PRÁCTICA DE CULTIVO IN VITRO DE CRISANTEMOS EN INSTALACIONES

DEL SENA NORTE CAUCA.

UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
INGENIERÍA AGROPECUARIA
ASIGNATURA: BIOTECNOLOGÍA

PRESENTADO A: MARTHA ISABEL ALMANZA

PRESENTADO POR:
JUAN DAVID CORTEZ MEDINA
YESSICA CAROLINA SOLARTE RUIZ

POPAYÁN, 2023
INTRODUCCIÓN.

Alrededor de las profesiones que están relacionadas con la vida y los seres existentes, se
están empezando a implementar nuevas estrategias para entender el comportamiento, la
forma de sobrevivir, sus características y sobre todo su forma de reproducirse de estos
mismos.
Una de estas especies que hasta hoy en día aún sigue siendo estudiada son las plantas,
que demuestran un potencial de desarrollo bastante interesante dentro del planeta,
causando gran interés, en sí, sus distintas maneras de propagarse y reproducirse dentro del
medio.
Por esta razón, el cultivo in vitro en las plantas, permite el modo de generar una planta
nueva, esto a partir de una porción que se tome de dicha planta, como por ejemplo, el
ápice, un segmento o una hoja, el segmento de un tallo, nudo, embrión, entre otros, que
facilitan colocarla en un medio estrèril, en general, gelificado o semisólido, donde nacen
muchas o una nuevas plantas.
Para este caso se implementaron los meristemos del viviente, para entender su
comportamiento en un medio in vitro bajo condiciones de laboratorio y así mostrar la
manera de supervivencia de este pequeño segmento tomado de la planta, y con ello
obtener una copia o hija que después de pasar por su proceso de aislamiento en dicho
cultivo, podrá ser trasplantada en el suelo, teniendo mejores condiciones para la
continuación de sus ciclos o etapas.
OBJETIVOS.

General.

Evaluar el efecto que tiene las técnicas de buena asepsia y desinfección para el cultivo in
vitro de los meristemos del crisantemo.

Específico.

- Caracterizar cada una de las áreas y equipos que se utilizan para que sea posible el
desarrollo del cultivo in vitro.
- Identificar los errores que se tienen en el momento de realizar una práctica de cultivo
In vitro.

METODOLOGÍA.
Metodología área de estudio
El procedimiento se realizó en el centro de estudios e investigaciones del SENA CAUCA,
sede norte de la ciudad de Popayán, el día 09 de junio en horas de la mañana, donde
estuvieron presentes para dicha práctica los estudiantes de la asignatura de biotecnología
quinto semestre del programa de ingeniería agropecuaria de la Universidad Del Cauca, bajo
la dirección de la docente Martha Isabel Almanza Pinzón, y en el SENA, en el área de
laboratorio bajo las indicaciones de la profesora Margarita Chiguiro.

En primera parte, al estar dentro del aula experimental, se les explica a los estudiantes que
lo que se va a realizar es el cultivo in vitro de una planta, entiendo que hay una fase de
iniciación, luego, una fase de multiplicación y por último una fase de enraizamiento, donde a
cada una de las tres hay que hacer un protocolo de cultivo nuevo, así mismo, se muestra de
ejemplo uno de los cultivos que se han hecho, en este caso la Orquídea, siendo una planta
muy inteligente, que después de florecer forma una càpsula que se hincha y está contiene
muchos hijos , que en el campo se abre para esparcirse y reproducirse, como dato curioso,
sólo se salva una y en laboratorio dos.

ÁREAS DE ESTUDIO:

DESINFECCIÓN Y LAVADO.

Por otra parte, se procede a conocer las áreas que componen el aula de biotecnología,
empezando por la desinfección y lavado, que es donde entra el material vegetal para que
esté completamente inocuo y el área de tipo gris, que es donde sale el material sucio y
contaminado. Dentro de esta primera área, se cuenta con equipos bastantes importantes y
especializados para realizar todo el proceso, tales como, el autoclave, que realiza el
proceso de esterilización, consta de una puerta hermética, en acero inoxidable de una
chaqueta interna, una externa, un manómetro de presión de las dos chaquetas, un
termostato, botones de control de encendido y apagado, agua ionizada, porque esta no
daña las membranas como el agua normal y hay que tener en claro que todo lo que entre
ahí debe ir envuelto de papel aluminio. Funciona partiendo de que el vapor de agua ingresa
a la chaqueta externa, produce termostato de chaqueta externa y empieza luego a subir
termostato de chaqueta interna, tiene que subir a 120 grados Celsius. Luego, al reconocer
el equipo presión y temperatura, se cuentan 20 minutos, donde las bacterias y hongos se
hinchan, haciendo que todo organismo malo se elimine. Un dato curioso es que la vida útil
del equipo es el agua.
El segundo equipo es el destilador, el cual cuenta con una platina de calentamiento, un
condensador lineal y espiral. Lo que pasa aquí es que dicha platina se pone al rojo vivo
calentando el agua, de ahí, este líquido pasa por el refrigerante, que es un condensador
lineal, ya como se enfría dicha agua, se va a formar lo que es vapor, y al formarse, el agua
queda destilada. Un dato curioso es que por 1 litro de agua destilada, se elimina 10
residuales, siendo un impacto ambiental bastante grande.
Como tercer equipo se tiene el desionizador, que la función de este básicamente es quitar o
eliminar iones, se debe de tener en claro que la molécula que indica mejor el proceso de
ionización es la del agua, pues cuando se desioniza se queda un hidrógeno solo, es decir,
hidrogenión positivo que termina presentando acidez y queda un hidrógeno con el único
oxígeno de la molécula, es decir, se forma un hidroxilo que es significado de basicidad. Este
equipo hace la división por medio de membranas, haciendo la separación debido a los
microorganismos. Lo que sucede es que el agua entra por una primera membrana quitando
los sólidos más grandes, quedando una segunda membrana con sólidos más medianos y
por último la tercera membrana, que es la que quede con sólidos más pequeños, hecho
esto, el agua procede a pasar a la V del equipo donde va a salir purificada. Como dato
curioso, hay que darle seguridad para que el material no se vaya a contaminar por agua y la
separación de membranas va a pasar por un gradiente de concentración.
Dentro de esta área también se encuentra la estufa de secado, siendo el sitio donde se
pone el material de vidrio a secar, y de ahí se procede a guardarlo o ubicarlo en las
estanterías donde solo su uso es para frascos. Para resaltar, este equipo no puede pasar de
mayo de 50 grados, porque los materiales terminan por dañarse, es decir, ocurre una
descalibración.
Ya teniendo en claro cada una de las funciones de los diferentes equipos y conociendo
mejor el área de desinfección se procede a pasar a la segunda área que es la preparación
de medios de cultivo.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.

Esta área de estudio es importante porque permite evidenciar el comportamiento de la

planta y que comida o sustrato se les va a proporcionar. Aquí se cuenta con agua
esterilizada, bikers, y lo más importante, las balanzas analíticas, que por protocolos estrictos
se deben de hacer las medidas adecuadas y totalmente exactas.
Cuando se hacen las preparaciones de los medios de cultivo, en este proceso se debe de
mirar bien la elongación ( auxinas, citoquininas y giberelinas), para simular bien el
comportamiento de la planta, para ello se utiliza lo que se conoce como “la receta mágica”
y el resto termina por ser complementario. Dato importante, entre más pequeño el corte,
mucho mejor.
AISLAMIENTO Y CIRUGÍA.

Es la tercera área del aula de biotecnología, aquí se debe de entrar con uniforme totalmente
especializados para manipular los diferentes implementos. Se encuentran las cámaras de
flujo laminar, que sirven para hacer un procedimiento totalmente inocuo y lograr los
resultados esperados, cabe aclarar que las mejores cámaras son las que son triple.
Es importante tener en cuenta que a esta área se puede entrar solo cuando se tenga todos
los procesos listos (aislamiento).

CONTROL Y CALIDAD.

Básicamente lo que se hace en esta área es revisar el material de manera continua para ver
y saber si hubo algún tipo de contaminación o no. Como dato importante, el material que
salga de aquí se le debe de hacer prueba de virus.

INCUBACIÓN Y CONTROL.

Dentro de esta área se le hace el debido control a las distintas variables que influyen sobre
el cultivo, como son la temperatura, humedad y su respectivo fotoperiodo.

FASE DE INVERNADERO.

Es aquel lugar o sitio donde se procede a llevar a las plantas.

CAMPO.

En esta parte es donde ya se procede hacer la respectiva siembra de planta que se obtiene
en el cultivo, teniendo en cuenta que esta ya esté óptima para cumplir y aceptar las
diferentes condiciones ambientales y de su entorno por las cuales estará rodeada.

CULTIVO DE TEJIDOS.

Es de suma importancia tener en cuenta el banco de las plantas madres, para este caso,
fue el de los Crisantemos (Chrysanthemum), que por cada color de esta planta tiene un
nombre especial.
Para tomar el material vegetal de esta especie, se tienen en cuenta los siguientes pasos o
recomendaciones:
1. El material vegetal que está florecido, no se debe de tomar, es decir, el explante
tiene ocho días.
2. Lo que se hace es tomar un explante que no haya florecido.
3. Se toman en sí sus esquejes, para este caso se seleccionaron 3 hojas.
4. Se envuelven los esquejes en diagonal en servilletas, se marca y humedece con
agua destilada.
5. De inmediato hecho el paso anterior, estos son colocados en una nevera, ya que son
muy susceptibles a la deshidratación.
Es importante mencionar y tener en claro que las plantas necesitan tanto de macro y
micronutrientes.
El cultivo in vitro va a necesitar para su fase de iniciación lo que son sales básicas y
vitaminas, ya en el momento de su fase de multiplicación necesitará solamente sales
básicas. Para saber cuánto necesita cada uno se procede a hacer los respectivos cálculos
matemáticos.
- Volúmen final: 400 ml.
- 4.33*440/1000=1.9052, que sería lo que hay que agregar.
- De azúcar se debe de adicionar 30 gramos para un litro, es decir, 30=13,2
- Se necesitan 2.9 gramos del gelificante, que son equivalentes a 1.276
- Para el antioxidante, carbón activado, se necesita 1 gramo por litro = 0,44.

1. Imagen. 2. Imagen.
Primera parte de la tabla, sales. Pesaje del Medio MS.
Segunda parte de la tabla, vitaminas.

3. Imagen. 4. Imagen.
Pesaje del gelificante. Pesaje del azúcar.
Se debe de hacer 2 veces.
 5. Imagen.
Se saca un biker, se coloca un agitador con magento,
se agregan 100 mL de agua, ya que la solución es de
200 mL, porque está en fase de inicio.

Así sucesivamente, se pesan cada uno de los materiales que se necesitan para componer
el Agar Nutritivo que será para el meristemo, el cual, permite un buen desarrollo, nutrición y
supervivencia.
Posterior a esto, ya se procede a intervenir los esquejes para sacar sus respectivos
meristemos y que luego serán esterilizados con hipoclorito al 3 % para poder sembrarlos en
el agar nutritivo, esto, teniendo en cuenta todos los anteriores pasos mencionados y con
mucho cuidado. Ya solo queda hacer cirugía y sembrar los meristemos en el cultivo, esto se
hace dentro de las cámaras de flujo, para asegurar la inocuidad y sanidad en el momento
de proceder, así mismo, los implementos que se utilizan dentro de esta deben estar
completamente esterilizados.
Se hace el cultivo, introduciendo el pequeño meristemo dentro del frasco de vidrio que ya
contiene el agar, se esteriliza con fuego y luego se sella con papel vinipel.
Por último, mencionar que si en alguno de los procesos o pasos se llegan a tener fallas, el
meristemo no va a poder germinar o dar origen a una planta bajo ninguna circunstancia,
debido a que se alteraría su desarrollo óptimo en el cultivo in vitro.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De acuerdo a la metodología desarrollada se obtuvieron los siguientes resultados vistos el

día 23/07/23 en el área de estudio SENA.
Se obtienen dos resultados en uno de ellos el explante logra desarrollarse en el medio de
cultivo (E1) y en el segundo resultado el explante (E2) sufre una oxidación. Esto se debe a
distintos factores que se irán explicando más adelante.
6. Imagen (E1) 7. Imagen (E2)
El explante logra desarrollarse El explante sufre una oxidación

