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Escuela superior politécnica del litoral

Facultad de ciencias de la vida
Biología Celular y Molecular
Facultad de ciencias
LABORATORIO PRÁCTICO de la vida

CÓDIGO
NOMBRE Tatiana Natasha Ruiz Medina

PROFESOR Luis Eduardo Sanchez Timm

LABORATORIO Biología Molecular

FECHA 17-08-2023 PARALELO

TEMA DE LA PRÁCTICA Electroforesis de ADN en un gel de agarosa

OBJETIVOS:

Objetivo General:
- Comprender la técnica de electroforesis de ADN en gel de agarosa para separar y analizar fragmentos de
ADN según su tamaño, con el propósito de estudiar la estructura genética y adquirir habilidades en biología
molecular.
Objetivos Específicos:
- Analizar las funciones específicas de los reactivos utilizados en la extracción de ADN.
- Identificar si las muestras colocadas en el gel de agarosa contenían ADN y su respectiva calidad mediante
el transiluminador de luz ultravioleta.

INTRODUCCION:

La electroforesis corresponde a una de las metodologías más utilizadas en el laboratorio para el trabajo con

ácidos nucleicos. Esta separa biomoléculas como el ARN o el ADN, como en esta práctica de acuerdo con su

tamaño, además de que permite el aislamiento cortando la zona de interés. Esta separación de fragmentos

permite su visualización mediante una sencilla tinción que sirve para determinar el contenido de ácidos

nucleicos en la muestra, estimando también su concentración y grado de entereza. Está basado en que la

combinación de fuerzas eléctricas y de fricción permiten el desplazamiento y separación en función del tamaño

o tipología de las diferentes moléculas de ADN. Al ser sometida al campo eléctrico, la carga neta negativa del

ADN se moverá en dirección al ánodo. Esta se puede realizar en geles de agarosa o poliacrilamida. (Fierro,

2014)
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Para esta experimentación el medio de separación utilizado fue el gel de agarosa que es un polisacárido

derivado del agar, este gel se realiza mediante la disolución de agarosa en un buffer TAE 1X, cuyo pH es

alcalino para que todos los grupos fosfato del ADN se encuentre completamente ionizados y se mantenga

cargado negativamente. (Herráez, 2015)

MATERIALES Y EQUIPOS:

1. Agarosa
2. Buffer TAE 1X
3. Erlenmeyer de 250 ml
4. Micropipetas
5. Microondas
6. Sybr Safe DNA gel stain 10000X
7. Cámara de electroforesis vertical
8. Espaciadores verticales
9. Peineta
10. Alcohol 96%
11. Fuente de poder
12. Transiluminador de luz ultravioleta

MUESTRAS:

1. Muestra de ADN genómico

2. Loading dye 6X

PROCEDIMIENTO:

1. Pesar 2 g de agarosa y colocarla en un Erlenmeyer de 250 ml.

2. Adicionar 200 ml de buffer TAE 1X al Erlenmeyer y calentar en el microondas por 2 minutos para disolver
la agarosa.
3. Enfriar el Erlenmeyer y añadir 20 μl de Sybr Safe DNA gel stain 10000X.
4. Limpiar la cámara de electroforesis y accesorios con alcohol 96%.
5. Colocar espaciadores y la peineta en la cámara.
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6. Transferir la mezcla de agarosa al accesorio, ajustar y dejar polimerizar durante 1 hora.

7. Retirar espaciadores y la peineta, y colocar el gel en la cámara de electroforesis.
8. Llenar la cámara con 500 ml de buffer TAE 1X.
9. Cargar los pocillos con 20 μl de muestra (16 μl de ADN + 4 μl de loading dye 6X).
10. Tapar la cámara, encender la fuente de poder y configurarla a 100 voltios durante 1 hora.
11. Retirar el gel y observarlo en un transiluminador de luz ultravioleta. Tomar una fotografía para análisis
posteriores.

IMÁGENES Y GRÁFICOS:

Ilustración 1. Resultado de electroforesis

Ilustración 2. Resultado de PCR Ilustración 3. Resultado de PCR

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1 Marcador 18 35s 14-2 35 35FNOSR 8-1 52 ARF 14-2

2 Actina will-1 19 35s 1301 36 35FNOSR 8-2 53 ARF 1301
3 Actina will-2 20 35s neg 37 35FNOSR 13-1 54 ARF neg
4 Actina 8-1 21 Marcador 38 35FNOSR 13-2 55 vacio
5 Actina 8-2 22 NOS will-1 39 35FNOSR 14-1
6 Actina 13-1 23 NOS will-2 40 35FNOSR 14-2
7 Actina 13-2 24 NOS 8-1 41 Marcador
8 Actina 14-1 25 NOS 8-2 42 35FNOSR 1301
9 Actina 14-2 26 NOS 13-1 43 35FNOSR neg
10 Actina neg. 27 NOS 13-2 44 vacío
11 35s will-1 28 NOS 14-1 45 ARF will-1
12 35s will-2 29 NOS 14-2 46 ARF will-2
13 35s 8-1 30 NOS 1301 47 ARF 8-1
14 35s 8-2 31 NOS neg 48 ARF 8-2
15 35s 13-1 32 vacío 49 ARF 13-1
16 35s 13-2 33 35FNOSR will-1 50 ARF 13-2
17 35s 14-1 34 35FNOSR will-2 51 ARF 14-1
Tabla 1. Tabla explicativa del contenido de muestras

