrientes y un
ambiente estéril.
4.2 Metodología del Biorreactor
1. Garrafón de agua sellada con 14 L, destapar el garrafón y agregar 1L de
Chlorella con concentración de 107.
2. Agregar 1ml de vitaminas A (color amarillo) y vitamina B (transparente). Usar
diferente pipeta para para cada vitamina y así evitar contaminar el frasco de
las vitaminas.
3. Tapar el garrafón con solución preparada y agitar durante 15min, para que
se revuelva.
Posteriormente para agregar aireación, poner una varilla de plástico pegado
a una manguera en la parte superior del garrafón y pegarlo a una maquina
de pecera para para oxigenación de la Chlorella. Una vez implementada la
varilla se pone el garrafón a luz roja para favorecer su crecimiento.
4. Mover dos veces por semana el garrafón durante 30min para evitar que se
pegue la microalga hasta obtener una concentración de 10 7 que indica la
concentración adecuada de la Chlorella.

14
 a d e
b c

Figura 2. b (recipiente de 1l), c Figura 3.d (vitamina A),e

Figura 1. a (Garrafón con (cilindro de Chlorella concentrada) (vitamina B)
agua sellada)

f g h

Figura 5. g (vaciado de 1l de Figura 6. h (vaciado de

Figura 4. f (vaciado de Chlorella Chlorella concentrada al
concentrada al recipiente de 1l) vitamina A al garrafón con
garrafón de agua con 14 l Chlorella y agua)
recipiente de 1l)

15
 i j k

Figura 8. j (etiquetado Figura 9. k (garrafón

Figura 7. i (vaciado de vitamina de garrafón) expuesto a la luz led
B al garrafón con Chlorella y roja)
agua)

16
4.3 Método Conteo con cámara de Neubabuer
Para el conteo celular por método directo se usa la cámara de Neubauer, la cual es
una placa de cristal con forma similar al de un portaobjetos. Se deben contar el
número de células presentes en los cuadrantes de color rojo considerando que para
esto se enumeran las células de los cuadrados más pequeños realizándolo en forma
de zigzag (Bastidas, 2011).

• En un microscopio óptico poner la cámara de Neubabuer con la muestra de

las microalgas Clorarla, fijar microscopio correctamente y realizar el conteo
de tal forma que se muestra en la imagen.
• Con ayuda de una aplicación realizar la ecuación para obtener el conteo y si
es adecuada la concentración de la microalga.

La Ecuación 1 (Bastidas, 2011), presenta la fórmula para sacar la concentración

de células por mililitro.

4.2 METODO BBM

Bold’s Basal Medium (BBM) es un medio de algas de agua dulce que se ha utilizado
para cultivar una variedad de cultivos de algas verdes (por ejemplo, Trichosarcina,
Chlorococcum y Chlorella) sin necesidad de extracto de suelo o vitaminas
(Brownetal.,1964;NicholsyNegrita,1965). La naturaleza predominantemente
inorgánica de este medio se facilita como medio de mantenimiento de cultivos
axénicos (Nichols y Bold, 1965).

17
Para la metodología del medio BBM en solido se utilizan los siguientes datos
correspondientes en la siguiente tabla 2:
Solución Stock Volumen Componente Concentración en Conc. En
(SL) SL medio de la
final
1
SL1 5mL NaNO3 1.25 g*50 mL- 1.47 * 10-3 M
SL2 5mL MgSO4 7H2O 0.375 g *50 mL-1 1.52* 10-4 M
SL3 5mL NaCl 0.125 g * 50mL-1 2.14* 10-4 M
SL4 5mL K2HPO4 0.375 g * 50mL-1 2.155* 10-4 M
SL 5 5mL KH2PO4 0.875 g * 50 mL-1 0.645 * 10-3 M
SL6 5mL CaCl2 ! 2H2O 0.125 g * 50 mL-1 0.85*10-4 M
SL7 g/100 en 10ml
( 5 sales) 6 en 10ml
SL8 g/10 en 10ml
SL9
SL 10 g/100 en 10ml
Poner cada solución establecida en la tabla de la 1 a la 6 en los tubos de ensaye
poner la solución correspondiente.
Una vez puesta la solución en cada tubo vaciarlas en orden a un matraz Erlenmeyer
con 15 g o 1.5% de agar
Después realizar las soluciones de la 7 a la 10 en orden y incorporar al matraz con
las soluciones anteriores
Aforar matraz a 1000ml con agua destilada.

4.2.1 Método de la autoclave para los medios de cultivo

Laboratorio de ITESI
Se prepara la olla de presión y se le agrega agua hasta dónde llega el soporte de la
olla
Colocar correctamente la tapa de la autoclave, revisar que las marcas de la tapa
coincidan con la base de la olla
Cerrar la olla correctamente
Encender la estufa
Esperar a que suba a 15 libras por pulgada cuadrada la presión
18
Se cuenta 15 min después de llegar a las 15 libras ,apagar la estufa y esperar a que
la presión baje a cero.

4.4 Preparación de dulces de leche

El C.A.A. define por Dulce de Leche: el producto obtenido por concentración y
acción del calor a presión normal o reducida de la leche o leche reconstituida, con
o sin adición de sólidos de origen lácteos y/o crema, y adicionado de sacarosa
(parcialmente sustituida o no por monosacáridos y/u otros disacáridos), con o sin
adición de otras sustancias alimenticias (Resolución Conjunta 33/2006 y 563/2006
de la SAGPyA y la SPRRS modifica varios artículos del Capítulo Alimentos Lácteos
del C.A.A. - B.O. 22/09/06). Sin perjuicio a lo indicado en el C.A.A., para que un
Dulce de Leche sea considerado de calidad diferenciada a los fines del presente
Protocolo, deberá cumplir con atributos adicionales contemplados en el mismo,
vinculados al producto, al proceso y eventualmente al envase (Art. 768bis según
CAA).

Método para elaboración de dulce de leche (diagrama de flujo)

Recepción de la leche (cruda). Controles (PH Acidez Temperatura)

Higienización (filtrado)

Elaboración (propiamente dicha)

Filtrado

Enfriado

Envasado

Tratamiento térmico

19
4.5 Recepción y conservación de leche
Acidímetro para control de la leche. Este dispositivo permite efectuar una medición
de la acidez de la leche expresada en grados Dornic.
Recipiente de acero inoxidable con tapa de capacidad adecuada para recepción
de leche (para el caso de leche cruda)
Refrigerador
Filtro de malla fina
Elaboración
Recipiente de acero inoxidable
Filtro para producto elaborado
Utensilios varios (removedor,cucharas,cuchillo)
Refractómetro (optativo)
Equipamiento auxiliar
Quemador a gas (estufon)
Materias primas
Leche
Para la elaboración del dulce la principal materia prima, como es sabido, es la leche.
Principalmente se utiliza la leche de vaca, aunque también se podría usar leche
cabra u oveja. Por otro lado, la misma puede ser cruda o pasterizada. También
puede usarse leche en polvo. Se puede utilizar leche entera o parcialmente
descremada, según el contenido de grasa del dulce deseado.
Tanto la leche en polvo como la fluida tienen ventajas e inconvenientes, de modo
que se puede aconsejar su uso alternativo o combinado conforme a las
circunstancias y a las instalaciones. Se trata de todas formas de leches APTAS para
el consumo humano.
Azúcar
Se refiere al azúcar de caña, azúcar común que podemos encontrar en nuestra
cocina. Además de su importancia como componente del sabor típico del dulce de
leche tiene un papel clave en la determinación del color final, consistencia y
cristalización (defecto que puede aparecer en el dulce de leche).

