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LABORATORIO: RECUENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO

I. POR EL METODO DE PLATOS DE DILUCIN

1. OBJETIVO:
Determinar e identificar el tipo y nmero de microorganismos,
especialmente hongos, presentes en muestras de suelo, mediante
diluciones seriadas, con el fin de obtener un nmero adecuado de colonias
en el medio de cultivo especfico.

2. INTRODUCCIN:
El manto de minerales y de materia orgnica, que cubre la mayor parte de la
superficie terrestre y que propicia el crecimiento de las plantas se denomina
SUELO.
Los suelos con ms del 80% (en peso) de materia slida consistente en
partculas minerales y que contienen por lo tanto un 20% de material orgnico
se conoce como suelos minerales y son ms comunes que los suelos
orgnicos que tienen ms del 20% de materia orgnica. Un promedio
aproximado de materia orgnica en un suelo mineral bueno es de 4 a 5%.
El suelo es para las plantas terrestres, la fuente primaria de agua y es adems
un excelente fijador de nitrgeno.
El tamao de las partculas del suelo, codifica las caractersticas, como
textura, consistencia, en fin definen diversos tipos de suelos. Las partculas
coloidales en particular aquellas de 0.001 mm de grosor, tienen fuerte
influencia en la textura, en la capacidad de retencin del agua y en la actividad
qumica del suelo.
Factores tales como fertilidad, acidez, humedad, etc., determinan el tipo y la
cantidad de microorganismos presentes en el suelo. No se ha podido estimar
con exactitud el nmero de microorganismos presentes en un gramo de tierra;
las cuentas microbianas disminuyen notablemente en las profundidades. Los
recuentos de bacterias y de mohos terrestres hechos en placa son mucho
menores que los recuentos microscpicos. Las dos principales causas de
dicha divergencia radica en el hecho de que los medios de cultivo en placa,
permiten el crecimiento de un segmento muy pequeo de flora mixta y que
muchos microorganismos muertos pueden apreciarse en el microscopio.

MICROORGANISMOS PRESENTES EN EL SUELO:


1- BACTERIAS: Son las ms abundantes de la tierra. Las bacterias terrestres
son de varios tipos y presentan diferente comportamiento fisiolgico. Pueden
ser aerobias, anaerobias y facultativas; autotrficas o heterotrficas;
descomponen carbohidratos y / o protenas.
La mayor parte de las bacterias del suelo pertenecen a los grupos
Pseudomonadales, el gnero ms representativo es Pseudomonas sp., bacilo
Gram negativo, corto, no esporgeno, capaz de producir pigmentos
hidrosolubles verdes o azules fluorescentes, producen enzimas pectinolticas
que degradan el gel de pectato. Las Eubacteriales incluyen bacilos Gram
negativos cortos, no esporgenos pertenecientes al gnero Rhizobium,
Agrobacterium, Achromobacter y las formas pigmentadas Chromobacterium y
Flavobacterium (violeta y amarillo respectivamente); cocos del gnero
Micrococcus y Sarcina; bacilos Gram negativos del gnero Corynebacterium
(no esporulado) y los esporulados Gram positivos Bacillus y Clostridium.
Dentro del grupo de los Actinomycetales estn los miembros pertenecientes a
Streptomyces que producen colonias filamentosas con frecuencia duras y
terrosas y suelen expeler olores similares a hojas en descomposicin. Estos
microorganismos abundan en suelos de bosques que contengan grandes
cantidades de materia orgnica y participan activamente en su
descomposicin.

2- HONGOS Y MOHOS: Los mohos descomponen activamente la celulosa, las


protenas vegetales y animales y otras sustancias orgnicas del suelo.

El recuento por el mtodo de platos de dilucin es la tcnica ms frecuente


utilizada para determinar el nmero de clulas viables de microorganismos del
suelo. Adicionalmente, este mtodo suele utilizarse para el aislamiento de
microorganismos del suelo.
La tcnica se basa en que un peso conocido de suelo se agita en un lquido
apropiado, los microorganismos se desprenden del suelo y cada una de las
clulas da origen a una colonia discreta sobre un medio de cultivo. El nmero
de clulas en el suelo original (muestra) se estiman con base en las colonias
que se cuentan. Debido a que el nmero de clulas es alto, an en una
muestra de suelo pequeo, la suspensin del suelo debe diluirse de tal forma
que en los platos de petri se desarrollen solamente unas pocas colonias bien
separadas.
Debe tenerse en cuenta que existen varias fuentes de error y que por lo tanto
los resultados obtenidos deben considerarse como estimativos del nmero de
microorganismos y no como un recuento exacto de los mismos.

3. MATERIALES:
Muestra de suelo
Agua destilada estril
Cajas de petri con medio de cultivo PDA
Encubadora a 22C
Gradillas
Tubos de ensayo
Pipetas estriles de 10 ml y 1 ml

4. PROCEDIMIENTO:
Prepare una solucin patrn de suelo diluido en agua destilada estril: 10
gr de suelo se disuelven bajo condiciones de asepsia en 100 ml de agua
destilada estril.

A partir de la solucin anterior prepare soluciones ms diluidas de


concentraciones 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7.
Siembre en cada caja de Petri que contiene PDA, 1 ml de la solucin de
concentracin conocida y para lograr una dispersin uniforme agite
circularmente, de tal forma que la suspensin microbial aislada del suelo
se esparza en toda la superficie del medio. Efectelo con 4 repeticiones.
Espere a que el volumen que sirvi en la caja, se absorba en la superficie
del medio y luego proceda a voltear la caja, colocndola en posicin
adecuada para someterla a incubacin.
Incube a 22C durante 24 horas
Para conteo de los hongos use las diluciones 10 -3, 10-4, 10-5 y 10-6. el
tiempo de incubacin ser de 3 o 4 das y deben evaluarse los platos que
presenten un nmero de microorganismos representativos.
Para el conteo de Actinomycetes, use las diluciones 10-4 hasta 10-7 y utilice
los platos que contengan de 25 a 30 colonias.
Utilizar el medio de cultivo apropiado para cada microorganismo. (ver
anexo)
Efecte el clculo teniendo en cuenta el volumen de dilucin, para as
obtener un porcentaje significativo del nmero de microorganismo en la
muestra.

II. TECNICAS DE GRANITOS DE TIERRA


Se basa en el principio de que los granos de suelo la microflora total. Se
agregan sobre los medios slidos especficos para el microorganismo
deseado, las colonias de ese microorganismo se desarrollan alrededor del
grano. La abundancia del crecimiento del grupo dado da una idea
aproximada de la riqueza del suelo en ese grupo fisiolgico.
Se utiliza una porcin pequea de tierra tamizada en una malla de 2 mm la
cual se coloca en una caja petri. Se necesita tambin otra caja de petri con
un poco de agua destilada estril y una pipeta Pasteur cerrada (tapada).
Se sumerge el extremo cerrado de la pipeta en el agua y despus se coloca
encima de una partcula de suelo: un grano. Este se adhiere a la pipeta y
es transferido de esta manera a la caja petri, que contiene el medio
nutritivo. Se transfiere as varios granos alineados ms o menos
regularmente en la caja. Es mejor colocar siempre el mismo nmero de
granos para efectos comparativos (10 o 20).
Este mtodo da buena orientacin cualitativa de la muestra que se est
estudiando. No es el ms aconsejable para estudios cuantitativos.

ANEXO: PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

MEDIO PARA ACTINOMICETOS

Glicerol 8g
Asparginato 0.8 g
Fosfato cido de Potasio 0.8 g
Gelosa 12 g
Solucin de Winogradsky 0.8 g
Agua destilada 800 ml

SOLUCION DE WINOGRADSKY

Fosfato acido de potasio 0.25 g


Sulfato de magnesio 0.125 g
Cloruro de sodio 0.125 g
Cloruro frrico o sulfato frrico 0.0025 g
Sulfato de manganeso 0.0025 g
Agua destilada 50 ml
PH: 7.2

AGAR PAPA DEXTROSA (PDA)

Papa 325 g
Dextrosa 2.6 g
Agar-Agar 19.5 g
Agua destilada 1300 ml

AGAR TIERRA
Es la preparacin del extracto de tierra con gel (Agar) para obtencin de medios
slidos y semislidos.
Para medio slido se prepara el medio utilizando la concentracin usual para el
gel especfico (generalmente 15%) y se reduce la concentracin para medio
semislido. La esterilizacin se hace por los mtodos corrientes.

EXTRACTOS DE SUELO
Se escoge un suelo rico (tierra de jardn) de pH neutro o cercano a la neutralidad
(nunca se debe utilizar suelo acido).
Colocar la tierra en un recipiente con agua en partes iguales. Dejar a temperatura
ambiente por unas 24 horas agitando ocasionalmente. Luego se lleva a la
autoclave durante 1 hora a 130C. Dejar decantar y filtrar hasta obtener una
solucin clara (lmpida color mbar) se controla el pH que debe estar cercano a
la neutralidad. Esterilizar nuevamente por 20 minutos.

5. RESULTADOS:
MUESTRA: _______________________________________________
LOCALIDAD: _______________________________________________
RECUENTO DE MICROORGANISMOS: ________________________

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