OBSERVACIONES Y RESULTADOS :

Se verificó la concentración adecuada y distribución del buffer en el tanque de electroforesis, así como la
colocación correcta de electrodos y muestras. Se observaron marcadores de peso molecular para estimar
tamaños de muestras de ADN en gel de agarosa. Algunas muestras mostraron migración no uniforme,
indicando variabilidad en la electroforesis de fragmentos de ADN.
Se realizaron tres tipos de PCR en plantas de banano modificadas genéticamente, buscando genes
específicos. El control positivo Actina detecta problemas en las reacciones. Los controles 35S y terminador
NOS confirman la presencia del T-DNA. La amplificación de 35S-NOS señala la integración completa del T-
DNA, mientras que en plantas fallecidas indicaría falta de éxito en el proceso, volviéndolas vulnerables al
medio de Hygromicina.
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La variabilidad en la sobrevivencia de las plantas transgénicas con resistencia a hygromicina puede deberse
a problemas en la incorporación efectiva del gen de resistencia durante la transformación genética. Factores
como la transferencia ineficiente de T-DNA por Agrobacterium y dificultades en la integración en el genoma
pueden influir en la expresión incorrecta del gen. Para mejorar esto, se deben analizar la concentración de
Agrobacterium, la co-cultivación y la respuesta del tejido vegetal. La amplificación exitosa del gen de Actina
en el control positivo valida la técnica de PCR y el ADN utilizado. La ausencia de amplificación puede indicar
problemas en la obtención o calidad del ADN y en la salud de las plantas. La detección del promotor 35S y el
terminador NOS confirma la presencia del T-DNA, pero la ausencia podría señalar problemas de inserción. La
comparación con resultados esperados indica la integridad del T-DNA. La presencia o ausencia de fragmentos
amplificados en las muestras implica la viabilidad y expresión de los genes transgénicos, resaltando la
necesidad de análisis profundos para entender su relación con el fenotipo y expresión génica.

CONCLUSION Y DISCUSIÓN:

- Se preparó un gel de agarosa con condiciones apropiadas, logrando una visualización clara de las bandas de
ADN debido a la concentración adecuada de agarosa y buffer, y la inclusión de Sybr Safe DNA gel stain.
- La electroforesis fue exitosa para separar moléculas de ADN por tamaño, evidenciado por bandas de
diversos tamaños en el gel. Esto permitió analizar genes específicos.
- La observación de las bandas evaluó la calidad del ADN; la amplificación exitosa de Actina en el control
positivo validó la técnica de PCR, pero la falta de amplificación en algunas muestras señaló problemas en la
obtención o calidad del ADN, afectando la amplificación de genes de interés.
- La electroforesis en gel de agarosa demostró eficacia en la separación y visualización de segmentos de ADN,
aunque variaciones en la migración indican áreas para optimización.
- La PCR identificó genes específicos en plantas transgénicas; el control positivo Actina validó la calidad. La
amplificación en controles 35S y NOS señala la integración exitosa del T-DNA en ciertas plantas, mientras que
la ausencia plantea interrogantes en otras.
- Estos resultados resaltan la necesidad de optimización experimental y análisis profundo de la
transformación genética, contribuyendo al conocimiento de la modificación genética y su impacto en la
investigación agrícola.
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BIBLIOGRAFÍA:

Instituto de Química UNAM. (s.f.). Procedimiento de operación para el manejo de bromuro de etidio
. Obtenido de
https://www.iquimica.unam.mx/images/iqseguro/004_Manejo_de_bromuro_de_etidio.pdf
ThermoFisher Scientific . (s.f.). SYBR Safe DNA Gel Stain. Obtenido de
https://www.thermofisher.com/ec/en/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/nucleic-
acid-gel-electrophoresis/dna-stains/sybr-safe.html

Odell, J. T., Nagy, F., & Chua, N. (1985). Identification of DNA sequences required for activity of the
cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature, 313(6005), 810-812.
https://doi.org/10.1038/313810a0
Fraley, R. T., Rogers, S. G., Horsch, R. B., & Gelvin, S. B. (1986). Genetic transformation in higher
plants. Critical Reviews in Plant Sciences, 4(1), 1-46.
https://doi.org/10.1080/07352688609382217
De Almeida, W. A. B., De Assis Alves Mourão Filho, F., Mendes, B. M. J., Pavan, A., & Martinelli, A.
P. (2003). Agrobacterium-mediated transformation of citrus sinensis and citrus limonia epicotyl
segments. Scientia Agricola, 60(1), 23-29. https://doi.org/10.1590/s0103-90162003000100005
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ANEXOS: