Revalidación del intervalo de referencia para 17--

Hidroxiprogesterona durante el primer mes de vida

Resumen
Es importante disponer de un intervalo de referencia confiable y adaptado a las
posibles variaciones que pueda sufrir el método en uso para la correcta
interpretación de los resultados obtenidos. El objetivo de este trabajo fue revalidar el
intervalo de referencia para la 17-- Hidroxiprogesterona durante el primer mes de
vida. Como población de referencia se utilizaron 22 recién nacidos normales de entre
10 y 30 días de vida, nacidos a término, sin tratamiento con corticoides ni patología
suprarrenal. De este estudio se concluye que no se puede revalidar el intervalo de
referencia existente, quedando pendiente el establecimiento de uno nuevo.

Introducción
La hiperplasia suprarrenal congénita (HSC) comprende un grupo de enfermedades
que se heredan de forma autosómica recesiva, causada por diferentes defectos
enzimáticos en la vía de la biosíntesis de glucocorticoides y mineralocorticoides,
siendo la más frecuente la deficiencia de 21 Hidroxilasa que abarca el 95% de los
casos. Como consecuencia de esto se produce un déficit en la producción de cortisol,
y en algunos casos de aldosterona, y una elevación de los esteroides previos al
bloqueo enzimático, siendo más importante el incremento de la 17--
Hidroxiprogesterona (17OH-P) [1].

La forma de presentación clínica de la HSC por déficit de 21 Hidroxilasa incluye

macrogenitosomía en el varón y un grado variable de virilización en la mujer,
pudiendo llevar hasta una asignación de sexo masculino incorrecta, y en los casos
más graves puede presentarse una pérdida salina durante el período neonatal que
puede llevar a la muerte del paciente [2].

Debido a la necesidad de detectar precozmente los posibles casos de HSC, se incluye

a esta patología en el Programa de Pesquisa Neonatal, a través de la medida de
17OHP en sangre entera colectada en papel de filtro. Los neonatos cuya prueba de
pesquisa arroje un resultado anormal son derivados al centro de confirmación, donde
se les realiza un dosaje de la 17OH-P post extracción de la misma con dietiléter, para
eliminar la interferencia de otros esteroides, principalmente la 17--
Hidroxipregnenolona, presente en gran concentración durante la etapa neonatal y
que pueden ser causa de falsos positivos [3].

Objetivo
El objetivo de este trabajo fue evaluar si el intervalo de referencia establecido para
la 17-- Hidroxiprogesterona (0 - 5,75 ng/mL) sigue siendo válido luego de la
modificación del kit comercial RIA 17-- Hidroxyprogesterone, el cual se utiliza para
la medida del analito en cuestión.

Materiales y métodos
Muestras
Se utilizaron 22 muestras de plasma obtenido con EDTA de recién nacidos a término,
de ambos sexos, sin patología suprarrenal que concurrieron para extracción de
sangre con el fin de realizar diversos controles de laboratorio (no endocrinológicos).

Métodos
La concentración sérica de 17OH-P se determinó por radioinmunoensayo (RIA) de
tubo recubierto (Inmunotech, Francia), post extracción con dietiléter, siguiendo el
protocolo sugerido por el fabricante.
El RIA es una técnica competitiva que consiste en establecer una competencia entre
la hormona “fría” a medir y una cantidad fija de la misma hormona marcada
radiactivamente (trazador), por un número limitado de anticuerpos fijados al tubo de
reacción. Se deja incubar un determinado tiempo, se separa la fracción de hormona
no unida al tubo y se procede a medir la radiactividad de la fase ligada. La
concentración de hormona en la muestra se calcula por extrapolación sobre la curva
de calibración. Al tratarse de un ensayo competitivo, la concentración de hormona en
la muestra será inversamente proporcional a la señal obtenida.
El kit comercial RIA 17-- Hidroxyprogesterone fue modificado por el fabricante, con
variaciones en las indicaciones del procedimiento en las que se incluyen el cambio de
anticoagulante utilizado ( EDTA por heparina), disminución del volumen utilizado de
muestra no extraída ( de 50 uL a 25 uL) y disminución del tiempo de incubación de la
muestra y el trazador en el tubo recubierto ( de 180 min. a 120 min.).
La extracción de la 17OH-P con dietiléter se basa en la menor polaridad de la misma
con respecto a otros esteroides, por lo que podrá ser extraída de la muestra al
ponerla en contacto con el solvente orgánico, quedando en fase acuosa otros
esteroides presente en gran cantidad en el período neonatal, principalmente la 17--
Hidroxipregnenolona, los cuales interfieren en la reacción y pueden ser causa de
falsos positivos. Para realizar la extracción se ponen en contacto 100 uL de plasma
con EDTA y 2,5 mL de dietiléter, se tapa el tubo y se mezcla vigorosamente con ayuda
del vortex. Luego se deja reposar durante 5 minutos y se extrae cuidadosamente la
fase orgánica sin contaminarla con la fase acuosa y se coloca en un nuevo tubo. Se
hace evaporar completamente la fase orgánica colocando el tubo en un baño de agua
a 37ºC bajo campana y finalmente se re-disuelve el extracto de dietiléter secos con
100 uL de calibrador cero.

Análisis estadístico
Inicialmente se aplicó el test de Dixon para excluir valores aberrantes. Luego se
analizó la distribución de valores mediante un histograma de frecuencias (Figura 1).
Una vez confirmada la distribución normal de los datos mediante el test de Shapiro-
Wilk se aplicó la estimación paramétrica del intervalo de referencia usando las
fórmulas.
1) Límite inferior= X – 2.576 s
2) Límite superior= X + 2.576 s
Donde X es la media, s la desviación estándar y los límites inferior y superior
corresponden a los fractiles 0.005 y 0.995 respectivamente para un intervalo de
confianza del 99 %.

Resultados

Valores de 17OHP expresados en ng/ml:

Nº de muestra 17OHP
1 0,162
2 0,303
3 0,250
4 0,408
5 0,372
6 0,264
7 0,185
8 0,110
9 0,110
10 0,395
11 0,110
12 1,810
13 0,344
14 0,612
15 0,724
16 0,147
17 0,110
18 0,581
19 0,290
20 0,479
21 0,450
22 0,526
Mediante el test de Dixon se excluyó a la muestra nº 12 (1,81 ng/dL) por considerarse
un valor atípico.

Figura 1. Histograma de frecuencias

Del análisis estadístico se obtuvo:

(XSD)de 17 OHP sérica extraída= 0,330,18 ng/mL e IR= 0 – 0,79 ng/mL

Conclusiones y discusión
A pesar de la escasa cantidad de valores utilizados, se puede apreciar a simple vista la
gran diferencia que existe entre el intervalo de referencia obtenido y el preexistente.
El intervalo de referencia actual (0 – 5,75 ng/mL) fue calculado en el año 2000 (4], a
partir de 120 muestras de neonatos que cumplían los mismos criterios de exclusión
que se aplicaron en el presente trabajo (recién nacidos normales de entre 10 y 30
días de vida, nacidos a término, sin tratamiento con corticoides ni patología
suprarrenal). Se utilizó también el mismo kit comercial RIA 17--
Hidroxyprogesterone con la diferencia de una modificación del mismo ocurrida en el
período entre ambos trabajos, acerca de la cual no se conocen los detalles.
Se sospecha que una de las posibles causas del notable descenso de los valores
obtenidos podría ser la modificación de los anticuerpos anti 17 OH-P provistos por el
fabricante (anticuerpos más específicos).
La posibilidad de acortar el intervalo de referencia para la 17 OH-P durante el primer
mes de vida permitirá eventualmente detectar las formas no clásicas de HSC, con
leves aumentos en los niveles de este metabolito y sin sintomatología sino hasta la
infancia o adolescencia. De esta manera se podría realizar un seguimiento de estos
pacientes de manera de evitar la hiperandrogenización durante la infancia que puede
llevar, entre otras cosas, a una talla final baja.
En contraste con esto, la incorrecta reducción del intervalo de referencia provocará
un aumento en la cantidad de recitaciones a causa de resultados falsos positivos, lo
que incrementará los costos económicos además de generar angustia en la familia
del neonato.
A partir de los datos obtenidos en el presente trabajo no se puede revalidar el
intervalo de referencia para la 17 OH-P durante el primer mes de vida, quedando
como próximo punto, la recolección de un mayor número de muestras para correcto
cálculo y establecimiento de un nuevo intervalo de referencia.

Agradecimientos
A Daniel Vogliolo, Andrea Tournier, Alejandra Marinelli y Romina Bedogni por su
especial colaboración y predisposición para la realización de este trabajo.
A Paola Prener, Laura Delaplace y María Cecilia Girard Bosch por su apoyo y
compromiso.

Bibliografía
[1] Aizpun J.I., de Arriba Muñoz A., Ferrandez Longás A. Hiperplasia suprarrenal
congénita. Protoc diagn ter pedriatr. 2011; 1:117-28
[2] Pisarev M. A., Calandra R.S., Suescun M.O., Juvenal G.J. Fisiopatología Endócrina:
Bioquímica y métodos diagnósticos. (Fascículo V)
[3] Pattin J., Tournier A., Vogliolo D., Balbi V., Gonzalez V., Pistaccio L., Castillo P.,
Borrajo G. Medida de 17 OH-Progesterona post extracción: su importancia en la
confirmación de Hiperplasia suprarrenal congénita.
[4] Tournier A., Pattin J., Vogliolo D. Valoración de 17--
Hidroxiprogesterona sérica por radioinmunoensayo extractivo: Determinación de un
intervalo de referencia durante el primer mes de vida.