20
Bicarbonato de sodio
Se lo puede adquirir en cualquier local de productos alimenticios. Se lo utiliza como
neutralizante. Durante el proceso de elaboración el agua de la leche se va
evaporando y el ácido láctico (componente propio de la leche) se va concentrando.
Así, la acidez de la leche se va incrementando de una manera tal que se podría
producir una sinéresis (el dulce se corta). El uso de leche con acidez elevada
produciría un dulce de leche de textura arenosa, áspera. Asimismo, una acidez
excesiva impide que el producto terminado adquiera su color característico, ya que
las reacciones de coloración son retardadas por la elevada acidez. Por todo ello
será necesario reducir la acidez inicial de la leche neutralizándola con este aditivo.
Jarabe de Glucosa
El jarabe de glucosa es un derivado vegetal, fácilmente digerible y su uso, aunque
optativo, es sugerido. Tiene la apariencia de una miel solo que no presenta ese color
amarillento característico. Su poder edulcorante es inferior al de la sacarosa (azúcar
común) y su uti- lácteos página 13 lización obedece a varias razones: es económico,
agrega brillo al producto y ayuda en parte a evitar la cristalización de la lactosa,
defecto que puede ocurrir en el dulce de leche. Aromatizante de vainilla La cantidad
a utilizar dependerá del consumidor y de la calidad del aromatizante. La cantidad se
ajusta después de algunos ensayos organolépticos (sabor, aroma, etc.).
4.6 Preparación de dulces de leche
Para fabricar 6 kilogramos de dulce de leche se necesitará:
–12.5 litros de leche –2.5 kilos de azúcar –6.25 gramos de bicarbonato de sodio –1
kilo de glucosa –7.5 centímetros cúbicos (o ml) de aromatizante de vainilla
Etapa 1:

• Recepción de leche (para el caso de recibir leche cruda, recién ordeñada) La

leche se recibe y controla para conocer su calidad, luego se conserva
refrigerada (2-8ºC) hasta el momento de procesarla. Algunos de los controles
a realizar pueden ser:
• Es aconsejable que la leche no tenga más de 24hs posterior al ordeñe.
• Control visual: Observar si presenta impurezas o color anormal
• Control aroma: Verificar si emana olores extraños
• Controlar la temperatura de entrega, (T< 8ºC)
• Realizar la prueba del alcohol 70°*
• Evaluar la acidez Dornic, pH **

21
Etapa 2:

• Higienización (para el caso de recibir leche cruda, recién ordeñada)

• Antes de comenzar la elaboración es necesario eliminar la suciedad que se
incorpora durante el ordeñe. Con ese objetivo, se la filtra a través de filtros
de malla fina.
Etapa 3:

• Elaboración (propiamente dicha) Esta etapa es muy importante. En ella se

evapora el agua (por calentamiento), se eliminan las bacterias patógenas
presentes en la materia prima por efecto de la temperatura y ocurren todos
los cambios para la obtención del dulce de leche. Para elaborar el dulce de
leche tipo familiar, se deben colocar en el recipiente sólo 25 litros de leche
junto con todo el bicarbonato de sodio y el azúcar. Luego se la debe calentar
hasta que comience a hervir.
• Cuando comienza a hervir, se deben ir agregando de a poco los 25 litros de
leche restantes calentados previamente mientras continúa la cocción. Hay
que tener especial cuidado en el primer hervor, procurando que la leche no
rebalse de la olla o recipiente.
Durante todo el tiempo de la elaboración tiene que mezclar con el removedor

• No detener la agitación mientras la mezcla se encuentra en la olla o

recipiente. Esto evitará problemas tales como que el dulce se queme, se
corte o que se formen grumos.
• Cuando se está próximo a terminar la elaboración se agrega la glucosa y la
esencia de vainilla (aproximadamente a los 62° brix, escala utilizada por el
refractómetro). Se debe tener en cuenta que el agregado muy temprano de
la glucosa aumenta mucho el color del dulce y alarga la elaboración.
• Es de fundamental importancia determinar el momento en que debe darse
por terminado la evaporación (cocción).
• Si se pasa del punto, se reducen los rendimientos y se perjudican las
características del dulce. Por lo contrario, la falta de concentración o una
cocción escasa produce un dulce fluido, sin la consistencia esperada.
• Normalmente es la pericia del dulcero la que determina el punto exacto,
empleando a veces pruebas empíricas. Una de ellas consiste en dejar caer
una gota de dulce en un vaso con agua para ver si llega al fondo sin
disolverse. Otra, separando entre los dedos índice y pulgar una pequeña
cantidad de producto y observando cómo y cuánto se estira. Con mucha

22
 práctica, la simple evaluación del flujo vertido desde un cucharón de dulce
informa sobre el punto deseado.
• No obstante, es necesario complementar la experiencia con la exactitud.
Estas observaciones empíricas se hacen a modo de orientación y ya en las
cercanías del punto final se debería controlar el dulce con un instrumento
llamado refractómetro.

Etapa 4: Enfriamiento a 60°C

• Inmediatamente finalizada la elaboración, el dulce de leche obtenido se

enfría a 60ºC para realizar el envasado. El enfriado se puede realizar en un
recipiente destinado a tal efecto. Consiste simplemente en una bacha de
acero inoxidable o material sanitario donde deberá haber agua bien fría y en
cantidad.
• En dicho recipiente colocaremos la olla con el dulce manteniendo siempre
una buena agitación. La velocidad del enfriamiento es muy importante ya que
es una manera de prevenir y retardar la aparición de un defecto en el dulce:
la formación de cristales, que le otorga una textura arenosa: el “dulce
arenoso”.
Etapa 5: Envasado

• El envasado se realiza generalmente con el dulce todavía a unos 50-55ºC

para permitir un fácil flujo y deslizamiento. Envasar a mayor temperatura
tendría el inconveniente de que continuarían produciéndose vapores dentro
del envase que, condensando en la tapa, podrían facilitar la aparición de
hongos. Como es sabido, los envases a utilizar deberán estar en perfectas
condiciones de limpieza. Se recomienda usar envases de vidrio con tapa a
rosca.
Etapa 6: Tratamiento térmico

• Después de ser elaborado y envasado, y para evitar riesgos de

contaminación, al dulce se le puede realizar un tratamiento térmico. De esta
manera se prolonga la vida útil del producto y se facilita el almacenaje.
• Para una producción del tipo artesanal la vida útil del producto se podría
incrementar mediante el agregado de un conservante, el sorbato de potasio.
Este conservante es de uso difundido, se lo puede encontrar en cualquier
casa del ramo y se lo debería considerar en el caso de querer comercializar
el dulce de leche. Una forma de aplicarlo puede ser: una vez el dulce está en

23
 el envase, rociarlo superficialmente con el sorbato al igual que la tapa o
también se le puede agregar al producto durante el enfriamiento.

4.7. Características Organolépticas de los alimentos

La calidad y seguridad de los alimentos vienen garantizadas por los análisis
microbiológicos, físicos y químicos. Pero, además, los alimentos también destacan
por sus propiedades organolépticas, particularidades que se miden a través del
análisis sobre las sensaciones que producen. Es decir, son las propiedades de los
alimentos que son percibidas por los sentidos. Este análisis sensorial parte de
cuatro parámetros básicos: color, sabor, textura y aroma. Con los años, esta
disciplina va adquiriendo mayor importancia y tiene como principal objetivo
favorecer las interacciones de un alimento que respondan a criterios de calidad y
seguridadMercosur,1996).
Las características sensoriales que debe tener el dulce de leche según el mismo
reglamento son: consistencia cremosa o pastosa, sin cristales perceptibles
sensorialmente, la consistencia podrá ser más firme en el caso del dulce de leche
para confitería y/o heladería. Puede presentar consistencia semisólida o sólida y
parcialmente cristalizada cuando la humedad no supere el 20% m/m. Su color es
castaño acaramelado, proveniente de la reacción de Maillard. El color del dulce de
leche para heladería puede corresponder al colorante adicionado; el sabor y olor es
dulce característico, sin sabores ni olores extraños. Los requisitos fisicoquímicos
exigidos para el dulce de leche por Mercosur son los siguientes: humedad máx.
30%, materia grasa 6,0 a 9,0%, cenizas máx. 2,0% y proteínas mín. 5,0%(Mercosur,
1996).

4.8 Características organolépticas de los dulces de leche

Color castaño característico acaramelado
Sabor y olor dulce característico sin sabor y olores extraños
Apariencia uniforme ,sin cristales y poco arenoso.

24
4.9 Cuantificación de proteínas en un alimento dulces de leche
La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en la
cuantificación de la unión de un colorante, el Azul de Coomassie G-250, a la
proteína, comparando esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína
estándar (Albúmina de Suero Bovino (BSA)). La cuantificación se hace midiendo la
absorbancia en un espectrofotómetro, a 595 nm, y graficando la absorbancia vs la
concentración de proteínas, obteniendo una curva de calibración de la proteína
estándar. Con esta curva de calibración, se puede interpolar la concentración de
proteínas en una muestra al medir su absorbancia a 595 nm.
Contenido:
1 Reactivo de Bradford 1x 250 mL
2 Solución de dilución 100 mL
3 Estándar de proteína (BSA 0.5 mg/ml) 2 mL
4.9.1 Procedimiento:

Prepare diluciones del estándar de proteína de 25, 50, 75 y 100 g/mL, usando
la solución de dilución: En 4 tubos tipo Eppendorf, añada 5, 10, 15 y 20 L del
estándar de proteína (0.5 mg/mL) y complete el volumen de 100 L con la
solución de dilución. En otro tubo añada 100 L de la solución de dilución. Este
es el blanco.

2- Prepare la(s) muestra(s) tomando un volumen igual o menor a 100 L;

completando los 100 L con la solución de dilución.

3- Añada a cada tubo 1 mL del reactivo de Bradford, mezcle con agitador vórtex,
e incube la reacción a temperatura ambiente por 2 minutos.
4- Mida la absorbancia a 595 nm (A595) en un espectrofotómetro, en un plazo
no mayor de 1 hora.
5- Haga la curva de calibración estándar graficando la A595 vs la concentración
de proteína estándar.
6- Determine la concentración de proteína en las muestras a partir de la curva
de calibración estándar y los valores de A595. Si la concentración es muy alta
(queda fuera del rango del estándar), diluya la muestra o tome una alícuota
menor para la determinación.

25
5 . Determinación del contenido en proteínas (Método Sorensen-Walker)
Está técnica determina el contenido en proteínas de la leche mediante una
valoración ácido-base, ya que, tras la adición de formol a la muestra, el
formaldehido se une a los grupos amino de los aminoácidos de las proteínas
dejando los grupos carboxilos libres. Este hecho produce cambios en la acidez
titulable de la leche siendo valorada con hidróxido sódico. La cantidad de
hidróxido sódico utilizado en la neutralización es utilizada para calcular la
cantidad de proteínas presente en la muestra.
Material
• Bureta graduada en 0.1 mL.
• Matraz Erlenmeyer de 100 mL.
• Pipetas de 10 mL y 5 mL. Reactivos
• Solución de hidróxido sódico (0.1N).
• Solución comercial de formol (40%).
• Indicador: solución de fenolftaleína al 1 %.
5.1 Procedimiento
• Tomar 10 mL de leche problema en un matraz erlenmeyer.
• Añadir 20 mL de agua destilada y adicionar unas gotas de fenoltaleína.
• Neutralizar la ácidez titulable natural de la leche con la solución de hidróxido
sódico hasta la aparición de un color rosa.
• Añadir posteriormente a la leche neutralizada 2 o 3 mL de formol para dejar
libres los grupos carboxilos de los aminoácidos. Tras la adición del formol la
muestra se vuelve a acidificar y se muestra nuevamente de color blanco.
• Añadir unas gotas de fenolftaleína y valorar la acidez con hidróxido sódico,
hasta la aparición nuevamente del color rosa.
Cálculo
La cantidad de hidróxido sódico 0.1N gastados en la segunda valoración se
multiplican por 2.24, y el resultado se expresa como porcentaje de proteínas. El
contenido de caseína en la leche lo podemos calcular a partir de una regla de
tres, teniendo en cuenta que la cantidad de caseína en la leche de vaca es
aproximadamente del 78.5 %.