Para el explante (E1) se obtuvieron resultados en los que se evidencia que las condiciones
de asepsia empleadas en la cabina de flujo laminar y la desinfección fueron parte
fundamental del cultivo in vitro, de modo que no sufriera ningún tipo de daño por parte de
microorganismos indeseables como hongos y bacterias que habitan de forma natural en el
ambiente y que podrían contaminar el cultivo.
Esto deja como resultado que el explante o los tejidos escogidos crezcan y se desarrollen
en el medio de cultivo, evitando de alguna manera la competencia con otros
microorganismos y garantizando la pureza del cultivo. La buena asepsia evitando la
contaminación nos ofrece una mayor viabilidad celular donde los tejidos y células puedan
multiplicarse de manera óptima, formando tejidos u órganos, generando mayor éxito en el
establecimiento del cultivo y obteniendo resultados confiables y consistentes, para
eventualmente generar plantas completas, que serán trasplantadas a un invernadero con
las condiciones óptimas para que se sigan desarrollando de manera adecuada y posterior a
ello ser cultivadas en campo.

8. Imagen
Explante con buenas medidas de asepsia.
Para el caso del explante (E2) nos damos cuenta que el tiempo que se dejó el explante
dentro del hipoclorito al 1% para la pertinente desinfección fue incorrecto, lo que provocó
una oxidación u oscurecimiento por parte de los explantes y posterior a ello la muerte del
tejido, por lo cual no se obtuvieron resultados de desarrollo y crecimiento óptimo.

La oxidación y oscurecimiento de tejidos cultivados in vitro, se puede definir como la

oxidación, por radicales libres, de diferentes componentes celulares, así como, la oxidación
de compuestos fenólicos catalizado por la enzima polifenol oxidasa (PPO) para producir
quinonas, las cuales son especies químicas muy reactivas y propensas a reaccionar,
generando daño e incluso la muerte celular (Amiot et al. 1996, Bray et al. 2000).

La utilización del hipoclorito en el cultivo in vitro es una etapa del proceso muy importante a
la que se le debe prestar atención, debido a que puede tener diferentes resultados, tanto
positivos como negativos, dependiendo de cómo se utilice y de las condiciones específicas
del explante, el hipoclorito generalmente se utiliza para la desinfección de los explantes y
minimizar la introducción de contaminantes al cultivo in vitro, con el fin de reducir la carga
de contaminación como microorganismos presentes en la superficie de las plantas madre o
agentes patógenos transmitidos a través del ambiente

Sin embargo, se debe tener en cuenta que el hipoclorito en concentraciones inadecuadas o

tiempos de exposición prolongados puede resultar como un daño a los explantes. El
hipoclorito al ser un agente oxidante fuerte, puede tener efectos tóxicos en las células
vegetales, lo que causa problemas como inhibir su crecimiento, la necrosis, oxidación y
oscurecimiento. En este sentido se deben tener manejos adecuados cómo enjuagar y lavar
adecuadamente los explantes después del tratamiento con hipoclorito para eliminar
cualquier residuo tóxico, las concentraciones y los tiempos de exposición del explante al
hipoclorito deben ser apropiados para evitar daños en los explantes.

9. Imagen
Explante con mala implementación del hipoclorito
CONCLUSIONES

La implementación de medidas de asepsia efectivas en un cultivo in vitro con explantes

tiene el potencial de reducir la contaminación, mejorar la supervivencia y el crecimiento de
los explantes y aumentar la eficiencia en la producción de plantas.

La utilización de hipoclorito en un cultivo in vitro es una de las etapas más importantes ya

que puede ser efectiva para la desinfección y control de contaminantes externos, pero es
crucial tener cuidado en su aplicación para evitar daños a los explantes y asegurar que no
queden residuos tóxicos.

El agar nutritivo es la fuente de alimentación para el cultivo, ya que brinda los nutrientes
esenciales y necesarios para que el meristemo se pueda desarrollar de forma correcta y así
poder obtener una planta nueva, en buenas condiciones y que fácilmente se podrá adaptar
a las condiciones del medio.
BIBLIOGRAFÍA

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