26
 5.2 Centrifuga Procedimiento
Después del procedimiento del Biorreactor y el conteo por cámara de
Neubabuer
Procedimiento para el uso de la Centrífuga

• Protección ocular: Deberá utilizar protector ocular durante la colocación de

las muestras y el retiro de estas.
• Protección de pies: El calzado deberá ser cerrado y con el talón cubierto. No
se podrá utilizar calzado tipo sandalias o similar.
• Protección de manos: Deberá utilizar guantes para la manipulación de
muestras para evitar daños causados por agentes derramados dentro del
equipo.
• Operación del Equipo
• Instrucciones del manejo de la Centrífuga a) Verifique que el equipo esté
perfectamente limpio y libre de objetos en su interior.
• Cargue el cabezal, siguiendo las instrucciones de equilibrio y balanceo que
se acompañan.
• Cierre la tapa del equipo.
• Asegúrese que el selector de velocidad se encuentre en 0 (Cero).
• Lleve la perilla del reloj hasta el tiempo deseado, quedando así en
condiciones de hacer uso del equipo.
• Gire lentamente el selector de velocidad hasta el punto en que se alcanza las
r.p.m. requeridas.
• Al realizar esta operación, se encenderá la lámpara piloto indicadora de
marcha.
• Pasado el tiempo programado en el equipo, éste disminuirá paulatinamente
su marcha hasta 0 r.p.m, momento en el que recién podrá levantar la tapa y
retirar el material.

27
 Instrucciones de equilibrio y balanceo
• Utilice siempre los porta-tubos estándares para los cabezales
correspondientes a la marca y modelo de su equipo.
• Los tubos con la muestra deben ajustarse al alto y diámetro del porta-tubos
de la centrífuga para evitar rozamiento con el cabezal de la centrífuga durante
la operación.
• Coloque los tubos de idéntica forma y peso, cargados con igual cantidad de
material en lugares opuestos.
• Si tiene un N° impar de muestras, coloque un tubo extra conteniendo un
líquido balanceador (agua destilada aireada, vaselina líquida o glicerina) para
colocar del lado opuesto de la muestra impar.

28
Referencias
Algas diminutas Un recurso natural renovable, abundantey de gran potencial
industrial
Chlorella vulgaris cultivo https://docplayer.es/73574419-Cultivo-y-elaboracion-de-
un-producto-comestible-de-chlorella-vulgaris.html
Juan D. (2017) Estudio de la producción de biomasa de Chlorella vulgaris crecida
heterotróficamente sobre vinazas de la caña de azúcar
https://repository.icesi.edu.co/biblioteca_digital/bitstream/10906/82476/1/TG01745.
pdf
trabajos publicados relacionados a chlorella vulgaris en alimentos
LEIDY J . MARIA A (2018) Producción de proteínas a partir de la microalga
chlorella vulgaris enriqueciendo el medio de cultivo con fuentes de nitrógeno.
Fundación universidad de américa facultad de ingenierías programa de ingeniería
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https://repository.uamerica.edu.co/bitstream/20.500.11839/6725/1/6131047-2018-
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https://ruc.udc.es/dspace/bitstream/handle/2183/25013/Abalde_Julio_1995_Microa
lgas_cultivo_aplicaciones.pdf

Utilización de astaxantina de microalgas y biomasa de algas ricas en carotenoides

como suplemento alimenticio en la acuicultura y la industria avícola: una
descripción general noviembre 2022Revista de Ficología Aplicada
https://www.researchgate.net/publication/365771451_Utilization_of_astaxanthin_fr
om_microalgae_and_carotenoid_rich_algal_biomass_as_a_feed_supplement_in_a
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Y. Sánchez-Borroto1,*, I. Tobío-Pérez2, T. de J. Romero-López3, Y. Díaz-
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29
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30